DE60033380T2 - Verfahren zur quantifizierung der zahl von leukozyten in einer blutprobe - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen in einer Vollblutprobe. Insbesondere beschäftigt sich die vorliegende Erfindung mit einem Verfahren zur Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen in einer Vollblutprobe, welches umfasst: das Mischen einer Vollblutprobe mit einem oberflächenaktiven Mittel, um dadurch eine Mischung zu erhalten; das Stehen lassen dieser Mischung für eine Zeit, die ausreicht, um die in der Vollblutprobe enthaltenen weißen Blutkörperchen zu lysieren und die intrinsische Myeloperoxidase aus den weißen Blutkörperchen freizusetzen; das Messen der Konzentration der freigesetzten Myeloperoxidase in der Mischung; und das Bestimmen der Anzahl der weißen Blutkörperchen in der Vollblutprobe, basierend auf der Konzentration der freigesetzten Myeloperoxidase. Die Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen und/oder der Anzahl Neutrophiler in einer Vollblutprobe kann mittels des Verfahrens der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen einfach und schnell durchgeführt werden, ohne der Notwendigkeit, die Blutzellen aus der Vollblutprobe abzutrennen. Ferner kann durch das Bestimmungsverfahren der vorliegenden Erfindung, zusätzlich zur Anzahl weißer Blutkörperchen in einer Vollblutprobe, die Konzentration von C-reaktivem Protein, das in derselben Vollblutprobe enthalten ist, gemessen werden, so dass das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer infektiösen Krankheit und die Schwere einer Entzündung schnell und einfach und mit geringen Kosten diagnostiziert werden kann.
  • Stand der Technik
  • In den vergangenen Jahren werden, bei den anfänglichen Schritten zur Diagnose von Patienten, als Untersuchungsmittel zur Beurteilung, ob Patienten eine bakterielle Infektionskrankheit haben oder nicht, die Anzahl weißer Blutkörperchen in einer Vollblutprobe und die Konzentration von C-reaktivem Protein (nachfolgend hierin häufig einfach als "CRP" bezeichnet), enthalten in einer Vollblutprobe, bestimmt. Um Ärzte in die Lage zu versetzen, angemessene Maßnahmen zu ergreifen, wie z. B. die Verabreichung eines Antibiotikums, war es in diesem Zusammenhang gewünscht, Bestimmungsverfahren zu entwickeln, die schnell und einfach und mit geringen Kosten Ergebnisse liefern können.
  • Gewöhnlich wird die Bestimmung der Anzahl der weißen Blutkörperchen unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen automatischen Vorrichtung zur Zählung der Blutzellen, die auf dem Öffnungswiderstandsverfahren basiert, durchgeführt, wobei die Vorrichtung durch COULTER COUNTERTM (hergestellt und vertrieben von COULTER ELECTRONICS, INC., USA) repräsentiert wird. Jedoch kann die Konzentration von CRP, das ein Plasmaprotein ist, nicht durch eine derartige Vorrichtung bestimmt werden.
  • Kürzlich wurde sowohl zur Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen als auch der Konzentration von CRP ein Gerät auf den Markt gebracht, das beschrieben wird in Yasuo YAMAO, Hiroshi OKUNARI und Henri CHAM-PEIX: Readout, 16, 11–15 (1998), wobei in dem Gerät eine Vorrichtung zur Zählung von Blutzellen, die auf dem Öffnungswiderstandsverfahren basiert, bereitgestellt wird und die Funktion der CRP-Bestimmung auf einem Latextrübungstitrations-Immunoassay basiert. Im Falle der Verwendung eines derartigen Gerätes ist die Vorgehensweise wie folgt: zuerst werden die roten Blutkörperchen in der Vollblut probe lysiert und dann wird die Anzahl der weißen Blutkörperchen durch das Öffnungswiderstandsverfahren bestimmt, und anschließend wird die CRP-Bestimmung mittels eines Verfahrens durchgeführt, bei dem die Blutprobe, die die lysierten Blutkörperchen enthält, für eine vorbestimmte Zeit umgesetzt wird mit Latexkügelchen, die einen daran gebunden Anti-CRP Antikörper haben, und dann wird die Konzentration von CRP durch einen Latextrübungstitrations-Immunoassay bestimmt. Das heißt, im Falle der Verwendung des vorstehend erwähnten Gerätes, werden die Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen und die Bestimmung der Konzentration von CRP durchgeführt, basierend auf unterschiedlichen Prinzipien, so dass vollkommen unterschiedliche Arbeitsschritte für die Bestimmung notwendig sind. Deshalb hat das übliche Verfahren unter Verwendung des vorstehend erwähnten Geräts dadurch Nachteile, dass sehr mühselige Arbeitsschritte notwendig sind und, dass eine Reihe von Reagenzien für die Bestimmung verwendet werden, was zu einem Anstieg der Kosten führt. Darüber hinaus ist die Wartung des Gerätes mit viel Zeit und großen Kosten verbunden. Aufgrund dieser Nachteile ist ein automatisiertes Gerät zur Zählung von Blutzellen bisher nicht in nahezu allen medizinischen Einrichtungen, die die Verantwortung zur Bereitstellung der Grundversorgung haben, wie z. B. praktizierende Ärzte und allgemeine Krankenhäuser, eingeführt worden, und deshalb kann das Bedürfnis für medizinische Betreuung nicht vollständig befriedigt werden.
  • Als ein Mittel, um die vorstehend erwähnten Probleme zu lösen, ist ein Verfahren vorstellbar, bei dem sowohl die Zählung der weißen Blutkörperchen als auch die Konzentration von CRP basierend auf dem selben Prinzip bestimmt werden. Insbesondere ist ein Verfahren vorstellbar, bei dem, im Hinblick auf eine einzelne Vollblutprobe, sowohl die Anzahl der weißen Blutkörperchen als auch die Konzentration von CRP durch ein immunolo gisches Verfahren bestimmt werden. Eine immunologische Bestimmung der Anzahl der weißen Blutkörperchen kann durch das Messen eines Proteins erreicht werden, welches spezifisch in weißen Blutkörperchen vorhanden ist.
  • Es ist allgemein bekannt, dass, wenn eine bakterielle Infektion oder eine Entzündung auftritt, die Anzahl der Neutrophilen im Blut ansteigt, wobei die Neutrophilen den größten Anteil unter allen Arten von weißen Blutkörperchen haben. Deshalb kann der Anstieg und die Abnahme der Anzahl weißer Blutkörperchen nachgewiesen werden, indem die Anzahl der Neutrophilen bestimmt wird, so dass das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer bakteriellen infektiösen Krankheit und die Schwere einer Entzündung abgeschätzt werden kann.
  • Als ein Beispiel für ein Verfahren zur Bestimmung der Anzahl der Neutrophilen einer entzündeten Gewebestelle oder zur Messung der Anzahl weißer Blutkörperchen oder der Anzahl der Granulozyten in einer Vollblutprobe kann das Verfahren genannt werden, das beschrieben ist in Peter P. Bradley, Dennis A. Priebat, Robert D. Christensen und Gerald Rothstein: J. Invest. Dermatol., 78, 206–209 (1982). Dieses Verfahren ist wie folgt. Zuerst werden die Neutrophilen aus einer Vollblutprobe durch Verwendung von Ficoll-Reagenz abgetrennt, oder ein entzündetes Hautgewebe wird erhalten. Die erhaltenen Neutrophilen oder das erhaltene entzündete Hautgewebe wird homogenisiert in einer 50 mM Kaliumphosphatpufferlösung (pH 6,0), die 0,5 % Hexadecyltrimethylammoniumbromid (HTAB) enthält, und dann mit Ultraschall behandelt, um Myeloperoxidase zu extrahieren, und anschließend wird die Enzymaktivität der extrahierten Myeloperoxidase bestimmt.
  • Ein weiteres Verfahren wird offenbart in Rita Cramer, Maria Rosa Soranzo, Pietro Dri, Renzo Menegazzi, Anna Pitotti, Giu liano Zabucchi und Pierluigi Patriarca: Journal of immunological Methods, 70, 119–125 (1984). Dieses Verfahren ist wie folgt. Dextran (MW 200000) wird zugegeben zu Blut, das eine Lösung von ACD (acid citrate dextrose, Säurezitratdextrose) als ein Anti-Koagulanz enthält, um eine Mischung zu erhalten. Aus der erhaltenen Mischung werden die roten Blutkörperchen entfernt. Anschließend wird Ficoll-Reagenz zu dem Rückstand zugegeben und Granulozyten werden aus der resultierenden Mischung durch Zentrifugation abgetrennt. Dann werden 2 × 104 Granulozytenzellen mit einer 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gemischt, die 13 mM Guaiacol und 0,02 % Cetyltrimethylammoniumbromid enthält. 1 μmol H2O2 wird dazu zugegeben und die Peroxidaseaktivität wird gemessen.
  • W. M. Kuebler, C. Abels, L. Schuerer and A. E. Goetz: Int. J. Microcirc., 16, 89–97 (1996) offenbaren das folgende Verfahren. Polymorphkernige weiße Blutkörperchen werden unter Verwendung von Ficoll-Reagenz aus Vollblut abgetrennt. Die erhaltenen weißen Blutkörperchen werden mit einer 50 mM Kaliumphosphatpufferlösung (pH 6,0), die 0,5 % HTAB enthält, lysiert und dann wird die Enzymaktivität der Myeloperoxidase in der resultierenden Mischung von lysierten Zellen bestimmt. Ferner offenbart das vorstehend erwähnte Stand der Technik Dokument auch ein Verfahren, bei dem Hirngewebe von Ratten oder Lungengewebe von Kaninchen in 1 ml einer 0,02 M Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,4), die mit Eis gekühlt ist, homogenisiert wird, und dann wird dazu 1 ml einer 0,02 M Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,4) zugegeben und das Resultierende wird bei 2000 rpm für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert, um ein Zentrifugationsprodukt zu erhalten, das einen Überstand enthält. Anschließend wird die Enzymaktivität der Myeloperoxidase in dem Überstand bestimmt. Ferner wird der Rückstand des Zentrifugationsproduktes bei 60°C für 2 Stunden inkubiert und dann mit einer 50 mM Kaliumphosphatpufferlösung (pH 6,0) homogenisiert, die 0,5 % HTAB enthält, und dann mit Ultraschall behandelt, und das Resultierende wird bei 20000 rpm für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten. Anschließend wird die Enzymaktivität der Myeloperoxidase in dem Überstand bestimmt.
  • Die internationale Anmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO93/01306 offenbart das folgende Verfahren. Eine vorbestimmte Blutmenge wird auf einen Filter aus Glasmikrofaser gegeben, der sich in einer Spritze befindet. Wasser wird zu dem Blut zugegeben und die roten Blutzellen werden lysiert, ohne die Granulozyten aufzubrechen, und die Bestandteile der Zelllyse in dem Blut werden durch Waschen unter Druck entfernt, um dadurch Bestandteile zu entfernen, die die Bestimmung der Anzahl von Granulozyten hindern, und um nicht-lysierte Granulozyten zu erhalten, die von dem Filter aus Glasmikrofaser getragen werden. Der Filter aus Glasmikrofaser, der die nicht-lysierten Granulozyten trägt, wird getrocknet, und eine 50 mM Phosphatpufferlösung, die 0,005 % TritonTM X-100, 30 mM 3-Amino-1,2,4-triazol, 0,0005 % H2O2 und 0,5 mg/ml o-Tolidin enthält, wird auf den Filter aus Glasmikrofaser getropft, so dass Myeloperoxidase aus den Granulozyten freigesetzt wird und blaue Flecken durch Anfärbung bildet. Die blauen Flecken stellen die Granulozyten dar und werden gezählt.
  • Die offengelegte Beschreibung der japanischen Patentanmeldung Nr. 8-308593 (entsprechend EP 743519 und US Patent Nr. 5,639,630 ) offenbart das folgende Verfahren. Eine Lösung wird hergestellt, die umfasst: ein nicht-ionisches Polyethoxylat-Tensid, ein anionisches Tensid oder ein amphoteres Tensid in einer Konzentration, die die roten Blutkörperchen in Vollblut lysiert, wodurch Hämoglobin aus den roten Blutkörperchen freigesetzt wird, die aber nicht die weißen Blutkörperchen aufbricht; Formaldehyd oder Paraformaldehyd in einer Konzentration, die die weißen Blutkörperchen chemisch vernetzt, die aber nicht die roten Blutkörperchen vernetzt; einen Zucker oder einen Zuckeralkohol, der die Nachweisbarkeit der Lymphozyten verstärkt; und eine Pufferlösung, die bewirkt, dass die Reaktionsmischung einen pH-Wert aufweist, der bei oder um den Neutralpunkt ist, insbesondere einen pH-Bereich von etwa 6,8 bis etwa 8,0. Die Lösung wird mit Vollblut gemischt und die resultierende Mischung wird auf etwa 60 bis 75°C erhitzt, um die roten Blutkörperchen zu lysieren und die weißen Blutkörperchen zu vernetzen. Ein Teil der weißen Blutkörperchen wird gefärbt unter Verwendung der intrinsischen Peroxidaseaktivität, und die Anzahl der verschiedenen Arten von Zellen von weißen Blutkörperchen wird bestimmt durch elektrooptische Analyse unter Verwendung von Absorptionsvermögen oder Lichtstreuung.
  • Jedoch weisen diese Verfahren die folgenden Probleme auf. Da Myeloperoxidase im Wesentlichen aus Neutrophilen freigesetzt wird, die in Haut-, Hirn- und Lungengeweben vorhanden sind, und einer Bestimmung der Enzymaktivität unterworfen wird, ist es notwendig, extrem mühsame Arbeitsschritte, wie z. B. eine Behandlung zur Homogenisierung in der Gegenwart von HTAB und eine Zentrifugationsbehandlung, durchzuführen und viel Zeit wird auch benötigt. Ferner ist es bei der Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen von Vollblut notwendig, einen Arbeitsschritt auszuführen, bei dem die weißen Blutkörperchen unter Verwendung von Ficoll-Reagenz oder dergleichen vom Voll blut abgetrennt werden, um Substanzen zu entfernen, die die Messung von Myeloperoxidase hindern. Deshalb ist es notwendig, einen Arbeitsschritt zur Entfernung von Substanzen auszuführen, die die Messung hindern, und eine Reaktion zur Fixierung der weißen Blutkörperchen durchzuführen, so dass die Prozedur mühsam wird, und es ist notwendig, eine Reihe von Reagenzien und speziellen Vorrichtungen zu verwenden.
  • Akiko GOTO. Ichio UCHIDA,. Hitoshi TOMITA: "Rinsho Kensa (klinische Untersuchungen)", 40, 859–863 (1996) und die Beschreibungen der offengelegten japanischen Patentanmeldungen Nr. 8-145993 , 9-72906 , 9-196919 und 11-32793 offenbaren ein Verfahren zur Zählung der weißen Blutkörperchen, die in dem Urin eines Patienten mit einer Infektion des Harntraktes enthalten sind. Speziell wird bei diesem Verfahren eine Urinprobe mit 0,05 % TritonTM X-100 behandelt, und die Konzentration von Myeloperoxidase, die aus den weißen Blutkörperchen (95 % von diesen sind Neutrophile) freigesetzt wird, die in der Urinprobe enthalten sind, wird durch Enzym-Immunoassay gemessen.
  • Die Menge zellulärer Bestandteile ist in Urin extrem gering, verglichen mit der Menge zellulärer Bestandteile in Blut. Deshalb ist in Urin die Menge von Substanzen, welche die Messung der Konzentration von Myeloperoxidase hindern, gering. Aus diesem Grund wird bei dem vorstehend erwähnten Verfahren die Urinprobe vor der Messung der Konzentration von Myeloperoxidase, die aus den Neutrophilen freigesetzt wird, die in der Urinprobe enthalten sind, nur mit TritonTM X-100 behandelt. Jedoch enthält Vollblut eine Mischung von weißen Blutkörperchen, roten Blutzellen, Blutblättchen und Plasmaproteinen, und daher ist Vollblut ein System, das verschiedene Arten von biologischen Bestandteilen in hohen Konzentrationen enthält. Deshalb war es nicht vorstellbar, dass ein derartiges Verfahren, das geeignet auf eine Urinprobe angewandt werden kann, bei Vollblut angewendet werden kann.
  • Es gab einen Bericht von einer Studie, in welcher Vollblut einer Lysebehandlung unterworfen wird, um dadurch "Defensine" genannte Peptide aus den Neutrophilen in dem Vollblut freizusetzen, und die Konzentration der freigesetzten Defensive wird gemessen, und Korrelationen zwischen Defensinen und der Anzahl weißer Blutkörperchen und der Anzahl Neutrophiler werden untersucht (siehe Toshihiko Ihi, Masamitsu Nakazato, Hiroshi Mukae und Shigeru Matsukura: Clinical Infection Diseases, 25, 1134–1140 (1997)). Jedoch ist es bei dem in der vorstehend erwähnten Studie verwendeten Verfahren notwendig, eine mühsame Prozedur durchzuführen, bei der 1 M Essigsäure zu Vollblut zugegeben wird, und die resultierende Mischung mittels eines Polytronhomogenisators homogenisiert wird, und das Resultierende wird bei 2000 × g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert, wodurch das Peptid extrahiert wird. Deshalb kann dieses Verfahren in der Praxis nicht bei allen medizinischen Serviceeinrichtungen verwendet werden, wo es notwendig ist, schnell und einfach die Anzahl weißer Blutkörperchen in einer Vollblutprobe zu bestimmen.
