JPH09121893A - 生体反応検査方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 全血等を用いて、より簡略化された測定系に
より、免疫及び炎症等に関与する生体反応の検査を可能
とする方法を提供する。 【解決手段】 分子中に水酸基、アミド骨格及びエステ
ル骨格からなる群より選ばれる少なくとも１つの化学構
造を有する水不溶性高分子材料（例、キトサンまたはキ
トサン誘導体）又はカチオン性官能基を有する水不溶性
高分子材料と血液とを接触させることにより、マトリッ
クスメタロプロティナーゼ又はミエロペルオキシダーゼ
の産生を誘導させ、該マトリックスメタロプロティナー
ゼ又はミエロペルオキシダーゼの産生量を測定すること
を特徴とする生体反応検査方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、材料と血液とを接
触させることにより、マトリックスメタロプロティナー
ゼ又はミエロペルオキシダーゼを産生誘導し、その産生
能力を測定することにより、免疫及び炎症等に関する生
体反応を検査する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】周知のごとく、生体の免疫担当細胞とし
ては、単球、マクロファージ、顆粒球、リンパ球等の白
血球やキラー細胞、ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞等があり、こ
れらの細胞は血液中や各臓器、器官において免疫監視を
行うとともに、各種の免疫反応などの生体防御反応にお
いて様々な役割を担って活動している。

【０００３】一般に各種の疾患や悪性腫瘍においては、
多様な生体防御反応によって上記の細胞の機能が抑制さ
れたり、または増強されたりすることが知られている。
また、ステロイド剤や免疫抑制剤、抗癌剤等の薬剤を投
与すると、上記の細胞の機能が抑制されたり、または増
強されたりすることも知られている。そこで、これらの
細胞の機能を調べることによって、各種病態のモニタリ
ングが可能であり、薬剤の生体に対する効果あるいは副
作用を把握し、薬剤の投与量や投与タイミングを決定す
ることができる。

【０００４】従来、このような、生体防御の機能を測定
する方法としては、例えば、リンパ球幼若化試験や顆粒
球貪食機能試験、顆粒球殺菌能（活性酸素産生能）試験
等が行われ、また、最近では、フローサイトメトリー装
置と各種免疫担当細胞表面抗原に対する蛍光標識モノク
ローナル抗体を用いた表面抗原試験が行われてきた。し
かしながら、これらの試験には、細胞分離、細胞培養、
顕微鏡測定等の用手法の特殊な技術が要求され、また、
時間がかかり、ＲＩ（ラジオアイソトープ）施設や高価
な装置が必要なことから、もっと簡単で危険性がなく、
精度の良い検査方法が望まれている。

【０００５】前記の生体防御機能反応を担う細胞から分
泌されるサイトカインなどの各種免疫因子や酵素など
は、互いに、密接に関わり合って、生体の防御機能を調
節していることがわかってきた。現在では、生体の防御
系を考える上で、これらの免疫因子や酵素などの動態を
知ることが、非常に重要なことと考えられている。従っ
て、上記のリンパ球幼若化試験などとは別に、上記生体
防御機能反応を担う細胞の機能を推し量る方法として、
これらの細胞から分泌されるサイトカインなどの各種免
疫因子や酵素などを細胞機能の動態指標として測定する
方法が考えられる。例えば、特表平５−５０２０９９号
公報には、細胞に活性化物質を接触させ、酵素基質を供
給して酵素−基質反応の生成物を測定する方法が開示さ
れている。しかしながら、この方法は、全血を用いて行
うことはできず、白血球分離が必要である。白血球分離
には特殊な技術と時間が掛かる上、この過程で白血球の
活性低下又は不要な活性化が起こることがあり、精度の
よい測定結果が得られないという問題点がある。

【０００６】マトリックスメタロプロティナーゼは、上
記の生体防御機能反応を担う細胞から分泌される酵素の
一つであり、細胞の機能を推し量る重要な動態指標の一
つであり、最近では、活性化したリンパ球と単球との直
接的接触の結果、マトリックスメタロプロティナーゼ−
９（９２ＫＤａゼラチナーゼ）が単球から遊離されると
いう報告がある（「Direct Contact between T Lymphoc
ytes and Monocytes Is a Major Pathway for Inductio
n of Metalloprotenase Ex-pression 」SylvieLacraz e
t al. The Journal of Biological Chemistry，Vol.26
9,No.35,22027-22033,1994）。

【０００７】また、ミエロペルオキシダーゼも上記の生
体防御機能反応を担う細胞から分泌される酵素の一つで
あり、細胞の機能を推し量る重要な動態指標の一つであ
る。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、従来
の検査方法の欠点を解消し、全血を用いて、より簡略化
された測定系にて、マトリックスメタロプロティナーゼ
又はミエロペルオキシダーゼの産生能を測定することに
よって、生体反応検査を行う、新しい検査方法を提供す
ることにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題を達
成するためになされたものであり、請求項１および２に
記載の発明は、それぞれ、下記の構成を備える。

【００１０】すなわち、請求項１に記載の発明は、分子
中に水酸基、アミド骨格及びエステル骨格からなる群よ
り選ばれる少なくとも１つの化学構造を有する水不溶性
高分子材料又はカチオン性官能基を有する水不溶性高分
子材料と血液とを接触させることにより、マトリックス
メタロプロティナーゼの産生を誘導させ、該マトリック
スメタロプロティナーゼの産生量を測定することを特徴
とする生体反応検査方法である。

【００１１】また、請求項２に記載の発明は、分子中に
水酸基、アミド骨格及びエステル骨格からなる群より選
ばれる少なくとも１つの化学構造を有する水不溶性高分
子材料又はカチオン性官能基を有する水不溶性高分子材
料と血液とを接触させることにより、ミエロペルオキシ
ダーゼの産生を誘導させ、該ミエロペルオキシダーゼの
産生量を測定することを特徴とする生体反応検査方法で
ある。

【００１２】上記のように、請求項１及び２に記載の発
明は、水不溶性高分子材料と血液とを接触させることに
より、酵素（マトリックスメタロプロティナーゼ又はミ
エロペルオキシダーゼ）の産生を誘導し、該酵素の産生
量を測定することにおいて共通するものであり、上記酵
素の産生能力を測定することにより、免疫や炎症等に関
与する生体反応を検査することを可能とする、より正確
かつ簡便な生体検査方法を提供するものである。

【００１３】以下、本発明について詳述する。血液中の
リンパ球、単球や好中球などの白血球は、微生物のよう
な異物と反応すると、粘着反応、貪食反応を介して活性
化し、マトリックスメタロプロティナーゼ、ミエロペル
オキシダーゼをはじめとする細胞内酵素の放出や活性化
酸素、プロスタグランジン、サイトカイン等、種々のメ
ディエーターを放出し、生体防御反応において重要な役
割を果たしている。これらの反応は材料と接触するとき
にも同様に引き起こされる。例えば、単球や好中球など
の白血球は、ラテックス粒子のような合成高分子材料を
も旺盛に貪食する。これは、材料が異物とみなされて起
こるものであるが、これらの反応は高分子材料の表面性
状、物理化学的組成等の性質によって大きく変わってく
る。そのため、材料の性質を制御することによって、こ
の反応を制御できると考えられる。

