DE2522086C2 - Reagenz zum Abtrennen und Bestimmen von in biologischen Fluiden vorhandenen AK:Ag-Komplexen - Google Patents

Reagenz zum Abtrennen und Bestimmen von in biologischen Fluiden vorhandenen AK:Ag-Komplexen

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Description

(a) zu der Probe eine bekannte Menge eines für den nachzuweisenden Ak bzw. für das nachzuweisende Ag spezifischen Ag oder Ak oder, wenn ein Ak : Ag-Komplex bestimmt werden soll, eine bekannte Menge des zu bestimmenden Ak : Ag-Komplexes in markierter Form zugegeben wird,
(b) das Gemisch mit einem Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 11 in Berührung gebracht wird,
(c) die feste Phase des Reaktionsgemisches von der flüssigen Phase abgetrennt wjrd und
(d) die Menge des markierten Ak, Ag oder Ak : Ag-Komplexes, die in der flüssigen Phase verbleibt oder die mit der festen Phase abgetrennt wurde, gemessen wird.
Die Erfindung- bezieht sich auf ein Reagenz zum Abtrennen und Bestimmen von in biologischen Fluiden, beispielsweise von Harn oder Serum, vorhandenen Antikörper: Antigen-Komplexen.
Der Einfachheit halber werden im folgenden die Symbole »Ak«, »Ag« und »Ak : Ag« für »Antikörper«, »Antigen« bzw. »Antikörper : Antigen-Komplex« benutzt
Bekanntlich ist es wichtig, daß man biologische Fluide auf Ak, Ag und Ak: Ag-Komplexe analysiert So sind
to beispielsweise viele Krankheiten durch die Anwesenheit von Ak : Ag-Komplexen im Kreislauf gekennzeichnet Bei dem Ag kann es sich um eine große Vielfalt von Proteinen handeln, und zwar einschließlich von solchen Proteinen, die auf die Gegenwart von Bakterien oder Viren zurückzuführen sind, oder von solchen Proteinen, die von menschlichen Geweben oder Krebszellen freigesetzt sind. Die Ak sind natürlich für das^-sjondere Ag spezifisch, und es handelt sich vorwiegend um Immunglobuline der Klasse IgG, die durch das Lymphsystem des Lebewesens synthetisiert sind. Der Nachweis von Ak : Äg-Kompiexen im Biut sowie ihre Abtrennung und Charakterisierung liefern wertvolle Informationen, die beispielsweise zur Diagnose von Krankheiten verwendet werden können.
Zum Nachweis und quantitativen Bestimmung von Ag, Ak und Ak : Ag-Komplexen sind zahl reiche Verfahren bekannt Dies trifft insbesondere auch für die Bestimmung der Natur und Menge des vorhandenen Ag zu. Die quantitativen Bestimmungsverfahren werden Immunoassays genannt Sie sind hinsichtlich Genauigkeit und Einfachheit verbesserungsbedürftig. Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines genaueren und einfacheren Immunoassays sowie eines Reagenzes hierfür.
Es ist seit einiger Zeit bekannt, daß zwei natürlich vorkommende Substanzen, nämlich rheumatischer Faktor, im folgenden mit RF bezeichnet, und eine besondere Komponente von Komplement, nämlich CIq1 die Eigenschaft haben, sich mit Ak : Ag-Komplexen zu vereinigen, jedoch nicht mit einem freien Ag oder einem freien Ak. Obwohl es bereits vorgeschlagen wurde (Agnello et al., J. Exp. Med., 134.228.1971) diese Eigenschaft in einer besonderen Weise zur Feststellung von Ak : Ag-Kompiexen auszunützen (allerdings nicht zur quantitativen Analyse oder absoluten Bestimmung), hat man bisher nicht erkannt, daß RF und CIq potentiell außerordentlich nützliche Reagenzien bei der Analyse von Ak, Ag und Ak : Ag-Komplexen sind.
