DE3736205C2

DE3736205C2 -

Info

Publication number: DE3736205C2
Application number: DE3736205A
Authority: DE
Inventors: Christoph Dipl.-Chem. 8012 Ottobrunn De Eckerskorn; Friedrich Dr. 8027 Neuried De Lottspeich
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1987-10-26
Filing date: 1987-10-26
Publication date: 1989-09-07
Also published as: DE3736205A1

Description

Proteinsequenz- und Aminosäureanalyse spielen in der Proteinstrukturanalytik sowie in der Molekularbiologie eine wichtige Rolle. Aus den Daten der Sequenzanalyse und Aminosäurezusammensetzung lassen sich Primärstrukturen ermitteln, Proteine identifizieren und charakterisieren, posttranslationale Modifikationen erkennen, Epitope monoklonaler Antikörper aufklären und Proteinhomologien anhand von Peptidkarten ("peptide maps") herausfinden.

Zu Proteinteilsequenzen lassen sich Oligonukleotidsonden herstellen, mit deren Hilfe die entsprechende DNA in einer Genbank gefunden werden kann. Andererseits bestätigt die Proteinsequenzierung die von einer Nukleotidsequenz abgeleitete Primärstruktur eines Proteins.

Die SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate polyacrylamid gel electrophoresis) ist eine der wichtigsten Methoden der Biochemie, um die Zusammensetzung komplexer Proteingemische sichtbar zu machen. Dabei werden die Proteine als einheitlich negativ geladene Protein/SDS-Komplexe in Abhängigkeit ihres Molekulargewichtes in der Polyacrylamidmatrix durch das elektrische Feld aufgetrennt. Anschließend werden die aufgetrennten Proteinbanden in der Matrix fixiert und mit spezifischen Proteinfarbstoffen (z B. Coomassie Blue) angefärbt.

Das "protein-blotting" ist eine Erweiterung der PAGE-Technik, um bestimmte, einzelne Proteine in einem komplexen Proteingemisch zu identifizieren. Nach der Elektrophorese (meistens SDS-PAGE) werden die aufgetrennten Proteine auf eine immobilisierende Membran (Nitrozellulose, Nylon, Diazopapiere etc.) unter Bedingungen transferiert ("geblottet"), die das elektrophoretische Proteinmuster erhalten.

Auf diesen Membranen können über spezifische Wechselwirkungen einzelne Proteine selektiv erkannt werden, z. B. mit Hilfe von radioaktiv markierten Antikörpern zur Identifizierung der entsprechenden Antigene, oder mit Lektinen zur Bestimmung von Glykoproteinen.

Oftmals sind wichtige Proteine nur in geringsten Mengen vorhanden und isolierbar oder infolge ihrer hydrophoben Eigenschaften proteinchemisch nur unter großem Aufwand zu untersuchen. Zur Zeit ist es möglich, mit dem Gasphasensequenzanalysator Proteinmengen <10 pmol (0,5-1 µg für ein 50 kDa Protein) routinemäßig zu sequenzieren. In diesem Mengenbereich läßt sich nahezu jedes Protein mit modernen gelelektrophoretischen Methoden hochrein auftrennen und anschließend aus der Gelmatrix durch Elektroblotten auf eine Membran übertragen.

Einen Überblick über das "protein-blotting", die verschiedenen Membranen und deren Verwendung geben J. Gershoni und G. Palade in ihrem Übersichtsartikel (Protein Blotting: Pinciples and Applications, Analytical Biochemistry, Bd. 131 [1983], S. 1-5).

Mit der Entwicklung modifizierter Glasfasermembranen stehen nun Membranen zur Verfügung, auf denen die Proteine nach dem Blotten auch proteinchemisch analysiert werden können (Proteinsequenzanalyse, Aminosäureanalyse).

Die Herstellung von modifizierten Glasfasermembranen wird von J. Vandekerckhove u. Mitarb. (Eur. J. Biochem., Bd. 152 [1985], S. 9-19) beschrieben. Sie erfolgt nach folgendem Reaktionsschema:

Polybren (1,5-dimethyl-1,5-diazaundecamethylen):

An Stelle von Polybren wird auch Poly(4-vinyl-N-methyl-pyridiniumjodid eingesetzt (G. Bauw et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84 [1987], S. 4806-4810).

