DE68927403T2

DE68927403T2 - Derivatisierte glasträger zur sequenzierung von peptiden und proteinen

Info

Publication number: DE68927403T2
Application number: DE68927403T
Authority: DE
Inventors: Vincent Farnsworth
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1988-08-05
Filing date: 1989-08-04
Publication date: 1997-02-27
Anticipated expiration: 2009-08-05
Also published as: EP0389585A4; CA1339251C; EP0389585B1; DE68927403D1; JPH03500457A; AU4052389A; ATE144841T1; EP0389585A1; JP2649424B2; WO1990001702A1; US4992383A

Description

Hintergrund der Erfindung

Diese Erfindung betrifft die Verwendung eines mit 2-(4-Chlorsulfonylphenyl)ethyltrimethoxysilan (Silyl CSP), N-Trimethoxysilylpropyl-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (Silyl TMA) oder einer Kombination davon derivatisierten Glasträgers bei der Sequenzierung von Peptiden oder Proteinen.
Die primäre Aminosäurensequenz in einem Peptid oder Protein wird üblicherweise durch ein schrittweises chemisches Abbauverfahren bestimmt, wobei die Aminosäuren eine nach der anderen von einem Ende des Peptids entfernt und identifiziert werden. Bei dem Edman Abbau wird die N-terminale Aminosäure des Peptids an Phenylisothiocyanat gekoppelt, wodurch das Phenylthiocarbamyl-(PTC) Derivat des Peptids gebildet wird. Das PTC Peptid wird dann mit einer starken Säure behandelt, wobei das PTC Peptid an der ersten Peptidbindung cyclisiert wird und die N-terminale Aminosäure als das Anilinothiozolinon- (ATZ) Derivat freigesetzt wird. Die ATZ Aminosäure, die sehr instabil ist, wird extrahiert und in das stabilere Phenylthiohydantoin-(PTH) Derivat umgewandelt und durch Chromatographie identifiziert. Das Restpeptid wird dann einem weiteren schrittweisen Abbau unterzogen.
Automatische Proteinsequenzanalysatoren, bei denen die Edman Abbaureaktionen in einem Film auf der inneren Oberfläche einer sich drehenden Schale durchgeführt werden, sind bekannt. Edman und Begg, Eur. J. Biochem., 1:80 (1967); Penhast, US. 3 725 010. Ein quarternäres Ammoniumsalz, 1,5-Dimethyl-1,5-diazundecamethylenpolymethobromid (Polybrene) ist als Probenträger verwendet worden.
Schroeder, Meth. Enzymol., 11:445 (1967) und Jentsch, Jr., Proc. First Int'l Conf. on Meth. in Protein Sequence Anal. 193 (1975) haben den Edman Abbau in der Flüssigphase dadurch modifiziert, daß das Protein oder Peptid zuerst auf nicht-chemische Weise auf einem Papierstreifen abgeschieden wird.
Laursen, Meth. Enzymol., 25:344 (1972) hat Peptide vor der Sequenzierung kovalent an ein unlösliches Harz gebunden. Wachter et al., FEBS Lett., 35:97 (1973) hat die Peptide auf Glaskügelchen mit einer kontrollierten Porengröße immobilisiert, die mit 3-Aminopropyltriethoxysilan derivatisiert worden waren. Das entstandene Aminopropylglas bindet an die freien Carboxylgruppen der Peptide. Dreyer, U.S. 4 065 412 bevorzugt die Immobilisierung der Peptide entweder durch eine kovalente Bindung oder durch Adsorbtion auf der Oberfläche eines makroporösen Reaktionsträgers aus Polystyrol oder Glas.
Hood, U.S. 4 704 256 und 4 603 114 lehrt die Einbettung der Probe in eine permeable feste Matrix, die als ein dünner Film auf einem Träger, wie einem Glasfaserblatt, gebildet worden ist. Die Matrix ist vorzugsweise ein polymeres, quarternäres Ammoniumsalz, da die positiv geladenen quarternären Ammoniumgruppen stark mit der negativ geladenen Glasoberfläche wechselwirken.
Figuren 17A, 17B und 17C in den Hood Patenten erläutern drei Vorgehensweisen zur Verbesserung des Festhaltens der Proben durch Immobilisieren des Proteins oder Peptids. Figur 17A zeigt eine kovalente Haftung auf derivatisiertem Glas, wie in Wachter. Figur 17B zeigt die physikalische Adsorption der Probe auf dem Träger, wie in Schroeder. Figur 17C erläutert die Einbettung der Probe in einer das Glas bedeckenden Matrix, wie in Hood.
Saunders, U.S. 3 987 058 offenbart die Verwendung von sulfonierten Aralkylsiliciumdioxiden als Kationenaustauscher. Das Natriumsalz von Sulfobenzylsiliciumdioxid wurde verwendet um Nitrosoprolin von Prolin und anderen Verbindungen von konservierten Fleischproben zu trennen. Eine Proteinsequenzierung wird nicht diskutiert.