Es wurde nun gefunden, daß RF uvj CIq in unlöslich
so gemachter Form in einem sehr weiten Bereich einsetzbci.-e Reagenzien bei analytischen Verfahren sind, die Ak, Ag und bzw. oder Ak : Ag-Komplexe betreffen.
Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenz zum Abtrennen und Bestimmen von in biologischen Fluiden vorhandenen Ak : Ag-Komplexen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es mit einem in wäßrigen Fluiden unlöslichen Festphasensubstrat kovalent oder adsorptiv gebundenes RF oder CIq enthält. Die Verwendung dieser Reagenzien führt zu einfacheren und genaueren Immunoassays.
RF ist ein bekanntes Material, und Verfahren für seine Gewinnung und Abtrennung sind bekannt. Es ist im Blut einer Anzahl von Tierarten einschließlich des Menschen vorhanden oder kann darin hervorgerufen werden. Normalerweise gewinnt man es von Ziegen oder Kaninchen durch intradermale Injektionen ihrer eigenen gereinigten Immunglobuline, die vorher durch Erhitzen während 10 min bei etwa 630C angehäuft worden
sind. RF wird dann aus dem Serum, das man von den Tieren erhält, isoliert, indem man das Serum durch eine Säule von angehäuften Immunglobulinen leitet, an denen RF zurückgehalten wird. Der rheumatische Faktor kann dann aus der Säule eluiert werden, indem man als Eluiermittel eine Lösung mit einem geeigneten pH-Wert oder einer geeigneten Salzkonzentration verwendet
CIq ist ein natürlich umlaufendes Protein, und Verfahren zu seiner Abtrennung und Reinigung sind bekannt Man erhält es im allgemeinen vom Serum des Menschen, Kaninchens oder Rindes, und zwar durch ein Verfahren, das als Euglobulinausfällung bekannt und beispielsweise in der Druckschrift J. Immunol, 106, 304 - 413 (1971) beschrieben ist.
Nach der Erfindung werden RF und CIq in unlöslich gemachter Form als analytische Reagenzien verwendet. Unter »unlöslich gemachtem« RF und CIq ist hier gemeint, daß RF oder CIq kovalent an ein Festphasensubstrat gebunden »si, das in wäßrigen Fluiden unlöslich ist, oder an ein synthetisches Feslphasen&ubsiral adsorbiert ist, das in wäßrigen Fluiden unlöslich ist Ein Beispiel für ein solches synthetisches Festphasensubstrat ist Latex.
Die Unlöslichmachung von RF und Ciq kann man durch kovalente Bindung von RF oder CIq direkt oder indirekt an eine feste Phase bewirken. Die allgemein bekannten und verwendeten Verfahren zum kovalenten Kuppeln von Proteinen an unlösliche Substrate kann man zur Unlöslichmachung von RF und CIq verwenden. Die Festphasensubstrate müssen für die Kupplungsreaktion eine oder i: eftrere reaktionsfähige Gruppen enthalten, beispielsweise Amino- oder Carboxyl-Gruppen.
Geeignete Festphasensubstrate enthalten natürlich vorkommende Materialien, beispielweise angehäufte Immunglobuline, und synthetische Materialien, beispielsweise aminierte Agarose.
In einigen Fällen kann man RF oder CIq direkt an die feste Phase kovalent binden oder an die feste Phase adsorbieren, wenn es sich beispielsweise bei der festen Phase um Nylon, Agarose, Cellulose, Acrylamid oder Acrylpolymere, Polystyrol oder verschiedenartige Glaszubereitungen handelt. Im allgemeinen wird es allerdings bevorzugt, RF oder CIq an die feste Phase unter Verwendung einer Brückensubstanz zu binden, beispielsweise unter Verwendung von Glutaraldehyd. Ein nach der Erfindung bevorzugtes Reagenz ist durch eine Glutaraldehydbrücke an aminierte Agarose kovalent gebundenes RFoderClq.