Ein weiteres Verfahren zur Herstellung modifizierter Glasfasermembranen beschreiben R. Aebersold u. Mitarb. (J. Biol. Chem., Bd. 261 [1986], S. 7990-7997). Es besteht aus folgenden Stufen:

- Ätzung der Glasfaseroberfläche:
Die Glasfasermembranen werden 1 Stunde bei Raumtemperatur in 100%iger Trifluoressigsäure (TFA) geschwenkt. Anschließend wird die TFA im Exsikkator unter Vakuum über KOH entfernt.
- Glasfasermembran (geätzt) + monomeres Silylierungsreagenz modifizierte Membran.
- Die modifizierte Membran wird 10mal 5 min mit Aceton gewaschen.
- Härtung der Siloxanbindung durch Erhitzen der Membran auf 110°C.

Als Silylierungsreagenzien werden

(C₂H₅O)₃-Si-CH₂-CH₂-CH₂-NH₂ und (CH₃O)₃SiCH₂-CH₂-CH₂-N⁺(CH₃)₃

verwendet.

Die Autoren beschreiben eine Verdoppelung der Ausbeute an Aminopropylgruppen auf der Glasfaseroberfläche, wenn diese vorher mit TFA geätzt wird.

Die bisher bekannten modifizierten Glasfasermembranen weisen jedoch noch Mängel auf. Die mit Polybren beschichtete Glasfasermembran besitzt eine unzureichende Proteinbindungskapazität, und infolge ihrer positiven Ladung ist ihr Färbungsverhalten unzureichend. Es müssen Fluoreszenzfarbstoffe verwendet werden, die die N-Termini der Proteine teilweise blockieren können. Die von Aebersold und Mitarb. beschriebene beschichtete Membran hat den Nachteil einer unzureichenden Reproduzierbarkeit der Oberflächenmodifikation und läßt sich ebenfalls nicht in befriedigender Weise und nur mit Fluoreszenzfarbstoffen färben. Auch diese Membran besitzt nur eine geringe Proteinbindungskapazität, und das Verfahren zu ihrer Herstellung ist verhältnismäßig aufwendig.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine modifizierte Glasfasermembran bereitzustellen, auf der es möglich ist, Proteine aus verschiedenen Gelmatrizes durch Elektroblotten in hohen Ausbeuten zu immobilisieren und anschließend proteinchemisch zu analysieren. Die Membran soll einfach und reproduzierbar herzustellen sein und eine im Vergleich zu den bekannten modifizierten Glasfasermembranen höhere Proteinbindekapazität besitzen. Die Oberflächenmodifizierung soll während der Verwendung der Membran stabil bleiben und nicht mit den üblichen Protein-Detektionsverfahren interferieren.

Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist somit eine modifizierte Glasfasermembran, erhältlich durch

a) Behandlung einer Glasfasermembran mit einer Säure,
b) Umsetzung der mit der Säure behandelten Glasfasermembran mit einem Polysiloxan,
c) Trocknen der mit dem Polysiloxan umgesetzten Glasfasermembran.

Ein weiterer Gegenstand ist ein Verfahren zur Herstellung einer modifizierten Glasfasermembran, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

a) eine Glasfasermembran mit einer Säure behandelt,
b) die mit der Säure behandelte Glasfasermembran mit einem Polysiloxan umsetzt,
c) die mit dem Polysiloxan umgesetzte Glasfasermembran trocknet.

Gegenstand der Erfindung ist schließlich auch die Verwendung der modifizierten Glasfasermembran der Erfindung als Trägermaterial zur Immobilisierung von Proteinen, insbesondere zur proteinchemischen Analyse. Besondere Verwendungsmöglichkeiten sind Sequenzanalyse, Aminosäureanalyse, Entsalzung, Immobilisierung aus anderen Matrizes und als Träger für chemische und enzymatische Reaktionen an Proteinen und Peptiden.

Die modifizierte Glasfasermembran der Erfindung weist eine stabile Oberfläche auf. Sie eignet sich in besonders günstiger Weise für die elektrophoretische Übertragung von Proteinen aus Polyacrylamidgelen und zur anschließenden proteinchemischen Analyse. Die modifizierte Glasfasermembran der Erfindung kann in einfacher Weise durch chemische Umsetzung der Glasfaseroberfläche mit einem Polysiloxan, beispielsweise Polymethyl-3,3,3-trifluorpropylsiloxan hergestellt werden. Die modifizierte Glasfasermembran ist beim Immobilisierungsvorgang während der Aminosäure-Sequenzanalyse und gegen Hydrolyse beständig. Die siliconisierte Glasfasermembran besitzt eine hohe Proteinbindungskapazität, erlaubt die Anwendung der gängigen Anfärbeverfahren und übt keinen ungünstigen Einfluß auf die analytischen Verfahren der Proteinchemie aus, auch nicht, wenn diese im unteren Picomol-Bereich durchgeführt werden. Die durch Elektrophorese abgetrennten und auf der Glasfasermembran der Erfindung als Träger immobilisierten Protein-Proben zeigen keine nachweisbaren Verunreinigungen und gestatten die Ausnutzung der hohen Leistungsfähigkeit der verfügbaren proteinchemischen Verfahren.