【００１４】本発明者らは、上記の反応の中で、白血球
によるマトリックスメタロプロティナーゼ又はミエロペ
ルオキシダーゼの産生に注目し、種々の天然及び合成高
分子材料と血液との接触によるマトリックスメタロプロ
ティナーゼ又はミエロペルオキシダーゼの産生誘導につ
いて、鋭意研究を行い、種々の水不溶性高分子材料が血
液中でマトリックスメタロプロティナーゼ又はミエロペ
ルオキシダーゼの顕著な産生誘導を引き起こすことを発
見した。

【００１５】本発明で用いられる、分子中に水酸基、ア
ミド骨格及びエステル骨格からなる群より選ばれる少な
くとも１つの化学構造を有する水不溶性高分子材料に
は、アガロース、セルロース、デンプン、プルラン、デ
キストラン、グリコーゲン、マンナン、グルコマンノグ
リカン、ガラクトマンノグリカン、ペクチン、アルギン
酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、キチン、キト
サンのような天然多糖類や、それらをカルボキシメチル
化、スクシニル化、糖側鎖グラフト、ペプチド側鎖グラ
フト、グリコール化、アシル化、アミノ化によって修飾
した種々の誘導体が挙げられる。以上の材料のうち水溶
性の材料は、水不溶性の誘導体にした上で用いられる。

【００１６】例えば、本発明者らが得た知見では、キチ
ン及びそのＮ−脱アセチル化物であるキトサンやキトサ
ンのアミノ基に１級アミン、２級アミン、３級アミン又
は第４アンモニウム塩を導入したキトサン誘導体、アル
キル基を導入した誘導体、また、水酸基にスルホン基、
カルボキシメチル基を導入した誘導体などは血液との接
触によって、マトリックスメタロプロティナーゼ及びミ
エロペルオキシダーゼの大きな産生誘導を示した。ま
た、アガロースやアガロースに２、３−ジブロモプロパ
ノールを強アルカリ条件下で作用させて架橋することで
強度を高めた架橋型アガロースや、それにジエチルアミ
ノエチル（ＤＥＡＥ）基等のイオン交換基をエーテル結
合させたアガロース誘導体、第４アンモニウム塩等で修
飾したアガロース誘導体よりなるゲルビーズと血液との
接触によっても、マトリックスメタロプロティナーゼ及
びミエロペルオキシダーゼの顕著な産生誘導が見られ
た。また、アルギン酸ナトリウムなどを水に溶解させ、
これらとＣａ²⁺、Ａｌ³⁺、Ｂａ ²⁺、Ｃｕ²⁺などの多価金
属イオンを含む水溶液とを接触させることにより作製し
たアルギン酸ゲルビーズと血液との接触によっても、マ
トリックスメタロプロティナーゼ及びミエロペルオキシ
ダーゼの顕著な産生誘導が見られた。

【００１７】また更に、本発明で用いられる、分子中に
水酸基、アミド骨格及びエステル骨格からなる群より選
ばれる少なくとも１つの化学構造を有する水不溶性高分
子材料には、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシエ
チルアクリレート、ポリヒドロキシメチルアクリレー
ト、ポリフェノール、ポリアクリルアミド、ポリリジ
ン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸エステル、
ポリメタクリル酸エステル等の合成高分子材料やその種
々の誘導体や架橋物及びそれらとスチレン、メタクリル
酸エステル等のビニルモノマーとの種々の共重合体も挙
げられる。以上の材料のうち水溶性の材料は、水不溶性
の誘導体にした上で用いられる。

【００１８】また、本発明者らが得た知見では、上記官
能基を有するメタクリル酸エステルモノマーを重合又は
各種のビニルモノマーなどと共重合することによって、
水酸基を導入した修飾体や、アルキル基、フェニル基を
導入した材料でも、マトリックスメタロプロティナーゼ
及びミエロペルオキシダーゼの顕著な産生誘導が確認さ
れた。

【００１９】また、本発明で用いられるカチオン性官能
基を有する水不溶性高分子材料は、アミノ基、イミノ
基、ニトリロ基、第４アンモニウム基、スルホニウム
基、ホスホニウム基等を有する水不溶性高分子材料であ
り、例えば、ポリビニルピリジン及びその塩、イオネン
ポリマー、Ｎ−トリアルキルアミノメチルポリスチレ
ン、アミノアセタール化ポリビニルアルコール、ポリビ
ニルイミダゾール、ポリエチレンイミン、ポリジアルキ
ルジアリルアンモニウム塩、ポリジアルキルジアリルア
ンモニウム塩−ＳＯ₂ 共重合体、ポリビニルベンジルス
ルホニウム塩、ポリビニルベンジルホスホニウム塩等が
挙げられる。

【００２０】上記カチオン性官能基を有する水不溶性高
分子材料は、天然多糖類及びポリスチレン等の合成高分
子に種々の化学修飾方法を用いて、上記カチオン性官能
基を導入したり、これらの官能基を有するビニルモノマ
ー間の共重合、架橋反応により得ることができる。例え
ば、スチレンとジビニルベンゼンを共重合し、Ｆｒｉｅ
ｄｅｌ−Ｃｒａｆｔｓ反応を介して、クロロメチル基を
ベンゼン核に導入し、クロロメチル基をアミンで処理す
ることによって、アミノ化し、しかる後にアルキル置換
を行うことにより、ポリスチレンにカチオン性官能基を
導入することができる。

【００２１】また、他の方法として、例えば、エピクロ
ルヒドリンのような分子内にクロロメチル基とオキシラ
ン環とを有する化合物にイミダゾール類を反応させ、変
性イミダゾールを合成し、これを多官能性エポキシ化合
物で樹脂化することによっても得ることができる。ま
た、カチオン性官能基を有する水不溶性高分子材料につ
いては、他にも種々の合成法が考えられるが、本発明は
その方法によって限定されるものではない。

【００２２】本発明者らが得た知見では、カチオン性基
として、トリアルキル置換窒素原子をもつトリメチルア
ンモニウム基やジアルキルエタノールであるジメチルエ
タノールアンモニウム基を導入したポリスチレン修飾体
は、未修飾のポリスチレンやアニオン性基で修飾したポ
リスチレンからなる材料に比較して、著しく大きなマト
リックスメタロプロティナーゼ及びミエロペルオキシダ
ーゼの産生誘導を示した。また、カチオン性基として、
アミノ基またはイミノ基をもつものやニトリロ基をもつ
ものでも、マトリックスメタロプロティナーゼ及びミエ
ロペルオキシダーゼの大きな産生誘導が確認された。一
方、アニオン性基であるスルホン酸基を導入したポリス
チレン誘導体では、ほとんどマトリックスメタロプロテ
ィナーゼ及びミエロペルオキシダーゼの産生誘導が見ら
れなかった。

【００２３】また、ジメチルエタノールアンモニウム
基、ジエチルアミノ基、末端にアミノ基のようなカチオ
ン性基を有するメタクリル酸エステルモノマーの共重合
により得られたポリメタクリル酸エステル系材料は、顕
著なマトリックスメタロプロティナーゼ及びミエロペル
オキシダーゼの産生誘導を示した。一方アニオン性基で
あるカルボキシル基を有するメタクリル酸エステル系材
料では、ほとんどマトリックスメタロプロティナーゼ及
びミエロペルオキシダーゼの産生誘導が見られなかっ
た。

【００２４】また、キチン及びそのＮ−脱アセチル化物
であるキトサンやキトサンのアミノ基に１級アミン、２
級アミン、３級アミン又は第４アンモニウム塩を導入し
たキトサン誘導体、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）
基等のイオン交換基をエーテル結合させたアガロース誘
導体、第４アンモニウム塩等で修飾したアガロース誘導
体は、上述したように、特に高いマトリックスメタロプ
ロティナーゼ及びミエロペルオキシダーゼの産生誘導を
示した。