Wenn RF oder CIq durch Adsorption an ein synthetisches Festphasensubstrat unlöslich gemacht ist, kann dies beispielsweise dadurch bewirkt worden sein, daß eine Lösung von RF oder CIq mit der festen Phase in Kontakt gebracht worden ist.
Es wird im allgemeinen bevorzugt, daß die Reagenzien nach der Erfindung aus Einzelteilchen bestehen oder in körniger oder granulierter Form vorliegen, beispielsweise als Kügelchen aus aminierter Agarose mit einem Überzug aus RF oder CIq. Bei einigen Anwendungsfällen, beispielsweise bei der kontinuierlichen Durchflußanalyse, ist es allerdings von Vorteil, die Reagenzien als einen Überzug auszubilden, der mindestens über einen Teil der inneren Oberfläche eines Rohres oder Schlauches geht, so daß durch das Rohr geleitete Reaktionsteilnehmer mit dem Reagenz in Berührung kommen.
Es ist bekannt, RF aus Serum dadurch zu isolieren, daß das Serum durch eine Säule angehäufter Immunglobuline geleitet wird, von denen der rheumatische Faktor zurückgehalten wird. In einer solchen Säule wird RF vorübergehend an die angehäuften Immunglobuline adsorbiert und nicht kovalent gebunden. Es sei bemerkt daß angehäufte Immunglobuline keine synthetischen Stoffe sind.
Die unlöslich gemachten RF- und Clq-Reagenzien finden bei biologischen Analysen eine sehr große Anzahl von Änwendungsmöglichkeiten. Diese Anwendungsmöglichkeiten beruhen alle auf der Fähigkeit der
ίο Reagenzien, sich mit Ak : Ag-Komplexen zu vereinigen, jedoch nicht mit freien Ak und freien Ag. Dadurch ist es möglich, die Reagenzien zum Abtrennen von Ak : Ag-Komplexen zu verwenden, wenn diese Komplexe mit ireien Ak und freien Ag im Gemisch vorliegen.
Die Reagenzien der Erfindung können mit besonders großem Vorteil bei der kontinuierlichen Durchflußanalyse von biologischer. Fluidproben eingesetzt werden. Die Erfindung soll diese Verwendungsmöglichkeit umfassen.
Die Erfindung wird im folgenden durch die Beschreibung allgemeiner und spezieller Ausführungsbeispiele näher erläutert.
!.Abtrennung
Das Verfahren zum Abtrennen von Ak : Ag-Komplexen aus biologischen Fluiden besteht darin, daß das Fluid mit unlöslich gemachtem RF oder CIq in Kontakt gebracht wird. Die in dem Fluid vorhandenen Komplexe werden an das unlöslich gemachte RF oder CIq gebunden, während andere anwesende Stoffe, beispielsweise Ak oder Ag. nicht gebunden werden (oder zumindest nicht in einem beachtlichen Maß). Durch Abtrennen des unlöslich gemachten RF oder CIq aus dem Gemisch werden die an RF oder CIq gebundenen Ak : Ag-Komplexe mit abgetrennt. Sie können dann, sofern es erwünscht ist, mit einem geeigneten Puffer einer passenden Salzkonzentration und eines passenden pH-Wertes aus dem unlöslichen RF oder CIq ausgewaschen werden. Auf diese Weise erhält man eine verhältnismäßig konzentrierte Lösung des Komplexes bzw. der Komplexe.
