CN111812014B - 一种基于纳米材料的血小板抗体检测方法和血小板保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于纳米材料的血小板抗体检测方法和血小板保存方法。本发明首次将血小板膜蛋白包裹PLGA制备的纳米级复合颗粒应用于血小板抗体检测，证实其以人来源的含抗血小板抗体的血清为检测对象，可准确检出血小板抗体，具有较好的灵敏度。本发明有助于提高临床诊断血小板免疫异常性疾病，为患者提供相配合性的血小板，改善血小板临床输注效果，提高临床输血质量，同时为社会节约宝贵的血液资源。

Description

一种基于纳米材料的血小板抗体检测方法和血小板保存方法

技术领域

本发明涉及输血医学技术领域，具体地说，涉及一种基于纳米材料的血小板抗体检测方法和血小板保存方法。

背景技术

血小板是人类血液中最小的细胞成分，主要功能是通过启动凝血级联反应来止血。血小板计数已作为临床评估出血风险的重要指标，其正常值为100-300*10⁹/L。当血小板计数低于正常值时，称之为血小板数量减少，归因于血小板数目的减少或血小板破坏的增加。近年来，随着输血医学的发展，成分输血不断推广使用，输注血小板已成为临床输血治疗的重要手段之一。但随着血小板的大量使用，血小板输注无效成为临床输血最为棘手的问题，感染、发烧、脾大等非免疫因素和血小板抗体等免疫因素都可以引起血小板输注无效、输注后紫癜、新生儿同种免疫性血小板减少症。一旦某抗原阴性者受到外界免疫刺激产生相应的同种抗体时，临床上难以辨别，实验室不能立即检测出来，患者持续接受不配合的输血免疫，将产生严重的输血反应。引起血小板输注无效的同种免疫因素包括HLA抗体和HPA抗体。HPA-1a抗原是最先发现也是血小板表面数量最多的抗原，其相应抗体也是引起新生儿同种免疫性血小板减少症的主要抗体之一。

目前已知的血小板抗体检测方法包括：1)淋巴细胞毒实验(LCT)，仅能检测补体结合的抗HLA抗体，不能检测抗HPA抗体和非补体结合的抗HLA抗体；2)血小板单克隆特异性抗体固定试验(MAIPA)，该方法易出现假阳性、耗时长，血小板破碎降低HPA的抗原性，造成抗HPA抗体漏检；3)简易致敏红细胞血小板血清学试验(SEPSA)，该方法耗时较长，灵敏度不够，试剂有效期短；4)酶联免疫吸附试验(ELISA)，破碎的血小板导致抗体检出率低；5)单克隆抗体固相血小板抗体实验(MASPAT)，易出现假阳性；6)表面等离子共振技术(SPR)，仅能采用纯化的IgG抗体用于检测，对抗原的纯度和稳定性要求较高；7)Capture-P，检测成本高。

细胞膜因其固有的生物相容性，可作为体内植入材料和生物材料表面的改性剂。细胞膜材料主要分为两大类，一类是仿生细胞膜的材料如磷酸胆碱基团，一类则直接提取细胞膜本身的天然生物材料。后者较前者而言，具有更好的生物相容性。生物材料的生物相容性主要包括血液相容性和组织相容性。当生物材料植入宿主体内后不会产生免疫排斥反应。随着生命医学的发展，细胞膜包被的生物材料已广泛应用于各领域，包括药物传递、疫苗接种等。近来已有学者将血小板膜蛋白成功的包裹于PLGA表面，制备成纳米级的复合颗粒。也有学者将血小板膜包被于壳寡糖CS修饰后载蟾毒灵Bufalin的PLGA表面，并用于药物传递，例如专利文献CN109432048A公开了一种血小板膜包裹载药多孔纳米颗粒及其制备方法，该纳米颗粒是通过壳寡糖CS修饰PLGA后载蟾毒灵Bufalin，然后被血小板膜包裹得到；制备方法包括：壳寡糖修饰的PLGA制备，CS-pPLGA/Bu NPs制备，血小板膜碎片制备，PLTM-CS-pPLGA/Bu NPs制备；制备的血小板膜仿生包衣的多孔纳米颗粒有望实现优异的生物相容性、低免疫原性和对癌细胞的主动靶向性，可以将化疗药物主动靶向输送至肿瘤细胞，提高治疗效果。但未见将其用于血清中血小板抗体检测的研究。

鉴于此，本研究采用生物材料与血小板膜蛋白相结合的方式，首先解决血小板抗原保存期短的问题，并深入探索其在检测人源血清抗体方面的应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种基于纳米材料的血小板抗体检测方法。

本发明的另一目的是提供一种血小板保存方法。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案为：

一种基于纳米材料的血小板抗体检测方法，包括以下步骤：

a)制备PLGA微球颗粒；

b)制备受试血小板样品的血小板膜囊泡；

c)将所述血小板膜囊泡与所述PLGA微球颗粒混合，超声，得到血小板膜蛋白包裹于PLGA微球颗粒表面的纳米级的复合微球；

d)将受试血清或血浆与所述复合微球孵育，洗涤后，再与荧光素标记的二抗避光孵育，洗涤，重悬，流式细胞仪上机检测；以不含血小板抗体的血浆或血清为阴性对照；

e)Cut off值设定为：阴性对照荧光平均值+2个标准差；若受试血清或血浆组荧光值大于等于Cut off值时，表明所述受试血清或血浆含有针对所述血小板样品的抗体；反之，亦然。