Glajch, U.S. 4 705 725 betrifft insbesondere Trägerstrukturen, die Siliciumdioxid umfassen, an die ein monofunktionales Silan kovalent gebunden ist, das mindestens zwei sterische Schutzgruppen enthält, die an das Siliciumatom des Silans gebunden sind. Zur Verwendung bei der Peptidsequenzierung ist dieses Silan mit einer quarternären Aminogruppe substituiert, wodurch es in ähnlicher Weise wie Polybrene mit den Peptiden in Wechselwirkung tritt. Zur Verwendung bei der Kationenaustauschchromatographie wird dieses Silan mit einer -(CH&sub2;)&sub3;-C&sub6;H&sub4;-SO&sub3;H Gruppe substituiert.
Silane sind zur Kupplung von Antigenen oder Antikörpern an Glas verwendet worden. Weetall, U.S. 3 652 761.
Die Herstellung von mit Silylammoniumgruppen derivatisierten Glasfaserfiltern ist von Frank und Ashman beschrieben worden:
In Frank und Ashman, Methods of Protein Sequence Analysis (Proc. Int. Conference) 6tens, 1986 (veröffentlicht 1987), Seiten 403-407 werden Proteine dadurch auf Glasfaserfiltern immobilisiert, daß die Glasoberfläche chemisch durch Behandlung mit einem stark oxidierenden Gemisch aus Salpetersäure und Wasserstoffperoxid gefolgt von einer Waschung mit EDTA modifiziert wird. Das Glas wird dann mit Trimethyl-[3-(trimethyoxysilyl)- propyl]ammoniumchlorid umgesetzt, was zu einer kovalenten Bindung von Propyltrimethylammoniumgruppen führt (siehe D2, Fig. 2, Seite 576). In alternativer Weise wurden die Glasfaserfilter mit N-(β-aminoethyl)-γ-aminopropyltrimethoxysilan umgesetzt. Die Aminofunktionen wurden danach mit Methyliodid quaternisiert.
In ähnlicher Weise wird in Frank und Ashman, Biol. Chem. Hoppe- Seyler (1986) 367(7), Seiten 573-589, ein Glasfaserträger chemisch unter Bedecken des Glases mit quarternären Ammoniumgruppen dadurch modifiziert, daß die Silanolgruppen auf der Glasoberfläche mit Trimethyl-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ammoniumchlorid umgesetzt wird. Die Glasfaserblätter wurden vor der Kupplung mit der quaternären Ammoniumverbindung mit Trifluoressigsäure behandelt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gegenwärtige Verfahren der Gasphasen- oder sogen. Proteinsequenzierung mit pulsierender Flüssigkeit beruhen darauf, die Probe in einer Matrix einzubetten (Hood) oder die Probe covalent an einen Träger zu binden (Laursen). Dies dient dazu, eine Verdrängung der Probe von dem Träger während Waschungen mit flüssigem Lösungsmittel und bei Überführungen zu verhindern. Eine covalente Bindung weist den Vorteil auf, daß die Probe permanent in der Reaktionskammer angeordnet wird, ohne daß die Gefahr besteht, sie während der Flüssigphasenchemie oder des Waschens zu verdrängen. Die Nachteile sind zusätzliche chemische Reaktionen, um die Probe an den Reaktionsträger zu binden, Unzulänglichkeiten, die diesen Bindungsverfahren eigen sind, und geringe Ausbeuten von Resten in der Probe, die an der Bindung an den Träger teilnehmen. Eine Probeneinbettung weist den Vorteil auf, daß sie ein mehr oder weniger universelles Immobilisierungsverfahren ohne die zusätzliche Handhabung der Probe darstellt, die bei einer covalenten Bindung auftritt. Hauptnachteile umfassen große Mengen an verunreinigenden Artefakten auf analytischen Systemen, die zur PTH- Aminosäurenidentifikation verwendet werden, und die Notwendigkeit, den Sequenzanalysator mehrere Cyclen lang zu betreiben, bevor er mit der wirklichen Probe beladen wird. Es ist außerdem übliche Praxis, Amine zuzusetzen, die als Abfangmittel dieser Amino-reaktiven Verunreinigungen dienen, die sonst mit der N-terminalen Aminogruppe der Probe reagieren würden und sie für einen Edman Abbau blockieren würden. Da viele dieser Verunreinigungen bei der PTH Analyse als Artefakten auftreten (vgl. Figuren 1A und 1B) muß der Sequenzanalysator über mehrere Cyclen betrieben werden, um den Gehalt dieser Artefakte zu verringern, bevor er mit der Probe beladen wird. Dieses "Precycling", als das es bekannt geworden ist, erfordert teure Chemikalien und wertvolle Zeit. Ein weiterer Nachteil von Trägerverfahren betrifft die Edman Chemikalien und die Waschlösungsmittel, die in die Matrix hinein und aus ihr heraus diffundieren müssen. Da die Probe innerhalb einer Matrix eingeschlossen ist und auf der Oberfläche des Trägers nicht vollständig exponiert ist, können die Reaktion und die Wirksamkeit des Waschens in Mitleidenschaft gezogen werden.