Dieses Verfahren kann man in einfacher Weise durchführen, indem man eine Säule verwendet, die unlöslich gemachtes RF oder CIq enthält. Das Serum oder eine andere Probe, die einen Ak : Ag-Komplex aufweist, wird durch die Säule geleitet, und der Komplex wird darin an RFoderClq gebunden und damit zurückgehalten. Der Komplex kann dann eluiert v/erden. Bei einem typischen Verfahren wird eine Mikrosäule verwendet, die Kügelchen aus aminierter Agarose enthält, an die RF oder CIq mit Glutaraldehyd gekuppelt ist. Das Serum wird durch die Säule geleitet, und die zurückgehaltenen Ak : Ag-Komplexe werden anschließend eluiert.
beispielsweise unter Verwendung von zunehmenden Konzentrationen (1 molar bis 3molar) von Ammoniumrhodanid.
Anstelle der Verwendung einev Säule kann man das unlöslich gemachte RF oder CIq auch einfach mit der
6Q Testflüssigkeit mischen, beispielsweise in einem Kolben, und anschließend durch Zentrifugieren oder Filtrieren eine Trennung vornehmen.
Die Abtrennungsverfahren nach der Erfindung sind nicht nur für Ak : Ag-Komplexe verwendbar, sondern auch indirekt zum Abtrennen bestimmter Ak oder Ag aus Lösungen. Wenn es beispielsweise erwünscht ist, ein Antigen Ag' aus einer Lösung abzutrennen, kann man den spezifischen Antikörper Ak' im Überschuß zuee-
fϊ ben, um den Komplex Ak': Ag7 zu bilden, der dann
ti unter Verwendung eines Reagenzes nach der Erfindung
ti abgetrennt werden kann. Wenn die ursprüngliche Lö-
% sung einen Ak : Ag-Komplex enthält, muß dieser im all-
:i; gemeinen zunächst durch eine Vorbehandlung abge-
ί trennt werden, bevor der spezifische Antikörper Ak'
ä zugegeben wird.
Ein besonderes Merkmal dieser Trennungsverfahren > besteht darin, daß sie sehr effizient durchgeführt werft, den können und auf diese Weise die Ansammlung und ψ_ Konzentration von Ak : Ag-Komplexen aus äußerst W verdünnten Lösungen gestatten. Dies ist ein sehr wichti- |f ger Vorteil, da es durchaus nicht selten vorkommt, daß ff sich die Komplexe in sehr geringen Konzentrationen in $ Seren oder anderen biologischen Fluiden befinden.
ν 2. Abtrennung und anschließende Vornahme von
; Nachweis und quantitativer Bestimmung
Dieser Test umfaßt die selektive Entfernung von Ak : Ag-Komplexen aus einem biologischen Fluid durch Inkontaktbringen des Fluids mit unlöslic.': gemachtem RF oder CIq (wie oben beschrieben) und anschließendem Nachweis der Komplexe. So wird beispielsweise eine Serumprobe behandelt, um darin befindliche Ak : Ag-Komplexe abzutrennen, indem sie an unlöslich gemachten RF bzw. unlöslich gemachtes CIq gebunden werden. Die auf diese Weise gebundenen Komplexe können dann vom RF oder CIq befreit und nach bekannten Methoden nachgewiesen werden.
(a) Ein Nachweisverfahren umfaßt den Wettbewerb zwischen zwei Ak : Ag-Komplexen im Hinblick auf die Bindung an eine begrenzte Menge RF oder CIq. Wenn beispielsweise ein Überschuß eines markierten Ak : Ag-Komplexes einer begrenzten Menge von unlöslich gemachtem RF oder CIq zugegeben wird, wird sämtliches RF oder CIq an den Komplex gebunden. Wenn außer dem markierten Komplex eine Serumprobe zugegeben wird, die einen nicht markierten Ak : Ag-Komplex enthält, kommt es zwischen dem markierten und dem nicht markierten Komplex zu einer Konkurrenzreaktion um die begrenzte Menge an RF oder CIq. Wenn nach Erreichen des Gleichgewichts der RF oder das CIq zusammen mit den gebundenen Komplexen entfernt wird, zeigt das Vorhandensein (oder das Vorhandensein einer bestimmten Mindestmenge) des markierten Komplexes in der verbleibenden Lösung an, daß die Serumprobe einen Ak : Ag-Komplex enthalten hat. Dieses Verfahren kann man zur quantitativen Bestimmung verwenden, um die Menge des Komplexes in der Serumprobe zu messen.