【００２５】本発明において用いられる種々の上記水不
溶性高分子材料の形状としては、粒子状、繊維状、中空
糸状、膜状等いずれの公知の形状のものでも用いること
ができる。例えば、スチレンモノマーにジビニルベンゼ
ンとラジカル開始剤ベンゾイルパーオキサイドを加え
て、水中で６０℃、５時間懸濁攪拌を続けるとスチレン
・ジビニルベンゼン共重合体球状粒子を容易に得ること
ができる。粒子径は攪拌速度、水中に加える安定剤の種
類と濃度、モノマーと水の容量比などで制御できる。ま
た、希釈剤とモノマーの混液の懸濁重合を行うことで、
多孔質化を行うことも容易である。また、各種メタクリ
ル酸エステルモノマーの重合をモノマーに対する良溶媒
でかつポリマーに対する貧溶媒中で懸濁重合を行うと、
ポリメタクリル酸エステルの球状粒子を容易に得ること
ができる。粒子径は攪拌速度、添加する安定剤の種類と
濃度などで制御することができる。こうして合成した球
状粒子に、前述のような化学修飾反応を行い、種々のマ
トリックスメタロプロティナーゼ又はミエロペルオキシ
ダーゼ産生誘導材料が得られる。

【００２６】また、血液と上記材料とを接触させる方法
については、血液と上記材料が十分に接触され得る限
り、任意の方法を用いることができる。例えば、繊維状
の上記材料をカラムに充填し、該カラムに血液を循環さ
せる方法や、粒径５０μｍ〜５ｍｍのビーズ状の材料を
カラムに充填し、血液を循環させる方法を用いることが
できる。さらに、血液中に種々の形状の上記材料を懸濁
させることにより、血液と上記材料を接触させてもよ
い。

【００２７】本発明では、上記材料と血液とを接触させ
ることにより、上記材料と細胞との相互作用が起こり、
マトリックスメタロプロティナーゼ又はミエロペルオキ
シダーゼの産生誘導が行われる。マトリックスメタロプ
ロティナーゼ又はミエロペルオキシダーゼの産生細胞と
は、末梢血中の細胞に限らず、リンパ管、リンパ節、脾
臓等から得られる細胞も含まれる。血液中にはマトリッ
クスメタロプロティナーゼ又はミエロペルオキシダーゼ
を産生するこれらの細胞が多く含まれている。また、血
液中のこれらの細胞が上記材料と作用し、マトリックス
メタロプロティナーゼ又はミエロペルオキシダーゼが産
生誘導されるが、直接作用しなくとも、上記材料と血液
中の何らかの因子とが作用して誘導された別の因子を介
して、マトリックスメタロプロティナーゼ又はミエロペ
ルオキシダーゼの産生が誘導されてもよい。

【００２８】本発明方法の実施形態としての一例におい
ては、サンプルとして血液を採取し、この血液を全血の
まま、または希釈して組織培養用プレートや試験管等に
加える。これらのプレートウェルや試験管内壁の底面ま
たは側面は、細胞からのマトリックスメタロプロティナ
ーゼ又はミエロペルオキシダーゼの産生を誘導するため
の材料から構成されているか、あるいはそれらの材料が
塗布されているかまたは充填されている。これらの反応
容器を用いて血液を培養することにより、これらの材料
と血液が作用し合い、マトリックスメタロプロティナー
ゼ又はミエロペルオキシダーゼの産生が誘導される。こ
のマトリックスメタロプロティナーゼ又はミエロペルオ
キシダーゼ産生量を測定することにより、免疫や炎症等
に関する生体反応を把握することができる。

【００２９】上記において血液サンプルの採取は常法に
従い、任意の方法で実施できる。例えば、ヘパリン採
血、クエン酸採血等が挙げられる。ただし、マトリック
スメタロプロティナーゼ又はミエロペルオキシダーゼの
産生誘導は、細胞の生物学的反応であるため、血液や培
地中のカルシウムイオン、マグネシウムイオンなどをキ
レートしないヘパリン採血などがより好ましい。

【００３０】また、血液を希釈する場合には、例えばリ
ン酸緩衝液、ハンクス緩衝液、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６
４０等の通常の培地など、いずれであっても利用でき
る。培養は、通常３７℃付近の温度条件下で行われる
が、その他の温度の範囲でも行い得る。この培養時にプ
レートや試験管を振盪器や回転培養器を用いて混和する
ことが、マトリックスメタロプロティナーゼ又はミエロ
ペルオキシダーゼの産生誘導には好ましく、個々の血液
サンプルの産生能力を把握し易くなる。

【００３１】培養後のマトリックスメタロプロティナー
ゼの産生量の測定は、既存のコラーゲン、変性コラーゲ
ンを基質とした酵素量、酵素活性測定法やマトリックス
メタロプロティナーゼに特異的な抗体を用いた酵素抗体
測定法等で行い得る。

【００３２】また、培養後のミエロペルオキシダーゼの
産生量の測定は各種の酵素量および酵素活性測定法、代
表的には比色定量法等で行い得る。

【００３３】本発明の生体反応検査方法では、前述の材
料を用いて、健常人あるいは各種疾患の患者血液から簡
便にマトリックスメタロプロティナーゼ又はミエロペル
オキシダーゼを誘導することができ、その誘導量の程度
を測定することにより、個人のマトリックスメタロプロ
ティナーゼ又はミエロペルオキシダーゼ産生能力を調べ
ることができる。これは、健康状態や種々の疾患の病態
を反映する有効なパラメーターとなり得る。

【００３４】本発明の生体反応検査方法では、前記の通
り全血等をそのまま利用することもでき、その場合は該
血液より単球や好中球等を分離する必要がなく、それに
伴う操作や処理時間が不要であることは勿論のこと、そ
れらの操作、処理時間等による細胞の活性低下または不
要な活性化が惹起される問題もない。

【００３５】さらに、本発明では、検査に必要とされる
血液量も非常に少なくてすみ、被採血者の負担も軽減さ
れる。また、全血又はその希釈血液を用いるため、血液
中に含まれる様々な液性因子や細胞の関与が生体内と同
様に働き、より正確に生体内の防御機能を把握すること
ができる。

【００３６】（作用）上記のように、本発明によれば、
上記特定の水不溶性高分子材料が血液と接触されること
により、マトリックスメタロプロティナーゼ又はミエロ
ペルオキシダーゼが迅速にかつ簡便に誘導される。従っ
て、検査される者の血液から簡便にかつ迅速にマトリッ
クスメタロプロティナーゼ又はミエロペルオキシダーゼ
の産生誘導を行うことができるため、この産生量を測定
することにより、検査される者自身のマトリックスメタ
ロプロティナーゼ又はミエロペルオキシダーゼ産生能力
を調べることができる。

【００３７】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施例及び比較例
を挙げることにより、本発明を詳細に説明するが、本発
明は、以下の実施例に限定されるものではない。まず、
下記の実施例１〜４４及び比較例１〜９に記載する方法
にて、マトリックスメタロプロティナーゼ誘導用材料を
作製し、次いで得られた材料を用いて、マトリックスメ
タロプロティナーゼの産生誘導を試験した。