作为本发明的一个优选例，步骤a)中，所述PLGA微球颗粒其制备方法为：将PLGA溶解于丙酮，混匀，配制成工作液；将所述工作液滴加到匀速转动的超纯水或去离子水中，待丙酮完全挥发，离心，收集沉淀，去离子水重悬，即得。

作为本发明的另一优选例，步骤b)中，所述血小板膜囊泡其制备方法为：将所述受试血小板样品用洗涤液洗涤后，超纯水重悬，-80℃冻存，室温溶解、洗涤、重悬，如此反复2-4次，再超声处理，即得。

更优选地，制备所述血小板膜囊泡的超声处理的参数为：20W，100Hz，超声1分钟。

作为本发明的另一优选例，步骤c)中，将所述血小板膜囊泡与所述PLGA微球颗粒按照1:1的质量比混合。

作为本发明的另一优选例，步骤c)中，制备所述复合微球的超声处理的参数为：40W，100Hz，水浴超声2分钟。

作为本发明的另一优选例，步骤d)中，所述荧光素标记的二抗是所述受试血清或血浆的二抗。

作为本发明的另一优选例，步骤d)中，所述荧光素标记的二抗是用APC,FITC,PE,PEcy5或PEcy5.5标记的二抗。

作为本发明的另一优选例，所述受试血小板样品其血小板抗原是已知的或未知的，所述受试血清或血浆其血小板抗体是已知的或未知的。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案为：

一种血小板保存方法，将采集的血小板按以下方法制备成为复合微球再低温保存：

a)制备PLGA微球颗粒；

b)制备受试血小板样品的血小板膜囊泡；

c)将所述血小板膜囊泡与所述PLGA微球颗粒混合，超声，得到血小板膜蛋白包裹于PLGA微球颗粒表面的纳米级的复合微球；

低温保存的复合微球进一步用于血小板抗体检测。

本发明优点在于：

血小板是小而无核的双凹盘状细胞，是构成人体血液的重要组成成分，在参与血液凝固过程、维持毛细血管的稳定性、器官移植排斥、炎症等生理及病理过程中扮演着重要的角色。正常情况下血小板保存期仅为5-7天，而血小板的抗体检测依赖于血小板抗原，为血小板抗体的检测增加了难度。本研究主要通过物理化学手段，制备仿生血小板，解决了因储存时间造成的抗体难以检测的问题。在此基础上，基于该微粒检测人源血清中HPA1a抗体，建立微球包裹的血小板膜蛋白检测血小板抗体的方法，证实了其可行性。本发明优点还体现在以下几方面：

1、本发明将有助于提高临床诊断血小板免疫异常性疾病，为患者提供相配合性的血小板，改善血小板临床输注效果，提高临床输血质量，同时为社会节约宝贵的血液资源。

2、虽然现代科学技术手段不断进步，血小板抗体的检测仍需要血小板表面的抗原，而血小板保存期有限为血小板抗体的检测带来难度，尤其针对稀有血型的血小板抗体的检测，本发明的方法很好地解决了该难题。

3、相比于其他检测方法，本发明的检测方法运用流式细胞术，技术耗时短，可有效缩短抗体的检测时间；成本低，可有效减轻患者经济负担。

4、一直以来，由于血小板体积小、易活化等因素，使其不能像红细胞一样通过肉眼检测。本发明为血小板抗原谱的建立提供了基础。

5、本发明检测的对象是人来源的含抗血小板抗体的标准血清，易于获取和操作。

附图说明

附图1是复合微球PNP相关参数表征。PLGA表示裸露纳米微球，PLT-V表示血小板囊泡，PLT为血小板简写，PNP表示复合微球。

附图2是PNP检测含HPA-1a血清抗体灵敏度。

具体实施方式

下面对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

本发明主要使用聚乳酸羟基乙酸聚合物(PLGA)，它是一种由乳酸和羟基乙酸合成的，可降解的功能有机高分子材料，具有良好的生物相容性、物理和化学性能，其强度、机械性能和降解速率等均能通过共聚体的组成配比及分子量进行调节，同时已被FDA认证可作为药用辅料，因此PLGA可作为理想的生物材料，广泛的应用于生物医学领域。

1实验材料与仪器

PLGA粉末(购自sigma)；机采血小板洗涤后重悬；AB浆(已与多个随机血小板反应，抗体皆为阴性)；BCA快速检测试剂盒(购自thermo)；血小板保存液(ACD)作为洗涤液；去离子水；抗HPA1a抗体标准血清(NIBSC)；丙酮(购自国药)；-80℃冰箱，超声仪，磁力搅拌器，磁力搅拌转子，250ml玻璃量杯，通风橱，5ml针孔注射器，低温冻干机，水浴超声(LAB)，流式细胞仪亚微米粒径参考试剂盒(Thermo)，流式细胞仪(BD公司)。