Darüber hinaus kann man dieses Verfahren auch verwenden, um das Vorhandensein eines bestimmten Ag oder Ak nachzuweisen.
(b) Ein weiteres Nachweisverfahren (das zur quantitativen Bestimmung herangezogen werden kann) eignet sich insbesondere für ein bestimmtes Ag oder einen bestimmten Ak. Wenn beispielsweise festgestellt werden soll, ob eine Serumprobe ein bestimmtes Antigen Ag' enthält, wird der spezifische Antikörper Ak' hergestellt und beispielsweise mit einem Enzym markiert. Der markierte Ak' wird dann mit unlöslich gemachtem RF oder CIq gemischt, und die Serumprobe wird zugegeben. Der unlöslich gemachte RF oder das unlöslich gemachte CIq (init den anhaftenden Ak': Ag'-Komp!exen) wird dann abgetrennt und die verbleibende Flüssigkeit wird auf das Vori/andensein (oder die Menge) von darin befindlichem markierten Ak' untersucht. Wenn das gewonnene Ergebnis weniger als der ursprünglich zugegebenen Menge entspricht, muß das spezifische Antigen Ag' in der Serumprobe vorhanden gewesen sein. Die Anwesenheit (oder Abwesenheit) eines spezifisehen Ag, beispielsweise IgE, in einem Serum kann man beispielsweise wie folgt nachweisen. Anti-IgE-Antikörper, die mit Katalase markiert sind, werden dem unlöslich gemachten RF oder CIq (beispielsweise Agarosekügelchen) in einer Menge zugegeben, die die Menge übersteigt, die zum Komplexieren mit irgend einem IgE in der zu untersuchenden Probe erforderlich ist. Die Serumprobe wird dann zugegeben, und das Gemisch wird inkubiert. Nach der Abtrennung des unlöslich gemachten RF oder CIq (das irgendwelche gebildeten IgE : Anti-IgE-KompIexe mit sich trägt), wird die restliche enzymatische Aktivität der verbleibenden Flüssigkeit gemessen. Wenn IgE in der Scrumprobe vorhanden ist, ist diese restliche enzymatische Aktivität geringer als die ursprüngliche Aktivität der zugesetzten Anti-IgE-Antikörper, da einige dieser zule'."* genannten Antikörr%Ar- mit
unlöslich gemachten RF entfernt worden sind. Dieses Verfahren kann man zur quantitativen Bestimmung einsetzen, um die Menge des IgE in dem Serum zu bestimmen
Ein weiteres Beispiel für dieses allgemeine Verfahren betrifft die Bestimmung des Antigens Morphin. Bei diesem Verfahren wird Morphin durch ein Enzym, beispielsweise Amylase, markiert. Sepzifische Anti-Morphin-Antikörper Ak" werden hergestellt. Die auf Morphin zu überprüfende Probe aus einem Serum oder Harn wird mit den Ak" gemischt Das vorhandene Morphin bildet mit den Ak" einen Komplex. Dann wird das durch das Enzym markierte Morphin zugegeben.
Dieses ist lediglich in der Lage, mit den Ak" entsprechend der Konzentration des Morphins im Serum oder Harn zu komplexieren.
Unlöslich gemachter RF oder unlöslich gemachtes CIq wird zugegeben, um die Ak : Ag-Komplexe zu adsortieren, die zwischen dem Ak" und dem Morphin in jem Serum und zwischen dem Ak" und dem markierten Morphin gebildet werden. Der unlöslich gemachte RF oder das unlöslich gemachte RF oder dus unlöslich gemachte CIq (der bzw. das diese Komplexe mit sich trägt) wird dann aus der Lösung entfernt. Das markierte Morphin verbleibt in der Lösung, und durch Messen seiner enzymatischen Aktivität ist es möglich, festzustellen, ob die ursprüngliche Serumprobe Morphin enthalten hat oder nicht. Gegebenenfalls kann man weiterhin feststellen, wieviel Morphin vorhanden war.