Wir haben gefunden, daß gewisse derivatisierte Glasträger Peptide und Proteine so gut binden, daß der Verlust an Proben während der Lösungsmittel- und Reagenzzuführung minimiert wird, während die Aminosäurederivate immer noch freigesetzt werden, wenn sie während des Abbauverfahrens abgespalten werden. Dabei handelt es sich um "Silyl CSP", 2-(4-Chlorsulfonylphenyl)ethyltrimethoxysilan, und "Silyl TMA", N-trimethoxysilylpropyl- N,N,N-trimethylammoniumchlorid.
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines mit einem Silan mit einer freien Säuregruppe derivatisierten Glasträgers, wobei die Säure einen pKa< 1 aufweist und der derivatisierte Glasträger ein Peptid oder Protein festhalten kann, als Träger in einem Verfahren zur Sequenzierung eines Peptids oder Proteins, das das Immobilisieren des Peptids oder Proteins auf einem Träger und das Sequenzieren des Peptids oder Proteins durch stufenweisen Abbau umfaßt.
Die Erfindung betrifft auch einen derivatisierten Glasträger, der einen mittels eines ersten Silans mit einer freien Säuregruppe mit einem pKa< 1 und mittels eines zweiten Silans mit einer quarternären Ammoniumgruppe derivatisierten Glasträger umfaßt.
Sowohl die Protein- als auch die Peptidträger werden durch chemische Modifizierung der Oberfläche des Glases selbst hergestellt. Diese Derivatisierung ist ein kovalentes Verfahren und führt zu einer permanenten Veränderung der Glasfaseroberfläche. Das Silyl TMA und Silyl CSP sind bifunktionelle Reagenzien. Die Reagenzien werden auf dem Glas durch die Silylgruppen gebunden, was es der anderen funktionellen Gruppe ermöglicht, mit dem Protein oder Peptid frei wechselzuwirken. Da das Reagenz kovalent gebunden ist und da es sich in einer Monoschicht auf der Oberfläche des Glases befindet, kann es keine Matrix bilden, die die Probe umhüllt. Die Probe muß mit den freien funktionellen Gruppen durch eine Kombination von elektrostatischen und hydrophoben Kräften wechselwirken. Diese Art der Wechselwirkung ist sehr wünschenswert, da sie es der Probe ermöglicht, direkt mit den Reaktanden wechselzuwirken, ohne durch eine Matrix gehindert zu sein, durch die Chemikalien diffundieren müssen.
Während es möglich ist, eine Art eines derivatisierten Glasträgers herzustellen, der sowohl bei kurzen Peptiden als auch bei Proteinen funktionieren wird, haben wir gefunden, daß es vorteilhaft ist, die Oberfläche entweder für kleine oder große Moleküle individuell herzurichten. Nur mit Silyl-CSP derivatisiertes Glas funktioniert sehr gut als Anker für kleine Moleküle (Peptide mit einem Molekulargewicht von weniger als 8000 Daltons). Größere Peptide und Proteine haften auf dieser Oberfläche ebenfalls gut, aber PTH Aminosäuren mit positiv geladenen Seitenketten können von dem Träger nur in unwirksamer Weise extrahiert werden und ergeben bei der nachfolgenden Analyse nur sehr geringe Ausbeuten. Wenn die Glasoberfläche zunächst mit Silyl-CSP und dann mit Silyl-TMA behandelt wird, wird dieser Effekt in erheblichem Umfang reduziert, ohne die Fähigkeit der Oberfläche zu beeinflussen, die Probe festzuhalten. "Problem- "Peptide können durch Einstellen der Verhältnisse der beiden Silane sequenziert werden, die auf der Glasoberfläche gebunden sind (Figur 2). Ein mit reinem Silyl-TMA derivatisiertes Glas funktioniert gut als Träger für große Moleküle (Peptide und Proteine mit Molekulargewichten von mehr als 8000 Daltons), es ist zum Festhalten von kleineren Peptiden auf den Trägeroberflächen jedoch weniger zufriedenstellend.
