DE69220557T2

DE69220557T2 - Satz zur schnellen Aufzählung von Granulocyten und Verfahren das diesen Satz verwendet

Info

Publication number: DE69220557T2
Application number: DE69220557T
Authority: DE
Inventors: Dominique Carriere
Original assignee: Pasteur Sanofi Diagnostics SA
Current assignee: Bio Rad Innovations SAS
Priority date: 1991-11-25
Filing date: 1992-11-24
Publication date: 1998-02-05
Anticipated expiration: 2012-11-25
Also published as: CA2083424A1; EP0544578B1; ATE154846T1; FR2684186B1; DE69220557D1; EP0544578A1; FR2684186A1; JPH05346428A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Kit zur raschen quantitativen Bestimmung der Anzahl der Granulocyten sowie ein Verfahren, bei dem dieser Kit verwendet wird.
Die mehrkernigen Leukocyten, die auch als Granulocyten bezeichnet werden, umfassen drei Untergruppen: die neutrophilen, die basophilen und die eosinophilen mehrkernigen Leukocyten.
Die Granulocyten, die normalerweise im peripheren Blut vorliegen, können bei Infektionskrankheiten auch in anderen biologischen Flüssigkeiten festgestellt werden, z.B. im Urin, der Schädel-Wirbelsäulen-Flüssigkeit, der Pleuralflüssigkeit oder der von einer broncho-alveolären Lavage stammenden Flüssigkeit.
Die normale mittlere Anzahl mehrkerniger Leukocyten des Bluts kann unter bestimmten Umständen verändert sein. Eine anomale Erhöhung der Anzahl der mehrkernigen Leucocyten des Bluts kann ein Anzeichen für einen pathologischen Zustand sein, z.B. die durch ein infektiöses Mittel bei Hypereosinophilien oder bei myeloischer Leukämie hervorgerufene Hypergranulocytose. Umgekehrt kann eine anomale Verringerung der Anzahl der mehrkernigen Leukocyten (Granulopenie) durch Arzneimittel oder chemotherapeutische Behandlungen hervorgerufen werden. Bestimmte Arzneimittel können zu erheblichen Veränderungen in der Anzahl der Granulocyten führen; dies ist beispielsweise von P. Tarallo und J.F. Guelfi in Examens de Laboratoires et Médicaments, Herausgeber G. Siest et al., Expansion Scientifique, 1985, Seiten 163- 181, beschrieben. Die unerwünschten Wirkungen dieser Arzneimittel müssen systematisch und regelmäßig durch Zählung von Blutzellen ermittelt werden (Ermittlung der Anzahl und Ermittlung des Blutbildes).
Dementsprechend besteht eine der in der Hämatologie am häufigsten praktizierten Untersuchungen in der Erstellung des Blutblutes. Für die Erythrocyten sowie sämtliche Leukocytenpopulationen werden die Mittelwerte der Zellzählungen bestimmt und mit unabhängig bestimmten Grenzwerten (oberen und unteren Grenzwerten) , die als normal angesehen werden, verglichen.
So werden beispielsweise vor der Aufnahme einer chemotherapeutischen Behandlung sowie im Verlauf einer solchen Behandlung Zählungen der Granulocyten durchgeführt, um den Zustand des Patienten zu überwachen und die Behandlung entsprechend anzupassen. In der modernen therapeutischen Praxis erfolgt die Verabreichung der chemotherapeutischen Mittel in vielen Fällen während eines Tagesklinikaufenthalts. Es ist dann für den Arzt sehr günstig, über einen Test zur schnellen Bestimmung der Anzahl der Granulocyten zu verfügen, mit dem in einfacher Weise praktisch sofort ein Ergebnis erhalten werden kann.
Bisher wurde die Zählung der Blutzellen durch Mikroskopie oder mit Hilfe automatischer Vorrichtungen durchgeführt. Hierfür können beispielsweise elektronische Zähler vom Typ Coulter Counter/Coultronics verwendet werden, bei denen die Messung auf der Änderung des spezifischen Widerstands des Mediums, in dem sich die Zellen befinden, beruht. Bei anderen Vorrichtungen, wie z.B. bei Hematolog D , werden cytochemische Messungen herangezogen.
Die Kenntnis von Antigenen oder von Markern der Zelloberfläche erfuhr einen enormen Fortschritt mit der Entwicklung der Lymphocytenhybridisierung und der Entdeckung der monoklonalen Antikörper durch Köhler und Milstein (Nature 256 (1975) 495-497).
Durch internationale Übereinkunft wurden die Oberflächenmarker der menschlichen Leukocyten in Differenzierungsgruppen oder Differenzierungsklassen (CD) eingeteilt, die vom Unterkomitee IUIS-OMS 1984 definiert wurden und im Bulletin de l'Organisation Mondiale de la Santé 62 (5) (1984) 813- 815, das regelmäßig aktualisiert wird, beschrieben sind.
In der europäischen Patentanmeldung EP 297 290 ist ein Verfahren zur immunometrischen Bestimmung einer zu analysierenden Substanz in einer biologischen Flüssigkeit beschrieben. Bei dieser Verfahrensweise werden verwendet:
(i) magnetisch empfindliche Partikel, auf denen die analytisch zu bestimmende Substanz immobilisiert ist,
(ii) ein markiertes Reagens, das aus einem spezifischen Antikörper besteht, der gegen die zu bestimmende Substanz gerichtet und mit einer erfaßbaren chemischen Gruppe markiert ist, und
(iii) eine Vorrichtung zur Abtrennung und zur Erfassung der markierten zu bestimmenden Substanz.
Nach diesem Verfahren wird die markierte zu bestimmende Substanz durch Kapillaritätswirkung von der Trennzone in die Erfassungszone "transportiert".
Die europäische Patentanmeldung EP 311 492 beschreibt ein immunometrisches Verfahren zur quantitativen Bestimmung der charakteristischen Oberflächenantigene einer Zellpopulation. Dabei werden einerseits ein fester Träger, auf dem gegen die Oberflächenantigene der zu bestimmenden Zellpopulation gerichtete monoklonale Antikörper gebunden sind, und andererseits eine Lösung verwendet, die weitere, markierte monoklonale Antikörper enthält, die für die zu bestimmende Zellpopulation spezifisch sind. Durch dieses Verfahren werden in einem einzigen Schritt eine spezifische Immobilisierung der zu bestimmenden Zellpopulation durch Immunbindung auf einem festen Träger und die Erkennung eines Oberflächenantigens dieser Population durch einen markierten Antikörper durchgeführt.
Von den in der Patentanmeldung EP 311 492 beschriebenen Anwendungsbeispielen betreffen mehrere die Bestimmung von Oberflächenantigenenvon Blutzellen. Es ist festzustellen, daß der eigentlichen Bestimmung stets eine Stufe der Abtrennung der Blutzellen vorausgeht; in Beispiel 5 wird der Einfluß der gewählten Trennmethode (Zentrifugierung oder Lyse der Erythrocyten) auf die Ergebnisse der Bestimmung untersucht. Im gleichen Beisdiel wird ferner der Einfluß der Inkubationsdauer zur Immunbindung und Markierung der Zellen auf die festgestellten Ergebnisse bestimmt und gezeigt, daß ein analytisch auswertbares spezifisches Signal nach 10 min Kontaktzeit erzielt wird. Aufgrund der beschriebenen Beispiele kann allerdings festgestellt werden, daß die effektive Inkubationsdauer in keinem Falle weniger als 20 min beträgt.
In Beispiel 15 der Patentanmeldung EP 311 492 ist die quantitative Bestimmung des CDS-Antigens menschlicher T-Lymphocyten unter Verwendung magnetischer Kügelchen, die mit anti-CD2-Antikörpern beschichtet sind, als feste Träger zur Immunbindung beschrieben. In diesem Beispiel werden ferner die einkernigen Zellen vor der Stufe der Inkubation zur Immunbindung und quantitativen Bestimmung aus dem Vollblut abgetrennt. In diesen Beispielen beträgt ferner die Dauer der Inkubationsstufe allein 1 h.
Beispiel 11 beschreibt die quantitative Bestimmung der CD15-Antigene menschlicher Granulocyten. Die Bestimmung erfolgt an Granulocyten, die aus dem Vollblut stammen: Zunächst werden die Granulocyten durch Mischen mit einem zur Perfusion verwendeten physiologischen Milieu (Plasmion ) von den roten Blutkörperchen getrennt, worauf nach 45 min Stehenlassen die Suspension der Leukocyten an der Oberfläche des flüssigen Mediums abgenommen wird. Diese Stufe der vorgeschalteten Trennung dauert mehr als eine Stunde. Die Granulocyten werden dann in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit einem für das Antigen CD45 spezifischen monoklonalen Antikörper immobilisiert. Dieses Antigen CD45 liegt auf der Zellmembran sämtlicher Leukocyten vor. Zur quantitativen Bestimmung werden mit Peroxidase markierte Anti-CD15-Antikörper herangezogen.