Obwohl sich das beschriebene Beispiel lediglich auf Morphin bezieht, kann man das gleiche Verfahren zum Bestimmen von anderen Antigenen bzw. Antikörpern verwenden. Die Markierung braucht nicht auf einem Enzym zu beruhen.
(c) Die Reagenzien der Erfindung sind auch zum nephelometrischen Immunoassay nützlich, insbesondere wenn es gilt, die Empfindlichkeit der Assays zu verbessern. Die Verwendung von unlöslich gemachtem RF und CIq hat in einem hohen Maße das Verfahren der nephelometrischen Inhibitiorisimmunoassays erleichtert, bei denen die Restaktivität von Ak nach Absorption mit dem zu bestimmenden Ag gemessen wird. Bei diesem Verfahren wird beispielsweise zum Messen von Λι-Fe-
b5 tusprotein das Serum mit einem Anti-«i-Fetusprotein Antiserum gemischt. Die gebildeten Ak : Ag-Komplexe liegen in einer so niedrigen Konzentration vor, daß sie durch Zentrifugieren nicht eetrennt werden können.
Unlöslich gemachter RF oder unlöslich gemachtes CIq wird benutzt, um diese Komplexe zu binden und sie aus der Lösung zu entfernen. Die in der Lösung frei verbleibenden Ak werden dann mit iti-Fetusprotein vermischt, und die Teilchendichte der Lösung, die von der Restkonzcntration der Ak abhängt, wird durch Nephelometrie gemessen.
J.Charakterisierung
Kupplung von RF oder CIq an eine feste Phase
Beispiel 2
Herstellung von markierten RF oder C1 q
200 ml von 50molarer Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,4 wurden zu 100 ug RF (oder CIq) hinzuge-
10
Viele der oben beschriebenen Verfahren, bei denen unlöslich gemachter RF oder unlöslich gemachtes CIq verwendet wird, können zur Vorbereitung der Charakterisierung von Ak, Ag oder Ak : Ag-Komplexen benutz! werden. Einige der Verfahren führen direkt zu einer Identifizierung von beispielsweise einem bestimmten Ak oder Ag. Dabei handelt es sich beispielsweise um solche Verfahren, bei denen die Gegenwart eines bestimmten Ak vermutet wird und dies dann auch durch Zugabe des spezifischen Ag bestätigt und das Vorhandensein des Ak : Ag-Komplexes bestimmt wird. Die Reagenzien gemäß der Erfindung sind bei den im folgenden erwähnten Methoden zur Charakterisierung der Ak, Ag und Ak : Ag-Komptexe äußerst nützlich.
Die Identifizierung (d. h. Charakterisierung) eines Antigens wird im allgemeinen mit Hilfe verschiedenartiger Verfahren vorgenommen, beispielsweise durch Spektrofotometrie, um das Vorhandensein einer Nucleinsäure festzustellen, durch Elektromikroskopie, um Viren zu identifizieren, und durch Immunfluoreszenz mit spezifisehen Antiseren, die gegen Virus- oder Gewebeantigene gerichtet sind. Das zuletzt genannte Verfahren kann mit unlöslich gemachtem RF oder CIq (beispielsweise Agarosekügelchen) und daran gebundenen Ak : Ag-Komplexen durchgeführt werden, d. h. der Komplex braucht nicht erst entfernt zu werden.
Für gewisse Anwendungen ist es zweckmäßig, den unlöslich gemachten RF oder das unlöslich gemachte CIq zu markieren, und zwar beispielsweise mit J125, einem Fluoreszenzstoff oder einem Coenzym (NADH).