  • Wie vorstehend hierin beschrieben, ist es bei den üblichen Verfahren zur immunologischen Bestimmung einer Substanz, die aus weißen Blutkörperchen stammt, notwendig, mühsame und zeitaufwendige Arbeitsschritte durchzuführen, wie z. B. einen Arbeitsschritt, bei dem die weißen Blutkörperchen aus dem Vollblut abgetrennt werden, und einen Arbeitsschritt, bei dem die weißen Blutkörperchen für eine lange Zeit einer Lysebehandlung unter stringenten Bedingungen unterworfen werden, um eine gewünschte Substanz aus den weißen Blutkörperchen im Wesentlichen freizusetzen. Ferner weisen die üblichen Verfahren das Problem auf, dass der bestimmte Wert nicht notwendigerweise gut mit der Anzahl weißer Blutkörperchen übereinstimmt, wie sie direkt mittels einer Vorrichtung zur Zählung von Blutzellen bestimmt wird.
  • Die Veröffentlichung der internationalen Patenanmeldung Nr. WO 99/46599 (entsprechend der offengelegten Beschreibung der japanischen Patenanmeldung Nr. 11-258231 ) (die nach dem Anmeldedatum der japanischen Basispatentanmeldung der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht wurde) offenbart ein Verfahren, bei dem ein oberflächenaktives Mittel zu einer Vollblutprobe zugegeben wird, wodurch intrinsische Elastase aus den Granulozyten freigesetzt wird, und die freigesetzte Elastase wird durch ein immunologisches Verfahren unter Verwendung von α1-Antitrypsininhibitor, der ein Hemmstoff für Elastaseist, gemessen und die Anzahl weißer Blutkörperchen wird bestimmt, basierend auf der Konzentration der freigesetzten Elastase. Jedoch ist es bei diesem Verfahren zur Bestimmung der Elastase aus Granulozyten notwendig, einen Arbeitsschritt zur Zugabe von α1-Antitrypsininhibitor durchzuführen. Deshalb hat dieses Verfahren den Nachteil, dass die Prozedur mühsam ist und die Kosten hoch sind. Ferner, obwohl eine gute Korrelation zwischen der Elastase aus Granulozyten und der Anzahl weißer Blutkörperchen besteht, enthält das vorstehend erwähnte Dokument keine Beschreibung, dass dieses Verfahren auf eine Vollblutprobe mit einer Anzahl von weißen Blutkörperchen von 10000 Zellen/μl oder mehr, d.h., eine Vollblutprobe, die von einem nicht-gesunden Menschen erhalten wird, angewandt wird.
  • Somit ist es bei jedem der üblichen Verfahren unmöglich, dass eine intrinsische Substanz der weißen Blutkörperchen schnell und einfach durch ein immunologisches Verfahren gemessen wird, und die Anzahl weißer Blutkörperchen einer Vollblutprobe akkurat bestimmt wird, ohne die Notwendigkeit, die weißen Blutkörperchen aus der Vollblutprobe abzutrennen. Auch ist es mit jedem der üblichen Verfahren unmöglich, dass, zusätzlich zu der Anzahl weißer Blutkörperchen einer Vollblutprobe, die Konzentration von CRP, die in derselben Vollblutprobe enthalten ist, schnell und einfach gemessen wird.
  • ZUSAMNENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die gegenwärtigen Erfinder haben ausführliche und intensive Untersuchungen im Hinblick auf die Lösung der vorstehend erwähnten Probleme unternommen. Als Ergebnis wurde überraschenderweise gefunden, dass die vorstehende Aufgabe durch ein Bestimmungsverfahren gelöst werden kann, bei dem eine Vollblutprobe mit einem oberflächenaktiven Mittel gemischt wird, um dadurch die weißen Blutkörperchen wirksam zu lysieren und intrinsische Myeloperoxidase aus den weißen Blutkörperchen freizusetzen, und die Konzentration der freigesetzten Myeloperoxidase gemessen wird. Speziell wurde unerwartet gefunden, dass die Konzentration von Myeloperoxidase, wie sie durch das vorstehende Verfahren gemessen wird, eine sehr gute Korrelation mit der Anzahl weißer Blutkörperchen zeigt, wie mit dem üblichen Öffnungswiderstandsverfahren gemessen, so dass die Anzahl weißer Blutkörperchen basierend auf der Konzentration von Myeloperoxidase bestimmt werden kann. Ferner wurde auch gefunden, dass bei dem vorstehenden Verfahren die Konzentration von C-reaktivem Protein, das in der Vollblutprobe enthalten ist, zusätzlich zu der Konzentration von Myeloperoxidase auch gemessen werden kann. Basierend auf diesen neuen Erkenntnissen wurde die vorliegende Erfindung vollendet.
  • Deshalb ist es eine primäre Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein schnelles und einfaches Verfahren zur Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen in einer Vollblutprobe mit geringen Kosten bereitzustellen.
  • Die vorhergehenden und andere Aufgaben, Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden den in dem Gebiet tätigen Fachleuten aus der folgenden detaillierten Beschreibung und den angefügten Ansprüchen in Verbindung mit den begleitenden Abbildungen ersichtlich.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
  • In den begleitenden Abbildungen:
  • 1 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen dem HLB-Wert und der Freisetzungsmenge (in Form von Absorptionsvermögen) von Myeloperoxidase (MPO) zeigt;
  • 2(a) ist ein Diagramm, das die Korrelation zwischen den Konzentration von MPOen von Vollblutproben, die aus gesunden und nicht-gesunden Menschen erhalten wurden, und der Anzahl weißer Blutkörperchen der Vollblutproben zeigt;
  • 2(b) ist ein Diagramm, dass die Korrelation zwischen den Konzentrationen von Lactoferrin (LTF) von Vollblutproben, erhalten aus gesunden und nicht-gesunden Menschen, und der Anzahl weißer Blutkörperchen von den Vollblutproben zeigt;
  • 2(c) ist ein Diagramm, dass die Korrelation zwischen den Konzentrationen von Elastase (ELT) von Vollblutproben, erhalten aus gesunden und nicht-gesunden Menschen, und der Anzahl weißer Blutkörperchen der Vollblutproben zeigt;
  • 3(a) ist ein Diagramm, das die Korrelation zwischen den Konzentration von MPOen von Vollblutproben, erhalten aus gesunden und nicht-gesunden Menschen, und der Anzahl Neutrophiler der Vollblutproben zeigt;
  • 3(b) ist ein Diagramm, das die Korrelation zwischen den LTF-Konzentrationen von Vollblutproben, erhalten aus gesunden und nicht-gesunden Menschen, und der Anzahl Neutrophiler von den Vollblutproben zeigt;
  • 3(c) ist ein Diagramm, das die Korrelation zwischen den ELT-Konzentrationen von Vollblutproben, erhalten aus gesunden und nicht-gesunden Menschen, und der Anzahl Neutrophiler von den Vollblutproben zeigt;
  • 4(a) ist ein Diagramm, das die Korrelation zwischen den Konzentration von MPOen von Vollblutproben, erhalten aus gesunden Menschen, und der Anzahl weißer Blutkörperchen der Vollblutproben zeigt;
  • 4(b) ist ein Diagramm, das die Korrelation zwischen den LTF-Konzentrationen von Vollblutproben, erhalten aus gesunden Menschen, und der Anzahl weißer Blutkörperchen der Vollblutproben zeigt;
  • 4(c) ist ein Diagramm, das die Korrelation zwischen den ELT-Konzentrationen von Vollblutproben, erhalten aus gesunden Menschen, und der Anzahl weißer Blutkörperchen der Vollblutproben zeigt;
  • 5(a) ist ein Diagramm, das die Korrelation zwischen den Konzentration von MPOen von Vollblutproben, erhalten aus nicht-gesunden Menschen, und der Anzahl weißer Blutkörperchen der Vollblutproben zeigt;
  • 5(b) ist ein Diagramm, das die Korrelation zwischen den LTF-Konzentrationen von Vollblutproben, erhalten aus nicht-gesunden Menschen, und der Anzahl weißer Blutkörperchen der Vollblutproben zeigt;
  • 5(c) ist ein Diagramm, das die Korrelation zwischen den ELT-Konzentrationen von Vollblutproben, erhalten aus nicht-gesunden Menschen, und der Anzahl weißer Blutkörperchen der Vollblutproben zeigt;
  • 6 ist ein Diagramm, das die Korrelation zwischen den Konzentration von MPOen von Vollblutproben zeigt, einschließlich derjenigen mit einer Anzahl von weißen Blutkörperchen von 10000 Zellen/μl oder mehr, und der Anzahl der weißen Blutkörperchen der Vollblutproben;
  • 7 ist ein Diagramm, dass die Korrelation zwischen den Konzentration von MPOen von Vollblutproben zeigt, einschließlich derjenigen mit einer Anzahl von weißen Blutkörperchen von 10000 Zellen/μl oder mehr, und der Anzahl der Neutrophilen der Vollblutproben; und
  • 8(a) ist ein Diagramm dass die Korrelation zwischen der Anzahl weißer Blutkörperchen, wie bestimmt basierend auf den Konzentration von MPOen, und die Anzahl weißer Blutkörperchen, wie bestimmt mit einer Vorrichtung zur Zählung von Blutzellen, zeigt; und
  • 8(b) ist ein Diagramm dass die Korrelation zwischen der Anzahl Neutrophiler, wie bestimmt basierend auf den Konzentration von MPOen, und der Anzahl Neutrophiler, wie bestimmt mit einer Vorrichtung zur Zählung von Blutzellen, zeigt.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Bei der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen einer Vollblutprobe bereitgestellt, welches umfasst:
    • (a) das Mischen einer Vollblutprobe mit einem oberflächenaktiven Mittel, um dadurch eine Mischung zu erhalten;
    • (b) das Stehen lassen dieser Mischung für eine Zeit, die ausreicht, um die in der Vollblutprobe enthaltenen weißen Blutkörperchen zu lysieren und die intrinsische Myeloperoxidase aus den weißen Blutkörperchen freizusetzen;
    • (c) das Messen der Konzentration der freigesetzten Myeloperoxidase in der Mischung; und
    • (d) das Bestimmen der Anzahl der weißen Blutkörperchen in der Vollblutprobe, basierend auf der Konzentration der freigesetzten Myeloperoxidase.
  • Zum einfachen Verständnis der vorliegenden Erfindung werden die wesentlichen Eigenschaften und verschiedene bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung unten aufgezählt.
    • 1. Verfahren zur Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen in einer Vollblutprobe, welches umfasst: (a) das Mischen einer Vollblutprobe mit einem oberflächenaktiven Mittel, um dadurch eine Mischung zu erhalten; (b) das Stehen lassen dieser Mischung für eine Zeit, die ausreicht, um die in der Vollblutprobe enthaltenen weißen Blut körperchen zu lysieren und die intrinsische Myeloperoxidase aus den weißen Blutkörperchen freizusetzen; (c) das Messen der Konzentration der freigesetzten Myeloperoxidase in der Mischung; und (d) das Bestimmen der Anzahl der weißen Blutkörperchen in der Vollblutprobe, basierend auf der Konzentration der freigesetzten Myeloperoxidase.
    • 2. Verfahren gemäß Punkt 1 oben, wobei in Schritt (c) zusätzlich zu der Konzentration der freigesetzten Myeloperoxidase die Konzentration von C-reaktivem Protein, das in der Vollblutprobe enthalten ist, gemessen wird.
    • 3. Verfahren gemäß Punkt 1 oben, wobei in Schritt (c) die Konzentration der freigesetzten Myeloperoxidase durch ein immunologisches Verfahren gemessen wird.
    • 4. Verfahren gemäß Punkt 2 oben, wobei in Schritt (c) sowohl die Konzentration der Myeloperoxidase als auch die Konzentration des C-reaktiven Proteins durch ein immunologisches Verfahren gemessen werden.
    • 5. Verfahren gemäß Punkt 3 oder 4 oben, wobei das immunologische Verfahren ein Enzym-Immunoassay ist.
    • 6. Verfahren gemäß Punkt 3 oder 4 oben, wobei das immunologische Verfahren ein optischer Immunoassay ist.
    • 7. Verfahren gemäß irgendeinem der Punkte 1 bis 6 oben, wobei das oberflächenaktive Mittel ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel ist.
    • 8. Verfahren gemäß Punkt 7 oben, wobei das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel einen HLB-Wert (hydrophile-lipophile balance) von 12 bis 14 aufweist.
    • 9. Verfahren gemäß Punkt 7 oben, wobei das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel eine Polyethylenoxidverbindung mit einem daran gebundenen gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoff ist.
    • 10. Verfahren gemäß Punkt 9 oben, wobei das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel wenigstens ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel mit einer Polyoxyethylenalkylphenyletherstruktur, einem nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel, das eine Polyethylenoxidverbindung mit einem daran gebundenen ungesättigten aliphatischen Kohlenwasserstoff ist, und einem nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel mit einer Polyoxyethylenalkyletherstruktur.
    • 11. Verfahren gemäß Punkt 10 oben, wobei das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel wenigstens ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel ist, das ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus TritonTM X-114, TritonTM X-100, IgepalTM CA630, Nissan Nonion NS-208.5, Nissan Dispanol TOC, BrijTM 97, und BrijTM 56.
    • 12. Verfahren gemäß irgendeinem der Punkte 1 bis 6 oben, wobei das oberflächenaktive Mittel wenigstens ein kationisches oberflächenaktives Mittel ist, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus Hexadecyltrimethylammoniumbromid, Hexadecyltrimethylammoniumchlorid, Didecyldimethylammoniumchlorid, Dodecyltrimethylammoniumchlorid, Dodecyltrimethylammoniumbromid, Octadecyltrimethylammoniumchlorid, Tetradecylammoniumbromid, Dodecylpyridiniumchlorid, Hexadecylpyridiniumchlorid, He xadecylpyridiniumbromid, 1-Laurylpyridiniumchlorid, und Tetradecyltrimethylammoniumbromid.
    • 13. Verfahren nach irgendeinem der Punkte 1 bis 12 oben, wobei das oberflächenaktive Mittel mit der Vollblutprobe in einer Menge gemischt wird, das die Konzentration des oberflächenaktiven Mittels in der Mischung in dem Bereich von 0,2 bis 10 % (w/v) ist.
    • 14. Verfahren nach irgendeinem der Punkte 1 bis 13 oben, wobei in Schritt (b) die Mischung für nicht mehr als 1 Stunde stehen gelassen wird.
    • 15. Verfahren nach irgendeinem der Punkte 1 bis 14 oben, wobei die Anzahl der weißen Blutkörperchen die Anzahl der Neutrophilen ist.
  • Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben.
  • Bei der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "Vollblut" Blut, das alle Blutbestandteile enthält, wie z. B. rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen, Blutplättchen und Plasma. Der Ausdruck "weiße(s) Blutkörperchen" (white blond cell) soll Neutrophile, Monozyten, Basophile, Eosinophile und Lymphozyten umfassen. Der Ausdruck "Lyse eines/von weißen Blutkörperchen(s)" bedeutet, die Zellmembranen der weißen Blutkörperchen aufzubrechen, um dadurch den Inhalt der Zellen in die Umgebung der Zellen freizusetzen.
  • Zur weiteren Veranschaulichung der wesentlichen Eigenschaften der vorliegenden Erfindung werden die in der vorliegenden Erfindung enthaltenen technischen Eigenschaften nachfolgend im Detail beschrieben, während erklärt wird, wie die vorliegende Erfindung entwickelt worden ist.
  • Wie in Borregaard, N. et al., "Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocytes": Blond, 89, 3503–3251 (1997) beschrieben, beinhalten Beispiele von Substanzen, die in Neutrophilen vorhanden sind, Substanzen, die in azurophilen Granula (primäre Granula), spezifischen Granula (sekundäre Granula), Gelatinase Granula (tertiäre Granula) und Vesikeln vorhanden sind.
  • Insbesondere beinhalten Beispiele von Substanze, die in azurophilen Granula (primäre Granula) vorhanden sind, CD63, CD68, V-Typ H+ ATPase, β-Glycerophosphatase (acid β-glycerophosphatase), Mucopolysaccharidasen (acid mucopolysaccharides), α1-Antitrypsin, α1-Mannosidase, Azurocidin (CAP37/Heparin-bindendes Protein) (azurocidin/CAP37/heparinbinding protein), BPI (bactericidal/permeability-increasing protein), β-Glycerophosphatase, β-Glucuronidase, Cathepsin, Defensine, neutrophile Elastase, Lysozym, Myeloperoxidase, N-Acetyl-β-glucosaminidase, Proteinase, Sialidase und Ubiquitin.
  • Beispiele von Substanzen, die in spezifischen Granula (sekundäre Granula) vorhanden sind, beinhalten CD11b, CD15 Antigen, CD66, CD67, Cytochrom b558, fMLP-Rezeptor, Fibronectin Rezeptor, G-Protein α-Untereinheit, Laminin Rezeptor, NB-1 Antigen, 19-kD Protein, 155-kD Protein, Rap 1, Rap 2, SCAMP, Thrombospondin Rezeptor, TNF Rezeptor, Urokinase Plasminogen AktivatorRezeptor (urokinase type plasminogen aktivator receptor), VAMP-2, Vitronectin-Rezeptor, β2-Mikroglobulin, Collagenase, Gelatinase, hCAP-18, Histaminase, Heparinase, Lactoferrin, Lysozym, NGAL, Urokinasetyp Plasminogen Aktivator Rezeptor Sialidase, SGP28 und Vitamin B12-bindendes Protein.
  • Beispiele von Substanzen, die in Gelatinase Graunula (tertiäre Granula) vorhanden sind, beinhalten CD11b, Cytochrom b558 , Diacylglyceroldeacylase, fMLP Rezeptor, SCAMP, Plasminogen Aktivator Rezeptor vom Urokinasetyp, VAMP-2, V-Typ-H+ ATPase, Acetyltransferase, β2-Mikroglobulin, Gelatinase und Lysozym.
