DE4230403A1 - Desaktivierung der inneren Oberfläche von Kapillaren - Google Patents
Desaktivierung der inneren Oberfläche von KapillarenInfo
- Publication number
- DE4230403A1 DE4230403A1 DE4230403A DE4230403A DE4230403A1 DE 4230403 A1 DE4230403 A1 DE 4230403A1 DE 4230403 A DE4230403 A DE 4230403A DE 4230403 A DE4230403 A DE 4230403A DE 4230403 A1 DE4230403 A1 DE 4230403A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- capillaries
- capillary
- water
- proteins
- separation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 title abstract description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 49
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 16
- 238000001818 capillary gel electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000005515 capillary zone electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 229920006112 polar polymer Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 229920003176 water-insoluble polymer Polymers 0.000 claims abstract description 3
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 30
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims description 29
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000005350 fused silica glass Substances 0.000 claims description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 claims description 3
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 3
- VXEGSRKPIUDPQT-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(4-methoxyphenyl)piperazin-1-yl]aniline Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1N1CCN(C=2C=CC(N)=CC=2)CC1 VXEGSRKPIUDPQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000005049 silicon tetrachloride Substances 0.000 claims description 2
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 claims description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 abstract description 14
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 abstract description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 5
- 235000019422 polyvinyl alcohol Nutrition 0.000 description 29
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 8
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 8
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 7
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 7
- 102100033468 Lysozyme C Human genes 0.000 description 6
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 6
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 6
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 6
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 6
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 6
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 6
- 108010038061 Chymotrypsinogen Proteins 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- BUJAGSGYPOAWEI-SECBINFHSA-N (2r)-2-amino-n-(2,6-dimethylphenyl)propanamide Chemical class C[C@@H](N)C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C BUJAGSGYPOAWEI-SECBINFHSA-N 0.000 description 4
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 4
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 4
- 102000008192 Lactoglobulins Human genes 0.000 description 4
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 108010027252 Trypsinogen Proteins 0.000 description 4
- 102000018690 Trypsinogen Human genes 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- GDSRMADSINPKSL-HSEONFRVSA-N gamma-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO GDSRMADSINPKSL-HSEONFRVSA-N 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 125000005372 silanol group Chemical group 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 101800000263 Acidic protein Proteins 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005370 electroosmosis Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000002444 silanisation Methods 0.000 description 3
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 2
- 241001212789 Dynamis Species 0.000 description 2
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 2
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 2
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 2
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000274 adsorptive effect Effects 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 2
- 238000005530 etching Methods 0.000 description 2
- 229940080345 gamma-cyclodextrin Drugs 0.000 description 2
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 235000021241 α-lactalbumin Nutrition 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- 229910002808 Si–O–Si Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003926 acrylamides Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 238000003965 capillary gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Chemical class 0.000 description 1
- 239000011557 critical solution Substances 0.000 description 1
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 229940037395 electrolytes Drugs 0.000 description 1
- ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N furosemide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC(C(O)=O)=C1NCC1=CC=CO1 ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000017525 heat dissipation Effects 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N methacrylamide Chemical class CC(=C)C(N)=O FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 238000010525 oxidative degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002432 poly(vinyl methyl ether) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 150000004756 silanes Chemical class 0.000 description 1
- SCPYDCQAZCOKTP-UHFFFAOYSA-N silanol Chemical compound [SiH3]O SCPYDCQAZCOKTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006884 silylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44704—Details; Accessories
- G01N27/44752—Controlling the zeta potential, e.g. by wall coatings
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D57/00—Separation, other than separation of solids, not fully covered by a single other group or subclass, e.g. B03C
- B01D57/02—Separation, other than separation of solids, not fully covered by a single other group or subclass, e.g. B03C by electrophoresis
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Environmental & Geological Engineering (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Description
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Desaktivierung
der inneren Oberfläche von Kapillaren für die Kapillarzonen
elektrophorese und Kapillargelelektrophorese, die so erhaltenen
Kapillaren und deren Verwendung für die Trennung von Oligo
nukleotiden, Peptiden und Proteinen.
In der CZE ("capillary zone electrophoresis")-Variante der
modernen Kapillarelektrophorese (CE), aber z. B. auch in der
Kapillargelelektrophorese (CGE), werden praktisch ausschließlich
Kapillaren aus "fused silica" (FS)-Material verwendet. Diese
werden ohne oder mit Vorbehandlung der inneren Oberfläche mit
Pufferlösungen gefüllt. Zwischen den Enden der Kapillare, die
zusammen mit den Elektroden in Puffergefäße eintauchen, wird ein
starkes elektrisches Feld (< 60 kV/m) angelegt. In den elektri
schen Feldern, wie sie sich in der Füllung der Kapillare aus
bilden, erfolgen elektrophoretische Trennungen, die auf der un
terschiedlichen Elektromobilität geladener Analytmoleküle be
ruhen. Kapillaren aus "fused silica" Material werden zunächst in
der CE praktisch ausschließlich verwendet, weil sie mechanisch
flexibel sind und in den erforderlichen engen Durchmessern
(< 100 µm) kommerziell verfügbar sind. Sie erlauben wegen der
geringen Wandstärke und der Art des Materials (Quarz) eine sehr
gute Abführung der Wärme, die im Puffer je nach dessen Ionen
stärke durch die fließenden Ströme gebildet wird.
Die aciden Oberflächeneigenschaften derartiger Kapillaren er
geben sich als Folge vorhandenen Silanolgruppen. Sie beein
flussen kapillarelektrophoretische Trennungen auf verschiedene
Weise so stark, daß ohne entsprechende Modifizierung dieser
Oberflächen gute und reproduzierbare Trennungen in der analy
tischen Praxis nicht erreicht werden können. Der pH-Wert des
Puffers beeinflußt dabei die Dissoziation der Silanolgruppen,
die je nach Herstellungsprozeß und auch Vorbehandlung (etwa
durch Ätzen) in unterschiedlicher Konzentration vorhanden sein
können.
