DE3231627C2 - Elektrophoresegel auf Polysaccharidbasis und dessen Anwendung - Google Patents
Elektrophoresegel auf Polysaccharidbasis und dessen AnwendungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Elektrophorese-Gel zur
Trennung von Serumproteinen sowie dessen Verwendung.
Elektrophoretische Verfahren zur Trennung von Serumproteinen
sowie Elektrophorese-Gele zur Verwendung bei diesen
Elektrophorese-Verfahren sind dem Fachmann bekannt,
vergleiche Cawley, "Electrophoresis and Immunoelectrophoresis",
Little, Brown and Company, Boston, Mass. (1969).
Allgemein sind die zur Trennung von Serumproteinen
verwendeten elektrophoretischen Gele von einem Typ, der ein
Polysaccharid enthält. Auch ein Puffer mit einem basischen
pH-Wert liegt gewöhnlich in diesen Elektrophorese-
Gelen vor.
Typische Polysaccharide, wie sie in Elektrophorese-Gelen
nach dem Stande der Technik verwendet werden, sind unter
anderem Stärke, Celluloseacetat,
Agar, Agarose sowie Kombinationen hiervon.
Typische in Elektrophorese-Gelen nach dem Stande der Technik
verwendete Puffer mit einem basischen pH-Wert sind
unter anderem die in
der Tabelle I des obengenannten Werks von Cawley, Seiten
331-332, angegebenen basischen pH-Puffer.
Darüber hinaus können derartige Elektrophorese-Gels weitere
Zusätze für besondere Zwecke enthalten. So ist aus der US-
PS 37 66 047 ein Elektrophorese-Gel auf Polysaccharid-Basis
bekannt, bei dem zum Zweck der Verbesserung der Trennschärfe
(Selektivität) des Gels gegenüber eng verwandten Proteinen
das Puffer-System als wesentlichen Bestandteil einen
aliphatischen Aminoalkohol, vorzugsweise Amino-Methyl-Propan
(AMP), enthält, und bei dem des weiteren als antibakteriell
wirkendes Konservierungsmittel ein Zusatz von Äthylendiamintetra-
Essigsäure (EDTA) vorgesehen ist.
Aus der US-Patentschrift 39 59 251 ist bekannt, daß
Agar, das ein bekanntes und übliches Elektrophorese-Gel
darstellt und vorzugsweise auch als Grundpolysaccharid
für die Zwecke der vorliegenden Erfindung anwendbar
ist, im unbehandelten Zustand bereits ein Gemisch von
Polysacchariden darstellen kann, das u. a. auch bereits
saure Carboxylgruppen enthaltende Polysaccharide aufweisen
kann. Hieraus ist jedoch nicht die gezielte
Anwendung eines oder mehrerer zusätzlicher saurer
Polysaccharide aus der genannten Gruppe gemäß dem
Grundgedanken der Erfindung bekannt; außerdem ist in der US-
Patentschrift 39 59 251 angegeben, daß die Gegenwart
von carboxylgruppen-haltigen Bestandteilen in dem Agar
die Verwendung als Elektrophorese-Gel störend beeinträchtigen
kann und deshalb die Verringerung des Carboxylgehalts
praktisch auf Null vorzuziehen ist.
Ein Problem bei den Elektrophorese-Verfahren nach dem
Stande der Technik zur Trennung von Serumproteinen besteht
darin, daß eine beträchtliche Zeitdauer (in der
Größenordnung von 30 Minuten und länger) erforderlich
ist, bis die Serumproteine fixiert, d. h. für die visuelle
Beobachtung zugänglich werden. Diese verhältnismäßig
lange Protein-Fixierperiode macht das Serum-Elektrophorese-
Verfahren nach dem Stande der Technik zu einer zeitaufwendigen
Prozedur.
Es wäre daher sehr erwünscht, über ein Gel für ein Elektrophorese-
Verfahren zur Trennung von Serumproteinen zu verfügen,
bei welchem die Protein-Fixierperiode relativ kurz ist.
Ein derartiges verbessertes Elektrophorese-Gel zur
Trennung von Serumproteinen würde es dem klinischen
Laboratorium ermöglichen, dem Diagnostiker lebenswichtige
Information in einer kürzeren Zeitdauer zu liefern.