In den verschiedenen in aer Patentanmeldung EP 311 492 beschriebenen Beispielen wird ferner die Bedeutung der Stufe des Waschens des festen Trägers, auf dem die zu bestimmende Zellpopulation fixiert ist, im Hinblick auf die Manipulationen und hinsichtlich der Durchführungsdauer festgestellt.
Dementsprechend ist trotz der in dieser Patentanmeldung angegebenen Zielsetzung einer raschen Bestimmung die Gesamtdauer der Durchführung der Bestimmung mit < 1 h nach wie vor lang. Dies beruht darauf, daß zur Durchführung der Bestimmung folgende Schritte erforderlich sind:
- Herstellung der zu bestimmenden Probe, wobei erforderlichenfalls die Blutzellen vom Vollblut getrennt werden;
- Inkubation während mindestens 10 min und vorzugsweise länger;
- Waschen des festen Trägers;
- im Fall einer Enzymmarkierung Bestimmung der Enzymaktivität (20 bis 25 min mit Peroxidase, noch länger mit anderen Enzymen).
Für die Gesamtheit dieser Verfahrensschritte braucht ein Fachmann 45 bis 60 min.
Die Angabe der Ergebnisse erfordert schließlich eine von der gewählten Meßmethode abhängige Eichung, die mit einer Zellpopulation durchgeführt wird, die zuvor hinsichtlich der Antigene durch quantitative Cytofluorimetrie geeicht wurde.
Gemäß der Erfindung wurde nun ein System zur quantitativen Bestimmung der Anzahl der Granulocyten gefunden, das auf einer immunometrischen Messung beruht und die Kriterien für diagnostische Schnelltests erfüllt, insbesondere hinsichtlich der Einfachheit der Durchführung, der Schnelligkeit der Durchführung und der Zuverlässigkeit der Egebnisse:
- Die Messung der Granulocyten erfolgt unter Verwendung des gleichen Antikörpers für die Bindung und die Markierung der zu bestimmenden Zellen, wodurch so die Anzahl der Zellen direkt gemessen wird;
- die Messung erfolgt an einer Vollblutprobe oder einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, wodurch eine vorgeschaltete, lange dauernde Stufe der Trennung der mehrkernigen Leukocyten vom Vollblut oder der biologischen Flüssigkeit entbehrlich wird;
- die Verwendung geeigneter magnetischer Partikel sowie das zur Bindung und zum Waschen der Partikel, welche die zu messenden Zellen tragen, ausgewählte Verfahren erlauben eine Vereinfachung des Waschschritts und eine Verkürzung seiner Dauer;
- die Möglichkeit des sehr einfachen Zusatzes eines internen Standards erlaubt eine direkte Angabe eines Meßergebnisses.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist der zur Bindung und zur Markierung der Granulocyten eingesetzte Antikörper, der im folgenden als spezifischer Antikörper bezeichnet ist, ein monoklonaler Antikörper, der gegen ein spezifisches Oberflächenantigen der Granulocyten gerichtet ist.
Dieses Antigen liegt auf der Oberfläche der Granulocyten und nicht auf anderen Zellen vor; darüber hinaus liegt dieses Antigen auf der Oberfläche der Granulocyten so reichlich vor, daß zugleich ihre Bindung und ihre Markierung durch spezifische Antikörper möglich ist.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Kit zur raschen Bestimmung der Anzahl der Granulocyten des menschlichen Bluts oder einer beliebigen anderen biologischen Flüssigkeit menschlichen Ursprungs, die einem Normalzustand entsprechen oder pathologisch sein kann, anzugeben, der folgende Bestandteile aufweist:
a) einen ersten Behälter, der eine festgelegte Menge eines Verdünnungs- und Markierungsreagens zur Verdünnung und Markierung der Granulocyten enthält, das einen in einer üblichen Weise markierten spezifischen Antikörper enthält;
b) einen zweiten Behälter, der magnetische Partikel enthält, auf denen der gleiche spezifische, aber nicht markierte Antikörper gebunden ist,
c) ein als Meßstäbchen bezeichnetes Stäbchen, das einen magnetischen Endteil aufweist.
Der erfindungsgemäße Kit kann ferner vorteilhaft eines oder mehrere der nachstehenden Elemente aufweisen:
d) eine Vorrichtung, welche die Entnahme einer festgelegten Menge Blut oder der biologischen Flüssigkeit erlaubt;
e) eine Vorrichtung, die Waschflüssigkeit enthält;
f) eine Einrichtung zur Bestimmung des Markers des spezifischen Antikörpers&sub1; beispielsweise im Fall eines mit einer Enzymsonde markierten spezifischen Antikörpers einen oder mehrere Behälter, die das Bestimmungsreagens für das Enzym, d.h., eine oder mehrere Lösungen, die das Substrat des Enzyms enthalten, sowie erforderlichenfalls einen oder mehrere Reaktanten enthalten, die zur Messung der Enzymaktivität erforderlich sind;
g) mindestens ein als Referenzstäbchen bezeichnetes Stäbchen, das auf seinem Endteil mit einer festgelegten, fallabhängig unterschiedlichen Menge entweder gegen eine Species gerichteter polyklonaler Antikörper, wobei die Species die tierische Species ist, von welcher der spezifische Antikörper stammt, oder eines spezifischen Antigens beschichtet ist.
Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung enthält der Kit weder ein Meßstäbchen noch ein Referenzstäbchen, sondern es wird bei der Anwendung ein Magnetstab verwendet, der durch Anlegen an die Außenoberfläche des Behälters, der das Reagens zur Bindung und Markierung enthält, eine Immobilisierung der magnetischen Partikel auf der Innenoberfläche des Behälters erlaubt.
Wenn der Kit kein Referenzstäbchen enthält, können verschiedene Referenzproben hinzugefügt werden, die jeweils eine bekannte Anzahl Granulocyten enthalten, die durch Zählung mit einer automatischen Vorrichtung bestimmt wurde.
Unter einer "Vorrichtung, welche die Entnahme einer festgelegten Menge Blut oder der biologischen Flüssigkeit erlaubt" wird eine Spritze mit vorgegebenem Volumen, die mit einer Nadel versehen ist und die Entnahme von venösem Blut erlaubt, eine Lanzette, der ein geeichtes Kapillarröhrchen beigegeben ist, oder eine beliebige andere geeignete Vorrichtung verstanden, mit der ein gegebenes Volumen Blut oder biologischer Flüssigkeit aus einer vorliegenden Probe entnommen werden kann.
Die im erfindungsgemäßen Kit verwendeten magnetischen Partikel können unterschiedliche Formen besitzen: Sie können sphärische oder nichtsphärische Form aufweisen. Ihre längere Abmessung beträgt vorzugsweise 0,1 bis 20 µm. Beispiele hierfür sind magnetische Teilchen mit einer Ummantelung aus Polystyrol, wie z.B. die Teilchen des Produkts Estapor das von Rhône-Poulenc im Handel ist, und deren Abmessungen im Bereich von 0,1 bis 10 µm liegen, wobei der Mittelwert 0,8 µm beträgt. Ferner sind magnetische Mehrschicht-Kompositpartikel zu nennen, wie z.B. die Partikel des Produkts Dynabeads , das von der Firma Dynal im Handel ist und dessen Partikelgröße etwa 2 µm beträgt.
Es ist ferner auch möglich, Partikel einzusetzen, die nach dem europäischen Patent EP 104 101 durch Polymerisation von Acrylderivaten unter Bestrahlung mit Gammastrahlung in Gegenwart eines magnetischen Materials hergestellt sind, das nach einem bekannten Verfahren hergestellt wurde, beispielsweise unter Anwendung des von M. Ronay in American Chemical Society Symposium Serie, 1982, 200 Reprographic Technology, 553-576, beschriebenen Verfahrens. Die Größe dieser Partikel liegt im Bereich von 1 bis 10 µm.
Die im erfindungsgemäßen Kit verwendeten magnetischen Partikel besitzen besonders bevorzugt eine Größe von 0,5 bis 4 µm.
Die Bindung des monoklonalen Antikörpers an die magnetischen Partikel erfolgt durch physikalische Adsorption oder kovalente Bindung. Hierzu kann ein vom Lieferanten angegebenes Verfahren herangezogen werden, wenn die Teilchen Handelsprodukte darstellen, oder das in dem europäischen Patent EP 104 101 beschriebene Verfahren.