Im Kontakt mit den Puffern werden die Oberflächen je nach Vor
behandlung verschieden stark negativ geladen und es bilden sich
nach den allgemein akzeptierten theoretischen Vorstellungen
durch Adsorption von Ionen aus dem Puffer ξ-Potentiale aus, die
unter dem Einfluß des elektrischen Feldes zu einem elektroosmo
tischen Fluß (EOF) des Puffers führen. Dieser EOF kann in der
gleichen Richtung wie die Elektromigration der geladenen Elek
trolyten aber auch entgegengesetzt wirksam werden. Durch Ver
änderung der Oberflächeneigenschaften kann der Transport der zu
trennenden geladenen Analytmoleküle durch die Kapillare be
schleunigt oder verlangsamt werden.
Die Oberflächen der Kapillaren verursachen aber sowohl wegen
ihrer Ladung als auch generell wegen ihrer adsorptiven Eigen
schaften störende intermolekulare Wechselwirkungen der Analyt
moleküle mit der Wand, die eine Veränderung der Migrationszeiten
und insbesondere durch Bandenverbreiterung oder -verzerrung aber
eine sehr starke und störende Verschlechterung der Trenneffi
zienz und damit der Auflösung zur Folge hat.
Anders als in der Flüssigchromatographie (LC) sind in der CE
derartige Wechselwirkungen für gute analytische Trennungen voll
kommen unerwünscht.
Die Trenneigenschaften von Kapillaren für die Elektrophorese
werden also durch den Zustand der inneren Oberflächen stark be
einflußt. Da es von analytischem Interesse ist, den EOF in
seiner Stärke oder auch sogar seiner Richtung zu verändern, sind
Verfahren der Veränderung der Oberflächen durch Adsorption oder
chemische Bindung von kleinen und großen (oligomeren oder auch
polymeren) Molekülen von großem praktischem Interesse. Dabei ist
es aber unbedingt erforderlich, daß durch die Modifizierung der
Oberflächen nicht deren Adsorptivität für die zu trennenden
Analytmoleküle so stark erhöht wird, daß gute, d. h. effiziente
Trennungen von hoher Auflösung unmöglich werden. Dies gilt ganz
besonders für die Trennung von Oligonukleotiden, Peptiden und
Proteinen, die je nach ihrer Struktur bzw. Konformation in
hydrophobe oder hydrophile intermolekulare Wechselwirkung mit
Oberflächen treten.
Im Stand der Technik sind verschiedene Verfahren zur Modifi
zierung von Oberflächen in der Kapillarelektrophorese und Ka
pillargelelektrophorese und deren Nachteile bekannt:
Veränderung des pH-Wertes und der Ionenstärke des Puffers und
damit der Ionisation der Silanolgruppen.
Auch die Ladung der sauren oder basischen Analyten und damit
deren Elektromobilität kann hiermit verändert werden. Im Hin
blick auf Proteintrennungen kann mit diesem Verfahren eine aus
reichende Oberflächendesaktivierung nur bei extremen pH-Werten
erzielt werden, bei denen viele Proteine jedoch nicht mehr
stabil sind. Der Einsatz hoher Ionenstärken im Puffer ist durch
die starke Wärmeentwicklung infolge erhöhten Stromflusses be
grenzt.
Zugabe von Modifizierungsmitteln in kleiner Konzentration zu den
Arbeitspuffern.
Diese werden von den Oberflächen adsorbiert und verändern deren
Eigenschaften bezüglich EOF und Analytadsorption. Die Adsorption
solcher Zusätze hängt stark von der Natur der Kapillaroberfläche
ab, die von meist unbekannten Fertigungsprozessen verschiedener
Hersteller und von der Vorgeschichte bzw. Vorbehandlung der
Kapillare beeinflußt wird.
Diese Art von Reaktionen hat eine zweifache Wirkung. Es wird ein
Teil der aciden Silanolgruppen von der Oberfläche entfernt und
bei geeigneter Substitution des Silanisierungsreagenzes die Mög
lichkeit geschaffen, an diese Ankergruppen kleinere oder größere
auch polymere Moleküle auf den inneren Oberflächen der Kapil
laren zu fixieren. Deren Wechselwirkung mit den Analytmolekülen
soll sehr klein oder gar nicht vorhanden sein. Es können Be
schichtungen mit hydrophoben oder hydrophilen und auch ionischen
Eigenschaften erzeugt werden. Beschichtungen der Oberflächen mit
Polymeren, die bei Füllung der Kapillare mit für die CE typi
schen Puffern stabil sind, können auch nur durch Adsorption
fixiert werden. Dies ist insbesondere möglich, wenn die Polymere
einerseits stark polar sind und andererseits in den wässerigen
Puffern mit unterschiedlichen pH-Werten sehr schwer oder un
löslich sind. Beschichtungen mit polaren oder unpolaren Poly
meren (z. B. Polyethylenglykolen), wie sie in der Kapillargas
chromatographie eingesetzt werden, erwiesen sich als nicht ge
eignet für Serienmessungen und für Trennungen von Proteinen bei
höheren pH-Werten. Eine besondere Schwierigkeit tritt auf, wenn
hydrophile, gegebenenfalls hydroxylische, auch größere Moleküle
an den Oberflächen fixiert werden sollen, weil diese ihrer Po
larität wegen in den wässerigen Puffern sehr gut löslich sind.
Deswegen wurde auf verschiedene Weise versucht, hydrophile Mo
leküle oder Molekülgruppen nach vorheriger Silanisierung mit
bifunktionellen Reagenzien chemisch an die Oberfläche zu binden.
(S. Hjerten; J. Chromatogr. 347 (1985) 191; G.M. Bruin, J.P.
Chang, R.H. Kuhlmann, K. Zegers, J.C. Kraak und H. Poppe; J.
Chromatogr. 471 (1989) 429 und K.A. Cobb, V. Dolnik und M.
Novotny; Anal. Chem. 62 (1990) 2478).