Obwohl die vorstehend angeführten speziellen Chemikalien für mit Silyl derivatisierte Träger in der bevorzugten Ausführungsform verwendet werden, können modifizierte Derivate, die dieselben oder ähnliche funktionelle Gruppen enthalten, genauso gut oder besser funktionieren. Z.B. kann jede geeignete Säuregruppe mit einem ausreichend geringen pKa (< 1) die Sulfonsäure in der bevorzugten Ausführungsform ersetzen. Beispiele von anderen Säuren, die in diese Kategorie fallen, umfassen unter anderem Phosphor-, Pikrin-, Salz-, Trifluoressig-, Trichloressig- , Chrom-, Jodwasserstoff-, Pyrophosphorsäure, sind aber nicht auf sie beschränkt. Wir haben gefunden, daß die Gegenwart der sauren Gruppe für die Leistung des Peptidträgers wesentlich ist. Auslassen der Säuregruppe und Verwendung einer Verbindung, wie Phenethyltrimethoxysilan führt unabhängig von dem Prozentsatz der bei der Derivatisierung verwendeten Chemikalie zu einem Träger, der keine Peptide festhält. Wenn eine Verbindung, wie 3-(Trimethylsilyl)-1-propansulfonsäure verwendet wird, d. h. eine Verbindung der ein Phenylring fehlt, die aber eine Säuregruppe aufweist, hält die entstandene derivatisierte Oberfläche Peptide fest. Es ist offensichtlich die Gegenwart der Säuregruppe und nicht der Phenylring oder die Kohlenstoffkette, die das Festhalten der Probe fördert. Da diese Verbindung bei Raumtemperatur ein Feststoff ist, ist ihre Verwendung erheblich weniger bequem als die Verwendung von Silyl-CSP.
In ähnlicher Weise kann die Silyl-TMA durch eine andere eine quaternäre Ammoniumgruppe aufweisende Verbindung ersetzt werden, die kovalent an Glas bindet.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 vergleicht die Ausbeute an PTH-Prolin in dem ersten Cyclus der Analyse eines Decapeptids, bei dem ein Gasphasensequenzanalysator mit (a) einem Träger, der mit Polybrene behandelt worden ist oder (b) einem mit Silyl-CSP/TMA derivatisierten Träger verwendet wird.
Figur 2 vergleicht die Ausbeute an PTH-Histidin in Cyclus 2 der Analyse desselben Decapeptids, wobei ein Gasphasensequenzanalysator mit (a) einem mit Polybrene behandelten Träger, (b) einem mit Silyl-CSP/TMA derivatisierten Träger und (c) einem mit Silyl-CSP/TMA derivatisierten Träger mit einer bezogen auf Träger (b) reduzierten Menge an CSP.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung ist somit in einer Ausführungsform auf die Verwendung einer bindenden Siliziumdioxid-Substanz mit einer für Poly(amino)säuren reaktiven Gruppe zur Herstellung eines Trägers gerichtet, der zum Sequenzieren von Peptiden und/oder Proteinen geeignet ist. Die bindende Siliziumdioxid- Substanz ist vorzugsweise ein Organosilan mit der Formel RnSiX(4-n), worin n 1 bis 3 ist und X die Gruppe ist, die mit der anorganischen Substanz reagiert. X ist eine hydrolisierbare Gruppe, typischerweise Alkoxy, Acyloxy, ein Amin oder Chlor. Die üblichsten Alkoxygruppen sind Methoxy und Ethoxy. R ist ein nicht hydrolisierbarer organischer Rest, der eine Funktionalität aufweist, die mit Aminosäuren in Wechselwirkung tritt.
Die bevorzugte Konzentration beträgt nach Verdünnung 0,25-2% (V/V) an der bindenden Siliziumdioxid-Substanz in dem Lösungsmittel.
Der Träger wird vorzugsweise mit einem anionischen Silan, wie der hydrolisierten Form von Silyl-CSP oder sowohl mit einem anionischen Silan als auch einem kationischen Silan, wie Silyl- TMA derivatisiert.
Es ist bekannt, daß die Chlorsulfonylgruppe an der Silyl-CSP Verbindung mit primären und sekundären Aminen reagiert. Die Verwendung dieser aktiven Gruppe in der Gegenwart von Peptiden oder Proteinen wird sie für eine Sequenzanalyse durch den Edman Abbau blockieren, der für die Kupplungsreaktion eine freie Aminogruppe erfordert. Um dieses Problem zu lösen, wird die Chlorsulfonylgruppe quantitativ in das Sulfonsäurederivat überführt. Diese Hydrolysereaktion findet in geeigneter Weise während des Verfahrens zum Binden des Silyl-CSP auf der Glasoberfläche statt.
