DE69633962T2 - Verfahren zum Bilden einer kovalent gebundenen hydrophilen Schicht auf Basis von Polyvinyl-Alkohol für die Kapillarelektrophorese - Google Patents

Verfahren zum Bilden einer kovalent gebundenen hydrophilen Schicht auf Basis von Polyvinyl-Alkohol für die Kapillarelektrophorese Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung bezieht sich auf die Vorbereitung der Beschichtungen für Oberflächen und im besonderen, auf die Vorbereitung der Beschichtungen, die sich für kapillare Elektrophoresensäulen eignen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Kapillare elektrophoresische Trennungstechniken finden weite Anwendungen in den mit der Biologie verwandten Wissenschaften. Molekulare Spezien wie zum Beispiel Peptide, Proteine, Oligonukleotide und Oligosaccaride werden getrennt, indem man sie zum Migrieren in einer Pufferlösung unter dem Einfluss eines elektrischen Felds anregt. Die Trennung wird normalerweise in dünnwandigen, Narrow-Bore-Kapillarröhren ausgeführt, um die Hitzeentwicklung während der elektrophoresischen Trennung zur Vermeidung von Zonendeformation gering zu halten.
  • Andere Mechanismen, die Zonendeformation verursachen können, sind ungleiche Elektroendosmosis, exzessiver elektroosmotischer Fluss und Solute-Adsorption in die innere Oberfläche der Kapillare. Jedoch können diese Probleme verringert oder überwunden werden, indem man die innere Wand der elektrophoresischen Röhren mit verschiedenen polymerischen Substanzen beschichtet.
  • In U.S. Pat. Nr. 4,680,201 beschreibt Hjerten eine Beschichtungsmethode für die Innenwand einer Narrow-Bore-Kapillare mit einer monomolekularen polymerischen Beschichtung aus Polyacrylamid, die mit der Kapillarenwand durch bifunktionalen Reagenzien verbunden wird, wie z. B. γ-methacryloxypropyltrimethoxysilane. Diese Kapillaren können für Free-Zone-Elektrophorese in offenen Röhren verwendet werden.
  • Novotny et al., U.S. Pat. Nr. 5,074,982 beschreibt, dass die innere Wand der Silika-Kapillaren, die bei elektrophoretischen Trennungen verwendet werden, mit bifunktionalen Reagenzien beschichtet werden kann, indem man für hydrolytische Stabilität einen Grignard Reagenzen benutzt.
  • Thermale Immobilisation des aufgenommenen Polyvinylalkohols (PVA) als Beschichtung in fusierten Silika-Kapillarenoberflächen wird bei Gilges et al., Anal. Chem. 66: 2038–2046 (1994) beschrieben. Diese Beschichtungen sind für Trennungen in einem breiten pH Bereich stabil; jedoch bei einem hohen Puffer pH ist die Aufnahme der PVA Moleküle und die Unterdrückung der Analyte/Wand Interaktion geschwächt.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Im allgemeinen beschreibt die vorgelegte Erfindung Methoden zur Vorbereitung von Beschichtungen, die für Oberflächen in kapillaren elektrophoresischen Säulen vorhanden sind. Eine mikrokapillare Säule, die nach dieser Erfindung vorbereitet wurde, schliesst normalerweise eine Mikrokapillare ein, die einen inneren Hohlraum sowie eine Wand mit einer inneren Oberfläche hat, wobei die innere Oberfläche der Wand eine miteinander verbundene polymerische Beschichtung hat, die eine Vinyl-funktionale Gruppe enthält, die wiederum an die Innenoberfläche gebunden ist und fähig ist, mit einer hydrophobischen organischen Verbindung in einer organischen Lösung und einem Polymer der organischen Verbindung, die mit der funktionalen Gruppe copolymerisiert, zu copolymerisieren. Die Beschichtung kann entweder kovalent oder nicht-kovalent an die Säulenwand angeheftet werden und kann weiterhin eine zusätzliche Beschichtungsschicht enthalten. Vorzugsweise ist die organische Mischung ein Vinylester und am allerbesten besteht sie aus Vinylacetat und der angeheftete Polymer, der die offenliegende Beschichtungsoberfläche bildet, sollte ein Polyvinylalkohol der Hydroxyl-Gruppen sein, die weiterhin in jeder gewünschten Art und Weise abgeleitet werden können. In der bevorzugten Kapillarensäule schliesst die Beschichtung einen auf Polymer basierenden Polyvinylalkohol ein, der kovalent an der Säulenwand durch Si-O-Si Verbindungen angeheftet ist.