Der die magnetischen Partikel enthaltende Behälter wird nach einer üblichen Verfahrensweise hergestellt; die magnetischen Partikel, auf denen die monoklonalen Antikörper fixiert sind, werden in einen Phosphatpuffer mit einem pH- Wert in der Nähe von 7 gegeben, der durch Zusatz von Natriumchlorid isotonisch gemacht wurde und Proteine, wie Rinderserumalbumin oder Kälberfetalserum, enthält. Eine kleine Menge dieser Lösung wird in den Behälter gegeben, worauf lyophilisiert, verschlossen und bei tiefer Temperatur (unter 5 ºC) gelagert wird. Unter einer kleinen Menge wird ein Volumen verstanden, das etwa 100mal kleiner ist als das Volumen des Behälters.
Der markierte spezifische Antikörper wird in üblicher Weise nach einem der dem Fachmann geläufigen Markierungsverfahren hergestellt, beispielsweise durch Markierung mit einer Radioisotopsonde, durch enzymatische Markierung oder durch Markierung mit einem fluoreszierenden Mittel.
Die Granulocyten besitzen eine Größe von etwa 10 bis 15 µm und weisen unregelmäßige Form auf; sie tragen an ihrer Oberfläche zahlreiche Zellmarker oder Antigene. Bestimmte solche Marker, wie etwa das Antigen CD45, liegen auf sämtlichen Leukocyten vor, während andere, wie etwa das Antigen CD15, für Granulocyten spezifisch sind.
Für eine besondere Ausführungsform der immunometrischen Bestimmung gemäß der vorliegenden Erfindung wurde das Zellantigen CD15 zur Bindung und zur Markierung der Granulocyten ausgewählt. Dieses Antigen liegt auf der Oberfläche der Granulocyten in reichlicher Menge vor.
Dementsprechend erfolgen die Bindung und die Markierung der Granulocyten im Hinblick auf die Bestimmung der Anzahl dieser Zellen mit einem monoklonalen Anti-CD15-Antikörper, der eine Affinität zu diesem Antigen von mehr als 10&sup8; M&supmin;¹ aufweist.
Nach einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der verwendete monoklonale Antikörper ein Immunglobulin vom Isotyp IgM. Ein derartiges Immunglobulinmolekül besitzt 10 Antikörper-Bindungsstellen, während ein Immunglobulinmolekül vom Isotyp IgG nur zwei Antikörper- Bindungsstellen aufweist.
Aufgrund der großen Anzahl ihrer Bindungsstellen (die 5fach größer ist als bei Immunglobulinen vom Isotyp IgG) sind die Anti-CD15-IgM-Antikörper in erheblichem Maße befähigt, CD15-Antigene, die auf der Oberfläche der Granulocyten vorliegen, zu erkennen und dementsprechend die Granulocyten zu binden. Darüber hinaus können die Anti-CD15-IgM-Antikörper Tracermoleküle tragen, welche die enzymatische Sonde oder die Radioisotopsonde darstellen, wodurch sie eine sehr hohe Markierungskapazität für die CD15-Antigene der Granulocyten aufweisen.
Der Antikörper SMY15a, der von der Firma Biosys im Handel ist, stellt ein IgM-Immunglobulin dar, das sich ganz besonders zur Durchführung der erfindungsgemäßen Bestimmung eignet.
Es ist ferner auch möglich, den Anti-CD15-Antikörper, Klon 80H5, zu verwenden, der von.derfirmä Immunotech im Handel ist.
Unter einem Reagens zur Verdünnung und zur Markierung der Granulocyten wird das Reagens verstanden, das den fluoreszierenden oder mit einer Enzymsonde oder einer Radioisotopsonde markierten Anti-CD15-Antikörper enthält, verdünnt in einem kochsalzhaltigen Puffer mit einem pH in der Nähe von 7, beispielsweise einem kochsalzhaltigen Phosphatpuffer, wobei der Puffer Proteine, wie Rinderserumalbumin oder Kälberfetalserum, enthält.
Das Reagens wird so eingesetzt, daß die Konzentration des darin enthaltenen Anti-CD15-Antikörpers im Bereich von 0,5 bis 5 µg/ml liegt.
Unter der Waschflüssigkeit wird eine herkömmliche physiologische Flüssigkeit zum Waschen verstanden, beispielsweise ein kochsalzhaltiger Puffer mit einem pH-Wert in der Nähe von 7, z.B. ein Phosphatpuffer, der durch Zusatz von Natriumchlorid isotonisch gemacht ist.
Der Ausdruck "fluoreszierender monoklonaler Antikörper" bedeutet, daß der Antikörper mit einem geeigneten Fluorochrom, wie beispielsweise Fluoresceinisocyanat, fluoreszierend gemacht wurde.
Der Ausdruck "mit einer Radioisotopsonde markierter monoklonaler Antikörper" bedeutet, daß der monoklonale Antikörper entweder an einem Element seiner Struktur, beispielsweise darin enthaltenen Tyrosinresten, oder an einer geeigneten Gruppe, die an ihm gebunden wurde, ein radioaktives Isotop enthält, das eine quantitative Bestimmung der daran gebundenen Radioaktivität durch Zählung erlaubt.
Der Ausdruck "mit einer Enzymsonde markierter monoklonaler Antikörper" bedeutet, daß der monoklonale Antikörper an ein Enzym gekuppelt ist, das, bei entsprechender Verwendung geeigneter Reaktanten, eine quantitative Messung dieses monoklonalen Antikörpers erlaubt.
Das Substrat und die Reaktanten werden so gewählt, daß das Endprodukt der durch das Enzym hervorgerufenen Reaktion oder Reaktionsfolge bei Einsatz dieser Substanzen
- entweder eine gefärbte oder fluoreszierende Substanz ist, die in das flüssige Milieu hineindiffundiert, von dem die Zellen umgeben sind, und die entweder abschließend spektrophotometrisch bzw. fluorimetrisch gemessen oder visuell ausgewertet wird, ggf. durch Vergleich mit einem Satz geeichter Färbungen,
- oder eine unlösliche gefärbte Substanz ist, die sich auf den Zellen und dem Träger ablagert, auf dem sie gebunden sind, und die entweder photometrisch in Reflexion gemessen oder visuell ausgewertet werden kann, ggf. durch Vergleich mit einem Satz geeichter Färbungen.
Wenn ein fluoreszierend gemachter Antikörper verwendet wird, wird die an die Zellen gebundene Fluoreszenz mit einer geeigneten Vorrichtung direkt gemessen.
Wenn eine Radioisotopsonde Verwendung findet, beispielsweise ¹²&sup5;I, wird die an die Zellen gebundene Radioaktivität in einem Gammazähler in beliebiger geeigneter Weise gezählt, beispielsweise nach Solubilisierung der Zellen mit einer alkalischen Lösung (Z.B. einer Natriumhydroxidlösung) und Gewinnung der Lösung, welche die Radioaktivität enthält, mit einem absorbierenden Puffer.
Wenn eine enzymatische Sonde am monoklonalen Antikörper verwendet wird, wird die Entstehung eines gefärbten oder fluoreszierenden Produkts dadurch erzielt, daß zu dem festen Träger, an dem die das zu bestimmende Antigen tragende Zellpopulation gebunden wurde, eine Lösung zugegeben wird, die das Substrat des Enzyms und ein oder mehrere Hilfsreagentien enthält und es erlaubt, schließlich als Reaktionsprodukt entweder ein im Medium lösliches gefärbtes Produkt oder ein unlösliches gefärbtes Produkt oder ein lösliches fluoreszierendes Produkt zu erhalten, wie oben erläutert wurde. Anschließend wird das von den so behandelten Proben stammende Lichtsignal mit einer für den betreffenden Fall geeigneten Vorrichtung gemessen, d.h., mit einem Photometer in Transmission oder in Reflexion bzw. mit einem Fluorimeter. Alternativ dazu kann die erhaltene Färbung auch visuell bewertet werden, wobei man ggf. von einem Satz geeichter gefärbter Lösungen Gebrauch macht.
Bei Verwendung von alkalischer Phosphatase als Enzymsonde wird die Kupplung dieses Enzyms mit dem monoklonalen Antikörper nach dem von Boehringer Mannheim-Biochemica angegebenen Verfahren vorgenommen. Die bevorzugten Substrate dieses Enzyms sind p-Nitrophenylphosphat für eine abschließende spektrophotometrische Messung oder 4-Methylumbelliferylphosphat für eine fluorimetrische Messung oder 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat, um ein unlösliches gefärbtes Reaktionsprodukt zu erhalten. In gleicher Weise kann als Enzymsonde auch β-Galactosidase eingesetzt werden, deren bevorzugte Substrate dann o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid oder 4-Methyl-umbelliferyl-β-D-galactopyranosid sind.
Die monoklonalen Antikörper werden vorzugsweise an Peroxidase gekuppelt. In diesem Fall leitet sich das Kupplungsverfahren von dem Verfahren ab, das von M.B. Wilson und P.K. Nakane in Immunofluorescence and Related Staining Techniques, Hrsg. W. Knapp, K. Kolubar und G. Wicks, Elsevier/North Holland, Amsterdam, 1978, Seite 215-224, beschrieben wurde. Die in Bezug auf das ursprüngliche Protokoll zur Herstellung des Enzymkonjugats eingeführten Modifizierungen betreffen folgende Punkte:
- Molverhältnis Peroxidase/Antikörper gleich 3, im Gegensatz zu dem Molverhältnis von 2 gemäß dem ursprünglichen Protokoll;
- weniger starke Oxidation der Kohlenhydrateinheiten der Peroxidase durch Verringerung der angegebenen Konzentration an Natriumperiodat um 33 %.
Die zur Bestimmung der mit den monoklonalen Antikörpern konjugierten Peroxidase verwendeten Reagentien enthalten Wasserstoffperoxid, das Substrat des Enzyms sowie ein geeignetes Chromogen, z.B. o-Phenylendiamin oder 2,2'-Azino- bis(3-ethylthiazolin-6-sulfonsäure) bzw. ABTS zur Erzielung eines gefärbten und im Medium löslichen Endprodukts der Reaktion oder 3,3'-Diaminobenzidin oder 3-Amino-9-ethylcarbazol oder 4-Chlor-α-naphthol zur Erzielung eines unlöslichen Endprodukts der Reaktion oder aber p-Hydroxyphenylpropionsäure zur Erzielung eines im Medium löslichen fluoreszierenden Endprodukts der Reaktion.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung besteht in der Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die an Acetylcholinesterase gekuppelt sind.
Acetylcholinesterase wird unter bevorzugter Anwendung eines Verfahrens an die Antikörper gekuppelt, das sich von einem Verfahren ableitet, das in dem französischen Patent FR 2 550 799 beschrieben ist, oder nach einem Verfahren, das schematisch die Herstellung von Fragmenten der Antikörper nach einer bekannten Technik, die Modifizierung des Enzyms durch Umsetzung mit einem geeigneten heterobifunktionellen Reagens und schließlich die Kupplung der so erhaltenen Produkte umfaßt. Andere bekannte Verfahren zum Aufbau immunoenzymatischer Konjugate können in diesem Fall ebenfalls angewandt werden.
Die Bestimmung der spezifischen enzymatischen Aktivität, die an das zelluläre Antigen gebunden ist, das vom Konjugat mit Acetylcholinesterase erkannt wird, erfolgt vorzugsweise nach dem bekannten Verfahren, bei dem als Substrat des Enzyms Acetylthiocholin sowie Ellman-Reagens oder 5,5'- Dithio-2-nitrobenzoesäure als Chromogen verwendet werden, wobei beliebige an den betreffenden Fall angepaßte Varianten angewandt werden können, beispielsweise die von Pradelles et al. in Anal. Chem. 57 (1985) 1170-1173 beschriebene Variante.
Die genannten Chromogene werden als solche oder in Form von wasserlöslichen Salzen eingesetzt.
Nach der vorliegenden Erfindung sind die Stäbchen (Meßstäbchen und Referenzstäbchen) feste Träger, die eine Größe aufweisen, die an die Größe des Behälters angepaßt ist, der die magnetischen Partikel enthält. Die Stäbchen sind nämlich dazu vorgesehen, daß sie zum Teil in den Behälter eingetaucht und dann ganz einfach wieder herausgezogen werden. Das Meßstäbchen, das einen magnetischen Endteil aufweist, erlaubt so eine Bindung sämtlicher magnetischer Partikel, die im zweiten Behälter des zur Bestimmung dienenden Kits enthalten sind.
Als Meßstäbchen kann beispielsweise ein flacher Spatel von ätwa 10 cm Länge, etwa 1 cm Breite und 1 bis 2 mm Dicke verwendet werden, der an die Abmessungen der Hämolyseröhrchen angepaßt ist.
Der magnetische Teil kann in diesem Fall eine Oberfläche von etwa 1 cm² auf jeder Spatelfläche einnehmen. So können beispielsweise Scheibchen geeigneter Größe von dem magnetischen Band vom Typ Flexor 15 , das von der Firma Arelec im Handel ist, ausgeschnitten und auf jede Fläche des Stäbchens aufgeklebt werden. Es ist ferner auch möglich, einen Magneten im Inneren des Stäbchens in seinem Endteil einzugießen.
Das oder die Referenzstäbchen besitzen vorzugsweise die gleiche Länge wie das Meßstäbchen, sind jedoch schmäler, wobei ihr Querschnitt beispielsweise kreisförmig ist (Durchmesser etwa 2 mm) ; die Meßstäbchen und die Referenzstäbchen können ferner an einem Ende miteinander verbunden sein, wodurch es möglich wird, die Stäbchen für die Schritte der Bindung, der Markierung und des Waschens zusammen zu handhaben. Sie können vor der eigentlichen Messung, die an jedem Stäbchen vorgenommen wird, d.h., der Bestimmung der am Antikörper gebundenen enzymatischen Aktivität im Fall einer immunoenzymatischen Markierung oder der Zählung der Radioaktivität im Fall einer Markierung mit einer Radioisotopsonde, leicht voneinander getrennt werden.
Am Endteil eines oder mehrerer Referenzstäbchen wurde beispielsweise durch physikalische Adsorption oder durch kovalente Bindung eine festgelegte Menge des ggf. gereinigten Antigens CD15 gebunden. Es ist auch möglich, eine vorgegebene Menge gegen eine Species gerichteter polyklonaler Antikörper daran zu binden, wobei die Species die tierische Species ist, von welcher die eingesetzten monoklonalen Anti-CD15-Antikörper stammen, beispielsweise Anti-Immunglobulin-Antikörper der Maus, wenn es sich um Anti-CD15-Antikörper murinen Ursprungs handelt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung dient das Referenzstäbchen dazu, eine bekannte und zuvor fixierte Menge Anti-CD15- Antikörper zu binden, die mit einer Enzymsonde oder einer Radioisotopsonde markiert sind, die im Verdünnungs- und Markierungsreagens vorliegen.
Die Menge des CD15-Antigens oder des gegen die betreffende Species gerichteten Antikörpers, die am Referenzstäbchen gebunden ist, wird zuvor so festgelegt, daß das am Ende des erfindungsgemäßen Verfahrens meßbare Signal einem Grenzwert der Anzahl der Granulocyten in der analysierten Probe entspricht.
Wenn mehrere Referenzstäbchen verwendet werden, ist jedes Stäbchen mit einer unterschiedlichen Menge an CD15-Antigen oder gegen die Species gerichteter Antikörper beschichtet, wobei die Mengen derart gewählt sind, daß das am Ende des Verfahrens für jedes Referenzstäbchen meßbare Signal einem unterschiedlichen Wert der Anzahl der Granulocyten entspricht.
Wenn die Bestimmung der Anzahl der Granulocyten an einer Blutprobe vorgenommen wird, kann ein Grenzwert gewählt werden, der beispielsweise dem Minimalwert der mittleren Anzahl der bei gesunden Personen gezählten Granulocyten entspricht, d.h., etwa 2000 Zellen/mm³ Blut. Es ist auch möglich, einen niedrigeren Wert zu wählen, der einer gravierenderen Granulopenie entspricht, d.h. beispielsweise einen Wert im Bereich von 500 bis 1000 Zellen/mm³.
Der Zutritt der Zellen zu dem magnetischen Teil des Meßstäbchens darf nicht behindert sein; zu diesem Zweck ist das bzw. die Referenzstäbchen schmäler als das Meßstäbchen; ferner wird durch Wahl einer geeigneten Geometrie für die Stäbchen verhindert, daß die Stäbchen miteinander in Berührung kommen können. So erlaubt beispielsweise das Vorliegen einer Ausbauchung, die zum anderen Stäbchen hin vorspringt, an einem der Stäbchen, die beiden Stäbchen in einem gegebenen Abstand voneinander zu halten, beispielsweise in einem Abstand von 1 bis 2 mm.
Die Vorrichtung, die es ermöglicht, die Stäbchen vorübergehend fest miteinander zu verbinden, befindet sich entweder am Meßstäbchen an dem dem magnetischen Endteil gegenüberliegenden Teil oder am Referenzstäbchen an dem Teil, der dem Ende gegenüberliegt, das die gegen die Species gerichteten Antikörper oder das CD15-Antigen trägt.
Eine besondere Ausführungsform der beiden Stäbchen ist in den Figuren 1 und 1a dargestellt, worin das Meßstäbchen 1 an seinem unteren Teil das magnetische Endteil 2 trägt und das Referenzstäbchen 3 in seinem unteren Teil einen Endteil 4 aufweist, der mit Anti-Immunglobulin-Antikörpern der Maus beschichtet ist.
Das Meßstäbchen 1 und das Referenzstäbchen 3 weisen zur wechselseitigen lösbaren Befestigung aneinander eine Steckverbindung aus einem Muffenteil (5a) und einem Steckerteil (5b) auf.
In Fig. 1a sind das Meßstäbchen 1 und das Referenzstäbchen 3 in miteinander verbundener Form bei der Durchführung der Messung dargestellt, wobei die Stäbchen in einen Behälter 6 eingeführt sind, der das Reaktionsmedium oder die Waschflüssigkeit 7 enthält, beispielsweise ein Röhrchen. Eines der Stäbchen weist ferner eine Ausbauchung 8 auf, die zum anderen Stäbchen hin gerichtet ist. Die Stäbchen können mit einer Einrichtung 9 zum Greifen versehen sein, wie z.B. mit Halbkugeln.