  • Beispiele von Substanzen, die in Vesikeln vorhanden sind, beinhalten alkalische Phosphatase, komplementären Rezeptor, Cytochrom b558, CD11b, CD14, CD16, fMLP Rezeptor, SCAMP, Plasminogen Aktivator Rezeptor vom Urokinasetyp, VAMP-2, V-Typ H+ ATPase, CD10, CD13, CD45, C1q Rezeptor, DAF (decay accelerating factor) und Plasmaproteine (einschließlich Tetranectin).
  • Die gegenwärtigen Erfinder nahmen an, dass es bevorzugt ist, dass eine Substanz, die zum Zweck der Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen in Vollblut gemessen wird, die Eigenschaften hat, dass, wenn Vollblut mit einem oberflächenaktiven Mittel behandelt wird, die Substanz in einer Menge freigesetzt wird, die zur Messung derselben mit einem Enzym-Immunoassay ausreicht, und dass die Menge der Substanz in Vollblut sogar bei Vorhandensein einer anderen primären Krankheit als einer Infektion keine große Schwankung zeigt. Unter diesem Gesichtspunkt führten die gegenwärtigen Erfinder Untersuchungen durch, und, als Folge davon, berücksichtigten Sie, dass die Substanz, die zum Zweck der Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen in Vollblut gemessen wird, wünschenswert aus Substanzen ausgewählt wird, die in azurophilen Granula (primäre Granula) oder spezifischen Granula (sekundäre Granula) vorhanden sind, und besonders wünschenswert aus Myeloperoxidase (hierin nachfolgend häufig als "MPO" bezeichnet), neutrophiler Elastase (hierin nachfolgend häufig als "ELT" bezeichnet) und Lactoferrin (hierin nachfolgend häufig als "LTF" bezeichnet) ausgewählt wird.
  • Ferner führten die gegenwärtigen Erfinder die folgenden Untersuchungen durch. Vollblutproben mit jeweils einer Anzahl von weißen Blutkörperchen von weniger als 10000 Zellen/μl wurden erhalten von einer Gruppe gesunder Menschen, und Vollblutproben mit jeweils einer Anzahl weißer Blutkörperchen von 10000 Zellen/μl oder mehr wurden erhalten von einer Gruppe nicht-gesunder Menschen. Diese Vollblutproben wurden einzeln untersucht und die Korrelation zwischen den Konzentrationen von MPO, ELT und LTF und der Anzahl weißer Blutkörperchen wurde jeweils analysiert. Bezüglich der von der Gruppe der gesunden Menschen erhaltenen Vollblutproben wurde gefunden, dass der Korrelationskoeffizient (R) der Beziehung zwischen der Konzentration von MPO und der Anzahl weißer Blutkörperchen extrem hoch war, genau genommen R = 0,9336, verglichen mit dem Korrelationskoeffizienten (R) der Beziehung zwischen der Konzentration von LTF oder ELT und der Anzahl weißer Blutkörperchen. Deshalb wurde gefunden, dass in dem Fall der von gesunden Menschen erhaltenen Vollblutproben die akkurateste Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen durch Messung der Konzentration von MPO erhalten werden kann.
  • Ferner wurde bezüglich der Daten der Vollblutproben, erhalten von der Gruppe nicht-gesunder Menschen, die Aufmerksamkeit auf die Steigung einer Regressionslinie gerichtet, die jeweils die Korrelation zwischen MPO-, LTF- und ELT-Konzentrationen und der Anzahl weißer Blutkörperchen zeigt. Die Steigungen der Regressionslinien der MPO-, LTF- und ELT-Konzentrationen gegen die Anzahl der weißen Blutkörperchen in den Vollblutproben, erhalten von nicht-gesunden Menschen, wurden jeweils verglichen mit den Steigungen der Regressionslinien der MPO-, LTF- und ELT-Konzentrationen gegen die Anzahl weißer Blutkörperchen in den von gesunden Menschen erhaltenen Vollblutproben. Der Vergleich zeigte das Folgende. Die Steigung der Regressionsli nie, die die Korrelation zwischen der Konzentration von MPO und der Anzahl weißer Blutkörperchen in Vollblut von nicht-gesunden Menschen zeigt, war 0,0019, was annähernd der Steigung (0,0021) der Regressionslinie entspricht, die die Korrelation zwischen der Konzentration von MPO und der Anzahl weißer Blutkörperchen in Vollblut von gesunden Menschen zeigt. Im Gegensatz dazu war die Steigung der Regressionslinie, die die Korrelation zwischen der LTF-Konzentration und der Anzahl weißer Blutkörperchen in Vollblut von nicht-gesunden Menschen zeigt, 0,0007, gegenüber 0,0016, welches die Steigung der Regressionslinie ist, die die Korrelation zwischen der LTF-Konzentration und der Anzahl weißer Blutkörperchen in der Vollblutprobe von gesunden Menschen zeigt, d.h., es wurde gezeigt, dass im Falle von LTF die Steigung der Regressionslinie, die bezüglich des Vollbluts von nicht-gesunden Menschen erhalten wurde, so gering war wie etwa 1/2,3 der Steigung der Regressionslinie, die bezüglich des Vollblutes von gesunden Menschen erhalten wurde. Ferner war die Steigung der Regressionslinie, die die Korrelation zwischen der ELT-Konzentration und der Anzahl weißer Blutkörperchen in Vollblut von nicht-gesunden Menschen zeigt, 0,0031, gegenüber 0,0017, welches die Steigung der Regressionslinie ist, die die Korrelation zwischen der ELT-Konzentration und der Anzahl weißer Blutkörperchen in Vollblut von gesunden Menschen zeigt, d.h., es wurde gezeigt, dass im Falle von ELT der Gradient der Regressionslinie, die bezüglich des Vollbluts von nicht-gesunden Menschen erhalten wurde, so groß wie etwa 1,8 mal die Steigung der Regressionslinie war, die bezüglich des Vollbluts von gesunden Menschen erhalten wurde. Darüber hinaus wurde auch gefunden, dass im Falle einer Vollblutprobe, die von einem Patienten erhalten wurde, der unter akuter Pankreatitis leidet, die ELT-Konzentration extrem höher als die Konzentrationen von MPO und LTF war, und die ELT-Konzentration zeigte eine große Abweichung von einer Regressionslinie, die die Korrelation zwischen der ELT-Konzentration und der Anzahl weißer Blutkörperchen in Vollblut zeigt. Somit wurden Ergebnisse erhalten, die eine Tendenz anzeigen, wobei, im Fall von Krankheiten, die zu einem Anstieg der Anzahl der weißen Blutkörperchen in Vollblut bis zu einer Höhe von 10000 Zellen/μl oder mehr führen, die Menge von intrinsischem MPO keine signifikante Änderung zeigt, aber die Menge von intrinsischem LTF abnimmt und die Menge von intrinsischem ELT ansteigt. Jedoch wurde der Grund für eine derartige Tendenz noch nicht aufgeklärt.
  • Um eine akkurate Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen in Vollblut zu erhalten, ist es wichtig, ein Bestimmungsverfahren zu verwenden, das solche Ergebnisse liefert, dass die Steigung einer Regressionslinie, die im Hinblick auf Vollblut erhalten wird, keine Veränderung in Abhängigkeit davon zeigt, ob das Vollblut Vollblut eines gesunden Menschen mit einer Anzahl weißer Blutkörperchen von weniger als 10000 Zellen/μl oder das Vollblut eines nicht-gesunden Menschen mit einer Anzahl weißer Blutkörperchen von 10000 Zellen/μl oder mehr ist. Deshalb wurde in Anbetracht der vorstehend beschriebenen Ergebnisse bei den von den gegenwärtigen Erfindern durchgeführten Untersuchungen geschlossen, dass es zur akkuraten Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen einer Vollblutprobe am geeignetsten ist, die Menge von Myeloperoxidase zu messen, die in der Vollblutprobe enthalten ist.
  • Als ein Ergebnis der intensiven und ausführlichen, vorstehend beschriebenen Untersuchungen fanden die gegenwärtigen Erfinder, dass die Menge von Myeloperoxidase als ein Index für die Anzahl weißer Blutkörperchen geeignet ist. Basierend auf diesen Untersuchungen wurde die vorliegende Erfindung vollendet.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen in einer Vollblutprobe be reit, bei der eine Vollblutprobe mit einem oberflächenaktiven Mittel gemischt wird, um dadurch die weißen Blutkörperchen zu lysieren und intrinsische Myeloperoxidase aus den weißen Blutkörperchen freizusetzen, und die Konzentration der freigesetzten Myeloperoxidase wird gemessen. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen in einer Vollblutprobe bereit, welches umfasst:
    • (a) das Mischen einer Vollblutprobe mit einem oberflächenaktiven Mittel, um dadurch eine Mischung zu erhalten;
    • (b) Das Stehen lassen dieser Mischung für eine Zeit, die ausreicht, um die in der Vollblutprobe enthaltenen weißen Blutkörperchen zu lysieren und die intrinsische Myeloperoxidase aus den weißen Blutkörperchen freizusetzen;
    • (c) das Messen der Konzentration der freigesetzten Myeloperoxidase in der Mischung; und
    • (d) das Bestimmen der Anzahl der weißen Blutkörperchen in der Vollblutprobe, basierend auf der Konzentration der freigesetzten Myeloperoxidase.
  • Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine Vollblutprobe mit einem oberflächenaktiven Mittel gemischt, um dadurch eine Mischung zu erhalten, und die erhaltene Mischung wird stehen gelassen, um dadurch die weißen Blutkörperchen, die roten Blutkörperchen, die Blutplättchen und dergleichen, die in der Vollblutprobe enthalten sind, zu lysieren.
  • In der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "oberflächenaktives Mittel (Tensid)" eine Verbindung, die sowohl einen hydrophilen Teil als auch einen lipophilen Teil in einem ein zigen Molekül aufweist. Sofern nicht anders angegeben, bedeutet hierin "oberflächenaktives Mittel" ein wasserlösliches oberflächenaktives Mittel (Tensid).
  • Im Allgemeinen werden oberflächenaktive Mittel grob in ionische oberflächenaktive Mittel und nicht-ionische oberflächenaktive Mittel eingeteilt. Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann irgendein ionisches oberflächenaktives Mittel oder nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel als ein oberflächenaktives Mittel verwendet werden, das mit einer Vollblutprobe vermischt wird, um dadurch die weißen Blutkörperchen zu lysieren.
  • Ionische oberflächenaktive Mittel können in anionische oberflächenaktive Mittel, kationische oberflächenaktive Mittel und amphotere oberflächenaktive Mittel eingeteilt werden.
  • Beispiele für anionische oberflächenaktive Mittel beinhalten Natriumdodecylsulfat, Natriumdodecylsulfonat, Natriumdodecyl-N-sarcosinat, Natriumcholat, Natriumdeoxycholat, und Natriumtaurodeoxycholat.
  • Beispiele für kationische oberflächenaktive Mittel beinhalten Hexadecyltrimethylammoniumbromid, Hexadecyltrimethylammoniumchlorid, Didecyldimethylammoniumchlorid, Didecyldimethylammoniumbromid, Dodecyltrimethylammoniumchlorid, Dodecyltrimethylammoniumbromid, Octadecyltrimethylammoniumchlorid, Octadecyltrimethylammoniumbromid, Tetradecylammoniumbromid, Dodecylpyridiniumchlorid, Hexadecylpyridiniumchlorid, Hexadecylpyridiniumbromid, 1-Laurylpyridiniumchlorid, und Tetradecyltrimethylammoniumbromid.
  • Beispiele für amphotere oberflächenaktive Mittel beinhalten 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonsäure, 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propansulfonsäure, Palmitoyllysolecithin, Dodecyl-N-betain, und Dodecyl-β-alanin.
  • Beispiele für nicht-ionische oberflächenaktive Mittel beinhalten Octylglucosid, Heptylthioglucosid, Decanoyl-N-methylglucamid, Polyoxyethylendodecylether, Polyoxyethylenheptamethylhexylether, Polyoxyethylenisooctylphenylether, Polyoxyethylennonylphenylether, einen Fettsäureester von Polyoxyethylen, einen Fettsäureester von Sucrose, und Polyoxyethylensorbitolester.
  • Bezüglich der oberflächenaktiven Mittel, die bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ist es wünschenswert, dass das oberflächenaktive Mittel dazu dienen kann, intrinsisches MPO aus weißen Blutkörperchen freizusetzen, während die Denaturierung von MPO auf einem möglichst niedrigen Niveau gehalten wird. Unter diesem Gesichtspunkt ist es bevorzugt, dass das oberflächenaktive Mittel ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel ist, eher als ein ionisches oberflächenaktives Mittel, das die Eigenschaft einer hohen Oberflächenaktivität hat.
  • Als einer der Parameter, der die Eigenschaften eines oberflächenaktiven Mittels zeigt, kann der HLB-Wert (hydrophile liphophile balance) erwähnt werden. Der HLB-Wert ist ein Index für das Gleichgewicht zwischen der hydrophilen Gruppe und der lipophilen Gruppe in dem oberflächenaktiven Molekül. Das Konzept des HLB-Werts wurde von Griffin vorgeschlagen. Der HLB-Wert eines oberflächenaktiven Mittels wird experimentell bestimmt, indem die Fähigkeit zur Emulsion des oberflächenaktiven Mittels ausgewertet wird und eine einfache Berechnung durchgeführt wird (siehe z. B. "Sin-ban Kaimen-Kassei-Zai Handobukku (neue Ausgabe, Tensid Handbuch)", herausgegeben von Tokiyuki YOSHIDA, Shin-ichi SHINDO, Tadayoshi OOGAKI und Mikiyoshi YAMANAKA und publiziert von Kogaku Tosho Co., Japan (1987)). Die HLB-Werte beispielhafter oberflächenaktiver Mittel, die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind unten gezeigt.
    Oberflächenaktives Mittel (Tensid) HLB-Wert
    Nissan Nonion NS-204.5 9,5
    Triton X-45 10,4
    Triton X-207 10,7
    Nissan Nonion NS-206 10,9
    Nissan Nonion HS-206 11,2
    Nissan Dispanol TOC 12,0
    Triton X-114 12,4
    Brij 97 12,4
    Nissan Nonion NS-208.5 12,6
    Brij 56 12,9
    Igepal CA630 13,0
    Nonidet P-40 13,0
    Nissan Nonion HS-210 13,3
    Triton X-100 13,5
    Nissan Nonion NS-212 14,1
    Igepal CA720 14,6
    Nissan Nonion HS-215 15,0
    Nissan Nonion NS-215 15,0
  • Es ist bevorzugt, dass das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel, das in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, einen HLB-Wert von 12 bis 14 hat. Nicht-ionische oberflächenaktive Mittel mit einem HLB-Wert von 12 bis 14 können eine hohe Wirksamkeit bei der Freisetzung von intrinsi schem MPO aus weißen Blutkörperchen, die in Vollblutproben enthalten sind, zeigen. Wenn das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel einen HLB-Wert hat, der größer als 14 ist, zeigt das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel eine merklich geringere Wirksamkeit bei der Freisetzung von intrinsischem MPO aus weißen Blutkörperchen, die in der Vollblutprobe enthalten sind. Andererseits, wenn das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel einen HLB-Wert hat, der niedriger als 12 ist, zeigt das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel eine schlechte Löslichkeit in Wasser, so dass nicht nur die Wirksamkeit bei der Freisetzung von intrinsischem MPO aus den weißen Blutkörperchen gering wird, sondern auch die Handhabung des oberflächenaktiven Mittels schwierig wird. Die hierin erwähnten HLB-Werte sind diejenigen, die in "HANDBOOK OF INDUSTRIAL SURFACTANTS" 2. Auflage (Second Edition), herausgegeben von Michael and Irene Ash und publiziert von Gower Publishing Limited (1997), beschrieben sind, sofern nicht anders angegeben.
  • Unter dem Gesichtspunkt einer wirksamen Freisetzung von intrinsischem MPO aus den weißen Blutkörperchen ist es bevorzugt, dass das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel eine Polyethylenoxidverbindung mit einem daran gebundenen gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoff ist. Es ist stärker bevorzugt, dass nicht-ionische oberflächenaktive Mittel ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus: einem nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel mit einer Polyoxyethylenalkylphenyletherstruktur (z. B., TritonTM X-114 (hergestellt und vertrieben von Nacalai Tesque, Inc., Japan), TritonTM X-100 (hergestellt und vertrieben unter der Marke von SIGMATM, USA.), IgepalTM CA630 (hergestellt und vertrieben unter der Marke von SIGMATM USA), und Nissan Nonion NS-208.5 (hergestellt und vertrieben von Nippon Oil and Fats Co., Ltd., Japan)),
    ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, das eine Polyethylenoxidverbindung mit einem daran gebundenen ungesättigten aliphatischen Kohlenwasserstoff ist (z. B., BrijTM 97 (hergestellt und vertrieben unter der Marke von SIGMATM, USA)), und
    ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel mit einer Polyoxyethylenalkyletherstruktur (z. B. Nissan Dispanol TOC (hergestellt und vertrieben von Nippon Oil and Fats Co., Ltd., Japan) und BrijTM 56 (hergestellt und vertrieben unter der Marke von SIGMATM, USA)).
  • Es ist stärker bevorzugt, dass das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel TritonTM X-114 ist, da es eine hohe Aktivität zur Freisetzung von intrinsischem MPO aus weißen Blutkörperchen zeigt und eine äußerst empfindliche Messung von intrinsischem MPO ermöglicht.
  • Bezüglich der oben mit ihren Handelsnamen gezeigten oberflächenaktiven Mittel werden als Hinweis ihre CTFA (The Cosmetic, Toiletry and Fragrance Assoc.) Identifizierungen und/oder IUPAC Identifizierungen in der Tabelle unten zusammengefasst.