Zur Herstellung der aktivierten Glasfasermembran muß die Glasfaseroberfläche für die folgende Umsetzung einer Ätzbehandlung unterzogen werden. Diese Oberflächenaktivierung wird durch Behandlung mit einer Säure erreicht. Beispiele für geeignete Säuren sind die starken Mineralsäuren, wie Salzsäure, Salpetersäure oder Schwefelsäure, sowie starke organische Säuren. Besonders geeignet für die Ätzbehandlung der Glasfasermembran ist Trifluoressigsäure (TFA).

Die Modifizierung der Glasfasermembran wird durch Behandlung mit einem Polysiloxan durchgeführt. Zu diesem Zweck eignen sich Polysiloxane der allgemeinen Formel I

in der die Reste R¹, die gleich oder verschieden sein können, C_1-30-Alkyl-, substituierte C_1-30-Alkyl-, C_6-10-Aryl- oder substituierte C_6-10-Arylreste bedeuten, die Reste R², die ebenfalls gleich oder verschieden sein können, C_1-4-Alkylreste, Hydroxylgruppen oder Halogenatome bedeuten, und n einen Wert von mindestens 2 hat. Vorzugsweise ist an jedes Si-Atom nur jeweils eine Hydroxylgruppe oder ein Halogenatom gebunden.

Die Substituenten der C_1-30-Alkylreste und C_6-10-Arylreste in der Bedeutung von R¹ können beispielsweise Halogenatome, insbesondere Fluoratome, C_1-18-Alkoxyreste, Substituenten mit positiver oder negativer Ladung, insbesondere quaternäre Ammonium-, Carboxyl- oder Sulfonsäuregruppen oder Reste sein, die zur Vernetzung mit Proteinen in der Lage sind, wie Isothiocyanatgruppen. Besonders bevorzugte Alkylreste in der Bedeutung von R¹ und R² sind Methylgruppen. In der Bedeutung von R¹ sind jedoch auch längerkettige Alkylreste bevorzugt, beispielsweise Alkylreste mit etwa 18 Kohlenstoffatomen. Bevorzugter Arylrest in der Bedeutung von R¹ ist die Phenylgruppe. Die Bedeutung von n in der Formel I ist nicht besonders kritisch, solange es sich um polymere Polysiloxane handelt. Bevorzugt sind Polysiloxane, in denen n einen Wert von 10 bis 1500 besitzt.

Spezielle Beispiele für geeignete Polysiloxane sind Polymerisate der Formeln

Bei Verwendung von Polysiloxanen, die keine hydrophilen Gruppen aufweisen, insbesondere keine Substituenten mit positiver oder negativer Ladung, werden modifizierte Glasfasermembranen erhalten, deren Oberfläche stabil hydrophob modifiziert ist.

Besonders gute Ergebnisse im Hinblick auf eine stabil modifizierte Glasfaseroberfläche werden erhalten, wenn die Behandlung mit der starken Säure und dem Polysiloxan in einer Stufe als Eintopf-Reaktion durchgeführt wird. Dabei erfolgt eine Bindung des Polysiloxans an die in situ aktivierte Oberfläche der Glasfasermembran. Bei der Durchführung als Eintopf-Verfahren wird das Polysiloxan als Lösung in der starken Säure mit einer Konzentration von 0,05 bis 10%, vorzugsweise 0,1 bis 5, insbesondere 0,1 bis 1%, eingesetzt.

Die Dauer der Behandlung der Glasfasermembran mit der Lösung des Polysiloxans in der Säure beträgt 1 bis 20, insbesondere 8 bis 15 Stunden. Vorzugsweise wird die Behandlung bei erhöhter Temperatur, beispielsweise bei der Rückflußtemperatur, der Lösung des Polysiloxans in der Säure durchgeführt.