Die Glasoberfläche weist dann negativ geladene Sulfonsäuregruppen mit einem sehr geringen pKa (< 1) auf. Dadurch wird die Bindung von positiv geladenen Molekülen auf dem Glas erheblich vereinfacht. Es wird jedoch beobachtet, daß Peptide mit einer negativen Netto-Ladung und diejenigen, die eine neutrale Ladung aufweisen, ebenfalls gut binden und während des Sequenzierverfahrens nicht von der Oberfläche entfernt werden. Aus mit anderen Arten von derivatisierten Glasträgern durchgeführten Experimenten scheint hervorzugehen, daß das Peptid von der Oberfläche am leichtesten während der ATZ Lösungsmittelextraktion entfernt wird, die auf den Säurespaltungsschritt des Edman Abbaus folgt. An diesem Punkt wird das Peptid unabhängig von seiner Zusammensetzung wegen der vollständig protonierten N-terminalen Aminogruppe eine positive Netto-Ladung aufweisen. Wenn der pKa der Oberflächengruppen ausreichend gering ist, wird die Oberfläche immer noch eine negative Netto-Ladung aufweisen, die die elektrostatische Wechselwirkung mit dem Peptid fördert. Das ATZ Aminosäurederivat ist unter diesen Bedingungen ein kleines ungeladenes hydrophobes Molekül und es wird leicht mit einem Lösungsmittel von dem geladenen Peptid extrahiert. Die einzigen Ausnahmen werden ATZ Histidin und ATZ Arginin sein, die eine positive Netto-Ladung aufweisen und somit schwerer zu extrahieren sind. Wenn die Oberfläche des Glases eine zu hohe Konzentration an Sulfonsäuregruppen aufweist, werden ATZ His und Arg während der Extraktion in der Tat quantitativ auf dem Träger festgehalten.
Lysin, das unter sauren Bedingungen positiv geladen sein kann, wird nach der ersten Edman Kupplungsreaktion nicht geladen sein, da die Epsilon-Amino Gruppe mit PTC unter Bildung des Epsilon-PTC Derivats reagiert, wodurch ATZ Lysin sehr hydrophob und leicht extrahierbar gemacht wird.
Während der Kupplungsreaktion hält eine basische Umgebung eine negative Netto-Ladung auf dem Träger aufrecht. Das Peptid wird über die Carbonylgruppe ebenfalls negativ geladen sein, da der Amino-Terminus an der neutralen PCT Gruppe beteiligt ist. Während der Extraktion von Nebenprodukten der Kupplungsreaktion bleibt das Peptid auf dem Träger, obwohl die elektrostatische Umgebung unvorteilhaft zu sein scheint.
Offensichtlich bildet eine Anzahl von Effekten in Kombination eine sehr stark anziehende Kraft. Vielleicht binden teilweise positive Ladungen innerhalb des derivatisierten Peptids dieses an die hoch negative Oberfläche. Dieser in hohem Maße wünschenswerte Effekt wird für sehr kurze hydrophobe Peptide etwas kompensiert, da ein geringeres CSP zu TMA Verhältnis (s. Fig. 3) ihre Affinität für den Träger verringern können und zu schlechten Ausbeuten an PTH Aminosäuren führen können, wenn die Sequenzierung nahe dem Carboxyl-Terminus stattfindet. Mit mehr hydrophilen Peptiden ist dieses nicht der Fall und die Ausbeuten nahe dem C-Terminus sind weiterhin gut.
In dem reinen Silyl-CSP Träger beträgt die bevorzugte Konzentration an Silyl-CSP in der Lösung, die auf das Glas aufgebracht wird, 1-2%. In dem hybriden Silyl-CSP/Silyl-TMA Träger beträgt die bevorzugte Konzentration an Silyl-CSP 0,1-0,25% und die bevorzugte Konzentration an Silyl-TMA beträgt 0,5-2,0%. Es kann auch ein reiner Silyl-TMA Träger hergestellt werden.
Wir haben gefunden, daß das zur Herstellung des Glasträgers verwendete Verfahren für die Leistung der Träger in Proteinsequenzanalysatoren sehr kritisch ist. Früher veröffentlichte Verfahren zur Silyl-Derivatisierung von Glas zur Verwendung bei Proteinsequenzen haben sich als sehr unzuverlässig herausgestellt. Viele dieser Verfahren machen eine extensive Vorbehandlung der zu derivatisierenden Oberfläche mit verschiedenen Säuren (ein sogen. "Säureätzen") und mit Basen notwendig, um die Silylierung erfolgreich zu machen. Wir haben gefunden, daß diese Vorbehandlungsverfahren vollkommen unnötig und in den meisten Fällen schädlich sind. Insbesondere ist die Spülung mit einem Lösungsmittel vor der Hitzebehandlung nicht wünschenswert. Durch die nachstehenden Verfahren werden Oberflächen mit einer konsistent höheren Affinität für Proteine und Peptide hergestellt. Diese Beispiele erläutern die Herstellung und Verwendung der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 1

