DE3935020A1 - Verbesserte elektrophoresegele aus agarose - Google Patents
Verbesserte elektrophoresegele aus agaroseInfo
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Description
Die Erfindung betrifft verbesserte Elektrophoresegele
aus Agarose.
Bei der isoelektrischen Fokussierung werden für die
antikonvektive Stabilisierung derzeit überwiegend
Polyacrylamidgele eingesetzt. Agarose ist eine
Alternative mit einer Reihe von Vorteilen.
- 1) Die Gelierung durch Abkühlen einer gelösten Agarose ist einfacher, reproduzierbarer und unbedenklicher als eine Polymerisation unter Mitwirkung freier Radikale. Die Herstellung von Agarosegelen schaltet gesundheitliche Risiken aus, die auf die neurotoxischen und/oder krebserregenden Eigenschaften der Reagenzien zurückgehen, die für die Polymerisation von Polyacrylamidgelen erforderlich sind. Agarosegele enthalten keine Restmengen der toxischen Reagenzien oder restliche freie Radikale, die z. B. auf die aufzutrennenden Proteine einen nachteiligen Einfluß haben können.
- 2) Agarosegele sind Polyacrylamidgelen deutlich überlegen aufgrund ihrer geringeren Restriktivität, so daß in diesen Gelen auch Moleküle bis zu einer Größe von mehreren Millionen Dalton getrennt werden können. Die Trennung einiger hochmolekularer Proteine ist von großer praktischer Bedeutung.
- 3) Agarosegele sind vielseitiger als Polyacrylamidgele bei der Anwendung immunologischer Nachweisverfahren, z. B. der Immunfixation, bei der Enzymvisualisierung und beim Proteinblotting.
Trotz dieser Vorteile hat in den letzten Jahren die
isoelektrische Fokussierung in Agarosegelen keine
größere Verbreitung gefunden. Die zögernde Aufnahme der
isoelektrischen Fokussierung in Agarose für
Routineanwendungen geht auf eine störende Eigenschaft
dieses Geles zurück, nämlich die Bildung von Exsudaten.
Sogar die besten im Handel erhältlichen
"Null-Elektroendosmose"-Agarosen, die speziell für die
isoelektrische Fokussierung entwickelt wurden, neigen
zur Bildung von Flüssigkeits-Exsudaten auf der
Geloberfläche. Das Ausmaß dieser Exsudate hängt von
verschiedenen Versuchsparametern ab, wie z. B.
Eigenschaften der Agarose, Luftfeuchtigkeit,
Konstruktion der Elektrophoresekammer, elektrische
Feldstärke, Volt × Stunden (Vh) Produkt, pH Bereich der
Trägerampholyte. Die Exsudation stört erheblich die
isoelektrische Fokussierung in Agarose, die deshalb
häufig weder unter Gleichgewichts-Bedingungen
durchgeführt werden kann, noch eine hohe elektrische
Feldstärke zuläßt, die für eine verbesserte Auflösung
von Vorteil wäre. Diese Nachteile der Agarosegele
lassen sich zum Teil beheben, wenn vor Beginn der
isoelektrischen Fokussierung die Geloberfläche mit
Filterpapier getrocknet wird, um aus dem Gel einen Teil
der flüssigen Phase zu entfernen. Während der
isoelektrischen Fokussierung können in regelmäßigen
Abständen die Exsudaten ebenfalls mit Filterpapier
entfernt werden. Beide Maßnahmen können zu guten
Trennergebnissen führen, sind aber in der Routine
umständlich.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß die
Eigenschaften von Agarosegelen bei der isoelektrischen
Fokussierung entscheidend verbessert werden können,
wenn die Agarosegele, anstatt der bisher üblichen
10-15% höhere Konzentrationen von Polyolen
enthalten. Erfindungsgemäß beträgt die Konzentration
der Polyole zwischen 20 (bevorzugt 25) und 80%
(g/v = Gewicht/Volumen; (g/ml)). Der bevorzugte Bereich
liegt zwischen 25 und 60% g/v; besonders bevorzugt ist
der Bereich größer 30% g/v. Die beanspruchten
Konzentrationen errechnen sich aus dem Gewicht des
Polyols bezogen auf das Gesamtvolumen des noch nicht
gelierten Gels (g/ml). Geeignet sind solche Polyole,
die gut wasserlöslich sind, d. h. in dem beanspruchten
Bereich mit Wasser mischbar bzw. in Wasser löslich sind.
Geeignete Polyole sind beispielsweise verzweigte oder
unverzweigte aliphatische Polyole mit 2 bis 8,
bevorzugt 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und mindestens zwei
Hydroxygruppen. Geeignet sind weiterhin Monosaccharide
vom Strukturtyp der Pentosen und Hexosen sowie
Oligosaccharide, insbesondere Disaccharide, wie z. B.
