DE2321784A1

DE2321784A1 - Verfahren zur behandlung von polysaccharid-gelen zur verbesserung ihrer physikalisch-chemischen eigenschaften

Info

Publication number: DE2321784A1
Application number: DE2321784A
Authority: DE
Inventors: Rene Tixier
Original assignee: SOGERAS
Current assignee: SOGERAS
Priority date: 1972-05-01
Filing date: 1973-04-30
Publication date: 1973-11-15
Also published as: GB1435508A; JPS5337417B2; US3956272A; FR2183009A1; JPS5176444A; DE2321784C2; FR2183009B1

Description

Patentanwälte

Dipl.-Ing. Leo Fleuchaus 9 q 9 a 7 ρ /

Dr.-Ing. Hans Leyh ^{C H}

A 12 637

SOGIETE GENERALE DE RECHERCHES ET D¹APPLICATIONS SCIENTIFIQUES "SOGERAS", 10, rue Clement Marot, Paris 8e, Frankreich

Verfahren zur Behandlung von Polysaccharid-Gelen zur Verbesserung ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von Polysaccharid-Gelen, wie sie in der Chromatographie und in der Elektrophorese verwendet werden, zur Verbesserung ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften.

Gelose (oder Agar-Agar) und Agarose (ein neutrales, aus Gelose isoliertes PoIysaccharid) werden häufig entweder in Form von Platten aus dem hydratisierten Gel in Immunodiffusions-, Elektro·

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phorese- und Immunoelektrophoreseverfahren oder in Form von Körnchen zur Abtrennung von natürlichen Substanzen durch Molekülausschlußchromatographie verwendet. In der granulären Form werden sie auch als Träger zum chemischen Fixieren von Enzymen (unlöslichen Enzymen), verschiedenen Substanzen (selektive Chromatographie) oder ionisierten Gruppen (Ionenaustauscherchromato·· graphie) verwendet.

Diese Gele müssen in ihren verschiedenen Anwendungsformen bei Temperaturen unterhalb 50 G und im hydratisierten Zustand verwendet werden, wodurch ihre Verwendbarkeit begrenzt und ihre Kommerzialisierung schwierig gemacht wird. Die Bildung eines Gels in Wasser geht nämlich im Prinzip auf die Anwesenheit von Wasserstoffbrücken zurück, welche die Polysaccharidketten zu einem dreidimensionalen Netzwerk miteinander verbinden. Diese Bindungen sind sehr schwach und infolgedessen durch physikalische oder chemische Agentien leicht aufspaltbar. Deshalb bildet Gelose oder Agarose bei extremen (sauren oder basischen) pH-Werten, bei einer Temperatur oberhalb etwa 50 C und in Gegenwart bestimmter chemischer Substanzen, wie Harnstoff, kein Gel. Diese natürliche Zerbrechlichkeit der Gele begrenzt ihre Verwendbarkeit sowohl in der Elektrophorese als auch in der Chromatographie und damit auch als Träger für die Enzyme.

In der Chromatographie können die Körnchen oder Perlen nicht durch Wärme sterilisiert werden, was einen schwerwiegenden Nachteil bei der Abtrennung von Viren oder biologischen Substanzen darstellt, die aseptisch gehandhabt werden müssen. Wenn die Körnchen als Träger für die Enzyme dienen, ist es außerdem nicht möglich, sie zu verwenden, wenn die Temperatur des Reaktionsmediums 40 C übersteigt.

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In der Elektrophorese werden Gelose- oder Agaroselösungen in geringen Konzentrationen (im allgemeinen unterhalb 2 %) verwendet, so daß die durch Abkühlen erhaltenen Gele weich und demzufolge sehr zerbrechlich (instabil) sind. Die Lösungen müssen deshalb auf Glasplatten gegossen werden und anschließend müssen bei der Handhabung der Gele und beim Konservieren der Elektrophoretogramme umfangreiche Vorsichtsmaßnahmen ergriffen werden. Letztere liefern nach dem Trocknen besonders bröckelige Filme.