Nach einer Ausführungsform der Erfindung können als Waschvorrichtung verschiedene Behälter verwendet werden, die Waschflüssigkeiten enthalten und in die das Meßstäbchen und erforderlichenfalls das Referenzstäbchen oder mehrere Referenzstäbchen, die mit dem Meßstäbchen verbunden sind, eingetaucht werden. Die zum Waschen ausgewählten Behälter können ähnliche Abmessungen aufweisen wie der zweite Behälter des Kits, der die magnetischen Partikel enthält; das Waschen wird durch Eintauchen des Meßstäbchens und erforderlichenfalls des oder der Referenzstäbchen nacheinander in jeden der Behälter mit Waschflüssigkeit vorgenommen.
Nach einer anderen Ausführungsform kann als Waschvorrichtung ein Behälter verwendet werden, der die Gesamtmenge an Waschflüssigkeit enthält, die für eine Bestimmung erforderlich ist, wobei die Vorrichtung mit einem System zum Einfließenlassen der Waschflüssigkeit versehen ist; sie kann ferner an den Behälter anpaßbar sein, der die magnetischen Partikel enthält (zweiter Behälter), in dem das Einfließenlassen der Waschflüssigkeit erfolgt. Der Behälter, der die magnetischen Partikel enthält, weist dann ebenfalls eine Vorrichtung zum Einfließenlassen von Waschflüssigkeit auf. Das Einfließen der Waschflüssigkeit erlaubt ein Spülen des Meßstäbchens und erforderlichenfalls des oder der Referenzstäbchen, die sich im zweiten Behälter des Bestimmungskits befinden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur raschen Bestimmung der Anzahl der Granulocyten unter Verwendung des erfindungsgemäßen Kits und ist dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Schritte umfaßt:
a) Mischen einer vorgegebenen Menge einer Probe von menschlichem Blut oder einer biologischen Flüssigkeit menschlichen Ursprungs mit einer festgelegten Menge Verdünnungs- und Markierungsreagens für Granulocyten, das einen spezifischen Antikörper enthält, der in einer üblichen Weise markiert ist;
b) Übertragen der so erhaltenen Probe in einen Behälter, der magnetische Partikel enthält, auf denen der gleiche spezifische, aber nicht markierte Antikörper gebunden ist, und Bewegen;
c) Einführen des mit einem magnetischen Endteil versehenen Meßstäbchens in den Behälter und ggf. auch Einführen mindestens eines Referenzstäbchens, das auf seinem Endteil mit einer festgelegten Menge entweder gegen eine Species gerichteter polyklonaler Antikörper, wobei die Species die tierische Species ist, von welcher der spezifische Antikörper stammt, oder eines spezifischen Antigens beschichtet ist;
d) Herausziehen des Meßstäbchens und ggf. des oder der Referenzstäbchen nach Ablauf einer Reaktionszeit und Waschen des Meßstäbchens sowie ggf. des oder der Referenzstäbchen;
e) eigentliche quantitative Ermittlung der Anzahl der Granulocyten.
Nach einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können die Stufen a) und b) vertauscht werden.
Die zu Stufe d) erwähnte Reaktionszeit liegt im Bereich von 1 bis 5 min.
In Stufe d) kann das Waschen entweder mit einem Strom von Waschflüssigkeit oder durch aufeinanderfolgendes Eintauchen in Behälter, welche die Waschflüssigkeit enthalten, erfolgen, wobei die Eintauchdauer bei jedem Behälter 5 bis 10 s beträgt.
Nach einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist der verwendete spezifische Antikörper ein monoklonaler Anti- CD15-Antikörper. Die Bindung dieses Antikörpers an den magnetischen Partikeln erfolgt durch physikalische Adsorption oder durch kovalente Bindung. Wenn der spezifische Antikörper mit einer Enzymsonde markiert ist, umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren ferner die Behandlung des Meßstäbchens mit dem Substrat des Enzyms und ggf. einem oder mehreren geeigneten Hilfsreagentien, wobei die gleiche Behandlung erforderlichenfalls auch mit dem oder den Referenzstäbchen vorgenommen wird.
Die eigentliche Messung der am Meßstäbchen gebundenen Granulocyten hängt von der Art der Markierung des spezifischen Antigens ab. Sie erfolgt beispielsweise durch Zählen der gebundenen Radioaktivität oder alternativ dazu durch photometrische Messung in Transmission oder Reflexion oder durch Messung der Fluoreszenzemission oder auch durch visuelle Bewertung, ggf. durch Vergleich mit einem Bereich geeichter Signale; erforderlichenfalls erfolgt die Messung des photometrischen Sigfials oder der Radioaktivität, die von dem oder den Referenzstäbchen herrühren, in der gleichen Weise, wonach ein Vergleich zwischen den von dem oder den Referenzstäbchen sowie dem Meßstäbchen stammenden photometrischen Signalen oder der entsprechenden Radioaktivität vorgenommen wird.
Nach einer besonderen Ausführungsform der Erfindung sind das oder die verwendeten Referenzstäbchen fest mit dem Meßstäbchen verbunden. In diesem Fall erfolgt die Trennung der verschiedenen Stäbchen in einer Stufe d1) nach Stufe d).
Gemäß der vorliegende:: Erfindung können mehrere Stäbchen verwendet werden, wobei eines als Meßstäbchen bezeichnet wird und das oder die anderen Stäbchen als Referenzstäbchen bezeichnet werden die es ihrerseits erlauben, Ergebnisse für einen oder mehrere Werte der Granulocytenzahl zu erfassen. Wenn daher eine genaue Ermittlung der Anzahl der in einer Probe vorliegenden Granulocyten vorgenommen werden soll, wird am Ende des Verfahrens die durch die markierten Zellen, die sich am Meßstäbchen befinden, bedingte Extinktion gemessen, wobei die gemessenen Extinktionswerte, die von dem oder den Referenzstäbchen stammen, als interner Standard dienen. Wenn die Anzahl der Granulocyten der zu bestimmenden Probe mit einem oder mehreren gewählten Grenzwerten verglichen werden soll, kann ein visueller Vergleich der erhaltenen Färbung für jedes Stäbchen ausreichend sein.
So wird z.B. in herkömmlicher Weise die Aktivität der Peroxidase während 20 min bestimmt, während die Aktivität der alkalischen Phosphatase während etwa 2 h ermittelt wird (Patentanmeldung EP 311 492). Anschließend wird die Intensität der erhaltenen Färbung (Extinktion) mit einem Spektrometer gemessen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, daß eine Bestimmungsdauer von 2 min für die Peroxidase zur visuellen Beobachtung der Extinktionsunterschiede zwischen dem Meßstäbchen und dem oder den Referenzstäbchen ausreichend ist. Es ist ferner zur Messung der Extinktion der am Meßstäbchen gebundenen Zellen ausreichend. In gleicher Weise kann für jedes zur Markierung verwendete Enzym die herkömmlicherweise für immunometrische Bestimmungen angegebene Bestimmungszeit wesentlich verkürzt werden.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Ermittlung der Anzahl der Granulocyten einer Blutprobe nach dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung des erfindungsgemäßen Kits, der zugleich das Meßstäbchen und das Referenzstäbchen enthält und bei dem der monoklonale Anti-CD15-Antikörper ein Immunglobulin vorn Isotyp M ist, das mit Peroxidase markiert ist. In diesem Fall werden die verschiedenen Verfahrensschritte während der nachstehend angegebenen ungefähren Zeiten durchgeführt:
Stufe a) : 15 s
Stufe b) : 15 s
Stufe d) : 2 min 30 s.
Wenn der Anti-CD15-Antikörper mit einer Enzymsonde markiert ist, beträgt die Stufe der Behandlung des Meßstäbchens mit dem Enzymsubstrat weniger als 2 min, wobei Gleiches auch für die ggf. vorgenommene Behandlung des oder der Referenzstäbchen gilt.
Die gesamte Durchführungsdauer beträgt somit weniger als 6 min.
In den nachstehenden Beispielen sind durchgehend die nachstehenden Bezeichnungen oder Abkürzungen verwendet:
BSA: Rinderserurnalbumin
PBS: kochsalzhaltiger Phosphatpuffer mit pH 7,4
IgG: Immunglobulin G
IgM: Immunglobulin M
cpm: counts per minute, Zählimpulse pro Minute
dpm: Zerfälle pro Minute
EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure
POD: Peroxidase.