Beispiel 1
45
5 ml aminierte Agarose (AH-Sepharose) die zuvor in einer Kochsalzlösung quellen gelassen worden war, in 5 ml Carbonatpuffer vom pH-Wert 8,5 wurden mit 1 ml einer 25°/oigen wäßrigen Lösung von Glutarald^hyd versetzt. Das Gemisch wurde 15 min bei Zimmertemperatur gerührt und dann mit 100 ml Carbonatpuffer gewaschen. Das Gemisch wurde zentrifugiert, der überstehende Anteil wurde dekantiert, und es wurden weitere 5 ml des Carbonatpuffers den Feststoffen zugegeben. Unter fortwährendem Schütteln wurden 125 mg gereinigter RF (oder CIq) und eine hinreichende Menge von Glycin zugegeben, um schließlich eine 0.2molare GIycinlösung zu erhalten. Das Schütteln wurde 10 bis 12 h fortgesetzt Die feste Phase wurde dann durch Zentrifugieren abgetrennt und mit physiologischer Salzlösung gewaschen.
geben.
Das Gemisch wurde in 20 μΙ-Aliquote aufgeteilt, und jedem Aliquot wurden 10 nC Jir>, gefolgt von 50 ng Chloramin-T zugegeben. Während 30 s wurde ein Fonschreiten der Oxydation zugelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 50 μΙ einer wäßrigen N;iiriummctabisulfitlösung mit 50 ng Salz abgebrochen.
Markierier RF (oder CIq) wurde dann von dem |i:' abgetrennt, indem das oben beschriebene Gemisch über eine Säule aus Sephadex G25 geleitet und das gewünschte markierte Material mit dem oben angegebenen Phosphatpuffer ausgewaschen wurde. Die Eluatfraktionen wurden auf /-Aktivität überprüft, und die Fraktionen mit einer Spitzenaktivität wurden vereinigt, verschlossen und bis zur Verwendung eingefroren.
Beispiel 3
Abtrennung eines Ak : Ag-Komplexes
100 ul unlöslich gemachter RF, hergestellt nach Beispiel 1. wurden zu 100 μΐ einer Probe hinzugegeben, die einen natürlich vorkommenden Ak : Ag-Komplex im Serum enthielt. Das Gemisch wurde V: h bei Raumtemperatur geschüttelt und dann 5 min bei 3000 g zentrifugiert. Es wurde festgestellt, daß der Ak : Ag-Komplex aus der flüssigen Phase entfernt worden und an die feste Phase gebunden war.
Beispiel 4
Bestimmung von Tetanusanotoxin + IgG
Kaninchenantikörper gegen Tetanusanotoxm wurden mit Peroxidase markiert, und zwar unter Anwendung des in der Druckschrift Nature. 219,186(1968), von Miles und Haies beschriebenen Verfahrens.
Zu 100 μΙ des Serums, das die Tetanusanotoxin-Ak : Ag-Komplexe enthalten sollte, wurde eine Menge der markierten Ak-Lösung zugegeben, die ausreicht, um 10 mg IgG zu enthalten. Das Gemisch wurde über Nacht bei 4~ C geschüttelt. 100μΙ von unlöslich gemachtem RF, hergestellt entsprechend dem Beispiel 1, wurden der resultierenden Lösung zugegeben. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur V2 h geschütteil und dann bei 3000 g 5 min zentrifugiert. Der überstehende Anteil wurde mit einer Pasteur-Pipette entferni und in ein mit 1 ml einer wäßrigen Lösung beschicktes Röhrchen gegeben, die 100 mg Phenol, 30 mg 4-Aminophanzon und 300 μΐ 30%iges H2O2 auf 100 ml enthwit.