Die bekannten Verfahren der Silanolderivatisierung sind umständ
lich und zeitraubend. Sie sind bezüglich ihrer Reproduzierbar
keit abhängig vom jeweiligen Herstellungsprozeß und/oder von der
gewählten Vorbehandlung der Kapillaren z. B. durch Ätzen. Der
artige Modifizierungen der Oberflächen in CE-Kapillaren sind
bezüglich der Beeinflussung des EOF und der Unterdrückung der
Adsorption von Analyten über einen größeren pH Bereich nicht
stabil, weil die kovalente Bindung der modifizierenden Moleküle
über Si-O-Si-Bindungen insbesondere bei höheren pH-Werten an
gegriffen wird.
Für die Trennung von Proteinen sind mit alkylsubstituierten
Silanen silylierte Oberflächen zu hydrophob und führen zur Ad
sorption dieser Proteine und deren Denaturierung. Andere ein
fache Silylierungen auch mit Reagenzien, die polare Substi
tuenten enthalten, bewirken keine ausreichende Desaktivierung.
Insbesondere hydroxylisch modifizierte Oberflächen, wie sie z. B.
von J.K. Towns und F.E. Regnier; Anal. Chem. 63 (1991) 1126 in
einem aufwendigem mehrstufigen Verfahren durch Adsorption von
Detergenzien auf hydrophoben z .B. C18-silanisierten Oberflächen
hergestellt wurden, konnten jedoch für Proteintrennungen ange
wendet werden. Die so hergestellten Kapillaren waren geeignet,
effiziente Proteintrennungen auch bei höheren pH-Werten (bis
zu 7) durchzuführen. Andere Kapillaren (z. B. nach Poppe, loc.
cit.) lieferten schon bei pH-Werten von < 4 vermutlich wegen
Adsorption keine gute Auflösung der Proteine mehr.
Generell gilt: Ein wichtiges Kriterium für gute Kapillaren für
die Trennung verschiedenartiger basischer und saurer Proteine
ist der pH-Bereich, in dem die Proteine überhaupt eluiert werden
und in dem die Modifizierungen stabil sind.
Für die kovalente Bindung von Beschichtungen über Si-O-Si-Bin
dungen ist zu berücksichtigen, daß diese nicht über den gesamten
pH-Bereich stabil sind, insbesondere nicht bei pH < 7 . Bei
höheren pH-Werten wird aber das Silica-Gerüst, insbesondere wenn
die Oberfläche nicht gut abgedeckt oder abgeschirmt ist, eben
falls angegriffen.
Das von M.Gilges, H. Husmann, M. -H. Kleemiß, St.R. Motsch und G.
Schomburg; HRC 15 (1992) 452 beschriebene Verfahren der dynami
schen Oberflächenmodifizierung mit Polyvinylalkohol (PVA) als
Pufferzusatz in der CZE konnte für die Trennung von Proteinen
bzw. chiralen basischen kleineren Molekülen eingesetzt werden.
Die Proteintrennungen konnten in solchen Systemen nur bei pH-
Werten < 4 durchgeführt werden. In Serien von Trennungen mit PVA
als Pufferzusatz war es allerdings schon nach einer oder wenigen
Analysen erforderlich, die Füllung der Kapillare nach einem
Zwischenspülschritt mit reinem Wasser durch einen frischen
Puffer zu ersetzen.
Die Wasserlöslichkeit von Polyvinylalkoholen wird durch ther
mische Behandlung bei Temperaturen bis zu 180°C als Folge der
Ausbildung semikristalliner hochassoziierter Strukturen stark
verringert (Encyclopedia of Polymer Science and Engineering,
Vol. 17, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1989 und J.F. Kenney
und G.W. Willcockson; J. Polymer Sci. A-1, 4 (1966) 679).
In der JP-92-053191 wird ein Träger für die Elektrophorese zur
Trennung von Proteinen beschrieben. Der Träger umfaßt eine tem
peraturempfindliche Hochpolymerverbindung mit einer niedrigen
kritischen Lösungstemperatur, ausgewählt aus einem Poly-N-sub
stituierten Acrylamidderivat, einem Poly-N-substituierten Meth
acrylamidderivat oder einem Copolymeren davon, Polyvinylmethyl
ether und partiell oxidiertem Polyvinylalkohol.
Die Instabilität der Kapillaren, wie sie mit den meisten bisher
eingesetzten Verfahren mit Silanisierung hergestellt wurden,
verhindert jedoch die Durchführung von Serientrennungen mit re
produzierbarem Migrationsverhalten. Die Nachteile der dynami
schen Oberflächenmodifizierung bestehen darin, daß die Beschich
tung nach einer oder mehreren Trennungen erneuert werden muß.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, sta
bile Kapillaren herzustellen, die insbesondere für die Durch
führung von Serientrennungen mit reproduzierbarem Migrations
verhalten geeignet sind.
Die vorgenannte Aufgabe wird in einer ersten Ausführungsform der
vorliegenden Erfindung gelöst durch ein Verfahren zur Desakti
vierung der inneren Oberfläche von Kapillaren für die Kapillar
zonenelektrophorese und Kapillargelelektrophorese durch Belegung
der inneren Oberfläche mit zunächst wasserlöslichen, polaren
Polymeren, wobei man die Polymere anschließend thermisch unter
Ausbildung wasserunlöslicher Polymerer fixiert.
Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, daß
Kapillaroberflächen mit thermisch fixierten Polymeren belegt
werden können und mit solchen Kapillaren die oben beschriebenen
Nachteile des Standes der Technik vermieden werden.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, semi
kristalline hochassoziierte Strukturen der Polymeren auf der
Oberfläche auszubilden, so daß diese ihre ursprüngliche Wasser
löslichkeit verlieren. Daher ist auch im Verlauf von Serien
trennung keine Erneuerung der Oberflächenbeschichtung erforder
lich.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
werden Kapillaren aus amorph geschmolzenem Siliciumdioxid ein
gesetzt, die aus Kieselgel oder hydrolysiertem Siliciumtetra
chlorid erhalten werden. Diese werden üblicherweise auch als
"fused silica"-Materialien bezeichnet.