    Handelsname CTFA Identifikation IUPAC Identifikation
    TritonTM X-114 Octoxynol-8 α-[4-(1,1,3.3,-Tetramethylbutyl)phenyl]-ω-hydroxypoly(oxy-1,2-ethandiyl)
    TritonTM X-100 Octoxynol-9 α-[4-(1,1,3,3,-Tetramethylbutyl) phenyl]-ω-hydroxypoly(oxy-1,2-ethandiyl)
    IgepalTM CA630 Octoxynol-9 α-[4-(1,1,3,3,-Tetramethylbutyl) phenyl]-ω-hydroxypoly(oxy-1,2-ethandiyl)
    Nissan Nonion NS-208.5 Nonoxynol-8,5 α-(4-Nonylphenyl)-ω-hydroxypoly(oxy-1,2-ethandiyl)
    Nissan Dispanol TOC Polyoxyethylenalkyl-ether ---
    BrijTM97 Polyoxyethylenoleilalchol(Oleth-10) ---
    BrijTM56 Polyoxyethylencetylalchol(Ceteth-10) ---
  • Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann das zum Lysieren der weißen Blutkörperchen und Freisetzen von intrinsischem MPO aus den weißen Blutkörperchen eingesetzte oberflächenaktive Mittel ein kationisches oberflächenaktives Mittel sein. Aus den Ergebnissen der von den gegenwärtigen Erfindern durchgeführten Experimente haben die gegenwärtigen Erfinder gefunden, dass es geeignet ist, zur Freisetzung von intrinsischem MPO aus weißen Blutkörperchen ein kationisches oberflächenaktives Mittel zu verwenden, das ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Hexadecyltrimethylammoniumbromid, Hexadecyltrimethylammoniumchlorid, Didecyldimethylammoniumchlorid, Dodecyltrimethylammoniumchlorid, Dodecyltrimethylammoniumbromid, Octadecyltrimethylammoniumchlorid, Tetradecylammoniumbromid, Dodecylpyridiniumchlorid, Hexadecylpyridiniumchlorid, Hexadecylpyridiniumbromid, 1-Laurylpyridiniumchlorid, und Tetradecyl trimethylammoniumbromid.
  • Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass das oberflächenaktive Mittel mit der Vollblutprobe in einer Menge gemischt wird, so dass die Konzentration des oberflächenaktiven Mittels in der resultierenden Mischung 0,2 % (w/v) oder mehr ist. Wenn die Konzentration des oberflächenaktiven Mittels in der Mischung weniger als 0,2 % (w/v) ist, ist es unmöglich, eine befriedigende Freisetzung von intrinsischem MPO aus den weißen Blutkörperchen zu erhalten. Andererseits, wenn die Konzentration des oberflächenaktiven Mittels in der Mischung zu hoch ist, werden aufgrund der Verwendung desselben in einer erhöhten Menge nicht nur die Kosten für das oberflächenaktive Mittel höher, sondern auch die Handhabung der Mischung wird schwierig. Deshalb ist es bevorzugt, dass das oberflächenaktive Mittel mit der Vollblutprobe in einer Menge gemischt wird, so dass die Konzentration des oberflächenaktiven Mittels in der resultierenden Mischung in dem Bereich von 0,2 bis 10 % (w/v), vorteilhafter von 0,2 bis 5,0 % (w/v), noch vorteilhafter von 0,2 bis 2,0 % (w/v) ist.
  • Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung gibt es bezüglich des Verfahrens zum Mischen einer Vollblutprobe mit einem oberflächenaktiven Mittel keine bestimmte Einschränkung, solange das Verfahren zum Mischen sicher den Arbeitsschritt ermöglicht, bei dem eine Vollblutprobe mit einem oberflächenaktiven Mittel gemischt wird, um dadurch eine Mischung zu erhalten, und die Mischung stehen gelassen wird, um dadurch die weißen Blutkörperchen, die in der Vollblutprobe enthalten sind, zu lysieren und die intrinsischen Myeloperoxidase aus den weißen Blutkörperchen freizusetzen. Zum Beispiel kann das Mischen mit einem Verfahren durchgeführt werden, bei dem eine wässrige Lösung eines oberflächenaktiven Mittels hergestellt wird, und die wässrige Lösung eines oberflächenaktiven Mittels zu einer Vollblutprobe zugegeben wird. In diesem Fall, nach der Zugabe der wässrigen Lösung eines oberflächenaktiven Mittels, kann die resultierende Mischung entweder gerührt werden oder nicht gerührt werden. Alternativ dazu kann das Mischen auch mit einem Verfahren durchgeführt werden, bei dem ein oberflächenaktives Mittel in Teilchenform an der inneren Oberfläche eines Mischungsgefäßes angebracht wird, und eine Vollblutprobe zu dem Mischgefäß zugegeben wird. Auch im Falle dieses Mischungsverfahrens werden die weißen Blutkörperchen beim Mischen zwi schen der Vollblutprobe und dem oberflächenaktiven Mittel lysiert und intrinsische Myeloperoxidase wird aus den weißen Blutkörperchen freigesetzt. Auch bei diesem Mischungsverfahren kann die Mischung aus Vollblutprobe und oberflächenaktivem Mittel entweder gerührt werden oder nicht gerührt werden.
  • Bei dem Schritt, bei dem die Mischung, die durch das Mischen einer Vollblutprobe mit einem oberflächenaktiven Mittel erhalten wurde, stehen gelassen wird, gibt es keine bestimmte Einschränkung bezüglich der Standzeit der Mischung, solange die Zeit ausreichend ist, um die weißen Blutkörperchen, die in der Vollblutprobe enthalten sind, zu lysieren und intrinsische Myeloperoxidase aus den weißen Blutkörperchen freizusetzen. Jedoch ist es bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung bevorzugt, dass die Standzeit der Mischung nicht länger als 1 Stunde ist. Im Allgemeinen ist die Standzeit in dem Bereich von etwa 1 Minute bis 1 Stunde. Bei den anfänglichen Schritten zur Diagnose bei einem Patienten, der unter einer infektiösen Krankheit leidet, ist es notwendig, die Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen (und die Konzentration von CRP) rasch zu erhalten, da es notwendig ist, dass eine geeignete Behandlung, wie z. B. die Verabreichung eines Arzneimittels, sobald wie möglich durchgeführt wird. Um die benötigte Zeit zur Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen zu verkürzen, ist es deshalb bevorzugt, dass die Standzeit der Mischung kurz ist.
  • Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung gibt es bezüglich der Temperatur, bei der die Mischung, die durch Mischen einer Vollblutprobe mit einem oberflächenaktiven Mittel erhalten wird, stehen gelassen wird, keine bestimmte Einschränkung. Da die Lyse der weißen Blutkörperchen und die Freisetzung von intrinsischer Myeloperoxidase aus den weißen Blutkörperchen in einer wässrigen Dispersion (Emulsion) durchgeführt wird, ist es jedoch nicht erwünscht, die vorstehend erwähnte Mischung auf eine Temperatur abzukühlen, bei der die Mischung gefroren ist. Auch ist es nicht erwünscht, die vorstehend erwähnte Mischung auf eine hohe Temperatur, bei der sich die Antigenizität von MPO verändert, zu erhitzen, da eine Veränderung der Antigenizität von MPO die immunologische Reaktion von MPO hindert. Deshalb ist es bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung bevorzugt, dass die Temperatur, bei der die Mischung, die durch Mischen einer Vollblutprobe mit einem oberflächenaktiven Mittel erhalten wird, stehen gelassen wird, in dem Bereich von 0°C bis Raumtemperatur (etwa 25°C) ist. Im Hinblick auf die Tatsache, dass die Diagnose einer infektiösen Krankheit in einer gewöhnlichen Klinik durchgeführt wird, ist es ferner stärker bevorzugt, dass die Temperatur, bei der die vorstehend erwähnte Mischung stehen gelassen wird, Raumtemperatur ist.
  • Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann die Mischung, die durch Mischen einer Vollblutprobe mit einem oberflächenaktiven Mittel erhalten wird, der Messung der Konzentration von C-reaktivem Protein, das in der Vollblutprobe enthalten ist, zusätzlich zu der Messung der Konzentration von freigesetzter Myeloperoxidase unterworfen werden. Bezüglich des CRP-Werts von einem gesunden Menschen (Standardbereich) gibt es Berichte von verschiedenen Forschern; Beispiele für berichtete Werte des Standardbereichs sind wie folgt: 60,3 μg/dl oder weniger (Yasuko YAMAGISHI et al: "Rinsho Byori (klinische Pathologie)" 32: 1389–1394, 1984); 300 μg/dl oder weniger (Akira NISHIDA: "Kitasato Igaku (Kitasato Medicine)" 16: 393–401, 1986); und 4,0 bis 235.3 μg/dl (Naoto SHIMETANI: "Kitasato Igaku (Kitasato Medicine)" 24: 97–103, 1994). Der CRP-Wert von einem gesunden Menschen (Standardbereich) wird auch in Handbüchern beschrieben, die die Daten betreffen, die bei klinischen Untersuchungen erhalten werden. Zum Beispiel wird in dem mit "Rinsho-ni-Yakudatsu Kensa-chi-no Yomikata·Kangaekata (wie die Daten klinischer Untersuchungen in einer klinisch geeigneten Weise gelesen und bewertet werden)", betitelten Handbuch, zusammengestellt unter der Aufsicht von Kin-ya KAWANO und Osamu NISHIZAKI und publiziert von Sogo-Igakusha Co., Japan, S. 236, 1997), beschrieben, dass der CRP-Wert von einem gesunden Menschen (Standardbereich) 0,3 mg/dl (= 3 μg/ml) oder weniger beträgt (obwohl der Wert abhängig von dem Bestimmungsverfahren teilweise etwas variiert. Wenn Monozyten/Makrophagen durch eine Läsion aktiviert werden, wie z. B. eine Entzündung und Krebs, sekretieren Monozyten/Makrophagen Interleukin 6, Interleukin 1, TNF-α und dergleichen, und als Folge davon, wird die Produktion von Akute-Phase-Proteinen, wie z. B. CRP, in Hepatozyten induziert, so dass die Konzentration von CRP des Blutes ansteigt. Der Anstieg der Konzentration von CRP des Blutes ist eine unspezifische Reaktion. Jedoch reagiert die Konzentration von CRP des Blutes empfindlich auf eine Läsion und ist daher ein äußerst weit verbreitet verwendeter Typ eines Markers für eine Entzündung. Ferner steigt die Konzentration von CRP des Blutes im Einklang mit dem Fortschreiten von Krebs an und ist daher im weiten Sinn auch als ein Tumormarker geeignet. Auch in Bezug auf Infektionskrankheiten zeigt das Blut im Falle einer bakteriellen Infektion eine Konzentration von CRP, die höher ist als im Falle einer viralen Infektion. Deshalb kann durch die Messung der Konzentration von CRP, zusätzlich zu der Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen, eine präzisere Diagnose erfolgen. Zum Beispiel sind die unten angegebenen Beziehungen zwischen dem CRP-Wert und pathologischen Zuständen bekannt.
    CRP (μg/ml) Pathologische Zustände
    0 bis 20 Schwangerschaft, Rauchen, akute Appendicitis, usw.
    0 bis 100 Maligner Tumor, virale Infektion, systemischer Lupus Erythematosus, usw.
    20 bis 200 bakterielle Infektion, chronische rheumatoide Arthritis, usw.
    20 bis 200 oder mehr Sepsis, Pneumonie, und Angiitis
  • Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung gibt es in Bezug auf das Verfahren zur Messung der Konzentration von MPO, das aus den weißen Blutkörperchen freigesetzt wird, keine besondere Einschränkung. Die Konzentration von MPO kann durch verschiedene Verfahren gemessen werden. Spezifische Beispiele für Verfahren zur Messung der Konzentration von MPO beinhalten die Messung der Enzymaktivität von MPO, Flüssigchromatographie und ein immunologisches Verfahren. Jedoch ist es bevorzugt, dass die Konzentration von MPO durch ein immunologisches Verfahren gemessen wird, da ein immunologisches Verfahren bei der Empfindlichkeit und Spezifität der Messung hoch ist und auch verwendet werden kann, um die Konzentration von CRP zu messen.
  • Bei der vorliegenden Erfindung soll der Ausdruck "immunologisches Verfahren", zum Beispiel, die folgenden Verfahren umfassen: ein Verfahren, bei dem die Menge eines Antigens oder Antikörpers gemessen wird, indem die Enzymaktivität oder Radioaktivität als ein Marker verwendet werden; ein Verfahren, bei dem die Menge eines Antigens oder Antikörpers gemessen wird durch das Nachweisen eines Immunkomplexes, der durch eine Antigen-Antikörper Reaktion gebildet wird; und ein Verfahren, bei dem ein Antigen oder Antikörper auf einem Träger, wie z. B. Latexkügelchen oder kolloidales Gold, getragen wird und das Träger-gebundene Antigen oder der Träger-gebundene Antikörper werden einer Agglutinierung mit einem Antikörper oder Antigen unterworfen, und die Ergebnisse der Agglutinierung werden untersucht, um das Ausmaß der Antigen-Antikörper Reaktion zu messen, und die Menge an Antigen oder Antikörper wird gemessen, basierend auf dem Ausmaß der Antigen-Antikörper Reaktion.
  • In Bezug auf den Typ des immunologischen Verfahrens, das bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, gibt es keine bestimmte Einschränkung. Unter dem Gesichtspunkt der Sicherheit ist es jedoch nicht erwünscht, ein immunologisches Verfahren zu verwenden, das Radioaktivität als Marker verwendet.
  • Als spezifische Beispiele für immunologische Verfahren können erwähnt werden: Immunochromatographie (das im Fachgebiet verwendet wird, um die Menge von Proteinen und dergleichen zu messen); ein Enzym-Immunoassay unter Verwendung einer 96-Lochplatte; und das Messverfahren (der optische Immunoassay von BioStar, USA), das in den internationalen Patentanmeldungen Nrs. WO 91/04491 , WO 92/14136 , WO 92/14147 , WO 92/15826 und WO 94/03774 beschrieben ist.
  • Eine spezifische Erklärung in Bezug auf das Verfahren zur Messung der Konzentration von MPO durch Immunochromatographie wird unten angegeben. Ein gegen humanes MPO gerichteter Antikörper (anti-human MPO antibody) wird durch Absorption oder durch ein chemisches Verfahren auf einer Substratmembran immobilisiert, wobei die Substratmembran Cellulose, Nitrocellulose oder eine Cellulose mit einer chemisch modifizierten Oberfläche (eine Cellulose, die klinisch modifiziert worden ist, um eine kationische funktionelle Gruppe aufzuweisen, wie z. B. eine Aminogruppe oder eine Diethylaminoethylgruppe, oder um eine anionische funktionelle Gruppe aufzuweisen, wie z. B. eine Carboxylgruppe) beinhaltet. Das Substrat mit dem daran immobilisierten Antikörper wird in eine Pufferlösung eingetaucht, die Rinderserum Albumin oder dergleichen enthält, um dadurch eine Blockierungsreaktion zu bewirken, und dann getrocknet, um einen Chip zur Verwendung bei der Immunochromatographie zur Messung von MPO zu erhalten.
  • Bei der vorstehend beschriebenen Herstellung des Chips zur Verwendung bei der Immunochromatographie, kann ein Chip zur Verwendung bei der Immunochromatographie zur Messung von MPO und CRP erhalten werden, wenn ein gegen humanes CRP gerichteter Antikörper (anti-human CRP antibody) zusätzlich zu dem gegen humanes MPO gerichteten Antikörper auf dem Substrat immobilisiert wird (wobei die 2 Antiköper an unterschiedlichen Positionen auf einem einzigen Substrat immobilisiert sein können oder auf zwei Substraten immobilisiert sein können, die jeweils Seite an Seite angeordnet sind).
  • Der Nachweis von MPO (und CRP) kann erfolgen unter Verwendung eines gegen humanesMPO gerichteten Antikörpers (und eines gegen humanes CRP gerichteten Antikörpers), der mit kolloidalem Gold oder Latexkügelchen markiert worden ist. Insbesondere kann der Nachweis wie folgt durchgeführt werden. Der vorstehend erwähnte markierte Antikörper wird mit der (Vollblutprobe/oberflächenaktives Mittel) Mischung, die die lysierten weißen Blutkörperchen enthält, gemischt und die resultierende Mischung wird auf ein Substrat des oben erwähnten Chips zur Verwendung bei der Immunochromatographie getropft, und dann wird dazu ein geeigneter Entwicklungspuffer zugegeben, so dass sich die aufgetropfte Mischung bewegt und auf der Oberfläche des Substrats bei dem Chip entwickelt. Die (Vollblutprobe/oberflächenaktives Mittel) Mischung, die die lysierten weißen Blutkörperchen enthält, kann vorher in einem geeigneten Ausmaß verdünnt werden. Während der Bewegung/Entwicklung der aufgetropften Mischung wird ein Immunkomplex aus dem markierten Antikörper und MPO (und CRP) durch den immobilisierten Antikörper erfasst und zeigt eine Färbung. Die Konzentration von MPO (und CRP) kann durch Auswertung des Grads der Färbung gemessen werden oder durch Verwendung einer optischen Messvorrichtung.