Ein mit Silyl-CSP derivatisierter Glasträger wird zur Verwendung als ein Peptidträger bevorzugt, wenn Histidin und Arginin nicht in dem Peptid vorliegen. Diese Art einer Oberfläche hält ATZ Histidin und ATZ Arginin stark fest, so daß sie nur schlecht von dem Reaktionsträger extrahiert werden können. Die Zugabe einer Verbindung wie Silyl-TMA, wie im nachstehenden Beispiel 2 dargestellt, verringert diesen Effekt möglicherweise dadurch erheblich, daß sie um die negativen Stellen konkurrieren, die auf der Silyl-CSP Oberfläche vorliegen. Eine reine Silyl-CSP Oberfläche zur Verwendung als Peptidträger wird wie folgt hergestellt
1. Gieße 95 ml Methanol vom HPLC-Grad in einen graduierten 100 ml Glaszylinder und gib 5 ml Wasser vom HPLC-Grad hinzu.
2. Mische gut und gib 2 ml einer 50%-igen Lösung aus Silyl-CSP in Methylenchlorid zu. (Die effektive Konzentration beträgt somit etwa 1 % an Silyl-CSP).
3. Mische gut und laß' 5 Minuten lang stehen, um die Hydrolyse der Silylgruppen zu ermöglichen - laß' nicht länger als 5 Minuten stehen.
4. Gieß die Lösung in Petrischalen aus Glas.
5. Bringe Glasfaserscheiben (z.B. Whatman GF/F oder GF/C Glasfaserscheiben) in die Lösung und stelle sicher, daß sie vollständig benetzt werden.
6. Inkubiere 5 Minuten lang unter häufigem Schütteln und Drehen, wenn notwendig, um eine gute Exposition des Glases an die Lösung sicherzustellen - es ist wichtig, die Scheiben mit der Lösung vollständig bedeckt zu halten.
7. Hänge die Scheiben nach Ablauf von 5 Minuten 30 Minuten lang in einen Ofen bei 110 ºC. Spüle die Scheiben vor der Hitzebehandlung nicht mit einem Lösungsmittel.
8. Verwirf die Lösung in den Petrischalen und ersetze sie mit frischem Methanol während sich die Scheiben in dem Ofen befinden.
9. Entferne die Scheiben am Ende der Inkubation in dem Ofen und bring sie in die Methanol enthaltenden Schalen und spüle sie gründlich durch Schwenken.
10. Bring jede Scheibe in einen Büchner-Filtertrichter und wasche mit drei Trichtervolumina Methanol unter Einsatz von Schwerkraftzuführung.
11. Bring die gewaschenen Scheiben in eine Vakuumkammer und trockne sie mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Andere Glasträger können anstelle von Whatman GF/F oder GF/C Filtern verwendet werden.
Der reine Silyl-CSP Träger oder der Hybridträger werden zur Sequenzierung von kurzen Peptiden bevorzugt.