Besonders bevorzugtes wasserlösliches Polymer im Sinne der vor
liegenden Erfindung ist Polyvinylalkohol (PVA), das in verschie
denen Hydrolysegraden und Molekulargewichten im Handel erhält
lich ist. Bevorzugterweise wird Polyvinylalkohol in Form einer
wäßrigen Lösung eingesetzt, die 0,1 bis 20 Gew.-%, insbesonderen
0,5 bis 10 Gew.-% und bevorzugt 5 bis 8 Gew.-% enthält. Die ein
zusetzende Menge ist an sich unkritisch, solange die Gesamtmenge
an Polyvinylalkohol ausreichend ist, eine gleichmäßige, mög
lichst dichte Belegung der Oberfläche der Kapillare zu gewähr
leisten. Für die Herstellung von Kapillarsäulen möglichst
gleicher Trennleistung ist es selbstverständlich erforderlich,
die Mengen an Polyvinylalkohol jeweils gleich zu wählen.
Die wäßrige Lösung der Polymere wird im Sinne der vorliegenden
Erfindung zunächst in die Kapillare eingeführt. Es ist im Sinne
der vorliegenden Erfindung bevorzugt, die Kapillarsäule durch
Anwendung von Überdruck zu entleeren. Erst daran schließt sich
in der Regel die thermische Fixierung der Polymeren an.
Zur Erzielung der semikristallinen, hochassoziierten Strukturen
ist es erforderlich, die Kapillare auf eine erhöhte Temperatur
zu erhitzen. Bevorzugterweise liegt der Temperaturbereich ober
halb des Siedepunkts von Wasser unter den gewählten Druckbedin
gungen, wobei die Fixierung gegebenenfalls unter Einsatz eines
Inertgases, beispielsweise Stickstoff, durchgeführt wird.
Bevorzugterweise wird die thermische Fixierung der wasserlös
lichen Polymeren dadurch erreicht, daß man die Kapillare bei
Normaldruck oder leicht vermindertem Druck auf eine Temperatur
im Bereich von 100 bis 250°C, insbesondere 130 bis 180°C, im
Verlauf von 0,5 bis 24 Stunden, insbesondere 1 bis 12 Stunden,
erhitzt. Wird die Fixierungstemperatur zu hoch gewählt, so ist
ein thermischer Abbau der Polymeren (Polyvinylalkohol) zu be
fürchten. Wird dagegen die Temperatur zu niedrig gewählt, so
kann das Lösungsmittel Wasser nicht in ausreichender Menge ver
dampfen und die Ausbildung der semikristallinen, hochassoziier
ten Strukturen wird nicht erreicht. In gleicher Weise ist die
Dauer der thermischen Fixierung von Bedeutung. Während der
Fixierung ist es im Sinne der Erfindung bevorzugt, ein Inertgas,
beispielsweise Stickstoff oder Argon, durch die Kapillare durch
zuleiten, damit ein oxidativer Abbau der Polymeren verhindert
werden kann.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht
in den Kapillaren für Kapillarelektrophorese und Kapillargel
elektrophorese, die nach dem Verfahren wie oben definiert er
hältlich sind.
Die so hergestellten Kapillaren können für die verschiedensten
analytischen Zwecke eingesetzt werden. Besonders bevorzugt wer
den die Kapillaren zur Trennung von Oligonukleotiden, Peptiden
und Proteinen eingesetzt. So sind hier insbesondere schwierige
Trennprobleme mit Hilfe der erfindungsgemäßen Kapillaren ohne
weiteres lösbar. In besonderer Weise sind die erfindungsgemäßen
Kapillaren für wiederholte Trennungen einsetzbar, da hier eine
sehr hohe Reproduzierbarkeit erreicht wird.
Während ein großer Teil der üblichen, im Stand der Technik be
kannten Kapillaren nur bei extremen, d. h. stark sauren pH-Wert-
Bereichen einsetzbar ist, ist es mit Hilfe der vorliegenden Er
findung möglich, sogar wiederholte Trennungen von Proteinen im
pH-Wert-Bereich von 5,5 bis 7 mit einer großen Reproduzierbar
keit durchzuführen.
Die gemäß der Erfindung erhältlichen Kapillaren sind permanent
mit wasserunlöslichem PVA beschichtet und konnten ohne weitere
Konditionierung für analytische Trennungen eingesetzt werden.
Mit Kapillaren von einer effektiven Länge von beispielsweise
57 cm konnten Serien von Proteintrennungen auch bei mittleren
pH-Werten von 5-7 mit hoher Effizienz (bis zu 1 200 000 theo
retische Böden/Meter) und guter Reproduzierbarkeit der Migra
tionszeiten der benutzten Testproteine durchgeführt werden. Dem
Puffer wurde hierbei kein PVA zugesetzt.
Diese Kapillaren zeigen nicht die Nachteile von solchen, die
nach den bisher bekannten Verfahren der Modifizierung von FS-
Oberflächen hergestellt wurden:
- - Sie sind in wiederholten Trennungen einsetzbar.
- - Sie erlauben Proteintrennungen mit sehr hohen Effizienzen und ausgezeichneter Peaksymmetrie auch bei höheren pH-Werten.
- - Sie zeigen eine gute Stabilität bzw. Reproduzierbarkeit des Migrationsverhaltens.
- - Thermisch fixierte PVA-Beschichtungen erwiesen sich als stabil unter den Bedingungen der CE.
Als Ursache für die Stabilität der Kapillaren wird die starke
Adsorption des PVAs an den Oberflächen, starke Wechselwirkungen
zwischen den Polymerketten über Wasserstoffbrücken und eine hohe
chemische Stabilität des Polyvinylalkoholmoleküls angenommen.
Die Leistungsfähigkeit solcher permanent mit PVA-Beschichtungen
desaktivierten Kapillaren konnte auch am Beispiel der Trennung
chiraler Verbindungen demonstriert werden.
