DE2631610A1 - Serum hepatitis test - Google Patents

Serum hepatitis test

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DE2631610A1 DE19762631610 DE2631610A DE2631610A1 DE 2631610 A1 DE2631610 A1 DE 2631610A1 DE 19762631610 DE19762631610 DE 19762631610 DE 2631610 A DE2631610 A DE 2631610A DE 2631610 A1 DE2631610 A1 DE 2631610A1
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Hepatitis - assoziiertem Antigen in Seren.
Stoffe lassen sich ,in fluiden Medien auch bei sehr geringer Konzentration durch radioaktive Kennzeichnung nachweisen. Bei der radioaktiven Iinmunprüfung (B.IA, radioimmunoassay) werden radioaktiv gekennzeichnete Stoffe in einer AntikÖrper-Antigenumsetzung zum. Nachweis oder zur .Konzentrationsmessung von Stoffen verwendet, für die Antikörper bestehen. Die Prüfung macht sich die Beobachtung zu Nutze, daß eine bekannte Menge des radioaktiv gekennzeichneten Stoffs mit einer radioaktiv nicht gekennzeichneten, unbekannten Menge dieses Stoffes bei der Besetzung einer begrenzten Menge komplexbildender Stellen auf dem Antikörper in Wettbewerb tritt. Durch radioaktive Zählung der Umsetzungsprodukte kann die unbekannte Konzentration ermittelt werden.
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263161 Q
Ein wesentlicher Schritt hierbei ist die Trennung der -immunchemisch komplexgebundenen Stoffe von der Iiifctibätionslösuiig, die möglichst vollständig, einfach und rasch möglich sein7 .soll. Wesentlich erleichtert wird diese Trennung durch Verwendung" von Antikörpern oder Äntigeneii, welche durch ■ Arüief tung oder Bindung an wasserunlösliche Träger immobilisiert wurden (soger;.. f estphasige RIA oder SPRIA, solid phase' radio iiiii.amo as cay).
Aufgabe der Erfindung ist ein rasch^ zuverlässig und mit ' großer Sfachweisempfindlichkeit durchführbares Verfahren suq Nachweis von HAA In Seren auf G-rundlage der SPRIA.
Zur Lösung wird erfindungsgemäS vorgeschlagen, daß eine" Seruniprobe mit einem Reagens infcubiert wird, welches Anti-Hepatitis assoziiertes Antigen-Antikörper über einen Silankuppler !covalent an siliziumhaltige Partikel mit einer Oberfläche von wenigstens 1 qm/g und falls diese porös sind, einem durchschnittlichen Porendurchmesser von wenigstens 1000 K gebunden enthält, wobei die Inkubation unter eine Komplexbildung von Hepatitis - ass'osiiertem Antigen mit den Antikörpern erlaubenden .Bed.indungen durchgeführt wird, das Reagens- abgetrennt und mit einer Lösung von radioaktiv gekennzeichneten Anti-Hepatitis — assoziierten Antiken-Antikörpern unter eine Kömplexbildung dieser gekennzeichneten Antikörper mit den zuvor gebildeten Komplexen des Reagens inkubiert wird, die Umsetzungsprodukte abgetrennt und auf Radioaktivität gemessen werden^-
6 0 -.··■:&/ 0 77 B
_ 1Z _
Es ist "bekannt, Antikörper und Antigene an die verschiedensten Träger zu "binden, so z.B. an organische Träger, US-PS 3,555,143, oder über Silankuppler an anorganische Stoffe, US-PS 3,652,761. Die US-PS (Ser. Nr. 447,252) beschreibt SPRIA Verfahren zur Konzentrationsmessung von Digoxin, Insulin und Estriol. Hierbei werden Antikörper verwendet, welche mit diesen Stoffen Komplexbildungen eingehen und über Silane an Glaspartikel im /um und noch kleineren Bereich gekoppelt werden.