  • Die Methode der Erfindung umschliesst allgemein das Erstellen einer Mikrokapillare, die Veränderung der inneren Oberfläche der Kapillarenwand mit Vinylsilanol-Oligomeren, um angeheftete funktionale Vinylgruppen zur Verfügung zu stellen, die in der Lage sind, mit einer organischen Verbindung in einem organischen Lösungsmittel zu copolymerisieren, die Einführung einer Lösung der organischen Verbindung in ein organisches Lösungsmittel in den inneren Hohlraum einer Mikrokapillare, und das Veranlassen der Moleküle der organischen Verbindung mit den verbundenen funktionalen Gruppen zu copolymerisieren, um ein innerverbundenes, polymerisches Beschichtungsmaterial zu bilden, das mit der inneren Oberfläche der mikrokapillaren Säule verbunden ist. Die angehefteten funktionalen Gruppen sind kovalent gebundene Vinylgruppen, die organische Verbindung ist vorzugsweise ein Vinylester und das sich daraus ergebende, innerverbundene polymerische Beschichtungsmaterial wird in einer polymer homologen Reaktion verändert, um die gewünschte Polyvinylalkoholbeschichtung zu erstellen.
  • Zusätzlich beschreibt die Erfindungsmethode allgemein das Herstellen einer Säule mit einer hydrophilischen polymeren Beschichtung, indem direkt ein verbundenes hydrophobisches polymerisches Beschichtungsmaterial in ein hydrophilisches Beschichtungsmaterial verwandelt wird. Die sich daraus ergebende hydrophobische polymerische Beschichtung kann säurehaltige, basische oder neutrale Wirksamkeiten enthalten, je nach der gewünschten Verwendung der Säule.
  • Die Begriffe „CE Säule" oder „Mikrokapillarische Säule" sollen jede Gefässform einschliessen, in dem kapillarische Elektrophorese durchgeführt werden kann. Zum Beispiel ist auch der Gebrauch von Chips für kapillare Elektrophorese bekannt, in deren Oberfläche offene Rillen mikrofabriziert wurden.
  • Die die nach der Erfindung vorbereiteten Beschichtung ergibt eine neue stabile Oberfläche, die für CE Säulen oder allgemeine Oberflächenmodifikation geeignet ist. Die Beschichtung ist über einen breiten ph-Bereich stabil und erlaubt hocheffektives Grafting und/oder Adsorption einer Vielfalt von zusätzlichen Schichten, falls gewünscht. Bei der kapillaren Elektrophorese unterdrückt oder steuert die Beschichtung den elektroosmotischen Fluss und verhindert die Adsorption der Analyte in die Oberfläche der Säule.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
  • Weitere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden deutlich durch die folgende Beschreibung der bevorzugten Ausführung in Verbindung mit den begleitenden Abbildungen:
  • 1 zeigt einen Querschnittsanblick einer, gemäss der Erfindung vorbereiteten beschichteten Mikrokapillarensäule, in der eine innerverbundene, auf Polyvinylalkohol basierende polymerische Beschichtung kovalent an der inneren Wand der Säule durch Si-O-Si Bindungen angeheftet ist.
  • 2 zeigt die Hydrolyse und Kondensation der Vinyltrimethoxysilane zur Bildung der Mischung der oligomerischen Vinylsilanolverbindungen, wie ausgeführt in dem Oberflächenmodifikationsschritt bei der Durchführung der Erfindungsmethode;
  • 3 zeigt die Verbindung und Curing der oligomerischen Vinylsilanolverbindungen der 2, wie ausgeführt in dem Oberflächenmodifikationsschritt bei der Durchführung der Erfindungsmethode;
  • 4 zeigt die Copolymerisierung des Monomer-Vinylacetats mit den Vinylgruppen der angehefteten oligomerischen Vinylsilanolverbindungen der 3, um ein kovalent gebundenes hydrophobisches Polymer (Polyvinylacetat) zu bilden, entsprechend einer Durchführung der Erfindungsmethode;
  • 5 zeigt die Umwandlung des kovalent gebundenen hydrophobischen Polymers (Polyvinylacetat) in sein hydrophiles Gegenstück (Polyvinylalkohol oder PVA);
  • 6 bis 9 zeigen eine open tube-kapillare Zonenelektrophorese der Proteine mit den pH Werten von 4,4; 8,8; 6,2; und 10,0 unter Benutzung einer gemäss der Erfindungsmethode vorbereiteten mikrokapillaren Säule;
  • 10 zeigt die isoelektrische Fokussierung der Proteine unter Benutzung einer gemäss der Erfindungsmethode vorbereiteten mikrokapillaren Säule;
  • 11 zeigt die isoelektrische Fokussierung der Hämoglobinvarianten unter Benutzung einer gemäss der Erfindungsmethode vorbereiteten mikrokapillaren Säule;
  • 12 zeigt die open tube-kapillare Zonenelektrophorese der Φx174, verdaut mit HAE III unter Benutzung einer gemäss der Erfindungsmethode vorbereiteten mikrokapillaren Säule;
  • 13 zeigt die Polymer-Netzwerktrennung der DNA Sequenz-Reaktionsprodukte unter Benutzung einer gemäss der Erfindungsmethode vorbereiteten mikrokapillaren Säule;
  • und 14 zeigt die Polymer-Netzwerktrennung der Poly-dÀ-Oligonukleotiden von verschiedenen Längen unter Benutzung einer gemäss der Erfindungsmethode vorbereiteten mikrokapillaren Säule.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung, wie sie in der kapillaren Elektrophorese angewandt wird, bietet eine neue Methode, hochstabile hydrophilisch beschichtete Mikrokapillarsäulen zu erstellen, die eine hervorragende Leistung bei der Trennung der Biopolymere bieten. Wie in 1 gezeigt wird, enthält eine bevorzugte mikrokapillare Säule, die nach der Erfindung vorbereitet wurde, eine fusierte Silika-Mikrokapillare 10 mit einer Innenwand 12 und einer innerverbundenen, auf Polyvinylalkohol basierende polymerische Beschichtung 14, die kovalent verbunden an die Innenwand durch Si-O-Si Verbindungen 16 angeheftet ist.
