DE3032071C2 - Verfahren zur Fixierung von Schichten aus wässrigen Agar- und Agarose-Gelen auf Kunststoff-Folien - Google Patents

Description

Agarose ist ein aus verschiedenen Algen gewonnenes neutrales Polymer, welches die Eigenschaft hat, in Konzentrationen ab 0,2% aus einer warmen wäßrigen Lösung von etwa 40—50⁰C bei Abkühlen auf Zimmertemperatur zu einem kräftigen, transparenten Gel zu erstarren. Ähnliches gilt für Agar-Agar selbst, aus welchem Agarose durch Reinigung gewonnen wird. Diese Gele werden in biologischen Diffusionsverfahren für die sogenannte Immunpräzipitation verwendet, d. h. zwei Eiweißkörper (ein Antigen und ein Antikörper) diffundieren aufeinander zu, an der Berührungslinie bildet sich ein unlösliches Präzipitat, welches in der Agarose als eine — entweder mit dem freien Auge erkennbare oder durch Farbstoffe markierbare — Zone erscheint und klinisch-diagnostische Rückschlüsse zuläßt Auch wird Agarose für die Elektrophorese von Gemischen in wäßriger Lösung befindlicher Makromoleküle verwendet, also für ein Verfahren, bei welchem diese Makromoleküle aufgrund verschiedenen Beweglichkeitsverhaltens im elektrischen Gleichspannungsfeld getrennt werden, welches auf dem Gebiet der Biochemie und der medizinischen Diagnostik eine große Bedeutung erlangt hat

Im allgemeinen werden Immundiffusionsverfahren und elektrophoretische Trennung mit Hilfe von Agarose in der Weise ausgeführt, daß man Glasplatten mit der warmen Lösung von Agarose beschichtet, welche beim Erkalten dann eine 1-2 mm dicke Gelschicht bildet Auf diese Gelschicht werden die Proteine aufgetragen, welche in die Agarose einsickern und beim Anlegen einer Gleichspannung aufgrund ihrer elektrischen Ladung verschieden schnell freigetragen und somit getrennt werden. Bei Diffusionsverfahren werden in die Gelschicht zwei Löscher in geringem Abstand voneinander gestanzt. In diese schalenförmi-

Haftvermittler

HHH

— C —C —C-

H R

CO
\

C —
CO

Agarose

OH OH OH OH
-C —C —C —C —
HHHH

gen Vertiefungen werden die Lösungen eingetropft, welche nunmehr in der Agaroseschicht aufeinander zu wandern und an der Berührungsstelle die sogenannten Präzipitationslinien bilden.

Für Nachweis und Dokumentation ist es erforderlich, diese Agaroseplatten mit verschiedenen Reagenzienlösungen zu behandeln und schließlich aufzubewahren. Das gelingt bei Glas nicht unschwer dadurch, daß man es zuerst mit einer verdünnten Agaroselösung abreibt und diese auf dem Glas gründlich eintrocknen läßt Auf eine nicht geklärte Weise verankert sich die Agarose an der Glasoberfläche, und da es sich um sehr große Fadenmoleküle handelt, verschlingen diese sich mit weiteren nunmehr aufgegebenen Agarosemolekülen, so daß die Ablösung nur schwer erfolgt.

Anders liegt das Problem bei Kunststoff-Folien, welche in vieler Beziehung den Glasplatten vorzuziehen sind. Hier ist es nur äußerst schwierig, ein befriedigendes Haften von Agarose zu erzielen, insbesondere wenn man die Schichten länger wässert oder durch Trocknen auf der Folie permanent festhalten will.

Es wurde nun gefunden, daß Agar und Agarose dann auf der glatten Kunststoff-Folie zum Haften zu bringen sind, wenn man diese zuvor mit einem lackartigen Haftvermittler versieht, welcher in der Lage ist, mit der Agarose durch Bildung von Estergruppen zu reagieren und sie dadurch auf der Folie festzuhalten. Die so fixierten Agarosemoleküle sind ihrerseits in der Lage, weitere als wäßriges Gel aufgebrachte Agarosemoleküle festzuhalten.

Der Haftvermittler ist ein Kopolymer von Maleinsäureanhydrid mit Vinylverbindungen vom Typ CH₂=CH-R. Das Reaktionsschema ist in folgender Skizze wiedergegeben:

HHHH

I I I I —c—c—c—c—

I I I I

H R CO CO
OH

OH OH OH O

—C—C—C—C—

HHHH

Im vorliegenden Fall ist R = O - CO - CH₃. Es handelt sich dabei um ein im Handel befindliches Präparat Es wurden jedoch auch andere gemischte Polymaleinsäureanhydride mit Erfolg verwendet Diese Polyanhydride bilden einen lackartigen, stark anhaftenden und wasserunlöslichen Oberzug auf der Kunststoff-Folie und reagieren ihrerseits mit Hydroxilgruppen der Agarose, so daß ein permanenter Überzug von Agarose auf den Schichten bestehen bleibt Der in dieser Weise gebundene Rasen von Agarose hat die Eigenschaft, später aufgebrachte dickere Schichten von Agarose ebenfalls fest zu binden, die dann alle Behandlungen mit Färbe- und Fixierbädern, ebenso wie auch das Trocknen, auf der Folie ohne Ablösung überstehen.