  • Als nächstes wird unten eine Erklärung in Bezug auf das Verfahren zur Messung der Konzentration von MPO und der Konzentration von CRP durch einen Enzym-Immunoassay unter Verwendung einer 96-Lochplatte gegeben. Zuerst werden ein gegen humanesMPO gerichteter Antikörper und ein gegen humanesCRP gerichteter Antikörper als primäre Antikörper an einer kommerziell erhältlichen 96-Lochplatte als ein Substrat immobilisiert. Auf der anderen Seite wird die (Vollblutprobe/oberflächenaktives Mittel) Mischung, die die lysierten weißen Blutkörperchen enthält, 2000-fach bis 4000-fach verdünnt, und die resultierende verdünnte Mischung wird zu der vorstehend erwähnten 96-Lochplatte zugegeben, um dadurch eine Antigen-Antikörper Reaktion zwischen den an der Platte immobilisierten Antikörpern und MPO und CRP in der verdünnten Mischung hervorzurufen. Anschließend werden eine Lösung von einem gegen humanesMPO gerichteten Antikörper und eine Lösung von einem gegen humanesCRP gerichteten Antikörper (als sekundäre Antikörper) zu der Platte zugegeben, wobei die Antikörper mit einem Enzym, wie z. B. Meerrettich-Peroxidase (HRP) oder alkalischer Phosphortase, markiert worden sind, um dadurch eine Antigen-Antikörper Reaktion unter Verwendung der sekundären Antikörper zu bewirken. Dann wird dazu entweder eine Lösung, enthaltend Tetramethylbenzidin (TMB) und H2O2, die Substrate für HRP sind, oder eine Lösung, enthaltend p-Nitrophenylphosphat, das ein Substrat für alkalische Phosphatase ist, zugegeben, um eine Färbung herbeizuführen. Nach einer vorbestimmten Zeitspanne wird 1 N Schwefelsäure oder eine Natriumhydroxidlösung dazu zugegeben, um die Reaktion zu beenden. Durch Messung der Absorption der gefärbten Reaktionsmischung kann die Konzentration von MPO und die Konzentration von CRP gemessen werden.
  • Das Verfahren zur Messung der Konzentration von MPO und der Konzentration von CRP durch einen optischen Immunoassay kann gemäß der Beschreibung von Covalciuc KA, Webb KH und Carlson CA: Journal of Clinical Microbiology 12:3971–3974 (1999) durchgeführt werden. Insbesondere wird dieses Verfahren wie folgt ausgeführt. Ein Siliciumwafer wird bereitgestellt. Ein dünner Film einer Substanz mit einem Refraktionsindex, der sich von dem Refraktionsindex des Siliciumwafers unterscheidet (z. B. ein dünner Film eines Polymers, wie z. B. Polysiloxan, oder eines Diamant artigen Kohlenstoffs) wird auf der Oberfläche des Wafers gebildet. Dann werden ein gegen humanesMPO gerichteter Antikörper und ein gegen humanesCRP gerichteter Antikörper als primäre Antikörper immobilisiert auf der Oberfläche des vorstehenden Siliciumwafers mit dem dünnen Film darauf. Die (Vollblutprobe/oberflächenaktives Mittel) Mischung, die die lysierten weißen Blutkörperchen enthält, wird 100-fach bis 200-fach verdünnt und die resultierende verdünnte Mischung wird mit einer Lösung eines mit HRP-markierten gegen humanesMPO gerichteten Antikörpers und einer Lösung eines mit HRP-markierten gegen humanesCRP gerichteten Antikörpers gemischt, und die resultierende Mischung wird auf die Oberfläche des Siliciumwafers gegeben, um dadurch eine Antigen-Antikörper Reaktion zwischen den auf dem Siliciumwafer immobilisierten Antikörpern und MPO und CRP in der verdünnten Mischung herbeizuführen. Anschließend wird "TMB fast" (hergestellt und vertrieben von Kirkegaad & Perry Laboratories Inc., USA) (das ein Substrat zur Präzipitation von TMB ist) dazu zugegeben, und das Resultierende wird für eine vorbestimmte Zeitspanne stehen gelassen, wodurch eine Präzipitationsschicht auf der Oberfläche des Siliciumwafers gebildet wird. Aus der Abweichung der Interferenzfarben, die sich aufgrund der Dicke der auf der Oberfläche des Siliciumwafers geformten Präzipitationsschicht ergeben, kann die Konzentration von MPO und die Konzentration von CRP bestimmt werden. Alternativ kann die Konzentration von MPO und die Konzentration von CRP auch durch das Messen der Dicke der auf der Oberfläche des Siliciumwafers geformten Präzipitationsschicht mittels eines Ellipsometers gemessen werden.
  • Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird die Anzahl weißer Blutkörperchen in der Vollblutprobe bestimmt, basierend auf der so gemessenen Konzentration von MPO. In Bezug auf das Verfahren zur Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen, basierend auf der Konzentration von MPO, gibt es keine bestimmte Einschränkung. Die Verfahren, die im Allgemeinen im Fachgebiet verwendet werden, können eingesetzt werden. Insbesondere, wie in Beispiel 10 der vorliegenden Beschreibung ausgeführt, kann die Anzahl weißer Blutkörperchen aus einer Regressionslinie bestimmt werden, die die Korrelation zwischen der Konzentration von MPO und der Anzahl weißer Blutkörperchen zeigt.
  • Ferner ist es bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung bevorzugt, dass die Anzahl weißer Blutkörperchen, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung bestimmt wird, die Anzahl Neutrophiler ist. Neutrophile sind die Zellen, die unter allen Arten von weißen Blutkörperchen mit dem größten Anteil vorhanden sind. Es ist bekannt, dass die Zahl von Neutrophilen im Blut erhöht ist, wenn eine bakterielle Infektion oder eine Entzündung auftritt. Deshalb ist es bevorzugt, die Anzahl Neutrophiler zu bestimmen, wenn es beabsichtigt ist, das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer infektiösen bakteriellen Krankheit zu beurteilen oder die Schwere einer Entzündung zu beurteilen. Wie in den Beispielen 7, 9 und 10 der vorliegenden Beschreibung beschrieben, zeigt die Konzentration des freigesetzten MPO nicht nur eine hohe Korrelation mit der Anzahl weißer Blutkörperchen, sondern auch mit der Anzahl Neutrophiler, wenn eine Vollblutprobe mit einem oberflächenaktiven Mittel gemischt wird, um dadurch die weißen Blutkörperchen zu lysieren und intrinsisches MPO aus den weißen Blutkörperchen freizusetzen. Deshalb kann durch das Verfahren der vorliegen den Erfindung die Anzahl Neutrophiler sowie die Anzahl weißer Blutkörperchen bestimmt werden.
  • BESTE ART ZUR AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG
  • Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung mit Bezug auf die folgenden Beispiele und Vergleichsbeispiele detaillierter beschrieben, aber dies sollte nicht als den Umfang der vorliegenden Erfindung limitierend aufgefasst werden.
  • Beispiel 1
  • Experimente zur Bestimmung der Zeit, die zur Lyse weißer Blutkörperchen benötigt wird
  • 10 ml Vollblut eines gesunden Menschen wurden in einem Reagenzglas gesammelt, das 10 mg EDTA-2K (hergestellt und vertrieben von Dojin Laboratories, Japan) enthält, und die resultierende EDTA-enthaltende Vollblutprobe wurde gut gerührt, und dann wurde ein 1 ml der Vollblutprobe aus dem Reagenzglas entnommen. Zu der aus dem Reagenzglas entnommenen 1 ml Vollblutprobe wurden 100 μl einer wässrigen 11 % Lösung von TritonTM X-100 (hergestellt und vertrieben unter der Marke SIGMATM, USA) zugegeben, und die resultierende Mischung wurde gut gerührt und dann bei Raumtemperatur für 1 Minute stehen gelassen, um eine (Vollblutprobe/oberflächenaktives Mittel) Mischung zu erhalten, die die lysierten weißen Blutkörperchen enthält. Im Wesentlichen die gleiche vorstehend erwähnte Operation wurde wiederholt, außer, dass die Standzeit bei Raumtemperatur auf 5 Minuten, 30 Minuten und 60 Minuten geändert wurde, um dadurch die weißen Blutkörperchen zu lysieren, die in dem Vollblut enthalten sind.
  • Nach der oben erwähnten Zeitspanne wurde jede der erhaltenen (Vollblutprobe/oberflächenaktives Mittel) Mischungen, enthaltend die lysierten weißen Blutkörperchen, individuell mit einem Puffer zur Verdünnung von Proben (20 mM Phosphatpuffer (pH 7,4), enthaltend 0,1 % Rinderserumalbumin und 0,2 %Natriumazid), 2000-fach verdünnt, wobei der Puffer dem BIOXYTECTM MPO-Enzym Immunoassay Kit (hergestellt und vertrieben von OXIS International, Inc., USA) beigefügt ist, und die resultierende verdünnte Mischung wurde als eine Probe für die Messung von Myeloperoxidase (MPO) genommen.
  • In Bezug auf die oben erwähnte Probe für die Messung von MPO und eine Standardlösung von MPO (die durch Lösung von kommerziell erhältlichem MPO in dem vorstehend erwähnten Puffer erhalten wird) wurde die Messung der Konzentration von MPO unter Verwendung von BIOXYTECTM MPO Enzym Immunoassay Kit (hergestellt und vertrieben von OXIS International, Inc., USA) gemäß der diesem Kit beigefügten Bedingungsanleitung durchgeführt.
  • Bezüglich der Messung der Konzentration von MPO der vorstehend erwähnten Probe, wurde insbesondere MPO (hergestellt und vertrieben von Elastin Products Co., INC., USA) zu der Probe zugegeben, so dass die Endkonzentration des zugegebenen MPO 5 ng/ml oder 10 ng/ml betrug, und die resultierende Mischung wurde gemessen in Bezug auf die Konzentration von MPO. Aus dem erhaltenen Wert der Konzentration von MPO wurde eine Eichkurve für jede Probe erhalten. Die erhaltene Eichkurve wurde korrigiert, basierend auf ihrer Beziehung mit einer Eichkurve, die in Bezug auf die Standardlösung von MPO erhalten wurde, und die korrigierte Eichkurve von jeder Probe wurde verwendet, um die Konzentration von MPO in dem Vollblut zu bestimmen. Die Messung wurde 3-fach ausgeführt und ein Mittelwert ± Standardabweichung wurde erhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
    Behandlungszeit mit TritonTM X-100 Konzentration von MPO in Vollblut (μg/ml)
    1 Minute 9,88 ± 0,50
    5 Minuten 10,17 ± 0,63
    30 Minuten 9,94 ± 0,72
    60 Minuten 10,01 ± 0,22
  • Somit wurde bestätigt, dass, im Falle der Behandlung mit TritonTM X-100, MPO innerhalb von 60 Minuten nach dem Beginn der Behandlung in einem befriedigenden Ausmaß aus den weißen Blutkörperchen freigesetzt werden kann.
  • Beispiel 2
  • Die Konzentration von einem oberflächenaktiven Mittel und die Freisetzungsmenge von MPO
  • 10 ml von Vollblut eines gesunden Menschen wurden gesammelt und sofort mit 10 mg EDTA-2K (hergestellt und vertrieben von Dojin Laboratories, Japan) gemischt, und die resultierende EDTA-enthaltende Vollblutprobe wurde innerhalb 1 Stunde nach der Sammlung des Bluts verschiedenen unten beschriebenen Messungen unterworfen.
  • Die Myeloperoxidasekonzentration wurde durch das folgende Verfahren gemessen.
  • 500 μl des Bluts wurden in ein 2 ml Eppendorf Gefäß gegeben und 500 μl einer wässrigen Lösung eines oberflächenaktiven Mittels mit einer Konzentration von oberflächenaktiven Mittel von 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 1, 2, 4, 10 oder 20 % (w/v) wurde zu dem Gefäß zugegeben, und die resultierende Mischung wurde für 2 Sekunden mit einem Vortex Mischer gerührt. Anschließend ließ man die Mischung für 60 Minuten auf Eis stehen, um dadurch die weißen Blutkörperchen zu lysieren. Als oberflächenaktives Mittel, welches vorstehend erwähnt wurde, wurden die unten erwähnten drei Typen von oberflächenaktiven Mitteln individuell verwendet: TritonTM X-114 (hergestellt und vertrieben von Nacalai Tesque, Inc., Japan), TritonTM X-100 (hergestellt und vertrieben unter dem Handelsnamen von SIGMATM, USA), und IgepalTM CA630 (hergestellt und vertrieben unter dem Handelsnamen von SIGMATM USA). Nach der Lyse der weißen Blutkörperchen wurden 100 μl der Mischung herausgenommen und zugegeben zu 900 μl einer PBS-Lösung, die darin gelöst 1 % BSA (Handelsname: "Sigma Fraktion V", hergestellt und vertrieben unter der Marke von SIGMATM USA). Die resultierende Mischung wurde mit einem Vortex Mischer gerührt und dann wurden 10 μl der Mischung herausgenommen und mit einer 1 % BSA/PBS-Lösung 2000-fach verdünnt. Die resultierende verdünnte Mischung wurde einer Messung durch ELISA unterworfen.
  • Die Ausführung des ELISA ist wie folgt. Eine 5 μg/ml PBS-Lösung eines gegen humane Myeloperoxidase gerichteten Kaninchenantikörpers (rabbit anti-human myeloperoxidase antibody) (hergestellt und vertrieben von Calbiochem-Novabiochem Corporation, USA) (nachfolgend häufig als "Anti-MPO Antikörper" bezeichnet) wurde in die Vertiefungen einer Nunc Immunoplatte (hergestellt und vertrieben von Nalge Nunc International, Dänemark) in einer Menge von 100 μl pro Vertiefung gegeben. Die Lösung in jeder Vertiefung wurde abgedichtet und für 18 Stunden bei 4°C einer Reaktion unterworfen, wodurch der primäre Antikörper immobilisiert wurde. Die Vertiefungen wurden mit einer Waschlösung (0,05 % TweenTM 20/PBS) gewaschen und dann unter Verwendung von 200 μl einer Blockierungslösung (1 % BSA/PBS) einer Blockierung für 1 Stunde bei Raumtemperatur unterworfen, und dann zweimal mit der Waschlösung gewaschen. Dann wurde die vorstehend erhaltene verdünnte Mischung (Blutprobe, die mit einem oberflächenaktiven Mittel behandelt worden ist und dann verdünnt wurde) in einer Menge von 100 μl pro Vertiefung in die Vertiefungen gegeben und für 2 Stunden bei Raumtemperatur einer Reaktion unterworfen. Dann wurden die Vertiefungen 3 mal mit der Waschlösung gewaschen, und eine 5 μg/ml Lösung eines mit Meerrettich-Peroxidase (hierin nachfolgend als "HRP" bezeichnet) markierten Anti-MPO Antikörpers wurde in einer Menge von 100 μl pro Vertiefung in die Vertiefungen gegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur einer Reaktion unterworfen. Als der vorstehend erwähnte HRP-markierte Anti-MPO Antikörper wurde ein gegen humanes MPO gerichteter Antikörper (anti-human MPO antibody) (hergestellt und vertrieben von Calbiochem-Novabiochem Corporation, USA), der mit HRP Grade IV (hergestellt und vertrieben und der Marke von SIGMATM, USA) markiert worden war, eingesetzt. Die Markierung wurde mit dem in Analytical Biochemistry, 132, 68–73 (1983) beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Vertiefungen wurden 5 mal mit der Waschlösung gewaschen, und 100 μl einer frisch hergestellten TMB-Lösung (hergestellt und vertrieben von Kirkegaad & Perry Laboratories, USA) wurde dazu zugegeben, um eine Farbreaktion herbeizuführen. 2 Minuten nach dem Beginn der Farbreaktion wurden 100 μl einer 1 N Schwefelsäurelösung (hergestellt und vertrieben von Nacalai Tesque, Inc., Japan) zu den Vertiefungen zugegeben, um dadurch die Reaktion zu beenden. Dann wurde die optische Dichte bei 450 nm mittels eines Lesegerätes für Platten (hergestellt und vertrieben von Bio-Rad Laboratories, USA) gemessen. Die Messung wurde 3 mal aus geführt und ein Mittelwert ± Standardabweichung wurde erhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
    Konzentration von oberflächenaktivem Mittel (% (w/v)) Freisetzungsmenge von MPO in Vollblut (Abs. 450 nm)
    TritonTM X-100 TritonTM X-114 IgepalTM CA630
    0,00 0,082 ± 0,002 0,101 ± 0,014 0,082 ± 0,006
    0,05 0,104 ± 0,005 0,120 ± 0,026 0,103 ± 0,005
    0,10 0,161 ± 0,009 0,131 ± 0,016 0,156 ± 0,009
    0,20 0,202 ± 0,006 0,207 ± 0,004 0,205 ± 0,007
    0,30 0,228 ± 0,009 0,198 ± 0,003 0,211 ± 0,008
    0,50 0,262 ± 0,005 0,259 ± 0,007 0,249 ± 0,002
    1,00 0,245 ± 0,011 0,240 ± 0,006 0,220 ± 0,008
    2,00 0,216 ± 0,004 0,245 ± 0,015 0,208 ± 0,003
    5,00 0,228 ± 0,007 0,239 ± 0,002 0,199 ± 0,018
    10,00 0,227 ± 0,007 0,243 ± 0,005 0,227 ± 0,006
  • Somit wurde gefunden, dass, in Bezug auf die Verwendung von irgendeinem von TritonTM X-100, TritonTM X-114 und IgepalTM CA630, intrinsisches MPO aus den weißen Blutkörperchen in einem befriedigenden Ausmaß freigesetzt werden kann, wenn die Konzentration des oberflächenaktiven Mittels in dem Bereich von 0,2 bis 10,0 % (w/v) ist.
  • Beispiel 3
  • MPO-freisetzende Wirkungen von verschiedenen oberflächenaktiven Mitteln
  • 10 ml von Vollblut eines gesunden Menschen wurden gesammelt unter Verwendung einer Nadel für die intravenöse Injektion vom 28 G-Typ (28 G winged) (hergestellt und vertrieben von Terumo Corporation, Japan) und sofort mit 10 mg EDTA-2K (hergestellt und vertrieben von Dojin Laboratories, Japan) gemischt, und die resultierende EDTA-enthaltende Vollblutprobe wurde innerhalb 1 Stunde nach der Blutabnahme den verschiedenen unten beschriebenen Messungen unterworfen.