  • Die Methode der Erfindung umschliesst im allgemeinen als ersten Schritt einen Silanierungsprozess, der die Silikaoberfläche der Kapillare mit hochreaktiven Vinylsilanololigomeren modifiziert und dadurch freie Vinylgruppen als eine reaktive Funktionalität zurücklässt. Danach wird ein hydrophobischer Monomer (Vinylacetat) copolymerisiert mit den verankerten Vinylgruppen in einem organischen Lösungsmittel in dem inneren Hohlraum der oberflächenmodifizierten, fusierten Silikakapillare. Im letzten Schritt wird der kovalent gebundene hydrophobische Polymer (Polyvinylacetat) in sein hydrophilisches Gegenstück (Polyvinylalkohol oder PVA) umgewandelt. (Es ist möglich, dass eine kleine Menge an Acetatgruppen übrig bleiben). Der Vorbereitungsprozess dieser Erfindung für die mit Polyvinylalkohol beschichteten Kapillaren ist einfach, zuverlässig und reproduzierbar. Es werden keine giftigen Chemikalien verwendet. Die sich ergebende hydrophilische Beschichtung ist chemisch und hydrolytisch sehr stabil und erlaubt die effektive Trennung von Biopolymeren über einen breiten pH Bereich.
  • Der folgende Prozess (der bei den PROBEN ausführlicher beschrieben wird) resultiert in einer stabilen Beschichtung aus Polyvinylalkohol, der kovalent an die Oberfläche der fusierten Silikakapillaren angeheftet ist:
  • Oberflächenmodifikation der fusierten Silikakapillaren um eine stabile, kovalent gebundene Gruppen für Copolymerisierung mit Monomeren einer organischen Verbindung zu erstellen
  • Um eine reproduzierbare Oberflächenmodifizierung zu erlauben, werden die Kapillaren zunächst mit Säure behandelt, um die verschiedenen Oberflächenqualitäten der individuellen fusierten Silikakapillaren auszugleichen (verschiedene Hersteller, unterschiedliche Alterungsbedingungen der verschiedenen Sätze). Dieser Prozess ergibt eine aktivere Kapillarenoberfläche und eine uniformere Oberfläche, indem die Anzahl der offengelegten, reaktiven Silanolgruppen erhöht wird. Die aktuelle Modifikation der Kapillarenwand wird durch die Reaktion der Oberflächensilanole mit einer Mischung aus oligomerischen Vinylsilanolverbindungen erreicht. In Bezug auf 2 werden diese Verbindungen in der Lösung erreicht, indem Vinyltrimethoxysilane 22 mit einer begrenzten Menge an 0,1 M HCL reagiert. Die Säure spaltet die geschützte Methoxygruppe und wandelt die Silane in ein auf der Oberfläche hoch reaktives Polysilanol-Spezies (Vinylsilanetriol) 24 um. Zusätzlich kondensiert das Vinylsilanetriol zu Oligomer 26. Die begrenzte Menge an vorhandenem Wasser verhindert die Verbindungen in der Mischung am Polymerisieren und Vernetzen, was zum Niederschlag führen würde. Es ist erwähnenswert, dass diese Silanisierungsmischungen über mehrere Tage stabil sind.
  • In Bezug auf 3, die daraus erfolgende Verbindung der Oligomere 26 mit der Kapillarenoberfläche 12 (durch die Kondensierung der Oberflächen- Silanolgruppen 28 mit Oligomer-Silanolgruppen 30) ergibt eine sehr stabile Si-O-Si Verbindung 16 und bietet der Oberfläche kovalent gebundene Vinylgruppen 32, die mit Vinylacetat copolymerisieren können. Der Gebrauch einer olefinischen, nicht funktionsbeteiligten Silane verhindert hydrolytisch instabile funktionale Gruppen in dem angehefteten Molekül. Zusätzlich, aufgrund der thermischen Stabilität der Vinylsilan-Gruppe, kann ein Curing der modifizierten Oberfläche bei einer hohen Temperatur (110° Celcius über 1 Stunde) durchgeführt werden, was die Stabilität der Coupling Chemie erhöht.