BEISPIEL 1

Messung der Granulocyten an menschlichen Blutproben.

A) Herstellung des zur Bestimmung dienenden Kits.

a) Herstellung der magnetischen Partikel.

Es wird wie in dem europäischen Patent EP 104 101 verfahren, wobei magnetische Oxide zugesetzt werden.
Es wird eine Lösung hergestellt, die enthält:
- 3,8 ml Methacrylsäure
- 121,9 ml einer wäßrigen Lösung von N,N'-Methylenbisacrylamid (20 g/l)
- 88,1 ml Acrolein
- 93,2 ml Hydroxyethylmethacrylat
- 193 ml Wasser.
Diese Lösung, die als Stammlösung bezeichnet wird, enthält entsprechend 37,5 Volum-% Monomere.
Es wird ferner ein fluoriertes grenzflächenaktives Mittel eingesetzt, das unter der Bezeichnung Forafac 1157 von der Firma Atochem im Handel ist; es wird in einer Verdünnung von 18,8 g/l eingesetzt.
Als magnetisches Oxid wird EGM 805 verwendet, das von der Firma Ferrofluidics im Handel ist.
In einem verschließbaren Röhrchen von 18,8 ml werden gemischt:
- 2,5 ml Stammlösung
- 0,1 ml der Lösung des grenzflächenaktiven Mittels
-1 ml EGM 805
- die erforderliche Menge Wasser.
Nach Durchleiten eines Stickstoffstroms werden die Reaktionsmedien in flüssigem Stickstoff eingefroren und die Ampullen im Vakuum zugeschmolzen.
Die Polymerisation wird durch Bestrahlung mit Gammastrahlen aus einer Cobaltbombe (&sup6;&sup0;Co) während 3 h bei einer Energiedosisleistung von 60 krd/h initiiert.
Der Durchmesser der erhaltenen magnetischen Partikel liegt im Bereich von 1 bis 10 µm.

b) Herstellung der die magnetischen Partikel enthaltenden Röhrchen

Es werden entweder in Stufe a) hergestellte Partikel oder Latexpartikel vom Typ Estapor mit der Bezeichnung M1.070/40, die von Rhône-Poulenc im Handel sind und deren mittlerer Durchmesser 0,8 µm beträgt, eingesetzt. Diese Partikel werden mit einem spezifischen CD15- Antikörper gekuppelt. Der ausgewählte Antikörper ist der Antikörper SMY 15a vom Isotyp M, der von der Firma Biosys im Handel ist. Die Kupplung der Latex-Partikel mit dem Antikörper wird nach der nachstehend beschriebenen Arbeitsweise vorgenommen.
In ein Glasröhrchen werden 0,1 ml einer 10-%igen Suspension von Latex-Partikeln gegeben. Dann werden 1 mg Antikörperlösung in 1 ml PES-Puffer zugegeben, worauf 30 min bei 56 ºC gerührt wird. Nach Belassen über Nacht bei 4 ºC wird 30 bis 60 min zentrifugiert (15 10³ U/min, 4 ºC), worauf mit 1 ml PBS-Puffer gewaschen und wieder zentrifugiert wird. Anschließend wird mit 1 ml PBS- Puffer, der 0,2 % BSA enthält, gesättigt.
Die so erhaltenen Partikel werden in 1 ml kochsalzhaltigen Phosphatpuffer gegeben, der 0,2 % Rinderalbumin enthält. 25 µl dieses Gemisches werden in ein Hämolyseröhrchen mit einem Volumen von 5 ml gegeben. Die so hergestellten Röhrchen werden lyophilisiert, verschlossen und anschließend in einem versiegelten Plastikbeutel bei +4 ºC gelagert.

c) Herstellung von Vorrichtungen, welche die Lösung des Konjugats aus monoklonalern Antikörper und Peroxidase enthalten.