  • Die Myeloperoxidasekonzentration wurde durch das folgende Verfahren gemessen.
  • 500 μl des Blutes wurden in ein 2 ml Eppendorf-Gefäß gegeben und 500 μl einer 1 % (w/v) wässrigen Lösung eines oberflächenaktiven Mittels wurde zu dem Gefäß zugegeben, und die resultierende Mischung wurde für 2 Sekunden mit einem Vortex Mischer gerührt. Anschließend wurde die Mischung für 60 Minuten auf Eis stehen gelassen, um dadurch die weißen Blutkörperchen zu lysieren. Nach der Lyse der weißen Blutkörperchen wurden 100 μl der Mischung entnommen und zu 900 μl einer PBS Lösung, die darin gelöst 1 % BSA (Handelsname: "Sigma Fraktion V", hergestellt und vertrieben unter der Marke von SIGMATM, USA) enthält, zugegeben. Die resultierende Mischung wurde mit einem Vortex Mischer gerührt, und dann wurden 10 μl der Mischung entnommen und 2000-fach mit 1 % BSA/PBS-Lösung verdünnt. Die resultierende verdünnte Mischung wurde einer Messung durch ELISA unterworfen.
  • Der Ausführung des ELISA ist wie folgt. Eine 5 μg/ml PBS-Lösung eines Anti-MPO Antikörpers wurde in einer Menge von 100 μl pro Vertiefung in die Vertiefungen einer Nunc Immunoplatte (hergestellt und vertrieben von Nalge Nunc International, Dänemark) gegeben. Die Lösung in jeder Vertiefung wurde abgedichtet und für 18 Stunden bei 4°C einer Reaktion unter worfen, um dadurch den primären Antikörper zu immobilisieren. Die Vertiefungen wurden mit einer Waschlösung (0,05 % TweenTM 20/PBS) gewaschen und dann für 1 Stunde bei Raumtemperatur einer Blockierung unterworfen, indem 200 μl einer Blockierungslösung (1 % BSA/PBS) verwendet wurden, und dann zweimal mit der Waschlösung gewaschen. Dann wurde die oben erhaltene verdünnte Mischung (Blutprobe, die mit einem oberflächenaktiven Mittel behandelt worden war und dann verdünnt wurde) in einer Menge von 100 μl pro Vertiefung in die Vertiefungen gegeben und für 2 Stunden bei Raumtemperatur einer Reaktion unterworfen. Dann wurden die Vertiefungen 3 mal mit der Waschlösung gewaschen, und eine 5 μg/ml Lösung eines mit HRP-markierten Anti-MPO Antikörpers (ein HRP-markierter Anti-MPO Antikörper, der auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 hergestellt wurde) wurde in einer Menge von 100 μl pro Vertiefung in die Vertiefungen gegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur einer Reaktion unterworfen. Die Vertiefungen wurden 5 mal mit einer Waschlösung gewaschen, und 100 μl einer frisch hergestellten TMB-Lösung (hergestellt und vertrieben von Kirkegaad & Perry Laboratories, USA) wurde dazu zugegeben, um eine Farbreaktion herbeizuführen. 2 Minuten nach dem Beginn der Farbreaktion wurden 100 μl einer 1 N Schwefelsäurelösung (hergestellt und vertrieben von Nacalai Tesque, Inc., Japan) zu den Vertiefungen zugegeben, um dadurch die Reaktion zu beenden. Dann wurde die optische Dichte bei 450 nm mittels eines Lesegerätes für Plattenhergestellt und vertrieben von Bio-Rad Laboratories, USA) gemessen.
  • In Bezug auf die Messung der Konzentration von MPO der Probe wurde MPO (hergestellt und vertrieben von Elastin Products Co., INC. USA) zu der Probe zugegeben, so dass die Endkonzentration des zugegebenen MPO 5 ng/ml oder 10 ng/ml betrug, und die resultierende Mischung wurde in Bezug auf die Konzentration von MPO gemessen. Aus dem erhaltenen Wert der Konzentration von MPO wurde eine Eichkurve für jede Probe erhalten. Die erhaltene Eichkurve wurde korrigiert, basierend auf ihrer Beziehung mit einer Eichkurve, die in Bezug auf eine Standardlösung von MPO erhalten wurde, und die korrigierte Eichkurve jeder Probe wurde verwendet, um die Konzentration von MPO in dem Vollblut zu bestimmen. Die Messung wurde 3 mal durchgeführt und ein Mittelwert ± Standardabweichung wurde erhalten.
  • Die getesteten oberflächenaktiven Mittel waren wie folgt:
    Hexadecyltrimethylammoniumbromid (HTAB) (hergestellt und vertrieben von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan),
    TritonTM X-114 (hergestellt und vertrieben von Nacalai Tesque, Inc., Japan),
    TritonTM X-100 (hergestellt und vertrieben unter der Marke von SIGMATM, USA.),
    TritonTM DF-12 (hergestellt und vertrieben unter der Marke von SIGMATM, USA),
    BrijTM 56 (hergestellt und vertrieben unter der Marke von SIGMATM, USA),
    BrijTM 97 (hergestellt und vertrieben unter der Marke von SIGMATM, USA),
    IgepalTM CA630 (hergestellt und vertrieben unter der Marke von SIGMATM, USA),
    Nissan Nonion NS-208.5 (hergestellt und vertrieben von Nippon Oil and Fats Co., Ltd., Japan), und
    Nissan Dispanol TOC (hergestellt und vertrieben von Nippon Oil and Fats Co., Ltd., Japan).
  • Diese oberflächenaktiven Mittel wurden individuell in gereinigtem Wasser (hergestellt und vertrieben von Kyoei Seiyaku Co., Japan) gelöst, um 10 % oder 2 % (w/v) wässrige Lösungen zu erhalten. Vor der Verwendung bei den Tests wurde jede der wässrigen Lösungen weiter verdünnt, um eine 1 % (w/v) wässrige Lösung zu erhalten, und die 1 % (w/v) wässrige Lösung wurde bei den Tests innerhalb von 15 Stunden nach ihrer Herstellung verwendet. Als eine Kontrolle wurde gereinigtes Wasser (hergestellt und vertrieben von Kyoei Seiyaku Co., Japan) verwendet.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3
    Oberflächenaktives Mittel Konzentration von MPO in Vollblut (μg/ml)
    TritonTM x-114 7,44 ± 1,81
    Nissan Dispanol TOC 7,00 ± 1,64
    TritonTM X-100 6,43 ± 1,25
    IgepalTM CA630 6,23 ± 1,42
    Nissan Nonion NS-208.5 6,20 ± 1,51
    BrijTM 97 6,08 ± 1,44
    BrijTM 56 6,02 ± 1,38
    HTAB 5,80 ± 1,41
    Gereinigtes Wasser 2,02 ± 0,87
  • Somit wurde gezeigt, dass jedes der getesteten oberflächenaktiven Mittel fähig war, intrinsisches MPO aus den weißen Blutkörperchen, die in einer Vollblutprobe enthalten sind, wirksam freizusetzen.
  • Beispiel 4
  • MPO-freisetzende Wirkungen von verschiedenen oberflächenaktiven Mitteln
  • Mit dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 3 wurden die unten erwähnten verschiedenen oberflächenaktiven Mittel in Bezug auf ihre Wirkungen zur Freisetzung von MPO aus den weißen Blutkörperchen, die in einer Vollblutprobe enthalten sind, gemessen. Die getesteten oberflächenaktiven Mittel waren wie folgt:
    Hexadecylpyridiniumchloridmonohydrat (HPC),
    Hexadecylpyridiniumbromidmonohydrat (HPB),
    Hexadecyltrimethylammoniumchlorid (HTAC),
    n-Dodecyltrimethylammoniumbromid (DTAB),
    Hexadecyltrimethylammoniumbromid (HTAB),
    1--Laurylpyridiniumchlorid (LPC), und
    Tetradecyltrimethylammoniumbromid (TTAB) (alle diese oberflächenaktiven Mittel werden von Wako Pure Chemical industries, Ltd., Japan hergestellt und vertrieben).
  • Diese oberflächenaktiven Mittel wurden individuell in gereinigtem Wasser (hergestellt und vertrieben von Kyoei Seiyaku Co., Japan) gelöst, um 10 % oder 2 % (w/v) wässrige Lösungen zu erhalten. Vor der Verwendung in den Tests wurde jede der wässrigen Lösungen weiter verdünnt, um eine 1 % (w/v) wässrige Lösung zu erhalten, und die 1 % (w/v) wässrige Lösung wurde innerhalb von 15 Stunden nach der Herstellung derselben in den Tests verwendet. Als eine Kontrolle wurde gereinigtes Wasser (hergestellt und vertrieben von Kyoei Seiyaku Co., Japan) verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4
    Oberflächenaktives Mittel Konzentration von MPO in Vollblut (μg/ml)
    HPC 12,05 ± 1,18
    HPB 10,96 ± 0,46
    HTAC 10,93 ± 0,82
    DTAC 9,95 ± 0,71
    HTAB 9,58 ± 0,53
    LPC 9,58 ± 1,39
    TTAB 9,33 ± 1,30
    Gereinigtes Wasser 1,65 ± 0,81
  • Somit wurde gezeigt, dass jedes der getesteten kationischen oberflächenaktiven Mittel fähig war, intrinsisches MPO aus den weißen Blutkörperchen, die in einer Vollblutprobe enthalten sind, befriedigend freizusetzen.
  • Beispiel 5
  • MPO-freisetzende Wirkungen von unterschiedlichen oberflächenaktiven Mitteln
  • Mit dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 3 wurden die unten erwähnten verschiedenen oberflächenaktiven Mittel in Bezug auf ihre Wirkungen zum Freisetzen von MPO aus den weißen Blutkörperchen, die in einer Vollblutprobe enthalten sind, gemessen. Die getesteten oberflächenaktiven Mittel waren wie folgt:
    Hexadecylpyridiniumchloridmonohydrat (HPC),
    Hexadecylpyridiniumbromidmonohydrat (HPB),
    Hexadecyltrimethylammoniumchlorid (HTAC),
    n-Dodecyltrimethylammoniumbromid (DTAB),
    Hexadecyltrimethylammoniumbromid (HTAB),
    1-Laurylpyridiniumchlorid (LPC),
    Tetradecyltrimethylammoniumbromid (TTAB)
    (wobei alle vorstehend erwähnten oberflächenaktiven Mittel von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan hergestellt und vertrieben werden),
    Didecyldimethylammoniumchlorid (DDAC), und
    Octadecyltrimethylammoniumchlorid (OTAC)
    (wobei die letzten beiden oberflächenaktiven Mittel von Nippon Oil and Fats, Co., Ltd., Japan hergestellt und vertrieben werden).
  • Diese oberflächenaktiven Mittel wurden individuell in gereinigtem Wasser (hergestellt und vertrieben von Kyoei Seiykau Co., Japan) gelöst, um 10 % oder 2 % (w/v) wässrige Lösungen zu erhalten. Vor der Verwendung in den Tests wurde jede der wässrigen Lösungen weiter verdünnt, um eine 1 % (w/v) wässrige Lösung zu erhalten, und die 1 % (w/v) wässrige Lösung wurde innerhalb von 15 Stunden nach der Herstellung derselben in den Tests verwendet. Als eine Kontrolle wurde gereinigtes Wasser (hergestellt und vertrieben von Kyoei Seiykau Co., Japan) verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5
    Oberflächenaktives Mittel Konzentration von MPO in Vollblut (μg/ml)
    HPC 10,60 ± 1,44
    DTAC 9,28 ± 0,60
    HPB 9,07 ± 1,14
    TTAB 8,08 ± 0,11
    DTAB 8,05 ± 0,64
    DTAC 7,88 ± 0,46
    LPC 7,57 ± 0,60
    OTAC 7,47 ± 0,38
    HTAC 7,35 ± 0,28
    HTAB 7,15 ± 2,69
    Gereinigtes Wasser 1,58 ± 0,97
  • Somit wurde gezeigt, dass jedes der getesteten kationischen oberflächenaktiven Mittel fähig war, intrinsisches MPO aus den weißen Blutkörperchen, die in einer Vollblutprobe enthalten sind, befriedigend freizusetzen.
  • Beispiel 6
  • Beziehung zwischen der freigesetzten Menge von MPO und dem HLB-Wert des oberflächenaktiven Mittels
  • Die Blutentnahme, die Behandlung mit einem oberflächenaktiven Mittel und der ELISA wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3 durchgeführt, um die MPO-freisetzenden Wirkungen der unten erwähnten unterschiedlichen oberflächenaktiven Mittel zu messen.
  • Die getesteten oberflächenaktiven Mittel waren die folgenden nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel:
    NonidetTM-P40 (hergestellt und vertrieben von Nacalai Tesque, Inc., Japan),
    TritonTM X-114 (hergestellt und vertrieben von Nacalai Tesque, Inc., Japan),
    TritonTM X-100 (hergestellt und vertrieben unter der Marke von SIGMATM, USA),
    TritonTM X-207 (hergestellt und vertrieben unter der Marke von SIGMATM, USA),
    TritonTM X-305 (hergestellt und vertrieben unter der Marke von SIGMATM, USA),
    BrijTM 35 (hergestellt und vertrieben unter der Marke von SIGMATM, USA),
    BrijTM 56 (hergestellt und vertrieben unter der Marke von SIGMATM, USA),
    BrijTM 58 (hergestellt und vertrieben unter der Marke von f SIGMATM, USA),
    BrijTM 97 (hergestellt und vertrieben unter der Marke von SIGMATM, USA),
    BrijTM 98 (hergestellt und vertrieben unter der Marke von SIGMATM, USA)
    IgepalTM CA630 (hergestellt und vertrieben unter der Marke von SIGMATM, USA)
    TweenTM 65 (hergestellt und vertrieben unter der Marke von SIGMATM, USA),
    TweenTM 85 (hergestellt und vertrieben unter der Marke von SIGMATM, USA),
    TweenTM 20 (hergestellt und vertrieben von Bio-Rad Laboratories, USA), und
    TritonTM X-45 (hergestellt und vertrieben von Fluka, Schweiz)
  • Diese oberflächenaktiven Mittel wurden einzeln in gereinigtem Wasser (hergestellt und vertrieben von Kyoei Seiyaku Co., Japan) gelöst, um 10 % oder 2 % (w/v) wässrige Lösungen zu erhalten. Vor der Verwendung in den Tests wurde jede der wässrigen Lösungen weiter verdünnt, um eine 1 % (w/v) wässrige Lösung zu erhalten, und die 1 % (w/v) wässrige Lösung wurde in nerhalb von 15 Stunden nach der Herstellung derselben in den Tests verwendet. Als eine Kontrolle wurde gereinigtes Wasser (hergestellt und vertrieben von Kyoei Seiykau Co., Japan) verwendet.
  • Wie in 1 gezeigt, wurde gefunden, dass die freigesetzte Menge von MPO aus den weißen Blutkörperchen in Vollblut, das mit einem oberflächenaktiven Mittel behandelt worden ist, variiert, in Abhängigkeit von dem HLB-Wert des oberflächenaktiven Mittels, und dass die Verwendung eines oberflächenaktiven Mittels mit einem HLB-Wert von 12 bis 14 zum Freisetzen von MPO aus den weißen Blutkörperchen geeignet ist.
  • Beispiel 7 und Vergleichsbeispiele 1 und 2
  • Jeweilige Beziehung zwischen Myeloperoxidase, Lactoferrin und Elastase und sowohl der Anzahl weißer Blutkörperchen als auch der Anzahl Neutrophiler
  • In Beispiel 7 und Vergleichsbeispielen 1 und 2 wurden Vollblutproben (Gruppe A) verwendet, die von 13 gesunden Menschen erhalten wurden, und Vollblutproben (Gruppe B), die von 14 nicht-gesunden Menschen, von denen bekannt war, dass sie spezifische Krankheiten haben, erhalten wurden. 10 ml jeder Vollblutprobe wurden in ein Reagenzglas gegeben, das 10 mg EDTA-2K (hergestellt und vertrieben von Dojin Laboratories, Japan) enthielt, und die resultierende EDTA-enthaltende Vollblutprobe wurde gut gerührt. Ein Teil der erhaltenen EDTA-enthaltenden Vollblutprobe wurde entnommen und die Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen und die Anzahl Neutrophiler wurde mittels eines CELL-DYNETM 3500 (hergestellt und vertrieben von DAINABOT, USA) durchgeführt. Ferner wurde 1 ml der EDTA-enthaltenden Vollblutprobe entnommen und 100 μl einer 11 % (w/v) wässrigen Lösung von TritonTM X-100 (hergestellt und vertrieben unter der Marke von SIGMATM, USA) wurde zu dem entnommenen 1 ml Vollblutprobe zugegeben, und die resultierende Mischung wurde gut gerührt und dann für 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen, um dadurch die weißen Blutkörperchen, die in der Vollblutprobe enthalten sind, zu lysieren und eine (Vollblutprobe/oberflächenaktives Mittel) Mischung, die die lysierten weißen Blutkörperchen enthält, zu erhalten.
  • (1) Messung von Myeloperoxidase (Beispiel 7)
  • Die Myeloperoxidase (MPO) Konzentration wurde wie folgt gemessen. Die oben erwähnte (Vollblutprobe/oberflächenaktives Mittel) Mischung, enthaltend die lysierten weißen Blutkörperchen, wurde mit einem Puffer zur Verdünnung von Proben (20 mM Phosphatpuffer (pH 7,4), enthaltend 0,1 % Rinderserumalbumin und 0,2 % Natriumazid) 2000-fach verdünnt, wobei der Puffer dem BIOXYTECTM MPO Enzym-Immunoassay-Kit (hergestellt und vertrieben von OXIS International, Inc., USA) beigefügt ist, und die resultierende verdünnte Mischung wurde als Probe für die Messung von Myeloperoxidase (MPO) genommen.