Zur Beschichtung einer handelsüblichen Kapillare wurde ein etwa
2,5 m langes Stück einer unbehandelten von 50 oder 75 µm i.D.
"fused silica" Kapillare (Hersteller: MicroQuartz, München) mit
etwa 5 Gew.-%iger wäßriger PVA-Lösung (PVA, MW 50 000, Hydro
lysegrad 99+ %, Aldrich, Steinheim, Deutschland) durch Anwendung
eines Druckes von etwa 1 MPa Stickstoff gespült. Dann wurde die
mit der PVA-Lösung gefüllte Kapillare unter dem geringen Druck
von 0,5 MPa langsam leer gedrückt. Danach wurde die Kapillare in
einem Ölbad bei einer Temperatur von 130 bis 180°C im Verlauf
von 5 Stunden mit einem geringen Stickstoffstrom durch die
Kapillare (0,1 MPa) thermisch behandelt.
In einer nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellten
Kapillare der effektiven Länge 57 cm, der Gesamtlänge 70 cm und
mit einem Durchmesser von 50 µm i.D. wurde eine Mischung aus
Cytochrom C, Lysozym, Trypsin, Trypsinogen und α-Chymotrypsino
gen (je 0,2 mg/ml in einer Pufferlösung enthaltend 50 mM Na-
Phosphat bei einem pH-Wert von 3,0 bzw. 3,5) bei einer Feld
stärke von 429 V/cm getrennt. Die Trennung erfolgte mit Puffer
von pH 3,0 (Fig. 1) und pH 3,5 (Fig. 2). Die aus den Halbwerts
breiten berechneten Effizienzen lagen zwischen 1 200 000 m-1 für
Lysozym bei pH 3,0 und 710 000 m-1 für α-Chymotrypsinogen.
Probe: 1 Cytochrom C, 2 Lysozym, 3 Trypsin, 4 Trypsinogen,
5 α-Chymotrypsinogen A; je 0,2 mg/ml
Trennbed.: 30 kV (429 V/cm) (A) 28 µA, (B) 29 µA; 20°C
Puffer: 50 mM Na-Phosphat; (A) pH 3,0, (B) pH 3,5
Aufgabe: (A) 10 kV, 4 s, (B) 10 kV, 5 s
Detektion: UV 214 nm
Trennbed.: 30 kV (429 V/cm) (A) 28 µA, (B) 29 µA; 20°C
Puffer: 50 mM Na-Phosphat; (A) pH 3,0, (B) pH 3,5
Aufgabe: (A) 10 kV, 4 s, (B) 10 kV, 5 s
Detektion: UV 214 nm
Analog Beispiel 1 wurde die Trennung von Lysozym, Cytochrom C,
Trypsin, Ribonuclease A, Trypsinogen und α-Chymotrypsinogen mit
einer gleichen Kapillare vorgenommen.
In Fig. 3 ist eine Trennung von Lysozym, Cytochrom C, Trypsin,
Ribonuclease A, Trypsinogen und α-Chymotrypsinogen (Konzentra
tionen von 0,15 bis 0,18 mg/ml in der oben genannten Puffer
lösung mit einem pH-Wert von 3,5) mit einer mit thermisch be
handeltem PVA beschichteten Kapillare bei pH 5,5 (50 mM Na-Phos
phat, 429 V/cm) gezeigt. Aufgrund der verringerten Mobilitäten
der Proteine bei diesem pH-Wert und des geringen elektroosmo
tischen Flusses sind die Migrationszeiten etwa auf das Doppelte
erhöht. Die Effizienzen liegen bei dieser Trennung zwischen
1 100 000 m-1 für Lysozym und 600 000 m-1 für α-Chymotrypsino
gen. Die bei pH 5,5 erhöhte Ladungsdichte auf der Oberfläche in
einer nicht mit PVA behandelten Kapillare würde zu starker Ad
sorption der Proteine führen. An der Symmetrie der Peaks ist
erkennbar, daß die Adsorptivität der Oberfläche einer nach dem
beanspruchten Verfahren hergestellten Kapillare stark verringert
ist.
Analog Beispiel 1 wurden saure Proteine, mit einer Kapillare wie
in Beispiel 1 beschrieben, getrennt. Der Fig. 4 sind die guten
Trennungen der sauren Proteine β-Lactoglobulin A und B und
α-Lactalbumin, gelöst in dem oben genannten Puffer, die nor
malerweise stark adsorbiert werden, bei pH 3 zu entnehmen.
Probe: 1 β-Lactoglobulin B, 2 β-Lactoglobulin A, 3 α-Lact
albumin, je 0,3 mg/ml,
Trennbed.: 30 kV (429 V/cm), 23µA; 20°C
Puffer: 50 mM Na-Phosphat; pH 3,0
Aufgabe: 10 kV, 5 s
Detektion: UV 214 nm
Trennbed.: 30 kV (429 V/cm), 23µA; 20°C
Puffer: 50 mM Na-Phosphat; pH 3,0
Aufgabe: 10 kV, 5 s
Detektion: UV 214 nm
Analog Beispiel 1 konnte mit entsprechenden Kapillaren die Effi
zienz der Säulen am Beispiel eines Tocainid-Derivats gezeigt
werden. Fig. 5 zeigt, daß auch kleine Analyten mit PVA-beschich
teten Kapillaren eine deutliche Verringerung der Oberflächen
adsorptivität im Vergleich zu unbehandelten Kapillaren zeigen.
Die sich daraus ergebende Erhöhung der Effizienz ist am Beispiel
eines Tocainid-Derivates gezeigt. Die Effizienz eines Peaks die
ses stark basischen Wirkstoffes konnte durch PVA-Beschichtung
von 86 000 auf 180 000 theoretische Böden pro Meter gesteigert
werden. Die Verminderung des elektroosmotischen Flusses bewirkt
auch eine längere Migrationszeit der Verbindung in der behandel
ten Kapillare.