  • Polymerisierung der Vinylacetat Monomere innerhalb der Kapillarenröhre in einem organischen Lösungsmittel
  • Wie in der 4 gezeigt wird, ergibt die Copolymerisierung der Vinylacetat-Monomere 34 mit den Vinylgruppen 32 der kovalent gebundenen Vinylsilanen auf der Kapillarenoberfläche eine kovalente Bindung des sich ergebenden Polyvinylacetats 36 mit der Silikaoberfläche. (Die gepunkteten Linien in der Darstellung des Polyvinylacetats 36 in 4 zeigen den früheren Ort der Doppelverbindungen in den Vinylacetat-Monomeren an. Experten verwenden den Ausdruck Polyvinylacetat für das Polymer der Vinylacetat-Monomere obwohl der sich ergebende Polymer nicht länger Vinylgruppen enthält.)
  • Die Polymerisierung wird in der Kapillarenröhre durch ein organisches Lösungsmittel initiiert, durch die thermische Zersetzung der radikalen Initiatoren wie zum Beispiel α,α-azodiisobutyronitile oder Benzoyl-Peroxide, die mit der Zersetzung unterhalb des Siedepunkts des Monomers beginnen. Bei geeigneten Umständen kann die Polymerisierungslösung als dünner Film auf der modifizierten Kapillarenwand sedimentiert werden. Dieser Polymerisierungsprozess ist nicht empfindlich genug, Sauerstoffmengen aufzuzeichnen, wie z. Bspl. die Polymerisierung von Acrylamid. Organische Lösungsmittel wie Ethylacetat ergeben gute Polymerisierungsergebnisse. Da die Viskosität der sich ergebenden Polymerlösungen in organischen Lösungsmittel sehr gering ist, kann bis zu 40% Monomer für die Polymerisierung benutzt werden und garantiert damit eine hohe Graftingdichte (Copolymerisierung mit den Oberflächenvinyls und dadurch kovalentes Anheften des Polymers.) Darüberhinaus kann überflüssige Polymerlösung aus den Kapillaren leicht gedrückt werden. (Mit Acrylamid in wasserhaltiger Lösung liegen die Dichtungsgrenzen bei ca. 7% Monomer.)
  • Umwandlung des kovalent gebundenen hydrophobischen Polymers (Polyvinylacetat) in sein hydrophiles Gegenstück (Polyvinylalkohol oder PVA)
  • Nachdem der hydrophobische Polyvinylacetat-Polymer an die Kapillarenoberfläche gebunden ist, muss die Beschichtung in die gewünschte hydrophilische Form, in Polyvinylalkohol (PVA) umgewandelt werden.
  • In Bezug auf 5, in einer polymer homologen Reaktion kann das kovalent gebundene Polyvinylacetat 36 leicht desacetyliert werden, indem man eine Lösung von Natrium-Methylat durch die Kapillaren bei Raumtemperatur spült. Basisch katalysierte Desacetylierung ist sogar bei Raumtemperatur sehr effizient; dieser Schritt wird einfach durch das kurzzeitige Spülen (ca. 15 Minuten) der Natrium-Methylatlösung durch die Kapillare ausgeführt. Wenn die Hydrolyse der Estergruppe unter nicht wässerigen Bedingungen ausgeführt wird, wird die Silanechemie nicht von dieser starken Base beeinträchtigt. Bei der Verwendung von wasserfreiem Methanol als Lösungsmittel für die Hydrolyse setzt sich der resultierende Polyvinylalkohol 14 ab und schirmt dadurch die Silane Coupling Chemie unter dem Polymer ab. Das Ergebnis dieses Prozesses ist eine Mikrokapillare mit einer hydrophilischen, kovalent angehefteten Beschichtung aus Polyvinylalkohol, die bis zum Gebrauch gelagert werden kann.
  • Im Vergleich zum Beispiel mit der Polymerisierung von wasserhaltigen Lösungen von Acrylamid innhalb einer Kapillare, bietet das oben beschriebene Verfahren mehrere Vorteile. Da die Polymerisierung durch thermische Zersetzung eines radikalen Initiators initiiert wird nachdem die Polymerisierungslösung in die Kapillare injiziert wurde, ist der ganze Prozess sehr bequem und kontrollierbar. Im Gegensatz dazu wird die konventionale Polymerisierung der Acrylamide in wasserfreier Lösung sofort initiiert, wenn die Bestandteile (z. Bspl. TEMED, APS; Acrylamid-Monomer) zusammengegeben werden und die Lösung muss zur Verhinderung von frühzeitiger Polymerbildung schnell behandelt werden. Polymerisierung in organischen Medien ergeben eine viel geringere Viskosität der Polymerlösung, so dass eine höhere Monomerkonzentration verwendet werden kann. Dies ergibt eine höhere Graftingdichte und dadurch bessere Leistung und Stabilität. Mit 40% Vinylacetat kann überflüssiges organisches Lösungsmittel nach der Polymerbildung leicht aus den Kapillaren gedrückt werden, während in Wasser ca 7% Acrylamid die Grenze ist. Flüssige organische Verbindungen, die unter den beschriebenen Bedingungen polymerisiert werden können, können ohne zusätzliches Lösungsmittel verwendet werden. In diesem Fall würde eine überflüssige Verbindung aus der Kapillare gedrückt, nachdem genügend Polymerisierung stattgefunden hat.