【００３８】（キトサンまたはキトサン誘導体による産
生誘導用材料） 実施例１ キトサンのアミノ基がそのまま残っているキトサンゲル
粒子（富士紡績社製、商品名「Chitopearl basic AL-0
3」、平均粒径０．３ｍｍ）を、１５ｍｌ用ポリプロピ
レン試験管（岩城硝子社製）に、かさ体積で１ｍｌ充填
した。これに注射用生理食塩水（大塚製薬社製）を１２
ｍｌ添加して軽く攪拌した後、５００ｒｐｍで５分間遠
心分離し、上澄みを吸引して捨てることにより洗浄し
た。この洗浄操作を更に２回繰り返した後、一晩４℃で
放置した。その後、同様の洗浄操作を更に５回行った
後、最後にできるだけ注射用生理食塩水を取り除いた。
２ｍｌ用ポリプロピレンサンプルチューブ（eppendorf
社製）に、注射用生理食塩水を加えた後、１２１℃で２
０分間オートクレーブ滅菌し、注射用生理食塩水を廃棄
した後、さらに注射用生理食塩水で３度洗浄した。この
２ｍｌ用ポリプロピレンサンプルチューブに、上記で得
られたキトサンゲル粒子をかさ体積で５００μｌ充填し
た。

【００３９】実施例２ 実施例１のキトサンゲル粒子（富士紡績社製、商品名
「Chitopearl basic AL-03」）に代えて、キトサンのア
ミノ基がアセチル化されたキトサン誘導体ゲル粒子（富
士紡績社製、商品名「Chitopearl basic BL-03」、平均
粒径０．３ｍｍ）を使用したことの他は、実施例１と同
様にして行い、キトサン誘導体ゲル粒子が充填された２
ｍｌ用ポリプロピレンサンプルチューブを得た。

【００４０】実施例３ 実施例１のキトサンゲル粒子（富士紡績社製、商品名
「Chitopearl basic AL-03」) に代えて、キトサンのア
ミノ基にベンジル基を介して１級アミンが導入されたキ
トサン誘導体ゲル粒子（富士紡績社製、商品名「Chitop
earl BCW-3503 」、平均粒径０．３ｍｍ）を使用したこ
との他は、実施例１と同様にして行い、キトサン誘導体
ゲル粒子が充填された２ｍｌ用ポリプロピレンサンプル
チューブを得た。

【００４１】実施例４ 実施例１のキトサンゲル粒子（富士紡績社製、商品名
「Chitopearl basic AL-03」) に代えて、キトサンのア
ミノ基に直鎖アルキル基を介して１級アミンが導入され
たキトサン誘導体ゲル粒子（富士紡績社製、商品名「Ch
itopearl BCW-3003 」、平均粒径０．３ｍｍ）を使用し
たことの他は、実施例１と同様にして行い、キトサン誘
導体ゲル粒子が充填された２ｍｌ用ポリプロピレンサン
プルチューブを得た。

【００４２】実施例５ 実施例１のキトサンゲル粒子（富士紡績社製、商品名
「Chitopearl basic AL-03」) に代えて、キトサンのア
ミノ基に３級アミンが導入されたキトサン誘導体ゲル粒
子（富士紡績社製、商品名「Chitopearl BCW-2603 」、
平均粒径０．３ｍｍ）を使用したことの他は、実施例１
と同様にして行い、キトサン誘導体ゲル粒子が充填され
た２ｍｌ用ポリプロピレンサンプルチューブを得た。

【００４３】実施例６ 実施例１のキトサンゲル粒子（富士紡績社製、商品名
「Chitopearl basic AL-03」) に代えて、キトサンのア
ミノ基に第４アンモニウム塩が導入されたキトサン誘導
体ゲル粒子（富士紡績社製、商品名「Chitopearl BCW-2
503 」、平均粒径０．３ｍｍ）を使用したことの他は、
実施例１と同様にして行い、キトサン誘導体ゲル粒子が
充填された２ｍｌ用ポリプロピレンサンプルチューブを
得た。

【００４４】実施例７ 実施例１のキトサンゲル粒子（富士紡績社製、商品名
「Chitopearl basic AL-03」) に代えて、キトサンの６
位の水酸基にカルボキシメチル基が導入されたキトサン
誘導体ゲル粒子（富士紡績社製、商品名「Chitopearl C
M-03」、平均粒径０．３ｍｍ）を使用したことの他は、
実施例１と同様にして行い、キトサン誘導体ゲル粒子が
充填された２ｍｌ用ポリプロピレンサンプルチューブを
得た。

【００４５】実施例８ 実施例１のキトサンゲル粒子（富士紡績社製、商品名
「Chitopearl basic AL-03」) に代えて、キトサンの６
位の水酸基にスルホン基が導入されたキトサン誘導体ゲ
ル粒子（富士紡績社製、商品名「Chitopearl SU-03」、
平均粒径０．３ｍｍ）を使用したことの他は、実施例１
と同様にして行い、キトサン誘導体ゲル粒子が充填され
た２ｍｌ用ポリプロピレンサンプルチューブを得た。

【００４６】実施例９ キトサンのアミノ基がそのまま残っているキトサン粉末
粒子（カトキチ社製、商品名「CHITOSAN 10B」）５ｇ
を、注射用生理食塩水（大塚製薬社製）３０ｍｌに懸濁
し、１５００ｒｐｍ、１分間の条件で遠心分離し、上澄
みを吸引して捨てることにより洗浄した。この洗浄操作
を更に２回繰り返した後、一晩４℃で放置した。その
後、同様の洗浄操作を更に５回行った後、最後にできる
だけ注射用生理食塩水を取り除いた。２ｍｌ用ポリプロ
ピレンサンプルチューブ（eppendorf 社製）に、注射用
生理食塩水を加えた後、１２１℃で２０分間オートクレ
ーブ滅菌し、注射用生理食塩水を廃棄した後、さらに注
射用生理食塩水で３度洗浄した。この２ｍｌ用ポリプロ
ピレンサンプルチューブに、上記で得られたキトサン粉
末をかさ体積で５００μｌ充填した。

【００４７】（アガロース及びアガロース誘導体による
産生誘導用材料） 実施例１０ アガロース（ナカライ化学社製、電気泳動用特製試薬
ＧＰ−３６）を５重量％濃度で蒸留水に溶解させ、１２
１℃で２０分間オートクレーブを行った。この溶液を６
０℃に保温しておき、冷蒸留水（４℃）中にマイクロシ
リンジを用いて滴下して、アガロースゲルビーズ（粒径
５ｍｍ）を作製した。

【００４８】このビーズを注射用生理食塩水（大塚製薬
社製）で洗浄後、同じく注射用生理食塩水で洗浄した２
ｍｌ用ポリプロピレンサンプルチューブ（eppendorf 社
製）に充填した。充填量はアガロースゲルビーズ２０個
とした。

【００４９】実施例１１ 約２重量％濃度のアガロースよりなる、 Sepharose 2B
(Pharmacia LKB Biotechnology 社製) の懸濁液３ｍｌ
を、１５ｍｌ用ポリプロピレン試験管（岩城硝子社製）
に入れた。これを１０００ｒｐｍで５分間遠心して、上
澄みを吸引して捨て、注射用生理食塩水（大塚製薬社
製）を１２ｍｌ加えて攪拌し、同じ条件で遠心し、上澄
みを吸引して捨てた。この洗浄操作を３回行い、４℃に
て一晩放置した。