  • In Bezug auf die oben erwähnte Probe für die Messung von MPO und eine MPO-Standardlösung (die erhalten wird, indem kommerziell erhältliches MPO in dem oben erwähnten Puffer gelöst wird) wurde die Messung der Konzentration von MPO unter Verwendung von BIOXYTECTM MPO-Enzym-Immunoassay-Kit (hergestellt und vertrieben von OXIS International, Inc., USA) gemäß der dem Kit beigefügten Bedienungsanleitung durchgeführt. Insbesondere wurde mit Bezug auf die Messung der Konzentration von MPO der vorstehend erwähnten Probe MPO (hergestellt und vertrieben von Elastin Products Co., INC., USA) zu der Probe zugegeben, so dass die Endkonzentration des zugegebenen MPO 5 ng/ml oder 10 ng/ml betrug, und die resultierende Mischung wurde in Bezug auf die Konzentration von MPO gemessen. Aus dem erhaltenen Wert der Konzentration von MPO wurde eine Eichkurve für jede Probe erhalten. Die erhaltene Eichkurve wurde korrigiert, basierend auf ihrer Beziehung mit einer Eichkurve, die in Bezug auf eine MPO-Standardlösung erhalten wurde, und die korrigierte Eichkurve jeder Probe wurde verwendet, um die Konzentration von MPO in der Vollblutprobe zu bestimmen. Die Messung wurde 3 mal ausgeführt und ein Mittelwert wurde erhalten.
  • (2) Messung von Lactoferrin (Vergleichsbeispiel 1)
  • Die Konzentration von Lactoferrin (LTF) wurde wie folgt gemessen. Die vorstehend erwähnte (Vollblutprobe/oberflächenaktives Mittel) Mischung, enthaltend die lysierten weißen Blutkörperchen, wurde mit einem Puffer zur Verdünnung von Proben (20 mM Phosphatpuffer (pH 7,4), enthaltend 150 mM NaCl, 2 mg/ml Rinderserumalbumin, 0,1 % TweenTM 20 und 0,01 % Merthiolat), 2000-fach verdünnt, wobei der Puffer dem BIOXYTECTM Lactof Enzym Immunoassay Kit (hergestellt und vertrieben von OXIS International, Inc., USA) beigefügt ist, und die resultierende verdünnte Mischung wurde als eine Probe für die Messung von Lactoferrin (LTF) genommen.
  • In Bezug auf die vorstehend erwähnte Probe für die Messung von LTF und einer LTF-Standardlösung (die erhalten wird, indem kommerziell erhältliches LTF in dem vorstehend erwähnten Puffer gelöst wird) wurde die Messung der LTF-Konzentration unter Verwendung von BIOXYTECTM Lactof Enzym Immunoassay Kit (hergestellt und vertrieben von OXIS International, Inc., USA) gemäß der beigefügten Bedienungsanleitung durchgeführt. Insbesondere wurde in Bezug auf die Messung der LTF-Konzentration der vorstehend erwähnten Probe LTF (hergestellt und vertrieben von ICN Pharmaceuticals, Inc., USA) zu der Probe zugegeben, so dass die Endkonzentration des zugegebenen LTF 5 ng/ml oder 10 ng/ml betrug, und die resultierende Mischung wurde in Bezug auf die LTF-Konzentration gemessen. Aus dem erhaltenen Wert der LTF-Konzentration wurde eine Eichkurve für jede Probe erhalten. Die erhaltene Eichkurve wurde korrigiert, basierend auf ihrer Beziehung mit einer Eichkurve, die in Bezug auf die LTF-Standardlösung erhalten wurde, und die korrigierte Eichkurve jeder Probe wurde verwendet, um die LTF-Konzentration des Vollbluts zu bestimmen. Die Messung wurde 3 mal ausgeführt und ein Mittelwert wurde erhalten.
  • (3) Messung von Elastase (Vergleichsbeispiel 2)
  • Die Konzentration von Elastase (ELT) wurde wie folgt gemessen. Die vorstehend erwähnte (Vollblutprobe/Tensid) Mischung, enthaltend die lysierten weißen Blutkörperchen, wurde mit einem Puffer zur Verdünnung von Proben (20 mM Phosphatpuffer (pH 7,4), enthaltend 0,1 % Rinderserumalbumin und 0,2 % Natriumazid) 2000-fach verdünnt, wobei der Puffer einem PMN Elastase Kit (hergestellt und vertrieben von MERCK, USA) beigefügt ist, und die resultierende verdünnte Mischung wurde als eine Probe für die Messung von Elastase (ELT) genommen.
  • In Bezug auf die vorstehend erwähnte Probe für die Messung von ELT und einer ELT Standardlösung (die erhalten wird, indem kommerziell erhältliches ELT in dem vorstehend erwähnten Puffer gelöst wird) wurde die Messung der ELT-Konzentration unter Verwendung eines PMN Elastase Kits (hergestellt und vertrieben von MERCK, USA) gemäß der beigefügten Bedienungsanleitung durchgeführt. Insbesondere wurde in Bezug auf die Messung der ELT-Konzentration der vorstehend erwähnten Probe das dem Kit beigefügte ELT zu der Probe zugegeben, so dass die Endkonzentration des zugegebenen ELT 5 ng/ml oder 10 ng/ml betrug, und die resultierende Mischung wurde in Bezug auf die ELT-Konzentration gemessen. Aus dem erhaltenen Wert für die ELT-Konzentration wurde eine Eichkurve erhalten. Die erhaltene Eichkurve wurde korrigiert, basierend auf ihrer Beziehung mit einer Eichkurve, die in Bezug auf die ELT Standardlösung erhalten wurde, und die korrigierte Eichkurve von jeder Probe wurde verwendet, um die ELT-Konzentration des Vollbluts zu bestimmen. Die Messung wurde 3 mal ausgeführt und ein Mittelwert wurde erhalten.
  • Die Ergebnisse von Beispiel 7 und Vergleichsbeispielen 1 und 2 (Konzentrationen von MPO; LTF und ELT in gesundem menschlichem Vollblut und nicht-gesundem menschlichen Vollblut) sind in Tabelle 6 zusammen mit der Anzahl weißer Blutkörperchen und der Anzahl Neutrophiler in dem Blut gezeigt.
  • Figure 00610001
  • Basierend auf allen Ergebnissen der Messungen, betreffend sowohl die Vollblutproben von gesunden Menschen (Gruppe A) als auch die Vollblutproben von nicht-gesunden Menschen (Gruppe B), wurden ferner die Korrelationen zwischen der Anzahl weißer Blutkörperchen und den Konzentrationen von den intrinsischen Substanzen (MPO, LTF und ELT) untersucht und die Ergebnisse sind in 2(a) bis 2(c) gezeigt. Auch die Korrelationen zwischen der Anzahl Neutrophiler und den Konzentrationen von den intrinsischen Substanzen (MPO, LTF und ELT) wurden untersucht und die Ergebnisse sind in 3(a) bis 3(c) gezeigt.
  • Wie in 2(a) bis 2(c) und 3(a) bis 3(c) gezeigt, wurden die unten beschriebenen Korrelationen zwischen den Konzentrationen der intrinsischen Substanzen (MPO, LTF und ELT) und der Anzahl weißer Blutkörperchen sowie der Anzahl Neutrophiler gefunden.
  • Die Regressionsfunktion, die die Korrelation zwischen der Konzentration von MPO (y) und der Anzahl weißer Blutkörperchen (x) zeigt, ist wie folgt: y = 0,0019 x + 0,6981 (R = 0,9034).(Wie vorstehend erwähnt, stellt R den Korrelationskoeffizienten dar. Dies gilt für alle nachfolgend erwähnten R.)
  • Die Regressionsfunktion, die die Korrelation zwischen der Konzentration von MPO (y) und der Anzahl Neutrophiler (x) zeigt, ist wie folgt: y = 0,0018 x + 5,5395 (R = 0,9088).
  • Die Regressionsfunktion, die die Korrelation zwischen der LTF-Konzentration (y) und der Anzahl weißer Blutkörperchen (x) zeigt, ist wie folgt: y = 0,0014 x + 1,6278 (R = 0,8275).
  • Die Regressionsfunktion, die die Korrelation zwischen der LTF-Konzentration (y) und der Anzahl Neutrophiler (x) zeigt, ist wie folgt: y = 0,0013 x + 5,3757 (R = 0,8190).
  • Die Regressionsfunktion, die die Korrelation zwischen der ELT-Konzentration (y) und der Anzahl weißer Blutkörperchen (x) zeigt, ist wie folgt: y = 0,0032 x – 8,4464 (R = 0,8076).
  • Die Regressionsfunktion, die die Korrelation zwischen der ELT-Konzentration (y) und der Anzahl Neutrophiler (x) zeigt, ist wie folgt: y = 0,0032 x – 1,0451 (R = 0,8367).
  • Somit wurde gezeigt, dass sowohl die Anzahl weißer Blutkörperchen als auch die Anzahl Neutrophiler eine enge Korrelation mit der Konzentration von MPO zeigt.
  • Beispiel 8 und Vergleichsbeispiel 3 und 4
  • Analyse der Korrelation zwischen den jeweiligen Konzentrationen von MPO, LTF und ELT und der Anzahl weißer Blutkörperchen in Bezug auf die jeweilige Gruppe von Vollblutproben von ge sunden Menschen und die Gruppe von Vollblutproben von nicht-gesunden Menschen.
  • Die in Beispiel 7 und Vergleichsbeispielen 1 und 2 erhaltenen Datensätze wurden getrennt in einen Datensatz von Vollblutproben von gesunden Menschen (Gruppe A), die jeweils eine Anzahl weißer Blutkörperchen von weniger als 10000 Zellen/μl aufweisen, und einen Datensatz von Vollblutproben von nicht-gesunden Menschen (Gruppe B), die jeweils eine Anzahl weißer Blutkörperchen von 10000 Zellen/μl oder mehr aufweisen. Mit Bezug auf die jeweiligen Daten der Gruppe A und der Daten der Gruppe B wurde die Korrelation zwischen den jeweiligen Konzentrationen von MPO, LTF und ELT und der Anzahl weißer Blutkörperchen analysiert. Die Ergebnisse sind in 4(a) bis 4(c) und 5(a) bis 5(c) gezeigt.
  • Die Analyse der Daten der Gruppe A (Vollblutproben von gesunden Menschen) zeigt, dass mit Bezug auf die Gruppe A der Korrelationskoeffizient (R) der Beziehung zwischen der Konzentration von MPO und der Anzahl weißer Blutkörperchen extrem hoch war, genau genommen R = 0,9336 (y = 0,0021 x – 0,2414), sowohl im Vergleich zu dem Korrelationskoeffizienten (R) der Beziehung zwischen der LTF-Konzentration und der Anzahl weißer Blutkörperchen (R = 0,7929; y = 0,0016 x – 0,7488) als auch dem Korrelationskoeffizienten (R) der Beziehung zwischen der ELT-Konzentration und der Anzahl weißer Blutkörperchen (R = 0,8676; y = 0,0017 x – 1,33). Daher wurde gefunden, dass, im Fall der Vollblutproben von gesunden Menschen, eine äußerst genaue Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen durch das Messen der Konzentration von MPO erreicht werden kann.
  • Auch die Analyse der Daten der Gruppe B (Vollblutproben von nicht-gesunden Menschen) zeigt, dass mit Bezug auf die Grup pe B der Korrelationskoeffizient (R) der Beziehung zwischen der Konzentration von MPO und der Anzahl weißer Blutkörperchen hoch war, genau genommen R = 0,7318, sowohl im Vergleich zu dem Korrelationskoeffizienten (R) der Beziehung zwischen der LTF-Konzentration und der Anzahl weißer Blutkörperchen als auch dem Korrelationskoeffizienten (R) der Beziehung zwischen der ELT-Konzentration und der Anzahl weißer Blutkörperchen. In Bezug auf die Daten der Gruppe B wurde ferner die Aufmerksamkeit auf die Steigung der Regressionslinie, die die Korrelation zwischen den jeweiligen Konzentrationen von MPO, LTF und ELT und der Anzahl weißer Blutkörperchen zeigt, gerichtet. Die Steigungen der Regressionslinien von den Konzentrationen von MPO, LTF und ELT gegen die Anzahl weißer Blutkörperchen bei der Gruppe B wurden jeweils verglichen mit den Steigungen der Regressionslinien der Konzentrationen von MPO, LTF und ELT gegen die Anzahl weißer Blutkörperchen bei Gruppe A. Der Vergleich zeigte das Folgende. Die Steigung der Regressionslinie, die die Korrelation zwischen der Konzentration von MPO und der Anzahl weißer Blutkörperchen zeigt, betrug bei Gruppe B 0,0019 (y = 0,0019 x + 0,5678), was annähernd der Steigung (0,0021) der Regressionslinie entspricht, die die Korrelation zwischen der Konzentration von MPO und der Anzahl weißer Blutkörperchen bei Gruppe A zeigt. Im Gegensatz dazu betrug die Steigung der Regressionslinie, die die Korrelation zwischen der LTF-Konzentration und der Anzahl weißer Blutkörperchen zeigt, 0,0007 (y = 0,0007 x + 13,447) bei Gruppe B, gegenüber 0,0016, welches die Steigung der Regressionslinie ist, die die Korrelation zwischen der LTF-Konzentration und der Anzahl weißer Blutkörperchen bei Gruppe A zeigt, d.h., es wurde gezeigt, dass im Fall von LTF die Steigung der Regressionslinie, die in Bezug auf Gruppe B erhalten wurde, so gering wie etwa 1/2,3 der Steigung der Regressionslinie war, die in Bezug auf Gruppe A erhalten wurde. Ferner betrug die Steigung der Regressionslinie, die die Korrelation zwischen der ELT-Konzentration und der Anzahl weißer Blutkörperchen bei Gruppe B zeigt, 0,0031 (y = 00,31 x – 5,4788), im Gegensatz zu 0,0017, welches die Steigung der Regressionslinie ist, die die Korrelation zwischen der ELT-Konzentration und der Anzahl weißer Blutkörperchen bei Gruppe A zeigt, d.h., es wurde gezeigt, dass im Falle von ELT die Steigung der Regressionslinie, die in Bezug auf Gruppe B erhalten wurde, etwa 1,8 mal größer als die Steigung der Regressionslinie war, die in Bezug auf Gruppe A erhalten wurde. Darüber hinaus wurde auch gefunden, dass im Falle einer Vollblutprobe, die von einem Patienten erhalten wird, der unter obturierender Gelbsucht, akuter Pankreatitis und akuter Cholezystitis leidet, die ELT-Konzentration extrem höher als die Konzentrationen von MPO und LTF war, und die ELT-Konzentrationen eine große Abweichung von einer Regressionslinie zeigte, die die Korrelation zwischen der ELT-Konzentration und der Anzahl weißer Blutkörperchen in Vollblut zeigt.
  • Deshalb wurde gefunden, dass auch im Falle der Vollblutproben von nicht-gesunden Menschen eine äußerst genaue Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen durch Messen der Konzentration von MPO erhalten werden kann.
  • Beispiel 9
  • Korrelation zwischen der Konzentration von MPO und sowohl der Anzahl weißer Blutkörperchen als auch der Anzahl Neutrophiler in Vollblutproben von Menschen, einschließlich jener mit einer Anzahl weißer Blutkörperchen von 10000 Zellen/μl oder mehr
  • Die Tests wurden durchgeführt mit 46 Vollblutproben, die aus der Ambulanz erhalten wurden. Als oberflächenaktive Mittel zur Lyse der weißen Blutkörperchen wurden TritonTM X-100, Tri tonTM X-114 und IgepalTM CA630 einzeln verwendet. Eine Vollblutprobe wurde mit einem oberflächenaktiven Mittel auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 behandelt, und die Konzentration von MPO wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 gemessen. Die Anzahl weißer Blutkörperchen und die Anzahl Neutrophiler wurde mittels eines Coulter GEN·S System (hergestellt und vertrieben von COULTER ELECTRONICS, INC., USA) bestimmt und der Korrelationskoeffizient der Beziehung zwischen der Konzentration von MPO und sowohl der Anzahl weißer Blutkörperchen als auch der Anzahl Neutrophiler wurde erhalten. Die Messung wurde 3 mal ausgeführt und ein Mittelwert ± Standardabweichung wurde erhalten.
  • Die Ergebnisse betreffend die Anzahl weißer Blutkörperchen sind in 6 gezeigt. Im Falle der Verwendung von TritonTM X-114 betrug der Korrelationskoeffizient (R) der Beziehung zwischen der Konzentration von MPO und der Anzahl weißer Blutkörperchen R = 0,8430 (p < 0,0001) (y = 0,0022 x + 3,324). Im Falle der Verwendung von TritonTM X-100 betrug der Korrelationskoeffizient (R) der Beziehung zwischen der Konzentration von MPO und der Anzahl weißer Blutkörper R = 0,9066 (p < 0,0001) (y = 0,002 x + 2,1757). Im Falle der Verwendung von IgepalTM CA630 betrug der Korrelationskoeffizient (R) der Beziehung zwischen der Konzentration von MPO und der Anzahl weißer Blutkörperchen (R = 0,9061 (p < 0,0001) (y = 0,0019 x + 2,4259). Somit wurde eine sehr gute Korrelation zwischen der Konzentration von MPO und der Anzahl weißer Blutkörperchen gefunden. Deshalb wurde gefunden, dass im Fall der menschlichen Vollblutproben, einschließlich jener mit einer Anzahl weißer Blutkörperchen von 10000 Zellen/μl oder mehr, die Konzentration von MPO als ein genauer Index für die Anzahl weißer Blutkörperchen verwendet werden kann.