Die vermischten Lösungen wurden bei 37° C 10 min inkubiert. Die sich bei 520 nm entwickelnde Farbe wurde kolorimetrisch festgestellt. Die Konzentration des Tetanusanotoxins war der Peroxidaseaktivität umgekehrt proportional und konnte mit Hilfe einer Eichkurve errechnet werden, die zuvor mit Lösungen aus einem markierten Antikörper erstellt wurde.
B e i s ρ i e.1 5
Verwendung von unlöslich gemachtem RF in einem
nach dem kontinuierlichen Durchflußprinzip
arbeitenden Analysengerät
4,0 mg RF wurden an 200 mg Latexteilchen von 0,8 μπι Größe in einer Carbonatpufferlosung mit einem pH-Wert von 8,4 adsorbiert. Die Teilchen wurden dann mit einer O,l°/oigen Rinderalbuminlösung gewaschen,
um eine weitere Absorption zu blockieren.
In einem nach dem kontinuierlichen Durchflußprinzip arbeitenden Analysengerät wurde eine zu untersuchende Probe mit tiner Geschwindigkeit von 0,1 ml/min angesaugt und mit einem Strom von mit einem Durchfluß von 0,4 ml/min strömenden Kaninchenantiserum gegen HPL (Verdünnung 1 :2000) zusammengeführt. Dieser St'' m wurde mit einem Strom aus J'2S HPL mit einem Durchfluß von 0,4 ml/min vereinigt.
Die vermischten Ströme wurden bei 37°C durch eine Mischspule mit einer Verzögerungszeit von 10 min geleitet, und das Gemisch wurde dann mit einem Strom von 0,3 ml/min aus dem RF/Latex-Material zusammengeführt, das entsprechend den obigen Angaben hergestellt worden war und 100 000 Teilchen/ml enthielt.
Der Gesamtstrom wurde erneut bei 37°C während 10 min wärmebehandelt. Beim Austritt aus dem Wärmebad wurden die Latexteilchen aus dem Strom abgeircnrfi und uriier iicranziciiurig eines üblichen Verfahrens, wie es beispielsweise bei automatischen Blutgruppenuntersuchungsgeräten angewandt wird, abfesaugt und entfernt.
Der Strom wurde anschließend durch einen Gammazähler geleitet, und der Restzählwert festgestellt. Der Zählwcrt ist der Konzentration von HPL umgekehrt proportional.
35
40
45
50
55
60

Claims (12)

Patentansprüche:
1. Reagenz zum Abtrennen und Bestimmen von in biologischen Fluiden vorhandenen Ak.- Ag-Komplexen, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einem in wäßrigen Fluiden unlöslichen Festphasensubstrat kovalent oder adsorptiv gebundenes RF oder CIq enthält
2. Reagenz nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß das Festphasensubstrat ein natürlich vorkommendes Material ist
3. Reagenz nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Festphasensubstrat durch angehäufte Immunglobuline dargestellt ist.
4. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,, daß das Festphasensubstrat ein synthetisches Material ist
5. Reagenz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Festphasensubstrat durch aminierte Agarose dargestellt ist.
6. Reagenz nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet daß es Kügelchen aus aminierter Agarose enthält die mit kovalent gebundenem RF oder CIq überzogen sind.
7. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß das synthetische Festphasensubstrat Latex ist
8. Reagenz nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das RF oder CIq eine Markierung trägt.
9. Reagenz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung ein radioaktives Atom, ein Enzym oder ein Coenzym ist.
10. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 9. dadurch gekennzeichnet, daß es in Form von Einze!- teilchen vorliegt.
11. Reagenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Festphasensubstrat ein hohles Rohr darstellt, an dessen innere Oberfläche RF oder C1 q gebunden ist.
12. Verfahren für einen spezifischen Bindungstest, bei dem ein Ak, Ag oder Ak : Ag-Komplex in einer Probe unter Verwendung eines markierten und eines an ein Festphasensubstrat gebundenen Reagenzes bestimmt werden soll, dadurch gekennzeichnet, daß
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