Es wird Peroxidase (POD) eingesetzt&sub1; die von Boehringer Mannheim Biochemica im Handel ist (Referenznummer 814 393).
Das Verfahren der Kupplung zwischen dem Antikörper und der Peroxidase ist wie von M.B. WILSON und P.K. NAKANE in Immunofluorescence and Related Staining Techniques (Herausgeber W. Knapp&sub1; K. Kolubar, G. Wicks, Elsevier/North Holland, Amsterdam, 1978, Seiten 215-224) beschrieben, mit dem Unterschied, daß zur Oxidation der Peroxidase 1,5 mg POD in 0,36 ml destilliertem Wasser eingesetzt und 50 µl einer 0,2 M Natriumperiodatlösung zugegeben werden. Das so erhaltene Produkt wird mit 2 mg Anti-CD15-IgM-Antikörper gekuppelt, die in 500 µl Carbonatpuffer enthalten sind. Nach Behandlung mit Natriumbromhydrid und Dialyse gegen PBS wird das IgM-POD- Konjugat durch Filtration durch eine 0,22µm-Membran sterilisiert.
Das SMY 15a-Antikörper-Peroxidase-Konjugat wird in Dosiereinheiten von 400 µl anwendungsfertigem Reagens abgefüllt, wobei die Konzentration des Antikörpers 2 µg pro Milliliter eines Gemisches gleicher Volumina PBS- Puffer und Kälberfetalserum beträgt. Die Abfüllung kann entweder in Hämolyseröhrchen von 5 ml oder in Unopette -Vorrichtungen erfolgen, die von der Firma Becton- Dickinson unter der Referenznummer 5856 im Handel sind.

d) Herstellung des Bestimmungsreagens

810 mg o-Phenylendiamin-dihydrochlorid werden in 25 ml PBS-Puffer gelöst; dann werden Hämolyseröhrchen von 5 ml hergestellt, die jeweils 50 µl dieser Lösung enthalten. Die Röhrchen werden lyophilisiert, verschlossen und in einem versiegelten Plastikbeutel bei + 4 ºC aufbewahrt. Unmittelbar vor der Verwendung werden in jedes Röhrchen 600 µl einer Bestimmungslösung aus Citratpuffer und Wasserstoffperoxid (Substrat des Enzyms), die von der Firma Pasteur Sanofi Diagnostics im Handel ist, gegeben.

e) Herstellung der Meßstäbchen

Es werden weiße Plastikspatel von 10 cm Länge verwendet, die von der Firma Safaa im Handel sind. Am Ende der Spatel werden jeweils auf jeder Fläche ein Scheibchen von 8 mm Durchmesser eines selbstklebenden magnetischen Bandes befestigt, daß von der Firma Arelec im Handel ist (Bezeichnung Flexor 15, 15/10e) . Die Spatel werden 1 min mit destilliertem Wasser und einem Reinigungsmittel vom Typ Manisoft gewaschen, das von der Firma Paragem (Frankreich) im Handel ist, dann mit destilliertem Wasser gespült und anschließend getrocknet und in einem Aluminiumbeutel aufbewahrt.

f) Herstellung der Referenzstäbchen

Es werden Plastikspatel von 10 cm Länge und 2 mm Durchmesser verwendet, die von der Firma Somater im Handel sind. Anti-Immunglobulin-Antikörper der Maus werden an einem Ende des Stäbchens adsorbiert, wobei wie folgt verfahren wird: Das Ende des Stäbchens (5 mm Höhe) wird 12 h bei 4 ºC in eine Lösung eingetaucht, die 4 µg Antikörper/ml in Lösung in einem PBS-Puffer enthält; anschließend wird das Stäbchen 10 min in eine 0,2-%ige Lösung von Rinderalbumin in einem PBS-Puffer eingetaucht und schließlich getrocknet.

g) Herstellung der Waschröhrchen

In mehrere Hämolyseröhrchen von 5 ml werden 4 ml PBS- Puffer gegeben, worauf die Röhrchen verschlossen werden, die dann anwendungsfertig sind.

B) Quantitative Messung der Blutproben.

a) Markierung und Bindung der Granulocyten

In ein in Stufe A c) hergestelltes Röhrchen, das das Antikörper-POD-Konjugat enthält, werden 44 µl Blut gegeben, das über EDTA als gerinnungshemmendem Mittel entnommen worden war, und 5 s gemischt. Das Blut kann entweder venöses Blut sein, das mit einer mit Nadel versehenen Spritze entnommen wurde, oder Kapillarblut, das mit einer Lanzette an der Fingerspitze abgenommen wurde, z.B. einer Vorrichtung, die von Becton-Dickinson unter der Bezeichnung Microtainer , Referenznummer 6357, im Handel ist.
Wenn die Unopette -Vorrichtung verwendet wird, welche die Lösung des Antikörper-POD-Konjugats enthält, wird das vom Hersteller (Becton-Dickinson) vorgeschlagene Kapillarröhrchen verwendet, mit dem 44 µl Blut eingebracht werden.
Ein verschlossenes Röhrchen, das die magnetischen Partikel enthält und in Stufe A b) hergestellt wurde, wird geöffnet, worauf rasch das vorstehend hergestellte Gemisch von Blut und Antikörper-POD-Konjugat hineingegeschüttelt 15 s und führt dann das in Stufe A e) hergestellte Meßstäbchen und das in Stufe A f) hergestellte Referenzstäbchen in das Röhrchen ein und beläßt die Stäbchen 2 min 30 s in dem Röhrchen.
Der Vorgang wird mit 2 x 8 Blutproben durchgeführt.

b) Waschen und Bestimmung der Enzymaktivität

Die Stäbchen werden aus dem Markierungsröhrchen herausgezogen und dann durch Eintauchen und Bewegen von oben nach unten in vier aufeinanderfolgenden Röhrchen gewaschen, wobei die Waschdauer pro Röhrchen 5 s beträgt, was insgesamt einer Waschdauer von 20 s entspricht.
Die Stäbchen können ferner mit einem Strom von Waschflüssigkeit 20 s gewaschen werden. Die Stäbchen werden dann jeweils in das in Stufe A d) hergestellte Bestimmungsröhrchen eingetaucht, das o-Phenylendiamin enthält, wobei 600 µl Bestimmungslösung in das Bestimmungsröhrchen gegeben werden.

c) Ergebnisse

Nach 2 min wird festgestellt, daß die gelbe Färbung des Bestimmungsmediums, die vorn Meßstäbchen einer Analysenprobe herrührt, intensiver ist als die vom Referenzstäbchen stammende Färbung.
Ferner wird die Extinktion des Bestimmungsmediums mit 200 µl Lösung mit einem geeichten Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen.
Die Messung wurde an 2 x 8 Blutproben durchgeführt, die von gesunden Spendern stammten, wobei jedem Spender zwei Blutproben entnommen worden waren, eine venöse Blutprobe und eine Kapillarblutprobe.
Außerdem wurde bei jeder Probe von venösem Blut mit automatischen Vorrichtungen die Anzahl der in 1 mm³ Blut enthaltenen Granulocyten gemessen. Diese Messung wurde durch automatische Zählung der Zellen mit einer Vorrichtung vom Typ Ortho ELT 8 vorgenommen, die von der Firma Diagnostic System im Handel ist. Ferner wurde eine Vorrichtung vom Typ Hematrak (Geometric Data) zur Bestimmung der prozentualen Anteile der Leukocyten- Subpopulationen herangezogen.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 zusammengefaßt. Tabelle 1
Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, daß die Meßergebnisse für das venöse Blut und das Kapillarblut ähnlich sind. Ferner wurde der Wert r der Korrelationskoeffizienten zwischen der für jede Probe gemessenen Extinktion und der für die gleiche Probe durch Zählung ermittelten Anzahl der Granulocyten berechnet. Dieser Koeffizient beträgt r = 0,955 für die Proben von venösem Blut und r 0,943 für die Proben von Kapillarblut.