Saccharose und deren Derivate. Zu den wichtigsten
Pentosen bzw. Hexosen gehören Xylose, Glucose,
Fructose. Geeignet sind zudem Zuckeralkohole, wie z. B.
Sorbit und Xylit.
Von verschiedenen Polyolen haben sich besonders
bewährt: Glycerin (30-70%, bevorzugt 35-70% g/v),
Ethylenglykol (40-60% g/v), Propylenglykol (40-60%
g/v), Saccharose (30-50% g/v), Sorbit (30-50%
g/v), Dextran (20-30% g/v) sowie Kombinationen
dieser Polyole mit hoher Konzentration der
Einzelkomponenten. Besonders bevorzugt sind
Agarosegele, die 30 bis 60% (g/v) Glycerin enthalten.
Verglichen mit herkömmlichen Agarosegelen haben Gele,
mit dem oben angeführten hohen, durchschnittlich 30-60%
g/v Polyolgehalt folgende vorteilhafte
Eigenschaften: Die Geloberfläche zeigt keine Exsudate,
auch nicht unter besonders ungünstigen
Trennbedingungen, wie z. B. hohe Luftfeuchtigkeit, lange
Trennzeiten, hohe elektrische Feldstärken, großer
Temperaturunterschied zwischen Gel und Oberfläche der
Kühlplatte der Trennkammer. Gele mit hohem Polyolgehalt
können bei der isoelektrischen Fokussierung mit extrem
hohen Feldstärken, z. B. 500-1000 V/cm, ohne lokale
Überhitzung belastet werden. Bei hohen
Polyolkonzentrationen - insbesondere bei hohen
Glycerinkonzentrationen - mit einem Gehalt von mehr als
oder gleich 30% g/v kann überraschenderweise auf die
sonst üblicherweise notwendige Kühlung der
Elektrophoresekammer mit Hilfe eines Kryostaten
verzichtet werden.
Aufgrund der hohen Viskosität ist es vorteilhaft, die
Trennung bei Temperaturen zwischen 15 und 25°C
(Raumtemperatur) (üblich sind 2-15°C) durchzuführen,
d. h. es ist ausreichend, die Elektrophoresekammer mit
Hilfe eines Thermostaten zu kühlen. Bei den
herkömmlichen Gelen beobachtet man aufgrund von
Unterschieden in der Leitfähigkeit der Elektrolyte ein
Austrocknen der Gele und bei fortgesetztem
Stromdurchgang Verbrennungslinien, die in der Regel zu
einem Abbruch des Versuchs führen. Die Anwendung hoher
Feldstärken ist bei einigen Elektrophoresetechniken
anzustreben, weil dadurch die Auflösung verbessert
werden kann. Ein hoher Salzgehalt der Proben, wie er
z. B. in einigen Körperflüssigkeiten oder nach
vorangegangener Fraktionierung vorkommt, stört in
Agarosegelen mit hohem Polyolgehalt weniger als in
herkömmlichen Gelen. Ein hoher Polyolgehalt im Gel
ermöglicht nicht nur die Anwendung hoher Feldstärken
und damit eine bessere Auflösung während der Trennung.
Auch nach dem Abschalten des elektrischen Feldes wird
durch die erhöhte Viskosität die Diffussion der
aufgetrennten Komponenten vermindert, was dazu
beiträgt, daß bei den anschließenden
Visualisierungsschritten, wie z. B. Anfärbung der
Proteine oder spezifische Enzymvisualisierung, die
Trennschärfe erhalten bleibt. Auf diese Weise kann man
vermeiden, daß sich die im Gel nur mit geringem
Abstand, z. B. Bruchteilen eines Millimeters, getrennten
Komponenten durch Diffusion überlagern.
In ultradünnen Gelen wirkt ein hoher Polyolgehalt
stabilisierend und man erhält regelmäßigere Trennmuster
als in den herkömmlichen Gelen. Die Herstellung
ultradünner Gele mit hohem Polyolgehalt ist einfacher
als bei geringer Polyolkonzentration, weil insbesondere
in den ultradünnen Gelen der unerwünschte Einschluß von
Luftblasen dank der hohen Dichte der
Polymerisationslösung vermieden werden kann. Gele mit
hohem Polyolgehalt lassen sich besser lagern als
herkömmliche Gele, weil sie weniger zum Austrocknen
neigen und auch bakteriologisch stabiler sind. Glycerin
in hoher Konzentration hat eine bakterizide Wirkung, so
daß sich bei längerer Lagerung ein Zusatz anderer
Konservierungsstoffe, die manchmal den Trennvorgang
stören können, erübrigt.