Probe: 0,02 mg/ml in H2O
Kapillare: 43,2 cm effektive Länge, 56,7 cm Gesamtlänge; A: 50 µm i.D.; B: 50 µm i.D.
Coating: A: ohne; B: thermisch immobilisierter Polyvinyl alkohol, M.W. :50 000, 99% hydrolysiert, (Aldrich)
Spannung: 35 kV (617 V/cm); 27 µA
Puffer: 40 mM Na-Phosphat pH 3,0
Probenaufgabe: hydrodynamisch; ΔP: -85 mbar, 2 s
Temperatur: 20°C
Detektion: UV 210 nm
Kapillare: 43,2 cm effektive Länge, 56,7 cm Gesamtlänge; A: 50 µm i.D.; B: 50 µm i.D.
Coating: A: ohne; B: thermisch immobilisierter Polyvinyl alkohol, M.W. :50 000, 99% hydrolysiert, (Aldrich)
Spannung: 35 kV (617 V/cm); 27 µA
Puffer: 40 mM Na-Phosphat pH 3,0
Probenaufgabe: hydrodynamisch; ΔP: -85 mbar, 2 s
Temperatur: 20°C
Detektion: UV 210 nm
Analog Beispiel 4 wurden Tocainid-Derivate unter Zusatz von
γ-Cyclodextrin zum Puffer getrennt. Der Fig. 6 ist die Trennung
der chiralen Tocainide, die durch Zusatz von γ-Cyclodextrin zum
Puffer als chiraler Selektor in Enantiomere getrennt werden
konnten, zu entnehmen. Dies ist bei der hier gezeigten Verbin
dung mit ausreichender Auflösung nur in einer modifizierten
Kapillare möglich. Die PVA-Beschichtung führte durch Verrin
gerung adsorptiver Wechselwirkungen mit der Kapillaroberfläche
zu einer erhöhten Trenneffizienz. Daneben führt die Herabsetzung
des elektroosmotischen Flusses zu einer längeren Migrationszeit
des Enantiomerenpaares. Das Zusammenwirken beider Effekte be
wirkt eine Steigerung der Auflösung bis zur Basislinientrennung.
Probe: 0,02 mg/ml in H2O
Kapillare: 43,2 cm effektive Länge, 56,7 cm Gesamtlänge; A: 50 µm i.D.; B: 50 µm i.D.
Coating: A: ohne; B: thermisch immobilisierter Polyvinyl alkohol, M.W. :50 000, 99% hydrolysiert, (Aldrich)
Spannung: A: 35 kV; 49 µA; B: 35 kV; 27 µA
Puffer: 40 mM Na-Phosphat, pH 3,0, 50 mM γ-CD
Probenaufgabe: hydrodynamisch; ΔP: -85 mbar, 2 s
Temperatur: 20°C
Detektion: UV 210 nm
Kapillare: 43,2 cm effektive Länge, 56,7 cm Gesamtlänge; A: 50 µm i.D.; B: 50 µm i.D.
Coating: A: ohne; B: thermisch immobilisierter Polyvinyl alkohol, M.W. :50 000, 99% hydrolysiert, (Aldrich)
Spannung: A: 35 kV; 49 µA; B: 35 kV; 27 µA
Puffer: 40 mM Na-Phosphat, pH 3,0, 50 mM γ-CD
Probenaufgabe: hydrodynamisch; ΔP: -85 mbar, 2 s
Temperatur: 20°C
Detektion: UV 210 nm
Analog Beispiel 4 wurden 4 Tocainid-Enantiomerenpaare getrennt.
Der Fig. 7 ist die chirale Trennung der Enantiomerenpaare zu
entnehmen.
Unter den gleichen Bedingungen wäre in einer nicht mit PVA be
handelten Kapillare eine gute Trennung der vier Derivate nicht
möglich.
Probe: 0,02 mg/ml in H2O
Kapillare: 43,2 cm effektive Länge, 56,7 cm Gesamtlänge, 50 µm i.D.
Coating: thermisch immobilisierter Polyvinylalkohol, M.W. :50 000, 99% hydrolysiert, (Aldrich)
Spannung: 35 kV (617 V/cm); 27 µA
Puffer: 40 mM Na-Phosphat, pH 3,0, 50 mM γ-CD
Probenaufgabe: hydrodynamisch; ΔP: -85 mbar, 2 s
Temperatur: 20 °C
Detektion: UV 210 nm
Kapillare: 43,2 cm effektive Länge, 56,7 cm Gesamtlänge, 50 µm i.D.
Coating: thermisch immobilisierter Polyvinylalkohol, M.W. :50 000, 99% hydrolysiert, (Aldrich)
Spannung: 35 kV (617 V/cm); 27 µA
Puffer: 40 mM Na-Phosphat, pH 3,0, 50 mM γ-CD
Probenaufgabe: hydrodynamisch; ΔP: -85 mbar, 2 s
Temperatur: 20 °C
Detektion: UV 210 nm
Claims (11)
1. Verfahren zur Desaktivierung der inneren Oberfläche von
Kapillaren für die Kapillarzonenelektrophorese und Kapillargel
elektrophorese durch Belegung der inneren Oberfläche mit zu
nächst wasserlöslichen, polaren Polymeren, wobei man die Poly
mere anschließend thermisch unter Ausbildung wasserunlöslicher
Polymerer fixiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man
Kapillaren aus geschmolzenem Siliciumdioxid aus Kieselgel oder
hydrolysiertem Siliciumtetrachlorid (fused silica) einsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß man als wasserlösliche Polymere Polvinylalkohol einsetzt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man
Polyvinylalkohol in einer wäßrigen Lösung enthaltend 0,1 bis 20
Gew-%, insbesondere 0,5 bis 10 Gew.-% und bevorzugt 5 bis 8
Gew.-%, einsetzt.
5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet, daß man die Kapillaren vor der thermi
schen Fixierung des Polymeren durch Anwendung von Überdruck ent
leert.