Nach Beendigung der Behandlung mit dem Polysiloxan wird die an der Glasfasermembran anhaftende Säure entfernt. Dies kann günstigerweise durch Trocknen im Vakuum erfolgen. Anschließend wird überschüssiges, nicht gebundenes Polysiloxan entfernt, beispielsweise durch kurzes Waschen der Membran mit Aceton. Hierauf erfolgt eine Wärmebehandlung der mit dem Siloxan beladenen Glasfasermembran zur Festigung der Bindung des Polysiloxans an die Glasfaser. Diese Behandlung kann bei erhöhter Temperatur durchgeführt werden, beispielsweise bei einer Temperatur von 100 bis 200, vorzugsweise 130 bis 180°C. Die Dauer der Behandlung richtet sich nach der gewählten Temperatur; bei etwa 150°C ist eine Behandlung von etwa 1 Stunde ausreichend. Die modifizierte Membran kann nach dem Entfernen von überschüssigem Polysiloxan auch einfach bei Raumtemperatur belassen werden, wobei dann die Trocknung entsprechend längere Zeit, beispielsweise etwa 3 Tage, durchgeführt wird.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Glasfasermembran durch Behandlung mit einer etwa 0,2prozentigen Lösung von Polymethyl-3,3,3-trifluorpropylsiloxan in TFA hydrophobisiert. Dazu wird die Membran günstigerweise mehrere Stunden in der Lösung des Polymethyl-3,3,3-trifluorpropylsiloxans in TFA unter Rückfluß erhitzt.

Die Art der Bindung zwischen dem Polysiloxan und der Glasfaseroberfläche ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Im Hinblick auf den Reaktionsmechanismus wird angenommen, daß die verwendete starke Säure, insbesondere TFA, das Polysiloxan in Einheiten spaltet, die reaktive endständige Silanolgruppen aufweisen. Diese Polymerisate kondensieren dann mit ihren endständigen Silanolgruppen mit anderen Silanolgruppen, beispielsweise den auf der Oberfläche der Glasfaser vorhandenen, wobei wieder Siloxanbindungen ausgebildet werden. Diese Bindungen sind kinetisch stabil, da raumfüllende Seitengruppen eine erneute Spaltung verhindern. Dies trifft besonders bei Verwendung von Siloxanen mit Fluoropropylgruppen zu. Die Annahme einer kovalenten Bindung wird durch die Tatsache erhärtet, daß das Polysiloxan durch Behandlung mit Aceton teilweise von der Glasfaser wieder entfernt werden kann, wenn keine ausreichende Trocknung bzw. Wärmebehandlung der Oberfläche durchgeführt wird. Die Möglichkeit daß es sich bei der Oberflächenmodifizierung nach dem Verfahren der Erfindung um eine besonders stabile Art von Beschichtung ohne Ausbildung direkter kovalenter Bindungen handelt, kann nicht ausgeschlossen werden.

Die vorangehende oder gleichzeitige Behandlung der Glasfaser mit einer starken Säure, insbesondere TFA, ist für das Verfahren der Erfindung von besonderer Bedeutung. Die Behandlung der Glasfasermembran mit Polymethyl-3,3,3-trifluorpropylsiloxan ohne Säure, beispielsweise in Aceton, ergibt nur eine ungleichmäßig hydrophobe Oberflächenmodifizierung, die bereits durch kurzzeitiges Waschen mit Aceton wieder vollständig beseitigt werden kann.

Die modifizierten Glasfasermembranen der Erfindung weisen eine hydrophobe siloxanisierte Oberfläche auf, die während des Elektroblottens und auch beim Sequenzieren der übertragenen Proteine außergewöhnlich stabil ist. Diese Stabilität besteht auch bei der Durchführung einer sauren Hydrolyse sowie nach Behandlung mit den in der Proteinchemie üblicherweise verwendeten organischen Lösungsmitteln.

Mit den modifizierten Glasfasermembranen der Erfindung werden folgende Vorteile erreicht:

a) eine einfache und reproduzierbare Herstellung der modifizierten Glasfasermembran;
b) eine hervorragende Proteinbindungsfähigkeit während des Elektroblottens;
c) die Möglichkeit für einen empfindlichen Proteinnachweis mit den gängigen Proteinanfärbe- und immunochemischen Protokollen;
d) der Aminosäureabbau kann mit hohen Anfangs- und repetitiven Ausbeuten durchgeführt werden, wobei keine Schwierigkeiten mit bestimmten einzelnen Aminosäuren auftreten und keine zusätzlichen Peaks bei der Identifizierung der Phenylthiohydantoin-Aminosäuren beobachtet werden;
e) bei der Aminosäureanalyse ergibt sich ein besonders niedriges Maß an Kontaminierung.

Die Kombination all dieser Vorteile macht die modifizierte Membran der Erfindung besonders geeignet für die proteinchemische Charakterisierung von Proteinen und Peptiden, die durch SDS-Gelelektrophorese und Elektroblotten getrennt wurden. Die allgemeine Anwendbarkeit dieses Verfahrens mit Hilfe der modifizierten Membran der Erfindung wurde durch die Aufstellung von Sequenzdaten einer großen Zahl von Proben nachgewiesen, die eine Vielzahl unterschiedlicher Proteine repräsentieren.