Der Erfindung liegt als Aufgabe die Schaffung eines
für ein derartiges elektrophoretisches Trennverfahren
geeigneten Elektrophorese-Gels zugrunde, dessen
Verwendung bei der Trennung von Serumproteinen eine
schnellere Fixierung der Serumproteinfraktionen ermöglicht.
Zu diesem Zweck ist bei einem Elektrophorese-Gel der
o. g. Art gemäß der Erfindung vorgesehen, daß das
Elektrophorese-Gel zusätzlich ein saures Polysaccharid
aus der Gruppe Arabinsäure, Tragantsäure, Karayasäure,
Alginsäure und Pektinsäure und/oder Salz(e) hiervon
enthält.
Der Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis
zugrunde, daß sich durch das Vorliegen eines sauren
Polysaccharids (oder Salzes hiervon) als zusätzlicher
Bestandteil in dem Polysaccharid-Elektrophorese-Gel
eine beträchtliche Verringerung der Protein-Fixierdauer
erzielen läßt.
Zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignete
saure Polysaccharide sind unter anderem
Arabinsäure, Tragantsäure,
Karaya-Säure,
Alginsäure, Pektinsäure. Das bevorzugte
saure Polysaccharid ist Arabinsäure.
Zur Verwendung für die Zwecke der vorliegenden Erfindung
geeignete Salze von sauren Polysacchariden sind unter
anderem deren Natrium-,
Kalium-, Calcium- und Magnesiumsalze. Beispiele derartiger
saurer Polysaccharidsalze sind unter anderem
Gummiarabicumsäure, Tragantgummisäure,
Karayagummisäure, Algingummisäure und
Pektingummisäure.
Grund-Polysaccharide, welche bevorzugt in dem Elektrophorese-
Gel gemäß der Erfindung verwendet werden können, sind
Agar und Agarose. Die Agarose kann entweder niedrig-
elektroendosmotische Agarose, mittel-elektroendosmotische
oder hoch-elektroendosmotische Agarose sein. Besonders
bevorzugt wird als Polysaccharid in dem elektrophoretischen
Gel gemäß der Erfindung hoch-elektroendosmotische
Agarose verwendet.
Vorzugsweise besitzt der erfindungsgemäß verwendete
Puffer einen pH-Wert von 7 bis 10. Besonders bevorzugt
weist der Puffer einen pH-Wert von 8 bis
9 auf.
Das elektrophoretische Gel gemäß der Erfindung kann
gegebenenfalls des weiteren ein Konserviermittel enthalten.
Typische Konserviermittel sind unter anderem
Antibiotika, halogenierte organische
Verbindungen sowie anorganische Verbindungen. Ein
für die Zwecke der Erfindung geeignetes, leicht
verfügbares Konserviermittel ist Natriumazid.
Das erfindungsgemäße Elektrophorese-Gel kann gegebenenfalls
auch ein Alkylpolyol mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen
und 2 bis 4 Hydroxylgruppen enthalten. Für die Zwecke der
vorliegenden Erfindung geeignete Alkylpolyole sind unter
anderem Äthylenglykol,
Propandiol, Butandiol, Pentandiol und Glycerin. Vorzugsweise
weist das Alkylpolyol 2 bis 4 Kohlenstoffatome
auf.
Die in dem Elektrophorese-Gel gemäß der Erfindung
verwendeten jeweiligen genauen Konzentrationen der verschiedenen
Bestandteile sind nicht kritisch. Jedoch weist das
Elektrophorese-Gel gemäß der Erfindung vorzugsweise von
0,4 bis 1,5% Gewicht/Volumen hoch-elektroendosmotische
Agarose; von 0,01 bis 5% Gewicht/
Volumen Arabinsäure; bis zu 20% Volumen/Volumen
Äthylenglykol; bis zu 1% Gewicht/Volumen Natriumazid;
sowie einen Puffer mit einem pH-Wert von 7 bis
10 und einer Molarität von 0,001 bis 3 auf.
Besonders bevorzugt weist das Elektrophorese-Gel gemäß der
Erfindung von 0,7 bis 1,2% Gewicht/Volumen
hoch-elektroendosmotische Agarose; von 0,5 bis
1,5% Gewicht/Volumen Arabinsäure; von 1 bis 10%
Volumen/Volumen Äthylenglykol; von 0,05 bis
0,15% Gewicht/Volumen Natriumazid; sowie einen Puffer
mit einem pH-Wert von 8 bis 9 und einer Molarität
von 0,05 bis 1 auf. In optimaler Ausführung
weist das Elektrophorese-Gel gemäß der Erfindung etwa 1%
Gewicht/Volumen hoch-elektroendosmotische Agarose; etwa
1% Gewicht/Volumen Arabinsäure; etwa 5% Volumen/Volumen
Äthylenglykol; etwa 0,1% Gewicht/Volumen Natriumazid;
sowie einen Barbitalpuffer mit einem pH-Wert von etwa 8,6
und einer Molarität von etwa 0,05 auf.
Die Elektrophorese-Gele gemäß der Erfindung können nach
einem beliebigen, dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt
werden, vergleiche beispielsweise Cawley, a. a. O.
Allgemein wird die Gel-Lösung durch Mischen ihrer
verschiedenen Bestandteile bei gleichzeitiger Erhitzung des
Gemischs auf eine Temperatur von 80 bis 100°C
hergestellt. Das Elektrophorese-Gel kann nach üblichen
Formgebungs- oder Gießverfahren hergestellt werden. Die
erfindungsgemäßen Gele können bei praktisch jeder bequemen
Temperatur, beispielsweise bei Temperaturen von
2°C bis 40°C, vorzugsweise bei Temperaturen zwischen
18°C bis 26°C, gelagert werden. Vorzugsweise
werden die Elektrophorese-Gele bis zur Gebrauchsanwendung
in versiegelten Kunststoffbehältern aufbewahrt.
Die Aufgabe der Proben zu den erfindungsgemäßen
elektrophoretischen Gelen kann nach einem beliebigen, im Stande
der Technik verwendeten Verfahren erfolgen, beispielsweise
mittels einer Mikroliter-Injizierspritze. Die Elektrophorese-
Gele können bei 100 V über 20 Minuten der Elektrophorese
unterworfen werden. Falls gewünscht, können
die Gele in einem Alkohol/Essigsäure-Gemisch aus
beispielsweise 60% Alkohol, 30% entionisiertem Wasser
und 10% Eisessigsäure fixiert werden. Außerdem können
die Gele gegebenenfalls bei 80°C bis 90°C getrocknet
werden.
Die beiden in der Tabelle I angegebenen Elektrophorese-
Gel-Zusammensetzungen wurden jeweils gemäß dem nachfolgenden
Versuchsprotokoll verwendet, zur Veranschaulichung
des verbesserten Elektrophorese-Verfahrens gemäß der
Erfindung für die Trennung von Serumproteinen und des
verbesserten Elektrophorese-Gels hierfür. Der einzige
Unterschied zwischen den beiden in diesem Vergleichsexperiment
verwendeten Elektrophorese-Gelen bestand darin, daß das
innerhalb des Rahmens der Erfindung liegende Elektrophorese-
Gel Arabinsäure, d. h. ein spezielles saures
Polysaccharid, enthielt, während das außerhalb des
Rahmens der Erfindung liegende Elektrophorese-Gel frei von
jeglichem saurem Polysaccharid war.
1.0Eine Serumprobe wurde nach einem Schablonen-
Verfahren auf die Oberfläche des Gels aufgebracht.
2.0Das Gel wurde in einem Barbitalpuffer mit pH 8,6
der Elektrophorese unterworfen.
3.0Das Gel wurde in eine entionisiertes Wasser,
Äthylalkohol und Eisessigsäure (3 : 6 : 1) enthaltende
Fixierlösung bis zum Ausfällen gebracht
und beobachtet.
Die bei Ausführung dieses Versuchsprotokolls für die
beiden Gelzusammensetzungen gemäß Tabelle I erhaltenen
Ergebnisse sind ebenfalls in der Tabelle I angegeben.
Wie die Serumprotein-Fixierzeiten in Tabelle I zeigen,
ermöglicht ein Elektrophorese-Verfahren zur Trennung von
Serumproteinen unter Verwendung des verbesserten Elektrophorese-
Gels gemäß der Erfindung die Fixierung von Serumproteinen
in weniger als 3 Minuten. Demgegenüber konnte
mit einem ähnlichen Verfahren, das sich lediglich darin
unterschied, daß das dabei verwendete Elektrophorese-Gel
keinerlei saures Polysaccharid (in welchem der Säureanteil
wenigstens eine Carboxylgruppe enthält) oder die
Salze eines derartigen sauren Polysaccharids enthält, das
Serumprotein selbst nach einer Periode von 30 Minuten
nicht fixiert werden.
Claims (10)
1. Elektrophorese-Gel auf Polysaccharidbasis zur Verwendung
bei der elektrophoretischen Trennung von Serumproteinen,
wobei das Elektrophorese-Gel ein oder mehrere
Grundpolysaccharid(e) sowie einen Puffer mit einem
basischen pH-Wert enthält,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Elektrophorese-Gel zusätzlich ein saures
Polysaccharid aus der Gruppe Arabinsäure, Tragantsäure,
Karayasäure, Alginsäure und Pektinsäure und/oder Salz(e)
hiervon enthält.
2. Elektrophorese-Gel nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß das bzw. die Salz(e) des sauren Polysaccharids aus
der Gruppe Natrium-, Kalium-, Calcium- und Magnesiumsalze
gewählt ist/sind.
3. Elektrophorese-Gel nach
Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß es das Salz des sauren Polysaccharids und einen
Puffer mit einem basischen pH-Wert, vorzugsweise im
Bereich von 7 bis 10 und besonders bevorzugt
im Bereich von 8 bis 9, aufweist.
4. Elektrophorese-Gel nach einem oder mehreren der
vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß es zuzsätzlich ein Konservierungsmittel, vorzugsweise
Natriumazid, aufweist.
5. Elektrophorese-Gel nach einem oder mehreren der
vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß es zusätzlich ein Alkylpolyol mit 2 bis 6
Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2 bis 4 Kohlenstoffatomen,
und 2 bis 4 Hydroxylgruppen enthält.
6. Elektrophorese-Gel nach einem oder mehreren der
vorhergehenden Ansprüche und insbesondere nach Anspruch
5,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Grund-Polysaccharid aus der Gruppe Agar und
Agarose gewählt ist.
7. Elektrophorese-Gel nach Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet,
daß das saure Polysaccharid hoch-elektroendosmotische
Agarose ist.
8. Elektrophorese-Gel nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Alkylpolyol Äthylenglykol ist.
9. Elektrophorese-Gel nach einem oder mehreren der
vorhergehenden Ansprüche,
gekennzeichnet
durch die Gehalte
- (a) von 0,4 bis 1,5%, vorzugsweise von 0,7 bis 1,2%, und besonders bevorzugt etwa 1% Gewicht/Volumen hoch-elektroendosmotische Agarose,
- (b) von 0,01 bis 5%, vorzugsweise von 0,5 bis 1,5%, und besonders bevorzugt etwa 1% Gewicht/Volumen Arabinsäure,
- (c) bis zu 20%, vorzugsweise von 1 bis 10%, und besonders bevorzugt etwa 5% Volumen/Volumen Äthylenglykol,
- (d) bis zu 1%, vorzugsweise von 0,05 bis 0,15%, und besonders bevorzugt etwa 0,1% Gewicht/Volumen Natriumazid und
- (e) daß der Puffer einen pH-Wert im Bereich von 7 bis 10, vorzugsweise im Bereich von 8 bis 9, besonders bevorzugt von etwa 8,6, sowie eine Molarität im Bereich von 0,001 bis 3, vorzugsweise von 0,05 bis 1, besonders bevorzugt von etwa 0,05, besitzt.
10. Anwendung des Elektrophorese-Gels nach einem oder
mehreren der vorhergehenden Ansprüche mit einem
Elektrophorese-Verfahren zur Bestimmung der relativen
Verteilung von Proteinen.
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