6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet, daß die thermische Fixierung durch Er
hitzen der Kapillaren auf eine Temperatur oberhalb des Siede
punkts von Wasser unter den gewählten Druckbedingungen, gege
benenfalls unter Einsatz eines Inertgases durchgeführt wird.
7. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet, daß man die Kapillaren bei Normaldruck
oder leicht vermindertem Druck auf eine Temperatur im Bereich
von 100 bis 250°C, insbesondere 130 bis 180°C, im Verlauf von
0 bis 24 Stunden, insbesondere 1 bis 12 Stunden, erhitzt.
8. Kapillare für die Kapillarelektrophorese und Kapillargel
elektrophorese, erhältlich nach dem Verfahren wie in einem oder
mehreren der Ansprüche 1 bis 7 definiert.
9. Verwendung der Kapillaren wie in Anspruch 8 definiert, zur
Trennung von Oligonukleotiden, Peptiden und Proteinen.
10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man
die Kapillaren für Serientrennungen einsetzt.
11. Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet,
daß man Serientrennungen von Proteinen im pH-Wert-Bereich von 3
bis 7 durchführt.
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4230403A DE4230403A1 (de) | 1992-09-11 | 1992-09-11 | Desaktivierung der inneren Oberfläche von Kapillaren |
| CA002105821A CA2105821C (en) | 1992-09-11 | 1993-09-09 | Deactivation of the inner surfaces of capillaries |
| EP93114463A EP0587156B1 (de) | 1992-09-11 | 1993-09-09 | Desaktivierung der inneren Oberflächen von Kapillaren |
| AT93114463T ATE155704T1 (de) | 1992-09-11 | 1993-09-09 | Desaktivierung der inneren oberflächen von kapillaren |
| DE69312407T DE69312407T2 (de) | 1992-09-11 | 1993-09-09 | Desaktivierung der inneren Oberflächen von Kapillaren |
| JP22560893A JP3399593B2 (ja) | 1992-09-11 | 1993-09-10 | キャピラリーの内表面の不活性化方法 |
| US08/344,200 US5502169A (en) | 1992-09-11 | 1994-11-23 | Deactivation of the inner surfaces of capillaries |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4230403A DE4230403A1 (de) | 1992-09-11 | 1992-09-11 | Desaktivierung der inneren Oberfläche von Kapillaren |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE4230403A1 true DE4230403A1 (de) | 1994-03-17 |
Family
ID=6467731
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE4230403A Withdrawn DE4230403A1 (de) | 1992-09-11 | 1992-09-11 | Desaktivierung der inneren Oberfläche von Kapillaren |
| DE69312407T Expired - Fee Related DE69312407T2 (de) | 1992-09-11 | 1993-09-09 | Desaktivierung der inneren Oberflächen von Kapillaren |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE69312407T Expired - Fee Related DE69312407T2 (de) | 1992-09-11 | 1993-09-09 | Desaktivierung der inneren Oberflächen von Kapillaren |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5502169A (de) |
| EP (1) | EP0587156B1 (de) |
| JP (1) | JP3399593B2 (de) |
| AT (1) | ATE155704T1 (de) |
| CA (1) | CA2105821C (de) |
| DE (2) | DE4230403A1 (de) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19938002A1 (de) * | 1999-08-11 | 2001-02-15 | Studiengesellschaft Kohle Mbh | Beschichtung mit quervernetzten hydrophilen Polymeren |
| DE10042451A1 (de) * | 2000-08-29 | 2002-03-14 | Studiengesellschaft Kohle Mbh | High-Throughput Verfahren zur Bestimmung der Enantiomereneinheit von chiralen Verbindungen |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5605613A (en) * | 1994-01-25 | 1997-02-25 | Beckman Instruments, Inc. | Polyvinylalcohol coated capillary electrophoresis columns |
| DE69738029D1 (de) * | 1996-12-03 | 2007-09-27 | Eisai R&D Man Co Ltd | Kapillare mit beschichteter innenwand |
| US6224830B1 (en) * | 1998-01-30 | 2001-05-01 | The Governors Of The University Of Alberta | Absorbance cell for microfluid devices |
| SE0001790D0 (sv) * | 2000-05-12 | 2000-05-12 | Aamic Ab | Hydrophobic barrier |
| FR2811083B1 (fr) | 2000-06-30 | 2002-11-22 | Inst Curie | Milieu liquide non-thermosensible pour l'analyse d'especes au sein d'un canal |
| US8975328B2 (en) * | 2000-06-30 | 2015-03-10 | Institute Curie | Non-thermosensitive medium for analyzing species in a channel and for minimizing adsorption and/or electroosomosic phenomena |
| US7799195B2 (en) * | 2005-09-02 | 2010-09-21 | Vladislav Dolnik | Neutral polysaccharide wall coating for electrophoretic separations in capillaries and microchannels |
| US20070051629A1 (en) * | 2005-09-08 | 2007-03-08 | Vladislav Dolnik | Poly(amino saccharide) wall coating for electrophoretic separations in capillaries and microchannels |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4680201A (en) * | 1985-10-30 | 1987-07-14 | Stellan Hjerten | Coating for electrophoresis tube |
| EP0417925A2 (de) * | 1989-09-12 | 1991-03-20 | Northeastern University | Hochwirksame Mikrokapillargelelektrophorese |
| EP0429772A2 (de) * | 1989-12-01 | 1991-06-05 | Hewlett-Packard Company | Verfahren zur Herstellung einer Kapillare zur Elektrophorese mit Agarose |
| US5069766A (en) * | 1990-12-20 | 1991-12-03 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Suppression of electroendosmosis in capillary electrophoresis |
| DE4115291A1 (de) * | 1991-05-10 | 1992-11-12 | Volker Prof Dr Schurig | Herstellung und verwendung immobilisierter metallhaltiger chiraler polymerer |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE328715B (de) * | 1967-04-20 | 1970-09-21 | Incentive Res & Dev Ab | |
| US4865707A (en) * | 1986-10-21 | 1989-09-12 | Northeastern University | Capillary gel electrophoresis columns |