  • Polymerisierung in einem organischen Lösungsmittel ist weniger empfindlich auf Sauerstoff als die Polymerisierung in Wasser und ermöglicht dadurch die Eliminierung der Gasabscheidungsschritte und den Gebrauch von Chemikalien direkt vom Hersteller. Dadurch wird der ganze Prozess praktischer und ergibt zuverlässigere Ergebnisse. Zum Schluss sind die Chemikalien (Vinylacetat, Ethylacetat und Benoyl-Peroxid) viel weniger giftig als die, die in konventionellen Polymerisierung verwendet werden wie z. Bspl. wasserhaltiges Acrylamid.
  • Gebrauch
  • Die oben beschriebene Methode ergibt Kapillaren mit ausgezeichneter Leistung bei der Trennung von Proteinen über einen breiten Bereich von pH Werten hinweg (siehe 6–9). Selbst bei einem fast neutralem pH Weit (pH = 6,20, 8) kann eine ausgezeichnete Proteintrennung unter normalen Pufferbedingungen erreicht werden. Eine Kapillare, die konstant bei einem pH Wert von 10,0 mit einer Spannung von 540 V/cm lief, wies keinen Effizienzverlust bzw. keine Verschiebung bei den Migrationszeiten nach 7 Tagen auf. Im Gegenteil ist es bekannt, dass alle auf Acrylamid oder Acrylat basierende Polymere nach der Hydrolyse der funktionalen Gruppen bei einem hohen pH geladen werden. Dieser Zustand ergibt einen Höchstverfall und eine Verschiebung in Migrationszeiten für Proben, die bei hohem pH in polyacrylamid-beschichteten CE Säulen getrennt wurden. Weiterhin wurden Kapillaren, die gemäss der Erfindungsmethode vorbereitet wurden, erfolgreich für isoelektrische Fokussierung verwendet. Aufgrund ihrer chemischen Stabilität konnten exzellente Migrationszeiten-Reproduzierbarkeit erreicht werden.
  • Eine Vielzahl an weiteren Vinylestern könnten unter Verwendung der Erfindungsmethode zur Herstellung einer Polyvinylalkoholbeschichtung, die kovalent an die innere Oberfläche einer kapillaren Säule gebunden ist, benutzt werden. Zusätzlich zu dem bevorzugten Ester, Vinylacetat, sind weitere Vinylester wie Vinylpropionate, Butyrate, Benzoate oder Laurat geeignet. Weiterhin ist die Erfindungsmethode effektiv bei der Bildung einer Beschichtungsschicht aus jeder organischen Verbindung (Monomer oder Oligomer), die zur Copolymerisierung in einem organischen Lösungsmittel mit funktionalen Gruppen, die an der Kapillarenwand angeheftet sind, fähig ist. Gemässigt hydrophobische Monomere (wie zum Beispiel Vinylpyrrolidone, Hydroxyalkyl(meth)acrylate usw.) können verwendet werden, um angeheftete Polymere herzustellen, die für CE Trennung von Biopolymeren in wasserhaltigen Puffern genügend hydrophilisch sind, ohne dass eine Polymer homologe Umwandlung anschliessend erfolgt.
  • Die verankerten Vinyl funktionalen Gruppen können kovalent oder nicht kovalent an die Säulenwand angeheftet werden. Funktionale Gruppen, die mit Vinylester copolymerisieren können, sind hauptsächlich Vinylgruppen. Weitere funktionale Gruppen würden für die Polymerisierung mit anderen polymerisierbaren organischen Verbindungen verwendet werden.
  • Die Kapillare besteht vorzugsweise aus fusiertem Silika und die verankerten funktionalen Gruppen sind am besten kovalent an der inneren Oberfläche der Säule durch die beschrieben Silane Coupling Chemie angeheftet. Jedoch können Experten offensichtliche andere Coupling-Methoden anwenden. Die Kapillare kann auch aus jedem beliebigen organischen Polymer bestehen, der schon eine geeignete funktionale Gruppe enthält oder der es ermöglicht, copolymerisierbare Gruppen an die Oberfläche zu binden.
  • Die Beschichtung von anderen Oberflächen, die in der Trennungstechnologie wichtig sind (wie z. Bspl. Silikagel, Polystyrene usw.) könnte einfach mit Hilfe der Erfindungsmethode durchgeführt werden. Die hier beschriebene, bevorzugte Methode der PVA Beschichtung ist übertragbar auf alle, mit Vinylsilanol-Oligomeren modifizierten Silika-Oberflächen (oder Polymer Oberflächen), die mit dem hydrophobischen Monomer copolymerisieren können. Dieser Prozess ist besonders wichtig für HPLC, bei der Oberflächen mit geringer Protein-Adsorption sehr erwünschenswert sind und besonders für die Size-Exclusion-Proteinchromatographie.