Ein brauchbares, rasches und mit guter Empfindlichkeit arbeitendes SPRIA Verfahren zum Nachweis von HAA fehlt jedoch bisher, vgl. "Radioassay Test Kits and Components", Laboratory Management, Sept. 1974, S. 29 - 42, und US-PS 3,867,517, wonach zum Nachweis HAA sandxo.chartig zwischen einem immobilisierten Anti-HAA-Antikörper und einem gekennzeichneten Anti-HAA-Antikörper angeordnet werden muß. Nach einer Ausbildung sollen die ungekennzeichneten Antikörper durch Anheftung an die Innenwand eines Reagenzglases immobilisiert werden.
Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren ermöglicht demgegenüber die rasche und sehr empfindliche, genaue Prüfung in relativ einfacher und zuverlässiger Weise.
S0UÜ8G/0776
Each, "bevorzugter. Ausgestaltung werden die lachwelsmittel In einer etwa 10. - 300/ug Kompositum pro. Test in 0,1 -..0,2, ml .. Wasser enthaltenden Suspension vorgesehen, wobei die Anti- -.. körper an Kieselsäure- oder poröse Glaspartlkel der durchschnittlichen Größe 0,1 - 10/um, vorzugsweise 0,1 - 3/um"gekoppelt sind. Die bevorzugten Serumproben reichen von etwa, 100 - 1000 /L und die erste Inkubation dauert etwa 5 Minuten. Die zweite Inkubation wird vorzugsweise mit durch I ^ gekennzeichneten Antl-HAA-Antikörpern mit einer radioaktiven Zahlung von wenigstens 20 000 cpm durchgeführt.
Ein wesentliches Umsetzungmittel zur Durchführung des Verfahrens besteht aus einem als G-S-Ab kennzeichenbaren Kompositum, worin G einen Träger aus siliziumhaltigen Partikeln, insbesondere aus Kieselsäure oder porösem Glas, S ein Silankupplungsmittel mit einer (an der Oberfläche G in bekannter Weise gebundenen) silizitimfunktioiiellen Gruppe und einer zur kovalenten Bindung an Ab, (einen Anti-HAA-Aiitikörper) modifizierbaren organofunktionellen Gruppe bezeichnet. Die Bindung von Ab über S-G ist nicht Gegenstand der Erfindung, vgl. hierzu US-PS 3,652,761. Jedoch sind die physikalischen und chemischen Eigenschaften des Trägers G für die Prüfempfindlichkeit und Geschwindigkeit von großer Bedeutung.
Die physikalischen Eigenschaften und Grenzwerte des Trägers erhellen aus einem Prüfbeispiel. Das Äusgangsmaterial (das Umsetzungmittel G-S-Ab) wird mit einer unbekannten Serumprobe
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inkubiert. Ist HAA vorhanden, so entsteht unter immunchemischer Komplexbildung"des HAA mit der Ab Komponente G—S-Ab-HAA, das sodann seinerseits mit einer Lösung der gekennzeichneten Antikörper (Ab ) inkubiert wird und als Umsetzungsprodukt G-S-Ab. HAA.Ab bildet, unter immunchemischer Komplexbildung der Ab
-j or
Komponente (mit I gekennzeichnetes Anti-HAA) mit HAA. Ein gen nauer HAA Nachweis erfordert eine im wesentlichen vollständige Trennung des Umsetzungsproduktes von der Lösung der gekennzeichneten Antikörper. Sie wird durch Wahl einer Partikelgröße gewährleistet, welche groß genug ist, um mit dem in klinischen Laboratorien verfügbaren Zentrifugen auszentrifugiert zu werden. Plierfür sollte die durchschnittliche Partikelgröße wenigstens etwa 0,1 /um betragen.
Angesichts der Größe der verschiedenen entstehenden Komplexe kommt der Trägeroberfläche und Porösität große Bedeutung zu. So gestattet beispielsweise im Regelfall eine große Oberfläche eine vergleichsweise starke Beschickung mit Ab und letzten Endes einen sehr empfindlichen, genauen Nachweis. Eine Oberfläche kann durch Zerkleinerung von Partikeln und/oder poröse Partikel vergrößert v/erden. Im vorliegenden !"alle hat die zulässige durchschnittliche Porengroße aber eine praktische untere Grenze, bedingt durch die Größe der Komplexe und die erforderliche Diffusion, die bei etwa 1 qm/g liegt 9 und durch Zerkleinerung bis auf eine durchschnittliche Korngröße von etwa 0,1 - 10 /um oder durch Verwendung sorgfältig ausgewählter Porengrößen erreicht werden kann.