【００５０】このゲル担体５００μｌ（かさ体積）を実
施例１と同様に、２ｍｌ用ポリプロピレンサンプルチュ
ーブ（eppendorf 社製）に入れて、注射用生理食塩水
（大塚製薬社製）にて洗浄した。

【００５１】実施例１２ 約６重量％濃度の架橋型アガロースよりなる、Sepharos
e CL-6B (Pharmacia LKB Biotechnology社製）を用いた
こと以外は、実施例１１と同様に操作して、ゲル充填チ
ューブを得た。

【００５２】実施例１３ 約６重量％濃度の架橋型アガロースにジエチルアミノエ
チル（ＤＥＡＥ）基をエーテル結合で導入した、ＤＥＡ
ＥSepharose CL-6B (Pharmacia LKB Biotechnology社
製）を用いたこと以外は、実施例１１と同様に操作し
て、ゲル充填チューブを得た。

【００５３】実施例１４ 約４重量％濃度の架橋型アガロースにエーテル結合を介
してフェニル基を導入した、Phenyl Sepharose CL-4B(P
harmacia LKB Biotechnology社製）を用いたこと以外
は、実施例１１と同様に操作して、ゲル充填チューブを
得た。

【００５４】実施例１５ 約６重量％濃度の架橋型アガロースに第４アンモニウム
塩を導入した、Q Sepharose FF(Pharmacia LKB Biotech
nology社製）を用いたこと以外は、実施例１１と同様に
操作して、ゲル充填チューブを得た。

【００５５】（アルギン酸ゲルによる産生誘導用材料） 実施例１６ ２重量％のアルギン酸ナトリウム（ＡＬ−１、中粘度タ
イプ、新田ゼラチン社製）を生理食塩水に懸濁して、オ
ートクレーブにより１２１℃、２０分で処理すること
で、加熱滅菌と同時にアルギン酸ナトリウムを溶解させ
た。これを滅菌済み１．５重量％塩化カルシウム溶液中
へ滴下してゲル化させることにより、粒径約２．５ｍｍ
のアルギン酸カルシウムのゲルビーズを作製した。この
ゲルビーズを１５ｍｌ用ポリピロプレン試験管（岩城硝
子社製）に、かさ体積で１ｍｌ入れた。これに注射用生
理食塩水（大塚製薬社製）を１２ｍｌ添加して軽く攪拌
した。５００ｒｐｍで１分間遠心し、上澄みを吸引して
捨て、同様に注射用生理食塩水（大塚製薬社製）を１２
ｍｌ加えて攪拌し、遠心して上澄みを吸引して捨てた。
この洗浄操作を３回行い、一晩４℃にて放置した。その
後、同じ洗浄操作を５回行い、最後にできるだけ生理食
塩水を取り除いた。

【００５６】注射用生理食塩水を充填して滅菌洗浄した
２ｍｌ用ポリプロピレンサンプルチューブ（eppendorf
社製）にこのゲルビーズを７０個充填した。

【００５７】実施例１７ ２重量％のアルギン酸ナトリウムを５重量％の濃度のも
のに変更した以外はすべて実施例１６と同様に操作し
て、ビーズ充填チューブを得た。

【００５８】実施例１８ ２重量％のアルギン酸ナトリウムを１０重量％の濃度の
ものに変更した以外はすべて実施例１６と同様に操作し
て、ビーズ充填チューブを得た。

【００５９】実施例１９ １．５重量％の塩化カルシウム溶液を３重量％の濃度の
ものに変更した以外はすべて実施例１６と同様に操作し
て、ビーズ充填チューブを得た。

【００６０】実施例２０ １．５重量％の塩化カルシウム溶液を１．５重量％の塩
化バリウム溶液に変更した以外はすべて実施例１６と同
様に操作して、ビーズ充填チューブを得た。

【００６１】実施例２１ １．５重量％の塩化カルシウム溶液を１．５重量％の塩
化バリウム溶液に変更し、５重量％のアルギン酸ナトリ
ウムを３重量％の濃度のものに変更した以外はすべて実
施例１６と同様に操作して、ビーズ充填チューブを得
た。

【００６２】実施例２２ アルギン酸ナトリウム（ＡＬ−１、中粘度タイプ、新田
ゼラチン社製）をアルギン酸ナトリウム（100 〜150cp
s、和光純薬社製）に変更した以外はすべて実施例１６
と同様に操作して、ビーズ充填チューブを得た。

【００６３】実施例２３ アルギン酸ナトリウム（ＡＬ−１、中粘度タイプ、新田
ゼラチン社製）をアルギン酸ナトリウム（300 〜400cp
s、和光純薬社製）に変更した以外はすべて実施例１６
と同様に操作して、ビーズ充填チューブを得た。

【００６４】実施例２４ アルギン酸ナトリウム（ＡＬ−１、中粘度タイプ、新田
ゼラチン社製）をアルギン酸ナトリウム（500 〜600cp
s、和光純薬社製）に変更した以外はすべて実施例１６
と同様に操作して、ビーズ充填チューブを得た。

【００６５】（ポリビニルアルコールゲルによる産生誘
導用材料） 実施例２５ 重合度；約１４００、けん化度；９９ｍｏｌ％のポリビ
ニルアルコール（キシダ化学社製）の１０重量％水溶液
を調製した。この水溶液は、Ｒ＝［ポリビニルアルコー
ルモノマー単位］／［金属イオン］と定義された、Ｒ＝
１０となるようにＦｅ³⁺を含んでいる。この粘ちょう溶
液を、滅菌済み１ＭのＮａＯＨ水溶液中にシリンジを用
いて滴下し、約３０分放置した。これによって、粒径約
２．５ｍｍのポリビニルアルコールゲルビーズを調製し
た。［横井弘：ＰＶＡおよびＰＡＡの錯体ゲル、高分子
加工，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．１１，１９９１］。

【００６６】上記ゲルビーズを１５ｍｌ用ポリプロピレ
ン試験管（岩城硝子社製）に、かさ体積で１ｍｌ入れ
た。これに注射用生理食塩水（大塚製薬社製）を１２ｍ
ｌ添加し、軽く攪拌した。次に、５００ｒｐｍで１分間
遠心し、上澄みを吸引して捨て、同様に注射用生理食塩
水（大塚製薬社製）を１２ｍｌ加えて攪拌し、上記と同
条件で遠心し、上澄みを吸引して捨てた。この洗浄操作
を３回行い、４℃にて一晩放置した。その後、同じ洗浄
操作を５回行い、最後にできるだけ生理食塩水を取り除
いた。注射用生理食塩水を充填して滅菌洗浄した２ｍｌ
用ポリプロピレンサンプルチューブ（eppendorf 社製）
に、得られたゲルビーズを７０個充填した。

【００６７】実施例２６ 用いたポリビニルアルコールを重合度；約２０００、け
ん化度；９８．５〜９９．４ｍｏｌ％のポリビニルアル
コール（キシダ化学社製）に変更したこと以外はすべて
実施例２５と同様にして行い、ゲルビーズ充填チューブ
を得た。