  • Beschichtungen, die nach dieser Methode vorbereitet wurden, können mühelos abgeleitet oder modifiziert werden, um die Oberflächenchemie zu ändern oder eine zusätzliche Beschichtungslage anzuheften, z. Bspl. Modifizierungen an einer kovalent gebundenen PVA Beschichtung (wie beschrieben vorbereitet) in einer Kapillare oder auf der Oberfläche des Silikagels können die Vernetzung durch bi-(oder poly) funktionalen Reagenzien (wie z. Bspl. Diepoxide, Diisocyanate, Säure-Anyhydrid) einschliessen.; chemische Umwandlung der Polyhydroxy-Beschichtung in Polyether, Polyester etc.; durch chemische Reaktion der Hydroxyfunktionalität mit monomerischen oder polymerischen Reagenzien; Vernetzung der nahegelegenen Hydroxyfunktionalität wie in einer Epoxide oder Acetal oder Reagieren der funktionalen Oberfläche mit Gruppen, die Ladungen einbringen und in einer Ionenaustauschkapazität der Oberfläche enden. Thermische Behandlungen können eine physikalische (Orientierung der polymerischen Schichten, Hydrogenverbindung, teilweise Kristallisierung) oder chemische (teilweise oder komplette Kondensation und dadurch Vernetzung) Modifikationen der Beschichtung ergeben. Modifikationen der Polymerisierungsbedingungen oder chemische Umwandlung nach der Polymerisierung um die Verteilung der 1,2 und 1,3-Diols zu beeinflussen ist ebenso möglich.
  • Die Verwendung von borathaltigen Puffern mit einer PVA beschichteten Säule kann in komplexer Bildung von PVA Hydroxylgruppen enden. Die sich daraus ergebende Oberflächenladung ergibt bei einem hohen pH einen EOF, der mit einer freigelegten fusierten Silikakapillare vergleichbar ist. Daher können PVA beschichtete Kapillaren als Kapillaren mit auswechselbaren (pufferabhängig) EOFs betrachtet werden; mit PVA beschichteten HPLS-Unterstützungen könnten borathaltige Puffer als dynamische Kationenaustauscher verwendet werden.
  • Die Oberflächenchemie, die mit PVA beschichteten Silika-Oberflächen möglich ist, erlaubt einen breiten Bereich an chemischen Reaktionen, da die Oberfläche allgemein als eine Polyhydroxy-Verbindung (Polyalkohol) angesehen werden kann. Diese Eigenschaft ist nützlich für die Bildung von Affinitätsmatrixen für Affinität CE oder HPLC da Antikörper, oder andere biospezifische Reagenzien, leicht mit der beschichteten Oberfläche via Hydroxy-reaktive Gruppen gebunden werden kann. Die PVA Beschichtung unter den angehefteten Antikörper würde eine niedrige Adsorption garantieren und dadurch eine nicht-spezifische Interaktion ausschliessen.
  • Die folgenden Proben sollen der Illustration der Vorteile der vorgestellten Erfindung dienen und denjenigen helfen, die genügend Kenntnisse haben, um diese herzustellen und zu benutzen. Diese Proben sollen in keinster Weise das Ausmass dieser Veröffentlichung begrenzen.
  • PROBE I
  • Vorbereitung einer kovalent gebundenen, mit Polyvinylalkohol (PVA) beschichteten Kapillare:
    • A) Eine ca. 60 cm lange mit Polyimid beschichteten Silika-Kapillare mit einem Innendurchmesser von 75 μm wird 2 Stunden lang mit konz. HCL/H2O (1 : 1) bei einer Temperatur von 110° Celsius gespült, um eine Oberfläche mit hoher Silanolkonzentration für eine erfolgreiche Silane Coupling Chemie zu erstellen. Die Kapillare wird dann auf einen neutralen pH gespült und in einem sanften He-Strom getrocknet.
    • B) Die Silanisierungslösung wird zubereitet, indem 2 ml Vinyltrimethoxysilane und 0,4 ml 0,1 M HCL gemischt wird. Durch Rühren homogenisieren die ersten Zweiphasenmischungen aufgrund der Hydrolyse der Alkoxysilangruppen und der Freisetzung von Methanol, eine sehr exothermische Reaktion. Für die Hydrolyse und Kondensation der Vinylsilanolen wird eine Stunde angesetzt. Die Lösung mit oligomerischen Vinylsilanolen wird durch die Kapillaren eine Stunde lang gedrückt und kann dann übernacht stehen bleiben. Am nächsten Tag werden die Kapillaren mit Methanol gespült. Curing wird bei 110°C in einem sanften He-Strom durchgeführt.
    • C) Die Polymerisierungslösung wird durch das Mischen von 3 ml Ethylacetat mit 2 ml Vinylacetat zubereitet und ergibt dann eine Konzentration von 40% Vinylacetat (V/V). Der Zusatz von 100 μl einer 5%igen Lösung von Benzoylperoxid in Ethylacetat ergibt eine Initiatorkonzentration von 0,25%. Die durch Vinyl modifizierten Kapillaren von B) werden mit der Polymerisierungslösung gefüllt und die Polymerisierung wird bei 75°C 20 Stunden lang durchgeführt. Die Polymerlösung wird dann hinausgedrückt und die Kapillaren werden mit Ethylacetat und Methanol gespült, um jeglichen nichtgebundenen Polyvinylacetat zu entfernen.