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Die Größe des für den Nachweis verwendeten sandwichartigen Komplexgebildes "beträgt etwa· 1 χ 10 Dalton. Durch eine Reihe von Versuchen konnten die praktischen Mindestvoraussetzungen der physikalischen Trägereigenschaften ermittelt werden. Zur" Aufnahme der Komplexe und für die Diffusion der Umsetzungsteilnehmer sollte bei Wahl eines porösen Trägers die durchschnittliche Porenweite (Durchmesser) etwa 1000 Ä betragen. Diese Größenordnung erhält man z.B. bei Partikelgrößen von 200 - 400 mesh. Derart große Partikel bleiben allerdings nicht lange in Suspension und erfordern die Durchführung im Kolonnenverfahren oder bei absatzweisem Vorgehen Rührung bzw. Bewegung. Bevorzugt wird die Durchführung mit einer Suspension von Partikeln im Mikronbereich. Die verwendbaren Porengrößen (>- 1000 Ä) nehmen zusammen mit der durchschnittlichen Korngröße ab. Die physikalischen Eigenschaften der für den Nachweis geeigneten Träger sind also das Ergebnis einer spezifischen, gegenseitigen Abhängigkeit der Korngrößen, der erforderlichen Oberfläche,. Diffusion, Trennung und Mindestporengröße.
Es wurde z.B. gefunden, daß porösen Glas mit einer durchschnittlichen Korngröße von 1 - 3/um und einer durchschnittlichen Porenweite von 550 1 kein rationeller Träger ist, weil der größere Teil der vergleichsweise großen Gesamtoberfläche durch Poren gebildet wird, die zur Aufnahme des 1 χ 10 Dalton großen Komplexes zu klein sind. Dagegen kann ein aus Glas mit 550 £ großen Poren auf 0,1 - 0,4/um (im Durchschnitt) -zerkleinerten Partikeln erfolgreich eingesetzt werden, weil die verfügbare Gesamtoberfläche
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im wesseitlichen, durch den Oberflächenbereic.h und nicht.durch die inneren· Poren gebildet wird. An dem entgegengesetzten Extrem sind unpor.ö&e. Partikel der.- Größe 200 - 400 mesh wegen de%fpinima;lßn. G-esgmtoberfläche für die praktische Verwendung nicht ,geeignet* -:.-.. . : · . ■ . .
Die .bisher günstigsten Träger sind unporöse Partikel,der durchschnittlichen Größe 1 - 3/um. Sie bieten eine ausreichende Fläche.für eine starke Beschickung (und gute Empfindlichkeit) , können zur optimalen Diffusion der Umsetzungsteilnehmer während der Inkubation suspendiert werden,r und sind relativ einfach zu handhaben.
Die durchschnittliche Partikelgriüße (2/um) liefert eine Gesamtoberfläche von etwa 7 qm/g. Ebenfalls geeignet, wenn auch nicht ganz so günstig, waren unporöse Partikel der durchschnittlichen Große von 5 - 10 /um (etwa 3 qm/g Gesamtoberfläche). Die größten, praktisch brauchbaren, unporösen Partikel sind etwa 10/um im Durchschnitt.
Die Tabelle I enthält verschiedene Kombinationsmöglichkeiten von Gesamtoberflächen, durchschnittlichen Poren- und Partikelgroßen von siliziumhaltlgen Trägern, sowie eine Zusammenfassung der Prüfergebnisse für jeden Träger, wobei "-" nicht gut brauchbar, "+" praktisch sehr brauchbar, "1/2+" einigermaßen praktisch brauchbar bezeichnen.
609886/0711 ' " 8 "
Tabelle I
Trägereigenschaften Prüfergebnisse
Oberfläche Partikelgröße porös Porenweite
qm/g (durchschnitt1.) ja/nein (durchschnittl.)