2实验步骤

1)称取一定重量的PLGA，溶解于丙酮中，上下颠倒，混匀，配制成5mg/ml的工作液；

2)取玻璃量杯，往其中加入超纯水和转子；

3)将量杯置于磁力搅拌器表面，转速调至800转/分钟，使其匀速转动，并形成漩涡；

4)使用针孔注射器吸取工作液，滴加至超纯水中；

5)通风柜中搅拌直至丙酮完全挥发，离心，收集沉淀，超纯水重悬，4℃保存；

6)取单采血O型HPA1a阳性血小板，洗涤液洗2遍后，超纯水重悬至浓度为10⁵血小板/μl，-80℃冻存，室温溶解、洗涤，如此反复3次，20W，100Hz，超声1分钟，得血小板膜囊泡；

7)BCA试剂盒检测血小板膜蛋白浓度；

8)膜蛋白囊泡与PLGA微球颗粒以质量比1:1混合制备复合微球PNP，40W，100Hz水浴超声2分钟；

9)复合微球PNP相关参数表征：用纳米粒度电位仪测定复合微球PNP粒径；通过蛋白印迹实验检测复合微球PNP的CD61蛋白含量，并以正常血小板及血小板囊泡样本为对照。

10)将PNP与等比稀释的HPA1a抗体标准血清孵育1小时，以AB血浆为阴性对照，并作为稀释液对血清抗体进行稀释，以购买标准已知粒径大小微球，为阳性对照并圈门，1×PBS洗涤3遍，与APC标记的羊抗人二抗避光室温孵育0.5小时，1×PBS洗涤2遍，重悬后，转移至流式管中，流式细胞仪上机检测；

Cut off值为：阴性荧光平均值+2个标准差。若样本相对荧光值大于等于Cut off值时，表明该受试血清含有血小板抗体；反之，亦然。

3实验结果

3.1复合微球PNP相关参数表征

实验表明，所述微球PNP的粒径介于裸露PLGA和蛋白囊泡之间，且蛋白印迹实验显示，复合微球组CD61蛋白含量与血小板膜囊泡组含量接近，间接表明膜蛋白负载于微球表面。

3.2复合微球PNP检测人源血清抗体的灵敏度

实验表明，使用所述复合微球PNP检测人源血清抗体具有较好的灵敏度，能检出浓度最低为约6IU的抗HPA1a抗体标准血清。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种基于纳米材料的血小板抗体检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)制备PLGA微球颗粒；

b)制备受试血小板样品的血小板膜囊泡；

c)将所述血小板膜囊泡与所述PLGA微球颗粒混合，超声，得到血小板膜蛋白包裹于PLGA微球颗粒表面的纳米级的复合微球；

d)将受试血清或血浆与所述复合微球孵育，洗涤后，再与荧光素标记的二抗避光孵育，洗涤，重悬，流式细胞仪上机检测；以不含血小板抗体的血浆或血清为阴性对照；

e)Cut off值设定为：阴性对照荧光平均值+2个标准差；若受试血清或血浆组荧光值大于等于Cut off值时，表明所述受试血清或血浆含有针对所述血小板样品的抗体；反之，亦然。

2.根据权利要求1所述的血小板抗体检测方法，其特征在于，步骤a)中，所述PLGA微球颗粒其制备方法为：将PLGA溶解于丙酮，混匀，配制成工作液；将所述工作液滴加到匀速转动的超纯水或去离子水中，待丙酮完全挥发，离心，收集沉淀，去离子水重悬，即得。

3.根据权利要求1所述的血小板抗体检测方法，其特征在于，步骤b)中，所述血小板膜囊泡其制备方法为：将所述受试血小板样品用洗涤液洗涤后，超纯水重悬，-80℃冻存，室温溶解、洗涤、重悬，如此反复2-4次，再超声处理即得，所述超声处理的参数为：20W，100Hz，超声1分钟。

4.根据权利要求1所述的血小板抗体检测方法，其特征在于，步骤c)中，制备所述复合微球的超声处理的参数为：40W，100Hz，水浴超声2分钟。

5.根据权利要求1所述的血小板抗体检测方法，其特征在于，步骤d)中，所述荧光素标记的二抗是所述受试血清或血浆的二抗。

6.根据权利要求1所述的血小板抗体检测方法，其特征在于，步骤d)中，所述荧光素标记的二抗是用APC,FITC,PE,PEcy5或PEcy5.5标记的二抗。

7.一种血小板保存方法，其特征在于，将采集的血小板按以下方法制备成为复合微球再低温保存：

a)制备PLGA微球颗粒；

b)制备受试血小板样品的血小板膜囊泡；

c)将所述血小板膜囊泡与所述PLGA微球颗粒混合，超声，得到血小板膜蛋白包裹于PLGA微球颗粒表面的纳米级的复合微球；

低温保存的复合微球进一步用于血小板抗体检测。

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