Beispiel 2

Eine mit einem Gemisch aus Silyl-CSP/Silyl-TMA derivatisierte Glasoberfläche kann ebenfalls zur Verwendung als Peptid- oder Proteinträger hergestellt werden und dieses ist der am meisten bevorzugte Träger. Das Gemisch bietet im Vergleich zu reinem Silyl-CSP oder reinem Silyl-TMA eine überlegene Peptidleistung, da PTH Histidin und PTH Arginin gut extrahiert werden während die Oberflächenaffinität selbst für kleine hydrophobe Peptide hervorragend ist. Reines Silyl-TMA funktioniert bei den meisten kleinen Peptiden überhaupt nicht. Der gemischte Träger wird dadurch hergestellt, daß zuerst ein Silyl-CSP Träger wie in Beispiel 1, aber mit 0,5 ml einer 50%-igen Lösung von Silyl-CSP in Methylenchlorid (d.h. 0,25% nach Verdünnung) hergestellt wird und dann das Verfahren von Beispiel 1 allerdings mit 4 ml eines 50%-igen Silyl-TMAS in Methanol (d.h. 2% nach Verdünnung) befolgt wird.

Beispiel 3

Figur 1 erläutert den Wert des Hybrid CSP/TMA Trägers zur Peptidanalyse. Das Decapeptid Pro-His-Pro-Phe-His-Phe-Phe-Val-Tyr- Lys (200 PM) wurde in einen automatischen Gasphasensequenzanalysator (Porton Instruments PI 2020) geladen. Dieses Decapeptid stellt für die meisten automatischen Gas- oder Gas/Flüssigphasensequenzanalysatoren wegen seines extrem hydrophoben C- Terminus eine erhebliche Herausforderung dar.
Der Sequenzanalysator wurde entweder mit dem Hybrid CSP/TMA Träger aus Beispiel 2 oder einem mit Polybrene behandelten Träger ausgerüstet. Der letztere Träger wurde dadurch hergestellt, daß 1,5 mg Polybrene in 15 ul H&sub2;O auf einen nicht derivatisierten Glasfaserträger pipettiert wurden und man es verdampfen ließ. Wie in Figur 1 gezeigt wird, ergibt der mit Polybrene (1A) behandelte Träger einen erheblich höheren Hintergrundpegel von Artefakten (Peaks die mit "*" markiert sind) als der CSP/TMA Träger während des ersten analytischen Cyclus.