【００６８】実施例２７ 用いたポリビニルアルコールの濃度を１５重量％に変更
したこと以外はすべて実施例２５と同様にして行い、ゲ
ルビーズ充填チューブを得た。

【００６９】実施例２８ 用いたポリビニルアルコールの濃度を１５重量％に変更
したこと以外はすべて実施例２６と同様にして行い、ゲ
ルビーズ充填チューブを得た。

【００７０】実施例２９ 用いた金属イオン量をＲ＝２０となるように変更したこ
と以外はすべて実施例２５と同様にして行い、ゲルビー
ズ充填チューブを得た。

【００７１】実施例３０ 用いた金属イオン量をＲ＝２０となるように変更したこ
と以外はすべて実施例２６と同様にして行い、ゲルビー
ズ充填チューブを得た。

【００７２】実施例３１ 用いた金属イオンをＣｕ²⁺に変更したこと以外はすべて
実施例２５と同様にして行い、ゲルビーズ充填チューブ
を得た。

【００７３】実施例３２ 用いた金属イオンをＣｕ²⁺に変更したこと以外はすべて
実施例２６と同様にして行い、ゲルビーズ充填チューブ
を得た。

【００７４】実施例３３ 光架橋性ポリビニルアルコール（重合度；１７００、け
ん化度；８８ｍｏｌ％及びスチリルピリジニウム置換基
の割合；１．３％）を、５重量％となるように注射用生
理食塩水に加え、オートクレーブにより１２１℃、２０
分で処理することで加熱滅菌と同時に光架橋性ポリビニ
ルアルコールを溶解させ、光架橋性ポリビニルアルコー
ル溶液を得た。

【００７５】得られた溶液を流動パラフィン中に加えて
充分に攪拌し、溶液を懸濁させた。この後に３００Ｗの
ハロゲンランプを装着したスライドプロジェクターを用
いて、３０分間攪拌しながら光を照射することにより、
光架橋性ポリビニルアルコールをゲル化し、粒径２．５
ｍｍのゲルビーズを作製した。このゲルビーズを注射用
生理食塩水を用いて充分に洗浄し、付着していた流動パ
ラフィンを除いた。上記ゲルビーズ作製法以外は実施例
２５と同様にして行い、ゲルビーズ充填チューブを得
た。

【００７６】実施例３４ 用いた光架橋性ポリビニルアルコール濃度を１０重量％
に変更したこと以外はすべて実施例３３と同様にして行
い、ゲルビーズ充填チューブを得た。

【００７７】実施例３５ 用いた光架橋性ポリビニルアルコール濃度を１５重量％
に変更したこと以外はすべて実施例３３と同様にして行
い、ゲルビーズ充填チューブを得た。

【００７８】（ポリスチレン修飾体による産生誘導用材
料） 実施例３６ トリメチルアンモニウム基をもつ、スチレン・ジビニル
ベンゼン共重合体である、Ｄｉａｉｏｎ ＳＡ１１Ａ
（三菱化成社製）を５０ｍｌポリプロピレン試験管（岩
城硝子社製）に、かさ体積で３ｍｌ入れた。これにメタ
ノール（和光純薬社製 液体クロマトグラム用グレー
ド）４０ｍｌを添加して、軽く攪拌した。静置後、上清
を吸引して除去した。これを３回行った後、同様にメタ
ノール４０ｍｌを添加して、室温にて一晩静置した。

【００７９】次に、メタノールを吸引して除き、同様に
メタノールを用いて２回洗浄した。これに、滅菌済み蒸
留水を４０ｍｌ添加して軽く攪拌した。５００ｒｐｍで
１分間遠心し、上済みを吸引して除き、同様に滅菌済み
蒸留水を用いて３回洗浄した。その後、滅菌済み蒸留水
４０ｍｌを加えて、室温にて３時間静置した。

【００８０】次に、同じ洗浄操作を３回行い、最後にで
きるだけ蒸留水を取り除いた。これに、注射用生理食塩
水（大塚製薬社製）を４０ｍｌ添加して軽く攪拌した。
５００ｒｐｍで１分間遠心し、上済みを吸引して除き、
同様に注射用生理食塩水（大塚製薬社製）にて３回洗浄
を行い、最後に注射用生理食塩水４０ｍｌを加えて、一
晩室温にて静置した。その後、同じ洗浄操作を５回行
い、最後にできるだけ生理食塩水を取り除いた。注射用
生理食塩水を充填して滅菌洗浄した２ｍｌ用ポリプロピ
レンサンプルチューブ（eppendorf 社製）に、このポリ
スチレン粒子をかさ体積で５００μｌ充填した。

【００８１】実施例３７ 用いたポリスチレン粒子を、ジメチルエタノールアンモ
ニウム基をもつ、Ｄｉａｉｏｎ ＳＡ２１Ａ（三菱化成
社製）に変更した以外はすべて実施例３６と同様にして
行い、粒子充填チューブを得た。

【００８２】実施例３８ 用いたポリスチレン粒子を、アミノ基とイミノ基を含む
〔−ＣＨ₂ ＮＨ（ＣＨ ₂ ＣＨ₂ ＮＨ）n Ｈ（ｎ＝１〜
３）〕をもつ、Ｄｉａｉｏｎ ＷＡ２１（三菱化成社
製）に変更した以外はすべて実施例３６と同様にして行
い、粒子充填チューブを得た。

【００８３】実施例３９ 用いたポリスチレン粒子を、ニトリロ基を含む〔−（Ｃ
Ｈ₂ ）n Ｎ（ＣＨ₃ ） ₂ （ｎ＝１〜３）〕をもつ、Ｄｉ
ａｉｏｎ ＷＡ３０（三菱化成社製）に変更した以外は
すべて実施例３６と同様にして行い、粒子充填チューブ
を得た。

【００８４】（ポリメタクリル酸エステル誘導体による
産生誘導用材料） 実施例４０ ジメチルエタノールアミンで修飾されている、ポリメタ
クリル酸エステル系材料である、ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ
ＦＰ−ＱＡ１３（三菱化成社製）を５０ｍｌ用ポリプロ
ピレン試験管（岩城硝子社製）に、かさ体積で３ｍｌ入
れた。これにメタノール（和光純薬社製 液体クロマト
グラム用グレード）４０ｍｌを添加して、軽く攪拌し
た。静置後、上清を吸引して除去した。これを３回行っ
た後、同様にメタノール４０ｍｌを添加して、室温にて
一晩静置した。

【００８５】その後、メタノールを吸引して除き、同様
にメタノールを用いて２回洗浄した。これに、滅菌済み
蒸留水を４０ｍｌ添加して軽く攪拌した。５００ｒｐｍ
で１分間遠心し、上澄みを吸引して除き、同様に滅菌済
み蒸留水を用いて３回洗浄した。その後、滅菌済み蒸留
水４０ｍｌを加えて、室温にて３時間静置した。

【００８６】次に、同じ洗浄操作を３回行い、最後にで
きるだけ蒸留水を取り除いた。これに、注射用生理食塩
水（大塚製薬社製）を４０ｍｌ添加した軽く攪拌した。
５００ｒｐｍで１分間遠心し、上澄みを吸引して除き、
同様に注射用生理食塩水（大塚製薬社製）にて３回洗浄
を行い、最後に注射用生理食塩水４０ｍｌを加えて、一
晩室温にて静置した。しかる後、同じ洗浄装置を５回行
い、最後にできるだけ生理食塩水を取り除いた。

【００８７】注射用生理食塩水を充填して滅菌洗浄した
２ｍｌ用ポリプロピレンサンプルチューブ（eppendorf
社製）に、このポリメタクリル酸エステル系材料の粒子
をかさ体積で５００μｌ充填した。