BEISPIEL 2

Wirksamkeit des Verfahrens in bezug auf die Bindung von Granulocyten in Vollblut.

An fünf Blutproben, die gesunden Personen entnommen worden waren, wurde zunächst durch automatische Zählung die Anzahl der in 1 mm³ vorliegenden Granulocyten bestimmt; anschliessend wurde die gleiche Messung durchgeführt, nachdem das Verfahren der Bindung durch die magnetischen Partikel angewandt worden war, wie in Beispiel 1 beschrieben. Für jede Probe wurde der Prozentsatz der gebundenen Granulocyten aus der Differenz zwischen der vor und nach der Bindung der Zellen mit den magnetischen Partikeln durch Zählung ermittelten Anzahl der Granulocyten bestimmt.
In diesen Versuchen wurden die magnetischen Partikel und die Granulocyten vorn Reaktionsrnedium abgetrennt, und zwar entweder mit einem mit Magnet versehenen Stäbchen nach der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise oder mit einem festen Magneten, der außerhalb der Röhrchen angeordnet war und aus einem Magnetstab bestand.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2
Die Betrachtung der in Tabelle 2 aufgeführten Ergebnisse zeigt, daß der Prozentsatz der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gebundenen Granulocyten hoch ist (97 bis 100 %), und zwar unabhängig von der in den Blutproben vorliegenden Anzahl der Granulocyten und unabhängig von der Art des zur Bindung gewählten Magneten.

BEISPIEL 3

Bestimmung der Granulocyten in einem infizierten Urinmedium

In ein in Beispiel 1, Stufe A b) hergestelltes Röhrchen, das die magnetischen Partikel enthält, werden 40 µl infizierter Urin und 400 µl der in Beispiel, Stufe A c) hergestellten Lösung des Anti-CD15-Antikörper-Konjugats, das mit Peroxidase markiert ist, gegeben. Nach 30 s Schütteln wird ein in Beispiel 1, Stufe A e) hergestelltes Meßstäbchen 2 min 30 s eingeführt. Das Stäbchen wird anschließend durch aufeinanderfolgendes Eintauchen in vier Röhrchen mit 4 ml PBS gewaschen, wobei das Stäbchen in jedem Röhrchen 5 s bewegt wird. Anschließend wird das Stäbchen in 600 µl Bestimmungsreagens für die Peroxidase eingetaucht, das in Beispiel 1, Stufe A d) hergestellt wurde. Nach 2 min wird die Extinktion mit einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen. Die Ergebnisse werden mit Ergebnissen verglichen, die unter den gleichen Bedingungen mit einer Probe von nicht infiziertem Urin erhalten wurden. Außerdem wird mit einer Zellzählvorrichtung die Anzahl der in der Probe von infiziertem Urin enthaltenen Granulocyten bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 3 aufgeführt. Tabelle 3

BEISPIEL 4

Bestimmung der Anzahl der Granulocyten in verschiedenen Blutproben

Es wird der erfindungsgemäße Kit zur Bestimmung verwendet, der ein Meßstäbchen und ein Referenzstäbchen enthält, die wie in Beispiel 1 hergestellt sind, wobei die Meßergebnisse durch Spektralphotometrie bei 450 nm an 8 Blutproben erhalten werden. Zu Vergleichszwecken wird mit einer Zählvorrichtung die Anzahl der Granulocyten pro mm³ Blut bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt. Tabelle 4
Mit unbedecktem Auge wird bei jeder Probe eine gelbe Färbung des Meßstäbchens festgestellt, die intensiver ist als die Färbung des Referenzstäbchens.

Claims

1. Kit zur quantitativen Bestimmung der Anzahl der Granulocyten des menschlichen Bluts oder einer beliebigen anderen biologischen Flüssigkeit menschlichen Ursprungs,

der folgende Bestandteile aufweist:

a) einen ersten Behälter, der eine festgelegte Menge eines Verdünnungs- und Markierungsreagens zur Verdünnung und Markierung von Granulocyten enthält, das einen in einer üblichen Weise markierten spezifischen Antikörper enthält;

b) einen zweiten Behälter, der magnetische Partikel enthält, auf denen der gleiche spezifische, aber nicht markierte Antikörper gebunden ist;

c) ein als Meßstäbchen bezeichnetes Stäbchen (1), das einen magnetischen Endteil (2) aufweist.

2. Kit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er ferner enthält:

d) eine Vorrichtung, welche die Entnahme einer festgelegten Menge Blut oder der biologischen Flüssigkeit erlaubt;

e) eine Vorrichtung, die Waschflüssigkeit enthält;

f) eine Einrichtung zur Bestimmung des Markers des spezifischen Antikörpers;

g) mindestens ein als Referenzstäbchen bezeichnetes Stäbchen (3), das auf seinem Endteil (4) mit einer festgelegten, fallabhängig unterschiedlichen Menge entweder gegen eine Species gerichteter polyklonaler Antikörper, wobei die Species die tierische Species ist, von welcher der polyklonale Antikörper stammt, oder eines spezifischen Antigens beschichtet ist.

3. Kit nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das oder die Referenzstäbchen eine Einrichtung (5b) zur lösbaren Befestigung am Meßstäbchen aufweisen.

4. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetischen Partikel eine Größe von 0,1 bis 20 µm aufweisen.

5. Kit nach Anspruch 4, wobei die magnetischen Partikel eine Größe von 0,5 bis 4 µm aufweisen.

6. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der spezifische Antikörper mit einem fluoreszierenden Mittel, einer Enzymsonde oder einer Radioisotopsonde markiert ist.

7. Kit nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der spezifische Antikörper mit einer Enzymsonde markiert ist und die Einrichtung f) aus einem oder mehreren Behältern besteht, die das Substrat des Enzyms sowie erforderlichenfalls ein oder mehrere Reagentien enthalten, die zur Messung der Enzymaktivität erforderlich sind.

8. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der spezifische Antikörper ein monoklonaler Anti-CD15-Antikörper ist.

9. Kit nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Anti-CD15-Antikörper ein Immunglobulin vom IgM-Isotyp ist.

10. Verfahren zur raschen quantitativen Bestimmung der Anzahl von Granulocyten, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Schritte umfaßt:

a) Mischen einer vorgegebenen Menge einer Probe von menschlichem Blut oder einer biologischen Flüssigkeit menschlichen Ursprungs mit einer festgelegten Menge Verdünnungs- und Markierungsreagens für Granulocyten, das einen spezifischen Antikörper enthält, der in einer üblichen Weise markiert ist;

b) Übertragen der so erhaltenen Probe in einen Behälter, der magnetische Partikel enthält, auf denen der gleiche spezifische, aber nicht markierte Antikörper gebunden ist, und Bewegen;

c) Einführen des mit einem magnetischen Endteil (2) versehenen Meßstäbchens (1) in den Behälter und ggf. auch Einführen mindestens eines Referenzstäbchens (3), das auf seinem Endteil mit einer festgelegten Menge entweder gegen eine Species gerichteter polyklonaler Antikörper, wobei die Species die tierische Species ist, von welcher der polyklonale Antikörper stammt, oder eines spezifischen Antigens beschichtet ist;

d) Herausziehen des Meßstäbchens und ggf. des oder der Referenzstäbchen nach Ablauf einer Reaktionszeit und Waschen des Meßstäbchens sowie ggf. des oder der Referenzstäbchen;

e) eigentliche quantitative Ermittlung der Anzahl der Granulocyten.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufen a) und b) vertauscht werden.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß der spezifische monoklonale Antikörper ein monoklonaler Anti-CD15-Antikörper ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Anti-CD15-Antikörper ein Immunglobulin vom IgM-Isotyp ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe d) die Reaktionszeit 1 bis 5 min beträgt.