>100
1 - ja 550 S
2 - ja 250 Ä
- 3/um nein -
- 5/um nein -
200/400 mesh ja "550"
5 - nein -
0,1 ja 1500
1 ■ ja 2500
5 ■
- 10/um
I - 4/um
- 3 /um
- 10/um
200/400 mesh
Den Versuchen ist zu entnehmen, daß die Träger eine Gesamtoberfläche von wenigstens etwa 1 qm/g, eine Partikelgröße von wenigstens etwa 0,1 und im Falle poröser Träger eine durchschnittliche Porenweite von wenigstens etwa 1000 S. haben sollten . Dies erreicht man durch Verwendung von siliziumhaltigem Ausgangsmaterial mit Oxid- oder Hydroxidgruppen an der Oberfläche, welche mit dem Siliziumfunktionellen Teil des Silankupplers in Umsetzung treten können. Sie sind im Handel erhältlich (z.B. Syloid poröse Kieselsäure, CPG-controlled pore glass) oder können nach der US-PS 3,549,524 hergestellt werden; es hat meist Porenweiten von 100 - 2500 S, wobei der praktisch brauchbare Bereich hier 1000 2500 ϊ ist.
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!fach ganz besonders günstiger Ausbildung haben die porösen oder unporösen Partikel durchschnittliche Mindest- und Höchstwerte, von 0,1 - 3/um, um einerseits das Zentrifugieren zu erleichtern^ .andererseits eine für die optimale Umsetzung und Diffusion günstige Suspension im wässerigen Medium zu erhalten.
Die Herstellung des Kompositums erfordert zwei Yerfahrenssehritte. Zunächst werden die Partikel mit einem Silankoppler umgesetzt, um eine organische Basis für die Kopplung der Antikörper zu erhalten. Hierzu müssen die Partikel sauber sein und zur Bindung mit dem Siliziumfunktionellen Teil des Silans an der Oberfläche verfügbare Oxid- oder Hydroxidgruppen aufweisen. Die evtl. erforderliche Säuberung kann in bekannter Weise erfolgen. Nach Ansetzung mit dem ,Silan wird der Körper als "silanisiert" bezeichnet, oder nach der organofunktionellen Gruppe an der Oberfläche bezeichnet, z.B. Arylamin V.OPG·1' (geregelt poröses Glas- controlled porous glass), oder Alkylamin GPG.. Im einzelnen vgl. US-PS 3,519,538 und 3,652,761, sowie Ser. Nr. 447252. Nach der Silanisierung werden die organfunktionellen Teile des Silans meist zur Kopllung mit den Antikörpern modifiziert., z.B. diazotiert, und sodann mit dem Anti-HAA-Antikorpern in einer Lösung unter Bedingungen umgesetzt, welche eine maximale Bindung der Antikörper in einem aktiven (funktionellen) Zustand gewährleisten. Es wird angenommen, daß die Anti-HAA-Antikörper ihre komplexbildende Fähigkeit bei mehreren verschiedenen Kopplungsumsetzungen beibehalten.
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-ίο- 263 Ί
Zur Sicherung einer maximalen Antikörperbeschicfcung wird i.d.R. die Menge der mit dem modifizierten Silanträger umgesetzten Antikörper auf Trockengewichtsbasis im Bereich von etwa 100 für 1 ml unfraktioniertes Antikörpers erum. pro g Träger gehalten. Nach Immobilisierung der Antikörper auf dem Träger werden sie zur Verwendung vorzugsweise in wässerige Suspension gebracht, Z0B. durch Schallbehandlung, Eine bevorzugte Suspension für einen einzelnen 7ersuch bzw, Nachweis besteht aus etwa 10 — 300/Ug Kompositum pro 0,1 - 0,2 ml wässerige Lösung, vorzugsweise mit 0,05M phosphatgepufferter Salzlösung zur Aufrecht— erhaltung eines pH Bereichs von 6,5 - 8 gepuffert.
Das Umsetzungsmittel für einen Serum-Hepatitisnachweis besteht aus dem bis zum Gebrauch in einem verschlossenen Reagenzglas aufbewahrten Kompositum in wässeriger lösung.