【００８８】実施例４１ 用いたポリメタクリル酸エステル系材料を、ジエチルア
ミノ基をもつＳＥＰＡＢＥＡＤＳ ＦＰ−ＤＡ１３（三
菱化成社製）に変更した以外はすべて実施例４０と同様
にして行い、粒子充填チューブを得た。

【００８９】実施例４２ 用いたポリメタクリル酸エステル系材料を、末端にアミ
ノ基をもつＳＥＰＡＢＥＡＤＳ ＦＰ−ＨＡ１３（三菱
化成社製）に変更した以外はすべて実施例４０と同様に
して行い、粒子充填チューブを得た。

【００９０】実施例４３ 用いたポリメタクリル酸エステル系材料を、水酸基をも
つＳＥＰＡＢＥＡＤＳＦＰ−ＨＧ１３（三菱化成社製）
に変更した以外はすべて実施例４０と同様にして行い、
粒子充填チューブを得た。

【００９１】実施例４４ 用いたポリメタクリル酸エステル系材料を、疎水性基
〔−ＯＣ₆ Ｈ₅ 〕をもつＳＥＰＡＢＥＡＤＳ ＰＨ−１
３（三菱化成社製）に変更した以外はすべて実施例４０
と同様にして行い、粒子充填チューブを得た。

【００９２】比較例１ 注射用生理食塩水（大塚製薬社製）で洗浄した２ｍｌ用
ポリプロピレンサンプルチューブ（eppendorf 社製）。

【００９３】比較例２ 用いたポリスチレン粒子を、未修飾のポリスチレン粒子
であるテクポリマー：ＳＢ−１００Ｓ（積水化成品工業
社製）に変更した以外はすべて実施例３６と同様にして
行い、粒子充填チューブを得た。

【００９４】比較例３ 用いたポリスチレン粒子をスルホン酸基をもつスチレン
・ジビニルベンゼン共重合体である、Ｄｉａｉｏｎ Ｓ
Ｋ１Ｂ（三菱化成社製）に変更した以外はすべて実施例
３６と同様にして行い、粒子充填チューブを得た。

【００９５】比較例４ 用いたポリメタクリル酸エステル系材料を、カルボキシ
ル基をもつＳＥＰＡＢＥＡＤＳ ＦＰ−ＣＭ１３（三菱
化成社製）に変更した以外はすべて実施例４０と同様に
して行い、粒子充填チューブを得た。

【００９６】比較例５ ポリエチレンのビーズ（粒径２．５ｍｍ）を射出成形に
より作製した。このビーズをメタノールで洗浄後乾燥し
た。次に、このビーズを注射用生理食塩水（大塚製薬社
製）で洗浄後、同じく注射用生理食塩水で洗浄した２ｍ
ｌ用ポリプロピレンサンプルチューブ（eppendorf 社
製）に充填した。充填量はビーズ７０個とした。

【００９７】比較例６ ポリスチレンのビーズ（粒径２．５ｍｍ）を射出成形に
より作製した。このビーズをメタノールで洗浄後乾燥し
た。次に、このビーズを注射用生理食塩水（大塚製薬社
製）で洗浄後、同じく注射用生理食塩水で洗浄した２ｍ
ｌ用ポリプロピレンサンプルチューブ（eppendorf 社
製）に充填した。充填量はビーズ７０個とした。

【００９８】比較例７ ポリ塩化ビニルのビーズ（粒径２．５ｍｍ）を射出成形
により作製した。このビーズをメタノールで洗浄後乾燥
した。次に、このビーズを注射用生理食塩水（大塚製薬
社製）で洗浄後、同じく注射用生理食塩水で洗浄した２
ｍｌ用ポリプロピレンサンプルチューブ（eppendorf 社
製）に充填した。充填量はビーズ７０個とした。

【００９９】比較例８ ポリプロピレンのビーズ（粒径２．５ｍｍ）を射出成形
により作製した。このビーズをメタノールで洗浄後乾燥
した。次に、このビーズを注射用生理食塩水（大塚製薬
社製）で洗浄後、同じく注射用生理食塩水で洗浄した２
ｍｌ用ポリプロピレンサンプルチューブ（eppendorf 社
製）に充填した。充填量はビーズ７０個とした。

【０１００】比較例９ ポリテトラフルオロエチレンプロピレン共重合体のビー
ズ（粒径２．５ｍｍ）を射出成形により作製した。次に
このビーズをメタノールで洗浄後乾燥した。次に、この
ビーズを注射用生理食塩水（大塚製薬社製）で洗浄後、
同じく注射用生理食塩水で洗浄した２ｍｌ用ポリプロピ
レンサンプルチューブ（eppendorf 社製）に充填した。
充填量はビーズ７０個とした。

【０１０１】マトリックスメタロプロティナーゼの産生
誘導試験 実施例１〜４４及び比較例１〜９で得られた材料を用い
て、マトリックスメタロプロティナーゼの産生誘導試験
を行った。マトリックスメタロプロティナーゼの産生誘
導試験とその測定方法は以下のように行った。 （１）マトリックスメタロプロティナーゼ産生誘導試験 実施例１〜４４及び比較例１〜９で得られた各チューブ
にヘパリン採血した健常人新鮮血１．６ｍ１を加えて回
転円盤に取り付けて、３７℃にて２時間、回転数２６ｒ
ｐｍで転倒混和した。しかる後、血液を回収し、以下の
方法で血漿中のマトリックスメタロプロティナーゼの濃
度を測定した。

【０１０２】（２）血漿中マトリックスメタロプロティ
ナーゼ濃度測定方法 マトリックスメタロプロティナーゼ産生誘導試験後の血
液を遠心分離して血漿を採取し、この血漿をサンプルと
して、血漿中のマトリックスメタロプロティナーゼの濃
度を次のようにして測定した。

【０１０３】マトリックスメタロプロティナーゼ（９２
ＫＤａゼラチナーゼ）（ＭＭＰ−９）標準品の調整 ヒトＭＭＰ−９標準品は、U.Bergmann等の方法（「Enzy
me Linked Immunosorbent Assay (ELISA) for the Quan
titative Determination of Human LeukocyteCollagena
se and Gelatinase」J.Clinical.Chem.Clin.Biochem.Vo
l.27,1989,pp351-359）に従って、ヒト血液のバッフィ
コートから調製した。

【０１０４】上記標準品を使用して、マトリックスメタ
ロプロティナーゼの測定を以下のようにして行った。
０．２ｇ／ｌ ＮａＮ₃ 、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ９．６）に、調製したＭＭＰ−９標準品を０．
２μｇ／ｍｌになるように溶解し、９６穴マイクロタイ
タープレート（Ｎｕｎｃ社製）に２００μｌ／ｗｅｌｌ
になるように分注し、１２時間、４℃に静置した。過剰
のＭＭＰ−９標準品を吸引除去し、０．１５Ｍ塩化ナト
リウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．２Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、洗浄液という）
で２回吸引洗浄した。

【０１０５】次に、ＭＭＰ−９標準品を２％牛血清アル
ブミンを溶解した洗浄液（以下、希釈液という）で段階
希釈し０〜１０００ｎｇ／ｍｌの希釈系列を作製し、各
々に抗ヒトＭＭＰ−９モノクローナル抗体（富士薬品工
業社製）を２０ｎｇ／ｍｌになるように添加した。ま
た、各測定サンプル（血漿）は、ＭＭＰ−９標準品と同
様に段階希釈し、各々に抗ヒトＭＭＰ−９モノクローナ
ル抗体（富士薬品工業社製）を２０ｎｇ／ｍｌになるよ
うに添加した。