Die modifizierte Membran der Erfindung kann auch zur Probenvorbereitung für die Aminosäureanalyse von Proteinen benutzt werden, die sonst schwer in reiner Form herzustellen sind, beispielsweise Membranproteine und Fragmente davon. Die Qualität der Ergebnisse der Aminosäureanalyse mit Hilfe der Membran der Erfindung erlaubt die Identifizierung von Proteinen mit Hilfe von Protein-Datenbanken.

Wegen der hohen Proteinbindungskapazität besteht eine weitere Anwendungsmöglichkeit der Membran der Erfindung in der Möglichkeit zur Konzentrierung und Entsalzung von Proteinen zur Aminosäuresequenz- oder Aminosäureanalyse durch Aufbringen der Proteine auf die Glasfasermembran und einfaches Auswaschen der Salze mit destilliertem Wasser. Transfer, Aminosäuresequenz- und Aminosäureanalyse von Proteinen von zweidimensionalen Gelen können mit Hilfe der Membran der Erfindung durchgeführt werden.

Das Beispiel erläutert die Erfindung.

Beispiel Herstellung einer modifizierten Glasfasermembran

Eine Glasfasermembran (bestehend aus Mikro-Glasfasern) wurde in Stücke mit einer Größe von 10×12 cm geschnitten, die in Schichten aufgerollt wurden. Dabei wurde darauf geachtet, ein scharfes Umbiegen der Membran zu vermeiden. Die aufgerollten Membranschichten wurden in ein Reaktionsgefäß eingebracht und 10 Stunden unter leichtem Rühren in einer Lösung von 0,2% Polymethyl-3,3,3-trifluorpropylsiloxan in reiner TFA unter Rückfluß erhitzt. Nach Beendigung der Umsetzung wurden die feuchten Membranstücke in einen Exsikkator eingebracht und das TFA unter Vakuum entfernt. Die Membranstücke wurden dann zur Entfernung von überschüssigem, nicht gebundenem Polymethyl-3,3,3-trifluorpropylsiloxan kurz mit Aceton gewaschen. Anschließend wurden die Membranen zur Härtung der Siloxanbindung 60 Minuten bei 150°C oder alternativ 3 Tage bei Raumtemperatur getrocknet. Es wird eine Glasfasermembran mit einer stabilen, hydrophob modifizierten Oberfläche erhalten. Die Belegung der Glasoberfläche mit Polysiloxanresten kann durch ESCA-Spektroskopie nachgewiesen werden.

Claims

1. Modifizierte Glasfasermembran, erhältlich durch

a) Behandlung einer Glasfasermembran mit einer Säure,
b) Umsetzung der mit der Säure behandelten Glasfasermembran mit einem Polysiloxan und
c) Trocknen der mit dem Polysiloxan umgesetzten Glasfasermembran.

2. Verfahren zur Herstellung einer modifizierten Glasfasermembran nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlung mit der Säure und die Umsetzung mit dem Polysiloxan in einer Stufe in einem Eintopf-Verfahren durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Säure Trifluoressigsäure einsetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Polysiloxan der allgemeinen Formel I einsetzt, in der die Reste R¹, die gleich oder verschieden sein können, C_1-30-Alkyl, substituierte C_1-30-Alkyl-, C_6-10-Aryl- oder substituierte C_6-10-Arylreste bedeuten, die Reste R², die ebenfalls gleich oder verschieden sein können, C_1-4-Alkylreste, Hydroxylgruppen oder Halogenatome bedeuten, und n einen Wert von mindestens 2 hat.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Polysiloxan Polymethyl-3,3,3-trifluorpropylsiloxan der Formel einsetzt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das Polymethyl-3,3,3-trifluorpropylsiloxan als Lösung in Trifluoressigsäure mit einer Konzentration von 0,05 bis 10% einsetzt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Glasfasermembran mit der Lösung von Polymethyl- 3,3,3-trifluorpropylsiloxan in Trifluoressigsäure für eine Zeit von 1 bis 20 Stunden behandelt.

9. Verfahren nach Anspruch 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die behandelte Glasfasermembran bei einer Temperatur von 100 bis 200°C 10 Minuten bis 3 Stunden trocknet.

10. Verwendung der modifizierten Glasfasermembran nach Anspruch 1 als Trägermaterial zur Immobilisierung von Proteinen, insbesondere zur proteinchemischen Analyse.