Es wurde nun gefunden, daß es möglich ist, Gele dieses Typs herzustellen, die den Vorteil haben, daß sie gegen Agentien, welche die Wasserstoffbindungen schwächen, beständig sind, ohne daß sie dabei ihre physikalisch-chemischen Haupteigenschaften verlieren.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung dieser Gele, mit dessen Hilfe es möglich ist, dieses Ergebnis zu erzielen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man die labilen natürlichen Bindungen durch chemisch stabile Bindungen ersetzt, indem man durch Verwendung von 2,4,6-Trichlor-1,3,5-triazin eine Brückenbindung zwischen den linearen Polysaccharidketten hervorruft.

i3ei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verhalten sich die unlöslich gemachten Perlen nach der Behandlung in gleicher Weise wie die üblichen Perlen, welche die gleiche Konzentration an Agarose enthalten, d.h., daß insbesondere das Auflösungsvermögen gegenüber den untersuchten Substanzen unverändert bleibt. So können beispielsweise die mit erfindungsgemäß behandelten Perlen, die 2,4 und 6 % Agarose enthalten, erhaltenen

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Kurven der MolekülSelektivität auf die jeweiligen Kurven gelegt werden, die mit üblichen Perlen erhalten werden, welche jeweils die gleichen Mengenanteile an Agarose enthalten. Die Sterilisation bei 120 C über einen Zeitraum von 15 Minuten in einem Autoklaven führt zu keiner Veränderung der chromatographischen Eigenschaften der so behandelten Gele.

Die erfindungsgemäß behandelten Gelplatten behalten auch ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften bei, auf Grund deren sie in Elektrophorese-, Immunodiffusions- und Immunoelektrophoreseverfahren verwendet werden, darüber hinaus weisen sie aber nach der Behandlung neue physikalische Eigenschaften auf: sie sind gleichzeitig weich und beständig und können deshalb ohne Verwendung eines starren Trägers leicht gehandhabt werdenj sie können bei 120 C in einem Autoklaven sterilisiert werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Beispiel 1

200 ml eines Gels mit 2 % Agarose oder Gelose wurden in einer Lösung von 5 g Trichlortriazin in einem Gemisch aus 75 ml Aceton und 25 ml Wasser, das vorher auf 50 C erwärmt worden war, suspendiert. Anschließend wurde 90 Minuten lang gerührt, dann wurde mit In NaOH die während der Umsetzung gebildete Chlorwasserstoffsäure neutralisiert. Danach wurde das Gel mit entsalztem Wasser gewaschen, um das Aceton und die Nebenprodukte der Umsetzung sowie den Überschuß von Trichlortriazin zu entfernen.

Das Gel wurde erneut in 100 ml In NaOH suspendiert. Nach der Zuga.be von 0,500 g Natriumborhydrid wurde die Suspension eine

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Stunde lang bei einer Temperatur in der Nähe von 90 C gehalten. Das so behandelte Gel wurde mit warmem Wasser gewaschen, dann in kaltem Wasser wieder suspendiert, bis zu einem pH-Wert von 4 mit In Essigsäure versetzt, 15 Minuten lang gerührt, dann erneut mit entsalztem Wasser gewaschen und schließlich unter Vakuum abgesaugt. Die Mengen an verwendetem Trichlortriazin betrugen 8 g auf 200 ml eines 4%igen Gels und 12 g auf die gleiche Menge eines 6%igen Gels.

Die nach diesem Verfahren erhaltenen Gele verhielten sich ebenso wie die gewöhnlichen Gele mit der gleichen Konzentration an Agarose oder Gelose. Dies geht aus Ausschlußchromatographie-Vergleichsversuchen hervor, die mit einem 4%igen Agarose-Gel in Form von Perlen mit einem Durchmesser von 100 bis 160 mu vor und nach der Behandlung mit Trichlortriazin sowie nach 30 minütiger Sterilisation bei 120 G durchgeführt wurden. Durch mit dem Gel gefüllte Säulen, die einen Durchmesser von 20 mm und eine Höhe von 400 mm aufwiesen, ließ man eine Lösung von Blue-Dextran-2000 in dem Puffer tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan · HCl (0,5 m bei pH 7,4) laufen. Die aufgezeichneten Elutionskurven waren für die drei verschiedenen Gelformen identisch, was anzeigt, daß das Auflösungsvermögen des Gels mit 4% Agarose weder durch die Behandlung mit Trichlortriazin noch anschliessend durch die Sterilisierung des behandelten Gels (vergleiche die Kurven a, b und c der beiliegenden Fig. 1) verändert wurde.

Beispiel 2

Es wurden 200 ml eines Gels mit 2 % Agarose oder Gelose in 100 ml entsalztem Wasser suspendiert. Dann wurden 6 g Trichlortriazin in 100 ml Dioxan gelöst und diese Lösung wurde langsam unter Rühren bei Umgebungstemperatur in die Gelsuspension ge-

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gössen. Nach etwa 10-minütigem Rühren wurde die Suspension mit In NaOH neutralisiert. Das Rühren und Neutralisieren wurde fortgesetzt, bis der pH-Wert sich bei etwa 7 stabilisierte.