    • D) Um kovalent gebundenes Polyvinylacetat in Polyvinylalkohol umzuwandeln, werden die beschichteten Kapillaren von C) 15 Minuten mit einer Lösung aus 0.5 M Natrium-Methylat in Methanol gespült. Die Kapillaren werden danach mit Methanol gespült und in einem sanften He-Strom getrocknet.
  • PROBE II (6)
    • Probe: (1) Lysozyme, (2) Cytochrome C, (3) Myoglobin, (4) Trypsinogen, (5) α-chymotrypsinogen A (alle 0,1 mg/ml). Beschichtung: PVA wie beschrieben in Probe I. Bedingungen: Innendurchmesser = 75 μm; L = 30/37 cm; Puffer: 20 mM ε-aminocaproic Säure, pH = 4,40; Injektion: 4 Sekunden bei 5 kV; Trennungsspannung: 20 kV.
  • PROBE III (7)
    • Probe: (1) Glucose-6-Phosphatdehydrogenase, (2) Trypsin-Inhibitor, (3) L-Asparaginase, (4) α-lactalbumin (alle 0,1 mg/ml). Beschichtung: Probe I. Bedingungen: Innendurchmesser. = 75 μm; L = 30/37 cm; Puffer: 20 mM TAPS/AMPD, pH = 8,80; Injektion: 4 Sekunden bei 5 kV; Trennungsspannung: 20 kV.
  • PROBE IV (8)
    • Probe: (1) Lysozyme, (2) Cytochrome C, (3) Myoglobin, (4) Trypsinogen, (5) α-chymotrypsinogen À (alle 0,1 mg/ml). Beschichtung: Probe I. Bedingungen: Innendurchmesser = 75 μm; L = 30/37 cm; Puffer: 20 mM TRIS/Cacodylic Säure, pH = 6,20; Injektion: 5 Sekunden mit Druckinjektion (PAC/E); Trennungsspannung: 20 kV.
  • PROBE V (9)
    • Probe: (1) Glucose-6-Phosphatdehydrogenase, (2) Trypsin-Inhibitor, (3) L-Asparaginase, (4) α-lactalbumin (alle 0,1 mg/ml). Beschichtung: Probe I. Bedingungen: Innendurchmesser. = 75 μm; L = 30/37 cm; Puffer: 20 mM CAPS/NaOH, pH = 10,0; Injektion: 4 Sekunden bei 5 kV; Trennungsspannung: 20 kV.
  • PROBE VI (10)
    • Probe: (A) Myoglobin (pl = 7,2), (B) Carbonic-Anhydrase 1 (pl = 6,6), (C) Carbonic-Anhydrase II (pl = 5,9), (D) β-Laktoglobulin A (pl = 5,1) (0,1 mg/ml von jedem Protein 1 : 1 gemischt mit 2% Pharmalyte (3–10). Beschichtung: Probe I. Bedingungen: Innendurchmesser. = 50 μm; L = 30/37 cm; Fokussierung: bei 25 kV; Mobilisierung: geringer Druck (PAC/E) nach 10 Minuten (25 kV); Anolyte: 20 mM H3PO4; Katholyte: 20 mM NaoH
  • PROBE VII (11)
    • Probe: Hämoglobin Varianten C (pl = 7,45), S (pl = 7,20), F (pl = 7,00) und A (pl = 6,95) (0,1 mg/ml von jedem 1 : 1 gemischt mit einer 2% Ampholinenmischung (Pharmalyte, Servalyte und Ampholyte)). Beschichtung: Probe I. Bedingungen: Innendurchmesser = 50 μm; L = 30/40 cm; Fokussierung: bei 30 kV; Mobilisierung: Hydrodynamic (d H = 5 cm) nach 15 Minuten (30 kV); Anolyte: 0,5 Acetic Säure; Katholyte: 0,25% Ammoniumhydroxid.
  • PROBE VIII (12)
    • Probe: Φx174 verdaut mit Hae III;. Beschichtung: Probe I. Bedingungen: Innendurchmesser = 100 μm; L = 26,75/27,50 cm; Siebmatrix: 1% Metylcelulose (2% ergibt 4000 cps) in 40 mM TAPS/TRIS; Injektion: 5 Sekunden bei 5 kV; Trennungsspannung: 5 kV.
  • PROBE IX (13)
    • Probe: Mit FAM beschrifteter Primer der Sequenzreaktion wird beendet durch Dideoxythymidinetriphosphate auf M13mp18. Beschichtung: Probe I. Bedingungen: Innendurchmesser = 100 μm; L = 30/40 cm; Siebmatrix: 4% LPA in 40 mM TAPS/TRIS: mit 30% Formamid und 3,5 M Harnstoff; Trennungsspannung: 8 kV; Injektion: 5 Sekunden bei 8 kV.