【０１０６】この抗原抗体混合液を２時間、２５℃で攪
拌後、前記のマイクロプレートの各穴に１００μｌ／ｗ
ｅｌｌ分注し、２時間、２５℃で静置した。次に、プレ
ートを洗浄液で４回吸引洗浄し、西洋わさびペルオキシ
ダーゼで標識した抗ヒトＩｇＧヤギ抗体（生化学工業社
製）を希釈液で２０００倍に希釈した液を１００μｌ／
ｗｅｌｌ分注し、１時間、２５℃で静置した。

【０１０７】次に、プレートを洗浄液で５回吸引洗浄
し、基質反応液〔０．５ｇ／ｌ ２，２’−ａｚｉｎｏ
−ｂｉｓ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎ
ｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＡＢＴＳ）、１．
３ｍＭ Ｈ₂ Ｏ₂ 、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１
Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）〕を２００μｌ／ｗｅ
ｌｌ分注し、１時間、２５℃に静置後、ＯＤ４０５ｎｍ
の吸光度をＳＪ ｅｉａ ＡＵＴＯＲＥＡＤＥＲ（三光
純薬社製）にて測定し、標準曲線からサンプル中のＭＭ
Ｐ−９の濃度を算出した。

【０１０８】また、採血直後の血液を遠心分離して血漿
を採取して、血漿中のマトリックスメタロプロティナー
ゼの濃度を同様にして測定した。採血直後の血液の血漿
中マトリックスメタロプロティナーゼ濃度は何れも１０
０ｎｇ／ｍｌ以下であった。各実施例及び比較例のマト
リックスメタロプロティナーゼの産生誘導試験の結果を
表１及び２に示した。

【０１０９】

【表１】

【０１１０】

【表２】

【０１１１】実施例１〜４４及び比較例１〜９の結果か
ら以下のことが分かる。採血直後の血漿中のマトリック
スメタロプロティナーゼの濃度は１００ｎｇ／ｍｌ以下
であり、注射用生理食塩水で洗浄した２ｍｌ用チューブ
に血液を充填しただけのもの（比較例１）も、血漿中の
マトリックスメタロプロティナーゼの濃度は１００ｎｇ
／ｍｌ以下であった。表１及び２の結果から、分子中に
水酸基、アミド骨格及びエステル骨格からなる群より選
ばれる少なくとも１つの化学構造を有する水不溶性高分
子材料又はカチオン性官能基を有する水不溶性高分子材
料は、血液との接触によって特に高いＭＭＰ−９の産生
を誘導することが明らかである。未修飾のポリスチレ
ン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニルなどの疎水性高分子
材料やアニオン性官能基だけを有する高分子材料では、
マトリックスメタロプロティナーゼの産生は低かった。

【０１１２】（薬剤を投与したマウス血液でのミエロペ
ルオキシダーゼ産生誘導能の測定） 実施例４５ 生理食塩水（大塚製薬社製）にデキサメタゾン（和光純
薬社製）を０．０４ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した。
また、生理食塩水（大塚製薬社製）にデキサメタゾン
（和光純薬社製）を０．４ｍｇ／ｍｌとなるように懸濁
した。１週間の順化飼育の後、ＩＣＲマウス（日本ＳＬ
Ｃ社、雄性、９週齢）に、上記デキサメタゾン０．０４
ｍｇ／ｍｌ液を０．２ｍｇ／ｋｇずつ３日間、腹腔内投
与した。また、他の群のＩＣＲマウス（日本ＳＬＣ社、
雄性、９週齢）に、上記デキサメタゾン０．４ｍｇ／ｍ
ｌ液を２．０ｍｇ／ｋｇずつ３日間、腹腔内投与した。
対照としては、生理食塩水を投与した。最終投与後、１
時間後に、各々の投与群のマウスから血液を心搾針によ
り、１．５ｍｌずつヘパリン採血した（最終ヘパリン濃
度８ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）。採血した血液は各々、群ごと
に集めた。

【０１１３】次に、滅菌した生理食塩水にて洗浄した、
キトサンのアミノ基に直鎖アルキル基を介して１級アミ
ンが導入されたキトサン誘導体であるＣｈｉｔｏｐｅａ
ｒｌＢＣＷ−３０１０（富士紡績社製、商品名）を、２
４穴マイクロプレート（ベクトンディッキンソン社製）
の各穴に、０．１ｇ（湿重量）／穴になるように入れ
た。次に、このプレートの各穴に、採血した各群のマウ
ス血液を０．５ｍｌずつ添加し、２時間、３７℃で振と
う培養した。反応後の血液を遠心分離して血漿を採取
し、血漿中のミエロペルオキシダーゼの濃度をＤＡ−６
７〔和光純薬社製、商品名、１０−（Ｃａｒｂｏｘｙｍ
ｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ）−３，７−ｂ
ｉｓ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−ｐｈｅｎｏｔｈ
ｉａｚｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ〕を基質に用い
て、比色定量法にて測定した。その結果を図１に示し
た。

【０１１４】比較例１０ 実施例４５と同様の方法で、各群のマウスから採血し、
ＣｈｉｔｏｐｅａｒｌＢＣＷ−３０１０（富士紡績社
製、商品名）を入れていない、プレートの空の穴に、
０．５ｍｌずつ添加し、２時間、３７℃で振とう培養し
た。反応後の血液を遠心分離して血漿を採取し、血漿中
のミエロペルオキシダーゼの濃度をＤＡ−６７（和光純
薬社製、商品名）を基質に用いて、比色定量法にて測定
した。その結果を図１に示した。

【０１１５】図１に示した結果から明らかなように、生
理食塩水投与群に比較してデキサメタゾン投与群は、優
位にミエロペルオキシダーゼ誘導能が低下していた。す
なわち、本来免疫抑制剤であるデキサメタゾンでは、ミ
エロペルオキシダーゼの産生は抑制されていた。

【０１１６】

【発明の効果】本発明の生体反応検査方法の構成は上記
の通りであり、本発明の方法により、検査される者自身
の血液からのマトリックスメタロプロティナーゼ又はミ
エロペルオキシダーゼ産生誘導量を簡便に測定すること
ができ、それにより、検査される者の免疫、炎症に関係
する生体反応を検出することが可能になり、種々の疾患
の予防や各種疾患における病態の把握、治療のための薬
剤投与量や治療方法の決定に役立つ。

【図面の簡単な説明】

【図１】薬剤を投与したマウス血液でのミエロペルオキ
シダーゼ産生誘導能の測定結果を示す図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 分子中に水酸基、アミド骨格及びエステ
   ル骨格からなる群より選ばれる少なくとも１つの化学構
   造を有する水不溶性高分子材料又はカチオン性官能基を
   有する水不溶性高分子材料と血液とを接触させることに
   より、マトリックスメタロプロティナーゼの産生を誘導
   させ、該マトリックスメタロプロティナーゼの産生量を
   測定することを特徴とする生体反応検査方法。
2. 【請求項２】 分子中に水酸基、アミド骨格及びエステ
   ル骨格からなる群より選ばれる少なくとも１つの化学構
   造を有する水不溶性高分子材料又はカチオン性官能基を
   有する水不溶性高分子材料と血液とを接触させることに
   より、ミエロペルオキシダーゼの産生を誘導させ、該ミ
   エロペルオキシダーゼの産生量を測定することを特徴と
   する生体反応検査方法。