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Beispiel 1

Überziehen einer Kunststoff-Folie
mit Haftvermittler

Man löst 2,5 g eines Vinylacetat-Maleinsäureanhydrid-Kopolymers (vgl. Formel) in 11 Aceton und läßt die Polyesterfolie mit einer Geschwindigkeit von 2—5 cm/s durch dieses Bad laufen. Wenn die Folie aus dem Bad senkrecht nach oben steigt, so fällt ein Film der Acetonlösung gleichmäßig an der Folie ab und hinterläßt einen Überzug des Kopolymers. Etwa 40 cm über dem Flüssigkeitsniveau ist die Folie bereits trocken. Wenn man sie daraufhin noch durch einen senkrecht stehenden Trockentunnel laufen läßt, welcher auf 110⁰C geheizt ist erhält man die Folie in einer glatten Form, an welcher äußerlich kein Belag zu erkennen ist, weil dieser nur ca. 0,1 μίτι dick ist

Beispiel 2

Anbringen des Agarose-Überzuges
auf der vorbehandelten Polyesterfolie

Eine Lösung von Agarose in Wasser 2 g/l, wird dadurch hergestellt, daß man die Agarose etwa 1 Stunde

35 lang bei Siedetemperatur mit destilliertem Wasser rührt, bis sich eine klare, homogene Lösung gebildet hat Dann wird auf 70⁰C abgekühlt und nunmehr bei dieser Temperatur gehalten. Zur besseren Benetzung wird pro Liter Lösung noch ein Tropfen eines nichtionischen Netzmittels zugegeben (beispielsweise Triton X-100). Die Folie wird mit der Geschwindigkeit von 2 cm/s durch das Bad gezogen. Über demselben befinden sich beidseitig auf der Folie anliegende Gummiwischer, die den Überschuß der Lösung abstreifen, sowie beidseitig zwei kräftige Heizventilatoren mit je 1000 Watt Heizleistung und schließlich ein senkrecht stehender Trockentunnel, welcher auf 110° C geheizt ist Die Heizleistung wird so eingestellt, daß ca. 1,5 m über dem Spiegel der Agaroselösung keine Flüssigkeitsspuren mehr zu sehen sind. Die Temperatur an der Folie darf nicht über 100⁰C steigen. Das Verfahren gelingt nur, wenn die Folie zunächst mit dem Polyanhydrid gemäß Beispiel 1 vorbehandelt ist Im anderen Fall bilden sich Flüssigkeitsinseln, und der Überzug wird ganz ungleichmäßig.

Beispiel 3
Aufbringen von dickeren Agaroseschichten

Die nach Beispiel 1 und 2 behandelten Folien können nunmehr zur Herstellung von gebrauchsfertigen Agarose-Schichten weiter verarbeitet werden. In diesem Fall kann eine heiße Agaroselösung direkt auf die präparierte Folie aufgetropft werden, welche zu diesem Zweck auf eine Glasplatte aufgerollt wird, damit sie vollkommen horizontal liegt

Das Flüssigkeitsvolumen wird so bemessen, daß eine ca. 1 mm dicke gleichmäßige Flüssigkeitsschicht auf der ganzen Folie entsteht Bei Vorhandensein der Vorbeschichtung ist das ganz leicht weil die Folie nunmehr gut vom Wasser benetzt wird. Nach wenigen Minuten ist bei Zimmertemperatur die Agarose so weit erstarrt daß der Film völlig dimensionsstabil ist.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Fixierung von wäßrigen Agar- und Agarose-Gelen auf Kunststoff-Folien, dadurch gekennzeichnet, daß man die Folien zunächst zur Bildung eines gleichmäßigen haftvermittelnden Filmes in die verdünnte Acetonlösung eines reaktionsfähigen Maleinsäureanhydrid enthaltenden Polymers taucht, zum Aufbringen einer dünnen Agaroseschicht die Folien durch ein aus einer heißen wäßrigen Lösung bestehendes Bad

zieht, welchem eine geringe Menge eines neutralen

Net?mittels beigemischt ist,

die so behandelten Folien nach Verlassen des Bades durch Abstreifen von überschüssiger Agaroselösung befreit und

anschließend mit Hilfe eines kräftigen erhitzten Luftstromes vollkommen trocknet

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung dickerer permanent haftender Agaroseschichten eine wärme Agaroselösung aufbringt und diese offen oder unter einer Deckfolie wieder erkalten läßt.