| US4997537A (en) * | 1986-10-21 | 1991-03-05 | Northeastern University | High performance microcapillary gel electrophoresis |
| EP0490406A3 (en) * | 1990-12-14 | 1992-08-05 | Hewlett-Packard Company | Capillary gel electrophoresis columns and methods of preparing the same |
| US5221447A (en) * | 1991-12-06 | 1993-06-22 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Hydrophilic polymer coating of high pH stability for silica surfaces for suppression of electroendomosis and solute adsorption |
-
1992
- 1992-09-11 DE DE4230403A patent/DE4230403A1/de not_active Withdrawn
-
1993
- 1993-09-09 DE DE69312407T patent/DE69312407T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-09-09 AT AT93114463T patent/ATE155704T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-09-09 EP EP93114463A patent/EP0587156B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-09-09 CA CA002105821A patent/CA2105821C/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-09-10 JP JP22560893A patent/JP3399593B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-11-23 US US08/344,200 patent/US5502169A/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4680201A (en) * | 1985-10-30 | 1987-07-14 | Stellan Hjerten | Coating for electrophoresis tube |
| EP0417925A2 (de) * | 1989-09-12 | 1991-03-20 | Northeastern University | Hochwirksame Mikrokapillargelelektrophorese |
| EP0429772A2 (de) * | 1989-12-01 | 1991-06-05 | Hewlett-Packard Company | Verfahren zur Herstellung einer Kapillare zur Elektrophorese mit Agarose |
| US5069766A (en) * | 1990-12-20 | 1991-12-03 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Suppression of electroendosmosis in capillary electrophoresis |
| DE4115291A1 (de) * | 1991-05-10 | 1992-11-12 | Volker Prof Dr Schurig | Herstellung und verwendung immobilisierter metallhaltiger chiraler polymerer |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19938002A1 (de) * | 1999-08-11 | 2001-02-15 | Studiengesellschaft Kohle Mbh | Beschichtung mit quervernetzten hydrophilen Polymeren |
| DE10042451A1 (de) * | 2000-08-29 | 2002-03-14 | Studiengesellschaft Kohle Mbh | High-Throughput Verfahren zur Bestimmung der Enantiomereneinheit von chiralen Verbindungen |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0587156A1 (de) | 1994-03-16 |
| JP3399593B2 (ja) | 2003-04-21 |
| CA2105821A1 (en) | 1994-03-12 |
| JPH06186202A (ja) | 1994-07-08 |
| DE69312407D1 (de) | 1997-08-28 |
| DE69312407T2 (de) | 1998-02-26 |
| US5502169A (en) | 1996-03-26 |
| EP0587156B1 (de) | 1997-07-23 |
| CA2105821C (en) | 1997-12-30 |
| ATE155704T1 (de) | 1997-08-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69633962T2 (de) | Verfahren zum Bilden einer kovalent gebundenen hydrophilen Schicht auf Basis von Polyvinyl-Alkohol für die Kapillarelektrophorese | |
| DE69508852T2 (de) | Beschichtete kapillarsäulen und elektroforetische trennungsmethoden zu deren gebrauch | |
| DE69225494T2 (de) | Hydrophile n-substitutierte polyacrylamid-gele und ihre verwendung in elektrokinetischen und chromatographischen methodologien | |
| EP1076239B1 (de) | Verfahren zur Beschichtung von Kapillaren mit quervernetzten hydrophilen Polymeren | |
| DE69120058T2 (de) | Verbesserte kapillarzonenelektrophorese und geräte zur durchführung des verfahrens | |
| DE69124897T2 (de) | Vorrichtung zur Gewinnung von durch Kapillarelektrophorese getrennten Proben auf einer Membran | |
| DE2560557C2 (de) | ||
| DE3007869C2 (de) | ||
| DE69104903T2 (de) | Medium für die Elektrophorese. | |
| DE2656162C3 (de) | Verfahren zur Erzeugung einer stabilen pH-Funktion auf einem Träger für die elektrophoretische Trennung | |
| DE69023204T2 (de) | Verfahren zur Herstellung einer Kapillare zur Elektrophorese mit Agarose. | |
| DE69603962T2 (de) | Verfahren und silikatzusammensetzung zur konditionierung von silicaoberflächen | |
| DE69312407T2 (de) | Desaktivierung der inneren Oberflächen von Kapillaren | |
| DE69113617T2 (de) | Unterdrückung der elektroendosmose bei der kapillarelektrophorese. | |
| DE1951222A1 (de) | Fuellmaterial fuer chromatographische Saeulen | |
| DE3407814A1 (de) | Phasentraeger fuer die verteilungschromatographie von makromolekuelen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung | |
| DE60025374T2 (de) | Dynamische beschichtung | |
| EP0339062B1 (de) | Polyestergewebe zur herstellung von elektrophoresegelen und elektrophoresegel | |
| DE69415339T2 (de) | Unterdrückung der elektroendosmose während der elektroforese in gellosen medien durch verwendung von geladenen polymeren | |
| DE2001126A1 (de) | Traeger- bzw. Adsorptionsmittel fuer die Chromatographie und Verfahren zu deren Herstellung | |
| DE3879216T2 (de) | Halogenierte oberflaeche mit reduzierter protein-wechselwirkung. | |
| DE69422489T2 (de) | Beschichtete kapillarsäulen und elektrophorese trennverfahren mit deren verwendung | |
| DE69522564T2 (de) | Alkalibeständiges proteinadsorbens | |
| DE2321784A1 (de) | Verfahren zur behandlung von polysaccharid-gelen zur verbesserung ihrer physikalisch-chemischen eigenschaften | |
| DE4135545C2 (de) | Kapillargele, die durch eine räumlich fortschreitende Polymerisation unter Verwendung eines wandernden Initiators gebildet werden |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| OM8 | Search report available as to paragraph 43 lit. 1 sentence 1 patent law | ||
| 8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |