DD256720A1 - Verfahren zur herstellung von chemisch aktivierten hydroxyethylmethacrylat-ethylenglykol-dimethacrylat-copolymere - Google Patents

Abstract

Die Erfindung offenbart ein Verfahren zur Herstellung von chemisch aktivierten Hydroxyethylmethacrylat-Ethylenglykoldimethacrylat-Copolymere mit Organosilanen und gegebenenfalls hetero- oder homobifunktionellen Reagenzien zur einfachen, schonenden und stabilen Bindung von Proteinen, Lektinen, Nukleinsaeuren, niedermolekularen Liganden, Zellen, Mikroorganismen und anderen biologischen Materialien an diese Copolymere. Die Erfindung findet Anwendung in den Biowissenschaften, der Medizin und in der pharmazeutischen Industrie.

Description

(X R'n')n SiR4-n

besitzen, wo X eine Amino-, Carbonyl-, Carboxy-, lsocyano-, Epoxy-, Diazo-, lsothiocyano-, Nitroso-, Sulfhydryl- oder Halocarbonyl-Gruppe darstellt, während R' für eine Alkyl-, Alkylphenyl- oder Phenyl-Gruppe und R für eine Alkoxy-, Phenoxy- oder Halogen-Gruppe steht, wobei n' den Wert zwischen 0-20 und η den Wert zwischen 1-3 annehmen kann.

3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Formkörper eine sphärische, faserige oder eckige Form besitzen.

4. Verfahren nach Punkt 1 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Formkörper kugelförmig sind.

5. Verfahren nach Punkt 1,3 und 4, gekennzeichnet dadurch, daß die Formkörper durch Packung, Verweben oder durch Bindemittel zu Kolonnenpackungen oderflächenförmigen Materialien zusammengestellt sind.

6. Verfahren nach Punkt 1,3 und 5, gekennzeichnet dadurch, daß die Formkörper als dünne Schichten vorliegen, die als Filme oder Lacke auf anderen Trägern befindlich sind.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von chemisch modifizierten und aktivierten Hydroxyethylmethacrylat-Ethylenglykoldimethacrylat-Copolymere, die vorzugsweise für chromatographische Methoden und Verfahren eingesetzt werden. Anwendungsgebiete dieser so modifizierten Trägermaterialien sind die Biowissenschaften sowie die Medizin, in denen aktivierteTrägerfürdie Bindung von Proteinen, Lektinen, Nukleinsäuren, niedermolekularen Liganden, Zellen, Mikroorganismen und anderen biologischen Materialien vor allem zur Separation und und Isolierung von spezifischen Wechseiwirkungspactnern unter Einsatz der Affinitätschromatographie eingesetzt werden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Affinitätschromatographische Verfahren und Methoden haben in den letzten Jahren ihren festen Platz in der biowissenschaftlichen Forschung aber auch in der medizinischen Praxis zur spezifischen Isolierung von Proteinen, Enzymen, Lektinen, Antigenen und Antikörpern, Zellen und anderen biologischen Materialien eingenommen (Übersichtz.B.: W. H. Scouten, Affinity Chromatography, New York 1982). Hierfür wurden eine Vielzahl von Matrizes wie Cellulose, Dextrane, Agarose, Polyvinylalkohole, Polyacrylamid u.a. (Übersicht z. B.: T. CJ. Gribnau, Coupling of effector-molecules to solid supports, Dissertation, Nijmegen 1977) beschrieben, wobei generell keine Matrix über ideale Eigenschaften verfügt. Insbesondere die unter den Handelsnamen „Separon Hema" und „Spheron" bekannt gewordenen Poly(hydroxyethylmethacrylate), die durch Copolymerisation von 2-Hydroxyethylmethacrylat und Ethylendimethycrylat erhalten werden, zeichnen sich durch ihre geringe Quellfähigkeit und hohe mechansiche Festigkeit sowie Hydrophilität aus. Diese Trägermaterialien sind sehr gut für affinitätschromatographische Zwecke einsetzbar, wobei die Aktivierung im wesentlichen mittels Epichlorhydrin aber auch Bromcyan oder Carbodiimiden etc. durchgeführt wird, so daß die Bildung des entsprechenden Liganden vorzugsweise über Epoxygruppen erfolgt.

Nachteilig hierbei sind die Toxizität von Epichlorhydrin bei der Herstellung derartiger aktivierter Träger sowie die eingeschränkte Reaktionspalette dieser so aktivierten Trägermaterialien. Andere übliche Aktivierungsverfahren wie die CNBr-Aktivierung oder die Umsetzung mit Carbodiimiden ergeben eine relativ instabile chemische Bindung, die häufig zu einer beträchtlichen Freisetzung der gebundenen Liganden führt (leakage) oder sind durch hohe Kosten gekennzeichnet.

Ziel der Erfindung

Es ist Ziel der Erfindung, ein einfaches, nicht toxisches und ökonomisches Aktivierungsverfahren zur Herstellung von Copolymeren aus 2-Hydroxyethylmethacrylat und Ethylendimethacrylat zu entwickeln, das universell anwendbar ist und somit für die Bindung von Proteinen, Lektinen, Nukleinsäuren, niedermolekularen Liganden, ZeMen, Mikroorganismen und anderen biologischen Materialien eingesetzt werden kann.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Erfindung hat die Aufgabe, ein einfaches, kostengünstiges, nicht toxisches und universell einsetzbares Aktivierungs- und Modifizierungsverfahren für Polyhydroxyethylmethacrylate zu entwickeln.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß Hydroxyethylmethacrylat-Ethylenglykoldimethacrylat-Copolymere mit Organosilanen oder Haftvermittlern ähnlicher Zusammensetzung umgesetzt werden, wobei die Copolymere als Formkörper und gegebenenfalls hetero- oder homobifunktionelle Reagenzien eingesetzt werden.

Es ist seit langem bekannt (R. A. Messing, H.H. Weetall: US-Patent 3519538; H.H.Weetall, N.Y.EImira: US-Patent 3652761; H.H.Weetall: Methods in Enzymol. 44 [1976] 134), daß die OH-Gruppen auf SiO₂-Oberflächen als Angriffspunkte für chemische Agenzien, insbesondere Organosilanen mit unterschiedlichen funktionellen Gruppen, zur Verfügung stehen.

Überraschenderweise reagieren Organosilane, die bisher ausschließlich mit anorganischen Trägern eingesetzt wurden, mit mindestens gleicher Reaktivität mit Polyhydroxymethacrylaten. Während die silikofunktionelle Gruppe mit den Hydroxylgruppen des Trägers reagiert, steht die organofunktionelle Gruppe den üblichen chemischen Reaktionen unter verwendung von Amino-, Carbonyl-, Carboxy-, lsocyano-, Diazo-, Isothiocyano-, Sulfhydryl-, Nitroso oder Halocarbonyl-Gruppen zur Verfugung, so daß diese Verbindungen als Brücke zwischen dem organischen Träger und der organischen/ biologischen Verbindung fungieren.

Organosiiane im Sinne dieser Erfindung sind alle Verbindungen der allgemeinen Zusammensetzung

wo X eine Amino-, Carbonyl-, Carboxy-, lsocyano-, Diazo-, Epoxy-, Isothiocyano-, Nitroso-, Sulfhydryl- oder Halocarbonyl-Gruppe darstellt, während R' für eine Alkyl-, Alkylphenyl- oder Phenyl-Gruppe und R für eine Alkoxy-, Phenoxy- oder Halogengruppe steht, wobei n' den Wert zwischen 0-20 und η den Wert zwischen 1 -3 annehmen kann.

Die so aktivierten Copolymere können nunmehr im folgenden direkt über die entsprechenden funktionellen Gruppen oder unter Vermittlung von homo- oder heterofunktionellen Reagenzien auf an sich bekannte Art und Weise mit den zu bindenden Proteinen, Lektinen, Nukleinsäuren, niedermolekularen Liganden, Zellen, Mikroorganismen und anderen biologischen Materialien umgesetzt werden.

Wichtig hierbei ist, daß die Umsetzung mit den Organosilanen, die nicht toxisch sind und großtechnisch in beträchtlichem Umfang produziert werden, durch einfaches in Kontakt bringen oderTauchen bei Raumtemperatur oder höheren Temperaturen erfolgt, jedoch diese Bindung sehr stabil ist, so daß die hiermit gebundenen biologisch aktiven Stoffe über lange Zeit fest gebunden sind.

Vorteilhaft ist weiterhin, daß durch Wahl unterschiedlicher Organosilane und gegebenenfalls bifunktioneller Kopplungsreagenzien praktisch alle in Frage kommenden Reaktionsmöglichkeiten realisiert werden können.

Hinzu kommt, daß — bedingt durch den Spacereffect der Organosilane (R' = 0-20) und/oder der bifunktionellen Kopplungsreagenzien — die gebundenen biologischen Materialien fast ausnahmslos ihre biologische Aktivität erhalten, so daß diese mit Erfolg in der Affinitätschromatographie eingesetzt werden können.

Besonders vorteilhaft gestaltet sich der Einsatz von Gemischen an Organosilanen unterschiedlicher funktioneller Gruppen, da diese über unterschiedliche Mechanismen biologische Materialien in hoher Ausbeute binden können.

Die auf diese Art und Weise aktivierten Hydroxyethylmethacrylat-Ethylenglykoldimethacrylat-Copolymere liegen als Formkörper vor, wobei die Formkörper in vielen Fällen eine sphärische und kugelförmige Form aufweisen werden, jedoch für spezielle Anwendungsgebiete — insbesondere unter Berücksichtigung technologischer Aspekte — auch eine faserige oder eckige Form besitzen können, die durch Packung, Verweben oder durch Bindemittel zu Kolonnenpackungen, Flächenträgern oder anderen höheren Strukturen verbunden sein können. Eingeschlossen hiervon sind auch dünne Schichten, die als Filme oder Lacke auf anderen Trägern befindlich sind:

Im folgenden wird die Erfindung an einigen Beispielen erläutert.

Beispiel 1:

1 g makroporöses sphärisches Copolymer von 2-Hydroxyethylmethacrylat und Ethylendimethacrylat mit einer Partikelgröße von 15-25μ.ιη und einer inneren Oberfläche von ca. 70 m²/g Träger sowie einer Ausschlußgrenze von 2 · 10⁶ Dalton (im folgenden als Separon® Hema 1000 bezeichnet) wird mit 10% Aminopropyltriethoxysilan (NB 1114 VEB Chemiewerk Nünchritz, DDR) in Ethanol/Wasser (1:1), pH 2,5,6h bei 60⁰C und danach 6 h bei 120⁰C inkubiert und anschließend zweimal mit je 5 ml Ethanol/Wasser sowie fünfmal mit je 5 ml 0,1 m Phosphat-Puffer, pH 6,8, gewaschen. Der Aktivierungsgrad wird nachfolgend durch Bestimmung der Aminogruppen am Träger ermittelt. Hierzu bietet sich die Methode nach G.Antoni et al. (Anal, biochem. 129 [1983] 60) an. Der Aktivierungsgrad kann durch Wahl der Konzentration der Organosilane und/oder der Inkubationszeiten über einen weiten Bereich variiert werden. In der Regel erzielt man Aktivierungsgrade von 30/^Mol/g Separon.

Beispiel 2:

5g Separon Hema 1000 mit einer Partikelgröße von 15-25>m werden mit 10% Aminopropyltriethoxysilan (NB 1114 VEB Chemiewerk Nünchritz, DDR) in Ethanol/Wasser (1:1), pH 2,5,6 Stunden bei 6O⁰C inkubiert und anschließend zweimal mit je 30 ml Ethanol/Wasser (1:1) bzw. fünfmal mit je 20 ml 0,1 m Phosphat-Puffer, pH 6,8 gewaschen. Das so aktivierte Gel wird nachfolgend mit5%igem Glutardialdehyd2h bei 39°CinO,1 m Phosphat-Puffer, pH6,8, umgesetzt und nachfolgend wiederum fünfmal mit je 20 ml Phosphat-Puffer gewaschen. Die Bindung des Proteins erfolgt durch einfache Zugabe der Proteinlösung zu dem auf diese Art und Weise aktivierten Gel. Hierzu wird das aktivierte Separon mit 10 ml humanem Immunglobulin G (IgG) in einer Konzentration von 18,6mg/ml (0,1 m Phosphat-Puffer) versetzt und 2 h bei 37°C oder über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach Absaugen des nicht gebundenen Überstandes erfolgt die Bestimmung der gebundenen Proteinmenge am Träger durch Differenzmessung der Eiweißkonzentrationen der eingesetzten Proteinlösung und des Überstandes. Auf diese Art und Weise konnten in jedem Experiment mindestens 95% des angebotenen Proteins gebunden werden. In angeführtem Beispiel wurden von den angebotenen 186mg IgG 183mg Protein gebunden, so daß 36,7mg IgG/g Separon gebunden sind.

Beispiel 3:

1 ml gequollenes Separon wird, wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben, aktiviert und mit Glutaraldehyd in einer Konzentration von 3% umgesetzt. Anschließend wird der so umgesetzte Träger mit 2 ml humanem Immunglobulin G in einer Konzentration von 35,5 mg/ml (= 71 mg) in einem 0,1 m Phosphat-Puffer, pH 6,8,2 h bei Raumtemperatur versetzt. Nach Absaugender überschüssigen Proteinmenge wird nachfolgend die gebundene Proteinmenge, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt. Auf diese Art und Weise konnten 23,6mg IgG/ml Separon gebunden werden.

Beispiel 4:

1 ml gequollenes Separon wird mit einem Gemisch aus einem Aminopropyltriethoxysilan sowie einem Glycidoxypropyltriethoxysilan (Haftvermittler 6130, VEB Chemiewerk Nünchritz, DDR) in Kontakt gebracht und 2 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach Absaugen des überschüssigen Reagenz sowie Trocknen und nachfolgendem intensiven Waschen mit 0,1 m Phosphatpuffer, pH 6,8 wird der Träger mit Glutaraldehyd umgesetzt und anschließend humanes IgG — wie in Beispiel 3 beschrieben — gebunden. Es konnten 53,8mg IgG/ml Separon gebunden werden.

Beispiel 5

Humanes IgG wird, wie in Beispiel 1-4 beschrieben, an Separon gebunden und zur Isolierung von Kaninchen anti-human-lgG-Äntikörpem eingesetzt. Hierzu wird der mit dem IgG beladene Träger in eine Chromatographiesäule gefüllt, die mit einem spezifischen Antiserum gegen humanes IgG beladen wird. Die Elution erfolgt zunächst mit PBS-Puffer und anschließend mit einer 3 m KSCN-Lösung. Nach sofortiger Dialyse der Antikorperfraktionen wurde der Nachweis von spezifischen Antikörpern mit einem Enzymimmunoassay sowie der doppelten radialen Immundiffusion (Ouchterlony-Technik) geführt. Die Prüfung auf unspezifische Bindungen erfolgt durch Auftragung eines entsprechenden Kaninchen-Normalserums sowie Prüfung aller antikörperhaltigeh Fraktionen mit der Polyacrylamid-Disk-Elektrophorese und Immunelektrophorese.

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung von chemisch aktivierten Hydroxyethylmethacrylat-Ethylenglykoldimethacrylat-Copolymere, gekennzeichnet dadurch, daß diese Copolymere, die als Formkörper vorliegen, mit Organosilanen und gegebenenfalls hetero- oder homofunktionellen Reagenzien umgesetzt werden.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Organosilane als Kopplungsreagenzien fungieren und die allgemeine Zusammensetzung