Pur einen Nachweis werden etwa 200 χ des menschlichen Blutserums zu etwa 200 χ Suspension gegeben und vorzugsweise bei 45 C während 10 Minuten inkubieren gelassen. Etwa vorhandenes HAA geht dann mit den immobilisierten Anti-HAA-Antikörpern eine Komplexbildung ein, wobei die entstehende Komposita als
G - S - Ab·HAA
bezeichnet werden können, worin G- der Träger, S das Silan, Ab der Anti-HAA-Antikörper ist, und HAA an diesen komplexgebunden ist.
- 11 -
g09886/077S
Das Kompositum wird dann gewaschen, "beispielsweise, indem die
Partikel auszentrifugiert, in einer Waschiösung erneut suspendiert, und wiederum auszentrifugiert werden. Eine Wäsche reicht meist aus, um das Kompositum von anderen Stoffen wie Serumproteinen oder überschüssigem Antigen zu befreien. Nach der
Wäsche ist das Kompositum je nach der Serumprobe
G - S - Ab'HAA oder
G-S-Ab.
Es wird abgetrennt, mit 200 χ Lösung von gekennzeichneten
Anti-HAA-Antikörpern versetzt un<
20 Minuten, inkubieren gelassen.
Anti-HAA-Antikörpern versetzt und, vorzugsweise bei 45 C während
Da HAA mit mehr als einem Anti-HAA-Antikörper komplexbildend
sein kann, entsteht bei Vorhandensein von HAA in der Serumprobe der Komplex
G-S- Ab«HAA«Ab*,
worin Ab* den radioaktiv gekennzeichneten Antikörper bezeichnet,
125
wofür I bevorzugt wird. Die vorstehenden Ausführungen dienen nur der Erläuterung. Die wirklichen Bindungen und Komplexbildungsabläufe sind meistens komplizierter.
Nach der Inkubation mit den gekennzeichneten Antikörpern werden die festphasigen Inkubationsprodukte z.B. durch Zentrifugieren mit 2000 UpMin. während 1 Minute abgetrennt, und entweder die
abgetrennten Komposita oder das verbleibende Medium auf Radioaktivität gezahlt und damit festgestellt, ob die Serumprobe HAA
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enthielt. Zur Berücksichtigung von Spurenrest en "des gekenn— · ' ■ '■■ zeichneten -Materials und "von: Häuschen·,- Störungen etc. sollte" der HachweisTinter Herä-nziehung von positiven oder negativen Vergleichspröben durchgeführt werden, wob ei i.d»R. das' mittlere : Zählverhältnis der positiven zu negativen Vergleichsproben · - ■ wenigstens 3 i Ί"betragen sollte. Ein sehr-hohes Verhältnis der Probenzahlwerte zu negativen Vergleichszählwerten "ist' · :- . ■■ ■ für die Auswertung und den klaren'Nachweis' eines positiven Befundes günstig, da nur als Grenzwerte angezeigte positive Be- ■ funde u.U. noch bestätigt werden müßten.
In beispielsweise durchgeführten Versuchen wurden Anti-HAA-Antikörper mit verschiedenen slliziumhaltigen Partikeln Innerhalb der für Suspensionsfälligkeit und Nachweis empfindlichkeit ■ erforderlichen Poren- und Partikelgrößengrenzen gekoppelt. Es wurden etwa 2 - 5 g Abschnitte unter Verwendung der oben beschriebenen Träger hergestellt. Die bevorzugten Stoffe wurden durch Silanisierung der Träger mit a-Aminopropyltriäthoxysilan (A-1100 Union Carbide) zur Bildung einer Arylaminoberfläche bereitet, wobei die letztere anschließend in bekannter Weise zur Bildung einer gegenüber einer Lösung der Anti-HAA-Antikörper stark umsetzungsfreudigen, diazotierten Oberfläche modifiziert wird. Etwa 1 ml rohes Antikörperserum wird mit je 1 g diaziertera Träger umgesetzt und ergibt ein Kompositum G-S-Ab, dessen Ab über Azoketten gekoppelt ist. In den unten aufgeführten Versuchen bestand der bevorzugte Träger aus unporösen Schmelzkies elsäurepartikeln mit der durchschnittlichen Korngröße 1 - 3/um.