  • Die Korrelation zwischen der Konzentration von MPO und der Anzahl Neutrophiler ist in 7 gezeigt. Im Falle der Verwendung von TritonTM X-114 betrug der Korrelationskoeffizient (R) der Beziehung zwischen der Konzentration von MPO und der Anzahl Neutrophiler R = 0,8789 (p < 0,0001) (y = 0,0025 x + 7,4089). Im Falle der Verwendung von TritonTM X-100 betrug der Korrelationskoeffizient (R) der Beziehung zwischen der Konzentration von MPO und der Anzahl Neutrophiler R = 0,9364 (p < 0,0001) (y = 0,0023 x + 5,9748). Im Falle der Verwendung von IgepalTM CA630 betrug der Korrelationskoeffizient (R) der Beziehung zwischen der Konzentration von MPO und der Anzahl Neutrophiler R = 0,9405 (p < 0,0001) (y = 0,0022 x + 6,0951). Somit wurde eine sehr gute Korrelation zwischen der Konzentration von MPO und der Anzahl Neutrophiler gefunden, und es wurde bemerkt, dass, wenn diese Ergebnisse mit den Ergebnissen der Anzahl weißer Blutkörperchen verglichen werden, und wenn der Vergleich in Bezug auf das gleiche oberflächenaktive Mittel gemacht wird, die Korrelation zwischen der Konzentration von MPO und der Anzahl Neutrophiler höher war als die Korrelation zwischen der Konzentration von MPO und der Anzahl weißer Blutkörperchen. Deshalb, wie in 7 gezeigt, wurde gefunden, dass im Falle von menschlichen Vollblutproben, einschließlich jener mit einer Anzahl weißer Blutkörperchen von 10000 Zellen/μl oder mehr, die Konzentration von MPO als ein genauer Index für die Anzahl Neutrophiler verwendet werden kann.
  • Beispiel 10
  • Korrelation zwischen der Anzahl weißer Blutkörperchen/der Anzahl Neutrophiler, bestimmt basierend auf der Konzentration von MPO, und der Anzahl weißer Blutkörperchen/der Anzahl Neutrophiler, bestimmt mittels einer Vorrichtung zur Zählung von Blutzellen
  • Die Tests wurden mit 46 Vollblutproben durchgeführt, die aus der Ambulanz erhalten wurden, wobei die Proben dieselben wie in Beispiel 9 waren. Als oberflächenaktive Mittel zum Lysieren der weißen Blutkörperchen wurde TritonTM X-100 verwendet. Die Konzentration von MPO wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 gemessen. Die erhaltene Konzentration von MPO wurde in die in Beispiel 7 erhaltene Regressionsfunktion eingesetzt, wobei die Funktion die Korrelation zwischen der Konzentration von MPO und der Anzahl weißer Blutkörperchen zeigt, d.h. die Funktion: y = 0,0019 x + 0,6981 (siehe 2(a)), wodurch die Anzahl weißer Blutkörperchen erhalten wird. Auch wurde die Anzahl weißer Blutkörperchen mittels einer Vorrichtung zur Zählung von Blutzellen bestimmt, genau genommen mit einem Coulter GEN·S System (hergestellt und vertrieben von COULTER ELECTRONICS, INC., USA). Die Korrelation zwischen der Anzahl weißer Blutkörperchen, bestimmt basierend auf der Konzentration von MPO, und der Anzahl weißer Blutkörperchen, bestimmt mittels einer Vorrichtung zur Zählung der Blutzellen, ist in 8(a) gezeigt.
  • Wie aus 8(a) ersichtlich, wurde bestätigt, dass sogar im Fall von menschlichen Vollblutproben, einschließlich jener mit einer Anzahl weißer Blutkörperchen von 10000 Zellen/μl oder mehr, eine gute Korrelation (y = 1,0333 x + 777,69; R = 0,907) zwischen der Anzahl weißer Blutkörperchen, bestimmt durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung, und der Anzahl weißer Blutkörperchen, bestimmt mittels einer Vorrichtung zur Zählung von Blutzellen, besteht. Durch vorangehende Erstellung einer Regressionslinie, die die Korrelation zwischen der Konzentration von MPO und der Anzahl weißer Blutkörperchen in Vollblut zeigt, kann somit die Anzahl weißer Blutkörperchen einer Voll blutprobe einfach durch Messen der Konzentration von MPO der Vollblutprobe erhalten werden, wobei die erhaltene Anzahl weißer Blutkörperchen eine gute Korrelation mit der Anzahl weißer Blutkörperchen, bestimmt mittels einer Vorrichtung zur Zählung von Blutzellen, zeigt. Somit kann durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine genaue Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen in einer Vollblutprobe einfach durchgeführt werden, sogar im Falle von Vollblutproben, die eine Anzahl weißer Blutkörperchen von 10000 Zellen/μl oder mehr aufweisen.
  • Ferner wurde die oben erhaltene Konzentration von MPO auch in die Regressionsfunktion eingesetzt, die in Beispiel 7 erhalten wurde, wobei die Funktion die Korrelation zwischen der Konzentration von MPO und der Anzahl Neutrophiler zeigt, d.h., die Funktion: y = 0,0018 x + 5,5395 (siehe 3(a)), wodurch eine Anzahl Neutrophiler erhalten wird. Auch wurde die Anzahl Neutrophiler mittels einer Vorrichtung zur Zählung von Blutzellen bestimmt, d.h. Coulter GEN·S System (hergestellt und vertrieben von COULTER ELECTRONICS, INC., USA). Die Korrelation zwischen der Anzahl Neutrophiler, bestimmt basierend auf der Konzentration von MPO, und der Anzahl Neutrophiler, bestimmt mittels einer Vorrichtung zur Zählung von Blutzellen, ist in 8(b) gezeigt.
  • Wie aus 8(b) ersichtlich, wurde bestätigt, dass sogar im Falle menschlicher Vollblutproben, die eine Anzahl weißer Blutkörperchen von 10000 Zellen/μl oder mehr enthalten, eine gute Korrelation (y = 1,2542 x + 241,85; R = 0,936) zwischen der Anzahl Neutrophiler, bestimmt durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung, und der Anzahl Neutrophiler, bestimmt mittels einer Vorrichtung zur Zählung von Blutzellen, besteht. Durch die vorangehende Erstellung einer Regressionslinie, die die Korrelation zwischen der Konzentration von MPO und der Anzahl Neutrophiler in Vollblut zeigt, kann deshalb die Anzahl Neutrophiler einfach durch Messen der Konzentration von MPO der Vollblutprobe erhalten werden, wobei die erhaltene Anzahl Neutrophiler eine gute Korrelation mit der Anzahl Neutrophiler, bestimmt mittels einer Vorrichtung zur Zählung von Blutzellen, zeigt. Somit kann durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine genaue Bestimmung der Anzahl Neutrophiler einer Vollblutprobe einfach durchgeführt werden, sogar im Falle von Vollblutproben, die eine Anzahl weißer Blutkörperchen von 10000 Zellen/μl oder mehr enthalten.
  • Beispiel 11
  • Messung der Konzentrationen von MPO und CRP in einer Einzelprobe
  • Zu 10 ml Vollblut eines gesunden Menschen mit einer Anzahl weißer Blutkörperchen von 4800 Zellen/μl wurde 1 ml einer 11 % (w/v) wässrigen Lösung von TritonTM X-100 (hergestellt und vertrieben unter der Marke von SIGMATM, USA) zugegeben, und die resultierende Mischung wurde gut gerührt und dann bei Raumtemperatur für 60 Minuten stehen gelassen, um dadurch die weißen Blutkörperchen zu lysieren und eine (Vollblutprobe/oberflächenaktives Mittel) Mischung zu erhalten, die die lysierten weißen Blutkörperchen enthält. Die erhaltene Mischung wurde als "Probe A" bezeichnet. Ein Teil der Probe A wurde entnommen und MPO (hergestellt und vertriebe von Elastin Products Co., INC., USA) und CRP (hergestellt und vertrieben von Oriental Yeast Industries, Co., Ltd., Japan) wurden zu dem entnommenen Teil zugegeben, so dass die Endkonzentrationen an zugegebenem MPO und CRP 10 μg/ml bzw. 2 μg/ml betrugen, wodurch Probe B erhalten wird. Ein weiterer Teil der Probe A wurde entnommen und MPO und CRP wurden zu dem entnommenen Teil zugegeben, so dass die Endkonzentrationen an zugegebenem MPO und CRP 20 μg/ml bzw. 10 μg/ml betrugen, wodurch Probe C erhalten wird. Noch ein weiterer Teil der Probe A wurde entnommen und MPO und CRP wurden zu dem entnommenen Teil zugegeben, so dass die Endkonzentrationen an zugegebenem MPO und CRP 30 μg/ml bzw. 50 μg/ml betrugen, wodurch Probe D erhalten wird.
  • Es wurde ein Siliciumwafer bereitgestellt, dessen Oberfläche mit einem Polysiloxanpolymer (der Siliciumwafer wird von BioStar, USA hergestellt und vertrieben) beschichtet ist, wobei der Siliciumwafer in der internationalen Anmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 94/03774 beschrieben ist. Der Siliciumwafer wurde für 24 Stunden bei 4°C in eine 10 μg/ml Lösung eines gegen humanes MPO gerichteten Kaninchenantikörpers (hergestellt und vertrieben von Calbiochem-Novabiochem Corporation, USA) in 0,1 M HEPES (pH 8,0) oder in eine 10 μg/ml Lösung eines gegen humanes CRP gerichteten Kaninchenantikörpers (hergestellt und vertrieben von Oriental Yeast Industries, Co., Ltd. Japan) in 0,1 M HEPES (pH 8,0) eingetaucht, wodurch der Anti-MPO Antikörper oder der Anti-CRP Antikörper auf der Oberfläche des mit einem Polysiloxan beschichteten Siliciumwafer adsorbiert wird. Dann wurde der Siliciumwafer mit dem darauf adsorbierten Antikörper mit Wasser gewaschen und die auf dem Wafer verbleibenden Wassertropfen wurden unter Verwendung von Stickstoffgas, gefolgt von Lufttrocknung entfernt.
  • Die oben erwähnten Proben A, B, C und D wurden einzeln mit einer 0,1 M HEPES (pH 8,0) Lösung 100-fach verdünnt, um verdünnte Lösungen zu erhalten. 10 μl von jeder der verdünnten Lösungen wurde genommen und in einem Eppendorf Gefäß einzeln gemischt mit 30 μl einer Lösung eines mit HRP-markiertem Anti-MPO Antikörpers oder in einem Eppendorf Gefäß gemischt mit 30 μl einer Lösung eines mit HRP-markierten Anti-CRP Antikörpers (wobei die Markierung des Antikörpers mit HRP auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 durchgeführt wurde), und die resultierenden Mischungen wurden einzeln für 10 Minuten bei Raumtemperatur einer Reaktion unterworfen.
  • 30 μl von jeder der resultierenden Reaktionsmischungen wurden genommen und auf den oben erwähnten Siliciumwafer mit dem darauf adsorbierten Anti-MPO Antikörper oder dem darauf adsorbierten Anti-CRP Antikörper gegeben, und das Resultierende wurde für 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wurde der so behandelte Siliciumwafer mit Wasser gewaschen und die auf dem Wafer verbliebenen Wassertropfen wurden unter Verwendung von Stickstoffgas, gefolgt von Lufttrocknung entfernt. Sofort nach dem Trocknen wurden 30 μl von TMB fast (hergestellt und vertrieben von Kirkegaad & Perry Laboratories, USA) auf den Siliciumwafer gegeben und für 5 Minuten umgesetzt, um dadurch eine Präzipitationsschicht auf der Oberfläche des Siliciumwafers zu bilden. Nach Beendigung der Reaktion wurde der Siliciumwafer mit Wasser gewaschen und die auf dem Wafer verbliebenen Wassertropfen wurden unter Verwendung von Stickstoffgas, gefolgt von Lufttrocknung entfernt, um dadurch einen Siliciumwafer zu erhalten, der ein Protein trägt, das an den Antikörper gebunden hat, der an dem Wafer immobilisiert worden ist, und sichtbar gemacht worden ist. Der Grad der Färbung des sichtbar gemachten Proteins wurde visuell untersucht und mit einem Auswertungssymbol versehen, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus "–", "±", "+", "++" und "+++" besteht und wobei diese eine Reihenfolge von einem geringen Grad der Färbung bis zu einem hohen Grad der Färbung angeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7
    Probe (100-fache Verdünnung) Ergebnisse der visuellen Auswertung
    Nachweis von MPO Nachweis von CRP
    A – –
    B ± +
    C + ++
    D ++ +++
  • Wie aus Tabelle 7 ersichtlich, kann eine Probe, die durch Behandlung einer Vollblutprobe mit einem oberflächenaktiven Mittel erhalten wurde, sowohl in Bezug auf die Konzentration von MPO als auch CRP gemessen werden.
  • Beispiel 12
  • Der in Beispiel 11 erhaltene Siliciumwafer, der eine darauf geformte Präzipitationsschicht aufwies, wurde einer Dickenmessung der Präzipitationsschicht mittels eines Ellipsometers, in welchem polarisierende Platten fixiert sind (Einfallwinkel: 70°, Winkel der polarisierenden Platte bei der Einfallseite: 20°, Winkel der polarisierenden Platte bei der Nachweisseite: 10°, He/Ne-Laser) (hergestellt und vertrieben von Sigma Koki Co., Ltd. Japan), unterworfen, wodurch die Menge an Protein in jeder der Proben bestimmt wird. Die Messung wurde 10 mal ausgeführt und ein Mittelwert wurde erhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8
    Probe (100-fache Verdünnung) Nachweisergebnisse unter Verwendung eines Ellipsometers (μW)
    Nachweis von MPO Nachweis von CRP
    A 39,10 40,31
    B 50,46 70,45
    C 66,37 176,74
    D 71,36 315,29
  • Wie aus Tabelle 8 ersichtlich, kann eine Probe, die durch Behandlung einer Vollblutprobe mit einem oberflächenaktiven Mittel erhalten wurde, sowohl in Bezug auf die Konzentration von MPO als auch die Konzentration von CRP gemessen werden.
  • INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
  • Durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen kann die Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen und/oder die Anzahl Neutrophiler einer Vollblutprobe einfach und schnell durchgeführt werden, ohne die Notwendigkeit die Blutzellen aus der Vollblutprobe abzutrennen. Ferner kann durch das Bestimmungsverfahren der vorliegenden Erfindung, zusätzlich zur Anzahl weißer Blutkörperchen einer Vollblutprobe, die Konzentration von C-reaktivem Protein, das in derselben Vollblutprobe enthalten ist, gemessen werden. Dadurch kann durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer infektiösen Krankheit und die Schwere einer Entzündung schnell und einfach und mit geringen Kosten diagnostiziert werden.

Claims (14)

  1. Verfahren zur Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen in einer Vollblutprobe, welches umfasst: (a) das Mischen einer Vollblutprobe mit einem oberflächenaktiven Mittel, um dadurch eine Mischung zu erhalten; (b) das Stehen lassen dieser Mischung für eine Zeit, die ausreicht, um die in der Vollblutprobe enthaltenen weißen Blutkörperchen zu lysieren und die intrinsische Myeloperoxidase aus den weißen Blutkörperchen freizusetzen; (c) das Messen der Konzentration der freigesetzten Myeloperoxidase in der Mischung; und (d) das Bestimmen der Anzahl der weißen Blutkörperchen in der Vollblutprobe, basierend auf der Konzentration der freigesetzten Myeloperoxidase.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (c) zusätzlich zu der Konzentration der freigesetzten Myeloperoxidase die Konzentration von C-reaktivem Protein, das in der Vollblutprobe enthalten ist, gemessen wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (c) die Konzentration der freigesetzten Myeloperoxidase durch ein immunologisches Verfahren gemessen wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei in Schritt (c) sowohl die Konzentration der Myeloperoxidase als auch die Konzentration des C-reaktiven Proteins durch ein immunologisches Verfahren gemessen werden.
  5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei das immunologische Verfahren ein Enzym-Immunoassay ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei das immunologische Verfahren ein optischer Immunoassay ist.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das oberflächenaktive Mittel ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel einen HLB-Wert (hydrophile-lipophile-balance) von 12 bis 14 aufweist.
  9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel eine Polyethylenoxidverbindung mit einem daran gebundenen gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoff ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel wenigstens ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel mit einer Polyoxyethylenalkylphenyletherstruktur, einem nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel, das eine Polyethylenoxidverbindung mit einem daran gebundenen ungesättigten aliphatischen Kohlenwassersteoff ist, und einem nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel mit einer Polyoxyethylenalkyletherstruktur.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das oberflächenaktive Mittel wenigstens ein kationisches oberflächenaktives Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hexadecyltrimethylammoniumbromid, Hexadecyltrimethylammoniumchlorid, Didecyldimethylammoniumchlorid, Dodecyltrimethylammoniumchlorid, Dodecyltrimethylammoniumbromid, Octadecyltrimethylammoniumchlorid, Tetradecylammoniumbromid, Dodecylpyridiniumchlorid, Hexadecylpyridiniumchlorid, Hexadecylpyridiniumbromid, 1-Laurylpyridiniumchlorid, und Tetradecyltrimethylammoniumbromid ist.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das oberflächenaktive Mittel mit der Vollblutprobe in einer Menge gemischt wird, dass die Konzentration des oberflächenaktiven Mittels in der Mischung in dem Bereich von 0,2 bis 10% (w/v) ist.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei in Schritt (b) die Mischung für nicht mehr als 1 Stunde stehen gelassen wird.
  14. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Anzahl der weißen Blutkörperchen die Anzahl der Neutrophilen ist.
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