  • PROBE X (14)
    • Probe: poly-dÀ Oligonukleotide 12–18, 25–30 und 40–60. Beschichtung: Probe I. Bedingungen Innendurchmesser. = 100 μm; L = 20/27 cm; Siebmatrix: 10% Polyamid + 45% DMSO + 10% Harnstoff + 35% TAPS/TRIS (50 mM): Injektion: 3 Sekunden bei 10 kV; Trennungsspannung: 20 kV; Temperatur: 40°C.
  • PROBE XI
  • Beschichtung einer stationären Phase für den Gebrauch in HPLC mit Polyvinylalkohol. Ein Silikagel mit einer Porengrösse von 300 Å und 5 μm Partikeldurchmesser wird mit Vinylgruppen entsprechend der Beschreibung in Probe I für eine fusierte Silikaoberfläche modifiziert oder entsprechend anderer Methoden, die den Experten bekannt sind (E. P. Pluedemann, Silane Coupling Agents. Plenum, N. Y. (1982)). 5 g des Silikagels wird in einer Lösung von 10 ml Vinylacetat und 30 ml Ethylacetat suspendiert. Nachdem 25 mg von Benzoylperoxide zugegeben wurde, wird die Suspension 20 Stunden lang auf 75°C unter Rühren und Rückstrom erhitzt. Die Polymerlösung wird dann mit einem G4 Filtertrichter entfernt und das mit Polyvinylacetat beschichtete Silikagel wird mit Ethylacetat und Methanol gewaschen, um jeglichen nicht-funktionalen adsorbierten Polymer zu entfernen. Homologe Umwandlung der gebundenen Polyvinylcetate in PVA wird ausgeführt, indem das Silikagel 15 Minuten in einer 0,1 M Lösung von Natrium-Methylat in Methanol gerührt wird. Danach wird das Silikagel mit Methanol gewaschen und bei einer Temperatur von 60°C getrocknet.
  • PROBE XII
  • Das mit PVA beschichtete Silikagel der Probe XI wird in eine HPLC Säule gepackt und Size-Exclusion-Chromatographie (SEC) mit hoher Leistung (oder hohem Druck) der Proteine, Nukleotide und synthetischen Polymere kann in organischen oder wasserhaltigen Lösungsmitteln durchgeführt werden.
  • PROBE XIII
  • Vorbereitung der Affinitätzmatrixen von PVA beschichteten Oberflächen kann von Experten durchgeführt werden, die die Prozesse kennen, die z. Bspl. beschrieben werden in G. T. Hermanson, A. K. Mallia, P. K. Smith, Immobilized Affinity Ligand Techniques. Academic Press, San Diego (1992).
  • Weitere Ausführungen dieser Erfindung sind offensichtlich für Experten, wenn diese die Spezifikationen berücksichtigen oder die beschriebenen Proben der Erfindung nachvollziehen. Diese Spezifikationen und Proben sollen nur als Beispiele dienen, wobei das wirkliche Ausmass dieser Erfindung durch die folgenden Ansprüche dargestellt werden soll.

Claims (4)

  1. Eine Methode zur Bildung einer Beschichtung (14) auf einer Oberfläche (12), die aus folgenden sequenziellen Schritten besteht: Verfügungstellung einer Oberfläche (12) zum Anheften einer Beschichtung (14); Modifizierung der genannten Oberfläche mit Vinylsilanol-Oligomeren, um angeheftete funktionale Vinylgruppen zu erstellen, die fähig sind, mit einer hydrophobischen organischen Verbindung in einem organischen Lösungsmittel zu copolymerisieren; Aussetzen der besagten Oberfläche (12) einer Lösung von Monomeren oder Oligomeren dieser besagten organischen Verbindung in einem organischen Lösungsmittel; und Veranlassen der Moleküle der besagten organischen Verbindung zum Copolymerisieren mit besagten angehefteten funktionalen Vinylgruppen, wobei innerverbunden hydrophobisches polymerisches Material gebildet wird, dass an besagte Oberfläche (12) angeheftet wird; und Umwandlung besagter hydrophobischer polymerischer Beschichtung in sein hydrophiles Gegenstück.
  2. Die Methode entsprechend dem 1. Anspruch, wobei (a) besagte organische Verbindung Monomere von Vinylester umfasst und (b) das Erhitzen der besagten Lösung der Vinylester-Monomere mit einem Initiator die Copolymerisierung der besagten Monomere mit besagten angehefteten funktionalen Gruppen initiiert.
  3. Eine Methode entsprechend den Ansprüchen 1 oder 2, wobei besagte Oberfläche eine mikrokapillare Säule ist und besagte mikrokapillare Säule einen Innenhohlraum und eine Wand mit einer inneren Oberfläche (12) hat und die Beschichtung (14) auf der besagten inneren Oberfläche (12) gebildet wird.
  4. Die Methode entsprechend des Anspruchs 3, wobei (a) besagte organische Verbindung Monomere von Vinylester umfasst und (b) das Erhitzen der besagten Lösung der Vinylester-Monomere mit einem Initiator in besagten Mikrokapillaren die Copolymerisierung der besagten Monomere mit besagten angehefteten funktionalen Gruppen initiiert.
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