Beispiel 4

Figur 2 zeigt das Ergebnis der Veränderung des CSP/TMA Verhältnisses von 0,25% CSP/2% TMA (Figur 2B) auf 0,1% CSP/2% TMA (Figur 2C). Die Wahl des letzteren Verhältnisses steigerte die Ausbeute an PTH-Histidin in Cyclus 2 erheblich. Die Silyl-CSP Komponente des Hybrid Trägers sollte üblicherweise eine Konzentration von 1% nicht übersteigen und 0,25% werden bevorzugt. Wenn ein Peptid sequenziert wird, von dem bekannt ist, daß es reich an His oder Arg ist, kann der Einsatz eines Hybridträgers wünschenswert sein, der unter Verwendung einer noch geringen Silyl-CSP Konzentration hergestellt wurde.

Beispiel 5

Die Behandlung eines reinen 2%-igen Silyl-CSP Trägers mit 150 ug Polybrene verringert das Festhalten des Peptids und somit die Ausbeute an PTH Derivaten des analysierten Decapeptids erheblich. Wenn aber 1,5 mg Polybrene zugegeben werden, ist das Festhalten des Peptids mit demjenigen von mit Polybrene behandelten nicht derivatisierten Glasträgern vergleichbar.
Wenn der Silyl-CSP Träger durch Einbetten der Probe und dann Zugabe einer geringen Menge eines zusätzlichen Einbettungsmittels (d.h. Polybrene) bearbeitet wird, sollte dies nicht zu einem Verlust des Festhaltens der Probe führen. Wenn der Portonträger jedoch nach einem Prinzip arbeitet, das auf der elektrostatischen Wechselwirkung mit der Probe basiert, würde die Zugabe einer geringen Menge einer polybasischen (d.h. positiv geladenen) Substanz, wie Polybrene, sehr wahrscheinlich mit der elektrostatischen Anziehung des negativ geladenen Trägers für die Probe interferieren. Diese geringe Menge an Polybase reicht jedoch nicht aus, um die Probe einzubetten. Die Zugabe von einer größeren Menge Polybrene (> 1,5 mg) wird die geladenen Gruppen auf dem Träger vollständig bedecken und die Probe einbetten.

Claims

1. Verwendung eines mit einem Silan mit einer freien Säuregruppe derivatisierten Glasträgers, wobei die Säure einen pKa< 1 aufweist und der derivatisierte Glasträger ein Peptid oder Protein festhalten kann, als Träger in einem Verfahren zur Sequenzierung eines Peptids oder Proteins, das das Immobilisieren des Peptids oder Proteins auf einen Träger und das Sequenzieren des Peptids oder Proteins durch stufenweisen Abbau umfaßt.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Säuregruppe aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Phosphor-, Pikrin-, Salz-, Trifluoressig- Trichloressig-, Chrom-, Iodwasserstoff-, Pyrophosphor-, Sulfon- und Halogensulfonsäuren besteht.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Säuregruppe eine Sulfon- oder Halogensulfonsäuregruppe ist.

4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei der Träger durch Inkubation eines Glasträgers mit einem 4-Chlorsulfonylphenylalkylalkoxysilan hergestellt wird.

5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei das Silan 2-(4-Chlorsulfonylphenyl)ethyltrimethoxysilan ist.

6. Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Silan 3- (Trimethylsilyl)-1-propansulfonsäure ist.

7. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Träger sowohl mittels eines ersten Silans mit einer freien Säuregruppe mit einem pKa< 1 als auch mittels eines zweiten Silans mit einer quatären Ammoniumgruppe derivatisiert wird.

8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Säuregruppe eine Sulfon- oder Halogensulfonsäuregruppe ist.

9. Verwendung nach Anspruch 7, wobei das erste Silan 2-(4- Chlorsulfonylphenyl)ethyltrimethoxysilan und das zweite Silan N-Trimethoxysilylpropyl-N,N,N-trimethylammoniumchlorid ist.

10. Derivatisierter Glasträger, der einen mittels eines ersten Silans mit einer freien Säuregruppe mit einem pKa< 1 und mittels eines zweiten Silans mit einer quatären Ammoniumgruppe derivatisierten Glasträger umfaßt.

11. Träger nach Anspruch 10, wobei die Säuregruppe eine Sulfon- oder Halogensulfonsäuregruppe ist.

12. Träger nach Anspruch 10, wobei das erste Silan 2-(4-Chlorsulfonylphenyl)ethyltrimethoxysilan und das zweite Silan N-Trimethoxysilylpropyl-N, N, N-trimethylammoniumchlorid ist.