Es wurde eine Stunde lang auf 60 bis 65 C erwärmt, wobei die sich bei der Umsetzung von Trichlortriazin mit Agarose bildende Säure neutralisiert wurde. Man ließ abkühlen und das Gel wurde bis zur Eliminierung der Chloride gewaschen. Nach dem erneuten Suspendieren in 100 ml In NaOH wurde das Gel nach dem in Beispiel 1 angegebenen Verfahren mit Natriumborhydrid behandelt. Auf 200 ml 4%iges Gel mußten 8 g Trichlortriazin verwendet werden, während auf 200 ml 6%iges Gel 12 g Trichlortriazin verwendet werden mußten.

Die mit Blue-Dextran 2000 erhaltenen Elutionskurven zeigen, daß die 4%igen Agarose-Perlen nach der Behandlung in dem Dioxanmilieu und nach der Sterilisation das gleiche Auflösungsvermögen aufwiesen wie die nicht-behandelten Perlen.

Beispiel 3

200 ml eines Gels mit 2% Agarose oder Gelose wurden in 1000 ml entsalztem Wasser suspendiert. Außerdem wurden 6 g Trichlortriazin in 150 ml Aceton gelöst und diese Lösung wurde zu der Gelsuspension zugegeben. Die Mischung wurde langsam auf eine Temperatur in der Nähe von 60 C gebracht und dann wurden 90 ml In NaOH und 1 g Natriumborhydrid zugegeben. Das Rühren wurde 1 Stunde lang bei 60°G fortgesetzt. Nach dem Abkühlen wurde das Gel bis zur Eliminierung der Chloride gewaschen und dann unter Vakuum abgesaugt. Die verwendeten Mengen an Trichlortriazin betrugen 8 g auf 200 ml des 4%igen Gels und 12 g auf die gleiche Menge des 6%igen Gels,

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Beispiel 4

150 mg Trichlortriazin wurden in 2,5 ml Aceton gelöst. Außerdem wurde eine l,5%ige Lösung (100 ml) von Agarose oder Gelose in 0,1 m Trinatriumcitrat hergestellt. Die Trichlortriazinlösung wurde in die Agaroselösung (oder die Geloselösung), die vorher auf 50°C erwärmt \»7orden war, gegossen. Unter ständigem Rühren wurde die Temperatur auf 70 C gebracht, dann wurde eine 1 η KaOH-Lösung (25 ml), die vorher auf 70 G erwärmt worden war, zugegeben. Die Mischung wurde zur Herstellung einer Gelschicht einer Dicke von 2 mm in Kunststoffkaäen (4 8,2 mm » 13,5 mm große Kasten für 100 ml Gel) gegossen. Die Polymerisation war bei Umgebungstemperatur nach etwa 15 Stunden beendet. Die Platten wurden anschließend mit warmem Wasser (von etwa 70 G) bis zur Neutralität gewaschen.

Die Fig. X_der beiliegenden Zeichnung zeigt 3 Elutionskurven, die unter Verwendung von Blue Dextran-2000 durch Gelfiltration über ein polymerisiertes, 4%iges Agarosegel

a) vor der Polymerisation (durchgezogene Kurve)

b) nach der Polymerisation (gestrichelte Kurve) bzw.

c) nach der Sterilisation (strichpunktierte Kurve)

erhalten wurden. Die Verhältnisse der SlutionsVolumina (in ml) des zweiten Maximums (v₂) zum ersten Maximum (v,) der jeweiligen Kurven betrugen:

a) v₂/_Vl =1,83

b) V₂/v, = 1,84 bzw.

c) V₂Zv₁ = 1,82.

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Claims

Patentansprüche

XL/ Verfahren zur Behandlung von Polysaccharid-Gelen zur Verbesserung ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften, dadurch gekennzeichnet, daß man unter Verwendung von 2,4,6-Trichlor-l,3,5-triazin zwischen den linearen Polysaccharid-Ketten Brücken bildet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Polysaccharid-Gele in Form von Perlen, die für chromatographische Verfahren bestimmt sind, verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Polysaccharid-Gele in Form von Platten, die für Elektrophorese-, Immunodiffusions- und Immunoelektrophorese-Verfahren bestimmt sind, verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Polysaecharid-Gele in Form von Körnchen, die als Träger beim chemischen Fixieren von Enzymen oder analogen Substanzen dienen sollen, verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man es zum Fixieren von verschiedenen Substanzen zur Abtrennung von natürlichen Substanzen durch chromatographische Affinität anwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 1,. dadurch gekennzeichnet, daß man es zum Fixieren von ionisierten Gruppen für die Verwendung in der Ionenaustauscherchromatographie anwendet.

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7» Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daJ3 man als Gel ein Agarosegel verx^endet.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Gel ein Gelosegel verwendet.

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