Aus der Literatur ist bekannt, daß Polyole in hoher
Konzentration, z. B. 30-60% Glycerin, stabilisierend auf
Proteine und Enzyme wirken; so werden beispielsweise
empfindliche Enzyme in Lösungen hoher
Glycerinkonzentrationen im Handel angeboten, um sie
längere Zeit vor der Denaturierung zu schützen. Diese
stabilisierende Wirkung der Polyole ist auch während
der Elektrophorese besonders vorteilhaft, weil bedingt
durch lange Verweilzeiten im Trennsystem Proteine und
Enzyme durch extreme pH-Werte oder im Bereich ihrer
isoelektrischen Punkte leicht inaktiviert oder
modifiziert werden können. Die stabilisierende Wirkung
hoher Polyolkonzentrationen ist bei analytischer und
präparativer Elektrophorese vorteilhaft, weil
Trennartefakte (native und denaturierte Proteine können
sich in ihren Ladungseigenschaften unterscheiden)
vermieden werden und die Ausbeute erhöht wird.
Niedermolekulare Polyole stören die präparative
Elektrophorese nicht, da sie von den aufgetrennten
Proteinen oder anderen hochmolekularen Substanzen
leicht abgetrennt werden können.
Hohe Polyolkonzentrationen im Gel sind auch vorteilhaft
bei einer der heute wichtigsten Anwendungen der
Elektrophorese - dem Blotting. Beim Blotting werden die
im Gel elektrophoretisch aufgetrennten Komponenten für
weitere Visualisierungsschritte in eine
immobilisierende Matrix, z. B. eine
Nitrocellulosemembran, übertragen. Eine dabei häufig
beobachtete Schwierigkeit ist die zu starke Haftung der
Membran, die ein Abziehen von der Geloberfläche
erschwert oder unmöglich macht. Hohe
Glycerinkonzentrationen im Gel ermöglichen durch
verbesserte Gleiteigenschaften ein problemloses Abheben
der Membran von der Geloberfläche. Erfindungsgemäß
werden nicht nur die gebrauchsfertigen Gele
beansprucht, sondern auch die entsprechend
vorbereiteten Lösungen, die zur Herstellung des
gebrauchsfertigen Gels lediglich auf einen geeigneten
Träger aufpolymerisiert werden müssen. Solche
Gelkompositionen bestehen aus den eigentlichen
Monomerlösungen, z. B. wässerigen Lösungen wie Agarose,
üblichen Hilfs- und Zusatzstoffen sowie
erfindungsgemäße Konzentrationen an Polyolen. Zum
Gebrauch wird die vorbereitete Lösung mit einem
geeigneten Katalysator versetzt und auf einen
geeigneten Träger (Glasplatte, Gewebe oder Folie)
aufpolymerisiert.
Erfindungsgemäß werden gewebegestützte Agarosegele mit
hohem Polyolgehalt beansprucht, deren Gewebe einen
haftverbessernden Überzug aufweisen. Solche Gewebe sind
aus dem Stand der Technik bekannt und beispielsweise in
der internationalen Patentanmeldung WO 89/03 721
beschrieben, auf die hiermit inhaltlich Bezug genommen
wird. Bevorzugte Gewebe sind Polyestergewebe, die mit
einem Gemisch aus verdünnter Agarose und einem
Polyacrylamidgel überzogen worden sind.
Es werden Gele mit 1,3% Agarose, 3% Trägerampholyten
und 30% Glycerin wie folgt hergestellt:
"Null-Elektroendosmose" Agarose (1,3 g), z. B. IsoGel
Agarose (FMC, Rockland ME, USA) wird langsam unter
ständigem Rühren in destilliertes Wasser (50 ml)
gestreut und 30 s in einem Haushalts-Mikrowellenherd
bis zum vollständigen Auflösen der Agarose erhitzt. In
diese Lösung wird Glycerin (28 ml eines 87%igen
Glycerins, (d = 1,22) hinzugefügt und weitere 20 s im
Mikrowellenherd erhitzt. Nach Zugabe von 6,25 ml
Servalyt Trägerampholyten (Serva) wird die Lösung auf
100 ml destilliertem Wasser aufgefüllt. Die heiße
Agaroselösung wird in einer vorgewärmten Vakuumflasche
einige Sekunden entlüftet. Die Agaroselösung wird in
eine entsprechende Vorrichtung eingebracht. Die
Gelschichten können in einer Kassette, der üblichen
Kapillartechnik oder Klapp-Technik hergestellt werden.
Als Träger für die Agaroseschicht können Glasplatten,
entsprechend vorbehandelte und im Handel erhältliche
Polyesterfolien, oder Netzgewebe verwendet werden.
Die im Handel erhältlichen vorbehandelten Netzgewebe
sind für Polyacrylamidgele entwickelt worden.
Agarosegele haften auf ihnen nur unzureichend
und für die Herstellung gewebegestützter Agarosegele
müssen die Netze zusätzlich vorbehandelt werden, um die
Haftung zu verbessern. Eine verbesserte Haftung
erreicht man, wenn die Gewebe mit einem Gemisch aus
verdünnter Agarose und einem Polyacrylamidgel überzogen
werden. Das Gemisch wird auf das Gewebe
aufpolymerisiert und im Mikrowellenherd eingebrannt.
Das Gemisch besteht aus 0,4% Agarose (0,4 g), 10% g/v
Glycerin (9,4 ml eines 87%igen Glycerins) und einer
Polymerisationslösung (16 g/ml) aus 29,1 g Acrylamid
und 0,9 g N,N′-Methylenbisacrylamid. Die aufgeführten
Mengen werden in etwa 50 ml Wasser eingebracht, etwa
30 s im Mikrowellenherd erhitzt, mit
N,N,N′,N′-Tetramethyl- ethylendiamin und
Ammoniumpersulfat als Katalysatoren versetzt, und auf
100 ml mit Wasser aufgefüllt. Nach kurzem Entlüften in
einer Vakuumflasche wird die heiße Lösung auf das
Netzgewebe aufgetragen und mit einer Polyesterdeckfolie
zum Ausschluß von Sauerstoff abgedeckt. Das Gel ist
nach etwa 5 min auspolymerisiert und wird anschließend
3 min im Mikrowellenherd eingebrannt. Anstatt der
Polymerisationslösung kann auch eine Lösung von 0,4%
Agarose, 10% g/v Glycerin und 5-10% g/v im Handel
erhältlicher, hochmolekularer linearer Polyacrylamide
verwendet werden.
Claims (6)
1. Verbesserte Elektrophoresegele enthaltend
- a) ein Gewebe mit einem haftverbessernden Überzug und
- b) ein Gel aus Agarose und 20 bis 80% (Gewicht/Volumen) eines oder mehreren Polyole, wobei das Gewicht des Polyols auf das Gesamtvolumen des nicht gelierten Gels berechnet wird.
2. Elektrophoresegel nach Anspruch 1 enthaltend
- a) ein Polyestergewebe mit einem haftverbessernden Überzug - herstellbar aus einem aufpolymerisierbaren Gemisch aus verdünnter Agarose und einem Polyacrylamidgel und
- b) ein Gel aus Agarose und 20 bis 80% (Gewicht/Volumen) eines oder mehreren Polyole, wobei das Gewicht des Polyols auf das Gesamtvolumen des nicht gelierten Gels berechnet wird.
3. Elektrophoresegel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß das Polyol aus der Gruppe
Glycerin, Ethylenglykol, Propylenglykol,
Saccharose, Sorbit und/oder Dextran ausgewählt ist.
4. Elektrophoresegel nach Anspruch 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß die Konzentration des Polyols
30 bis 60% beträgt.
5. Elektrophoresegel nach Anspruch 1, 2 oder 4,
dadurch gekennzeichnet, daß das Polyol Glycerin ist.
6. Verwendung einer Gelkomposition enthaltend Agarose,
üblichen Zusatz- und Hilfsstoffen und als weitere
Komponente zwischen 20 und 80% (g/v) eines oder
mehreren Polyole zur Herstellung von
gewebegestützten Elektrophoresegelen.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19893935020 DE3935020A1 (de) | 1989-10-20 | 1989-10-20 | Verbesserte elektrophoresegele aus agarose |
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19893935020 DE3935020A1 (de) | 1989-10-20 | 1989-10-20 | Verbesserte elektrophoresegele aus agarose |
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| DE3935020A1 true DE3935020A1 (de) | 1991-04-25 |
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| DE19893935020 Withdrawn DE3935020A1 (de) | 1989-10-20 | 1989-10-20 | Verbesserte elektrophoresegele aus agarose |
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| FR2794758A1 (fr) * | 1999-06-11 | 2000-12-15 | Roussy Inst Gustave | Gels de polyacrylamide contenant en outre un polymere hydrophile |
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|---|---|---|---|---|
| FR2679033B1 (fr) * | 1991-07-09 | 1993-11-05 | Bertin Et Cie | Procede et dispositif de fabrication d'une plaque de gel a membrane microporeuse destinee a la separation et au transfert de macromolecules par electrophorese, et cassette de gel ainsi obtenue. |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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