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Die "besonders gute Brauchbarkeit dieses Trägers wurde in diesen Versuchen dadurch nachgewiesen, daiS er mit der Suspension zur Hachweisbestätigung in bekannter oder bezogenen, . HAA enthaltenden Blutproben eingesetzt wurde. Der HAA-Nach- ' :. weis gilt dabei als erfolgreich geführt, wenn das Zählverhältnis (cpm) einer positiven Probe zu einer bekannten, negativen Vergleichsprobe wenigstens 3 : 1 beträgt. Dies wurde in den unten aufgezeichneten Versuchen sogar über- . schritten.
Die folgenden Tabellen II und III zeigen die Titrierverfahren für die verwendeten HAA-Proben und Anti-HAA-Antikörper im Vergleich zu den durch G-egenstromelektrophorese (CEP, counterelectrophoresis) erhaltenen Ergebnissen.
T a b e 1 1 e II /Titrierverfahren für HAA-Antigen
Das verwendete Hepatitis-Antigen wurde in PBS/BSA Puffer gelöst,
(+) GPM
Ag Lösung : 20 (-) GPM
Vergleiche : 200 210
278
1 : 2000
1 : 20.000
1 : 200.000
1
1
787
778		 (1 : 1000 CEP)
13109
13228
111509
11163		 ■-
4476
4376
1179
1192
359
426
-H-609886/0776
-H-
Tabelle III Titrierverfahren für Anti-HAA-Ant!körper
Die Proben werden inkuMert, gewaschen, mit Reiiienlösungen des Antikörpers "versetzt, 30 Minuten inkubiert, gewaschen, zentrifugiert und abgesaugt.
1200
1190
201 189
220 215
305 291
491 501
1100 1200
Aus diesen Versuchen wurde der 'liter der nassen Antikörperlösung mit 1 : 10.000 ermittelt. Dies ist die stärkste Verdünnung, welche eine Bindung des gekennzeichneten Antikörpers an das Antigen verhindert.
Vergleiche : 10 190
201
1 : 100 209
190
1 : 1000 273
216
1 : 10.000 199
181
1 : 100.000 111
210
1 101
290
- 15 -
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T ab el I e IV
Versuche _ zur HAA Irtkubationsäauer.. . ;■ _.
Der immobilisierte Hepatitis Antikörper (100 * JOOyUg (Mlkrogramm) Kompositum in' 100 ^PBS-BSA Puffer)wurde mit .0,2 ml Serumprqben bei 40^e 1Ö:Min.ut8ii bis-2 Stunden inkUbiert,, einmal gewaschen,-mit 0,2 ml Hepatitis Antikörper versetzt/ JO. Miaa.uten.bei 45 G . ; inlmbiert, zweimal gewaschen und gezählt.
Antigen ' '"■ = ■-.....■_..-■■
Inlmbationsdauer .. / . . (.*) -QPM (,+ t-; 1000 PEP) QPM
10 Minuten 550 2f63
400 2100
30 Minuten 515 2497
518 2561
60 Minuten 605 2301
519 2675
120 Minuten 563 2738 -
482 2269
Wie die Versuche zeigen, ist die Ag-Ab Umsetzung nach etwa 10 Minuten beendet.
' " ' Tabelle .7 " ■. Probengrößen und Empfihdlichkeitserhöhung .
Hierzu wurd die Größe der Proben verändert.. Die positiven Proben bestanden aus einem im Handel bezogenen GBP, Vergleich in der änderung 1 : 500
Probengröße (λ) (-) CPM (+) QPM
1210
- 16 -
206
267		 586
488
201
- · 302		 783
894
194
199		 1217
1112
204 1212
1210
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In Grenzfällen, kann die Probe vergrößert und erneut getestet werden.
Wie diese Versuche zeigen, ermöglichst das erfindungsgemäße Umsetzungsmittel einen raschen Fachweis (+:- Verhältnis ^3 : 1). Die erste Inkubation dauert nur 10 Minuten, G-esamtprüfdauer ist oft nur 30 Minuten, im Vergleich zu bisher 3 Stunden und mehr.
- 17 -
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Claims (3)

  1. -17- ' bJ 1-610
    Patentansprüche
    1J Verfahren zum Nachweis -von Hepatitis-assoziiertem Antigen (HAA) in Seren, dadurch gekennzeichnet, daß eine Serumprobe mit einem Reagens inkubiert wird, welches Anti-Hepatitis-assoziiertes Antigen-Antikörper über einen Silankuppler kovalent an siliziumhaltige Partikel mit einer Oberfläche von wenigstens 1 qm/g und falls diese porös sind, einem durchschnittlichen Porendurchmesser von wenigstens 1000 Ä gebunden enthält, wobei die Inkubation unter eine Komplexbildung von Hepatitis-assoziiertem Antigen mit den Antikörpern erlaubenden Bedingungen durchgeführt wird, das Reagens abgetrennt und mit einer Lösung von radioaktiv gekennzeichneten Anti-Hepatitis-assoziierten Antigen-Antikörpern unter eine Komplexbildung dieser gekennzeichneten Antikörper mit den zuvor gebildeten Komplexen des Reagens ermöglichenden Bedingungen inkubiert wird, die Umsetzungsprodukte abgetrennt und auf Radioaktivität gemessen werden.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Serumprobe mit dem Reagens in wässeriger Lösung umgesetzt wird.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die siliziumhaltigen Partikel 0,1 - 10/um groß sind.
    - 18 -
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    Ein wesentliclier Schritt hierbei ist die Trennung der iinmunchemisch komplexgebundenen Stoffe von der Inkubationslösung, die möglichst vollständig, einfach und rasch möglich sein soll. Wesentlich erleichtert wird diese Trennung durch Verwendung von Antikörpern oder Antigenen, welche durch Anheftung oder Bindung an wasserunlösliche Träger immobilisiert wurden (sogen, festphasige RIA oder SPRIA, solid phase radioimmunoassay).
    Aufgabe der Erfindung ist ein rasch, zuverlässig und mit großer nachweisempfindlichkeit durchführbares Verfahren zum Hachweis von HAA in Seren auf Grundlage der SPRIA.
    Zur Lösung wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, daß eine Serumprobe mit einem Reagens inkubiert wird, welches Anti-Hepatitisassoziiertes Antigen-Antikörper über einen Silankuppler kovalent an siliziumhaltige Partikel mit einer Oberfläche von wenigstens 1 qm/g und falls diese porös sind, einem durchschnittlichen Porendurchmesser von wenigstens 1000 Ä gebunden enthält, wobei die Inkubation unter eine Komplexbildung von Hepatitis-assoziiertem Antigen mit den Antikörpern erlaubenden Bedingungen durchgeführt wird, das Reagens abgetrennt und mit einer Lösung von radioaktiv gekennzeichneten Antl-Hepatitis-assoziierten Antigen-Antikörpern unter eine Komplexbildung dieser gekennzeichneten Antikörper mit den zuvor gebildeten Komplexen des Reagens ermöglichenden Bedingungen inkubiert wird, die Umsetzungsprodukte abgetrennt und auf Radioaktivität gemessen werden.
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    Es ist "bekannt, Antikörper -und Antigene an die verschiedensten Träger zu "binden, so z.B. an organische Träger, US-PS 3 »555,143,- oder über Silankuppler an '
    US-PS 3,652,761. Die US-PS 3,975,511 beschreibt fahren zur Konzentrationsmessung von Digoxin, Insulin und Estriol. Hierbei werden Antikörper verwendet, welche mit diesen Stoffen Komplexbildungen eingehen und über Silane an Glaspartikel im /um und noch kleineren Bereich gekoppelt werden.
    Ein brauchbares, rasches und mit guter Empfindlichkeit arbeitendes SPHIA Yerfahren zum Nachweis von HAA fehlt jedoch bisher, vgl. "Radioassay Test Kits and Components", Laboratory-Management, Sept. 1974, S. 29-42 und US-PS 3,867,517, wonach zum Nachweis HAA sandwichartig zwischen einem immobilisierten Anti-HAA-Antikörper und einem gekennzeichneten Anti-HAA-Antikörper angeordnet werden muß. Nach einer Ausbildung sollen die ungekennzeichneten Antikörper durch Anheftung an die Innenwand eines Reagenzglases immobilisiert werden.
    Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren ermöglicht demgegenüber die rasche und sehr empfindliche, genaue Prüfung in relativ einfacher und zuverlässiger Weise.
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