JP3569588B2

JP3569588B2 - 尿路感染症の診断用キット

Info

Publication number: JP3569588B2
Application number: JP02180196A
Authority: JP
Inventors: 壱夫内田
Original assignee: 株式会社いかがく
Priority date: 1996-01-12
Filing date: 1996-01-12
Publication date: 2004-09-22
Anticipated expiration: 2016-01-12
Also published as: JPH09196919A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、尿路感染症の診断用キットに関し、特に尿中のミエロペルオキシダーゼと癌胎児性抗原（ＣＥＡ）または、分泌型ＩｇＡを測定することにより尿路感染症を診断するキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
尿路感染症は尿路臓器に炎症をひきおこす細菌感染症であり、臨床の場で高頻度にみられる感染症の一つである。尿路感染症の診断は、原因となった細菌を尿中から検出することが必須であり、特に原因菌の細菌数を定量培養法により測定することが有効とされ、広く普及している。また、従来から、尿路感染症の補助診断として尿沈渣中の白血球数の観察や、白血球由来のエステラーゼ活性を測定する方法、および尿中に存在する細菌に関係が深い亜硝酸還元能テストも迅速スクリーニング検査法として用いられている。さらに、尿の顕微鏡による検査方法として、血球計算盤を用いての尿沈渣や非遠心尿中の細菌数や白血球数を定量的に測定する方法がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述の各種方法について種々の問題点が指摘されている。たとえば、尿中の細菌を定量培養する方法は、正確な細菌数を得ることができる点で優れているが、通常少なくとも一晩以上の培養時間を要し、迅速性に劣る。また、尿路感染症の補助診断としての尿沈渣中の白血球数の観察や白血球由来のエステラーゼ活性測定についても、前者は尿中の白血球が自己のライソゾーム酵素による自己融解や、活性酸素により容易に崩壊するために、後者は尿中の常在成分であるトリプシンインヒビターにより阻害を受けるために満足な成績が得られない。さらに、血球計算盤を用いて尿沈渣や非遠心尿中の細菌数や白血球数を定量的に算定する方法は、処理能力の低さや面倒な手順のために普及するには至っていない。最近、１スライド中で１０検体測定可能なディスポーザブルの計算盤を用いる方法が提案されているが、やはり同様の問題点を有する。このように、従来から尿路感染症の診断に利用されてきた検査法は、診断精度や手技に難点があった。
この発明は、これらの問題点に着目してなされたものであって、上述の従来の測定対象に代わる新規な成分を測定することによって、尿路感染症の診断キットを提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上述の目的を達成するために、本発明では、尿中のペルオキシダーゼと、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）または分泌型ＩｇＡとを測定対象にしている。
なお、尿中のミエロペルオキシダーゼと癌胎児性抗原（ＣＥＡ）または分泌型ＩｇＡを検出するには、酵素免疫法、ラテックス凝集反応、発光酵素免疫法や免疫クロマト法など、日常多用されている免疫学的測定法を用いることができる。
ミエロペルオキシダーゼは尿路感染症時に尿中に出現する白血球（主に好中球）の顆粒内成分で、本発明者は尿中ミエロペルオキシダーゼ濃度が白血球数を正確に反映することを発見した。また、尿路感染症の原因菌（Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ，Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ，Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｓ．ａｕｒｅｕｓ，Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ，Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓなど）すべての感染時に、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）および分泌型ＩｇＡが生体防御のために相関性をもって尿中に出現することを発見した。すなわち、図１に示すごとく例えば、健常者（非感染者）群と尿路感染症群の尿中の癌胎児性抗原（ＣＥＡ），分泌型ＩｇＡ、ミエロペルオキシダーゼ濃度を比較すると、いずれの成分も尿路感染症群が有意に高値であり、また、図２のごとく代表的な原因菌であるＥ．ｃｏｌｉ，Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ，Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ感染時の尿中の癌胎児性抗原および分泌型ＩｇＡの濃度は、感染菌種によって有意差を示さず、いずれの細菌感染時にも増加した。さらに、癌胎児性抗原と分泌型ＩｇＡは相関性をもって尿中に出現することをみとめた（図３）。また、尿路感染症例での経過観察で、ミエロペルオキシダーゼと癌胎児性抗原または分泌型ＩｇＡ濃度の推移は後二者では一致するが、尿路感染症の治癒期には白血球（ミエロペルオキシダーゼ）が先行して正常化し（図４）、尿路感染症の発症時には白血球が癌胎児性抗原（ＣＥＡ）や分泌型ＩｇＡに先行して出現するので、尿路感染症の診断には尿中のミエロペルオキシダーゼと癌胎児性抗原または分泌型ＩｇＡを組み合わせ測定することにより、感度、特異度の向上が図れる。これら二組の検査はいずれも、免疫クロマト法への適応が可能であり、迅速、簡便性にすぐれた尿路感染症の診断法となりうる。
【０００５】
【実施例】
実施例として酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ）による測定対象３成分の測定法を示す。
１．ミエロペルオキシダーゼの測定
〔マイクロプレートへの抗体の固相化〕
マイクロプレート（ＳＵＭＩＬＯＮ，Ｊａｐａｎ）の各ｗｅｌｌに、抗ヒトミエロペルオキシダーゼ抗体（ＤＡＫＯＰＡＴＴＳ，Ｄｅｎｍａｒｋ）５μｇ／ｍｌを含む０．１ＭＴｒｉｓ緩衝液を１００μｌずつ分注し、一夜４℃で放置して抗体を吸着させる。
〔酵素標識抗体の調製〕
別途、過ヨウ素酸法により、アルカリホスファターゼ（Ｂｅｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を抗ヒトミエロペルオキシダーゼ抗体に酵素標識して調製する。
〔尿中ミエロペルオキシダーゼの測定〕
各ｗｅｌｌに１００μｌの１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むＴｒｉｓ緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ８．０）を分注し、次いで５０μｌの尿試料を加え混和した後、３７℃で１時間反応させる。
次に、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％含む脱イオン水で３回洗浄する。その後、アルカリホスファターゼ標識抗ヒトミエロペルオキシダーゼ抗体溶液（１％ＢＳＡを含むＴｒｉｓ緩衝液）を各ｗｅｌｌに１００μｌずつ加え混和した後、３７℃で１時間反応させ、先と同様に３回洗浄する。
さらにＫｉｎｄ−Ｋｉｎｇ法の基質緩衝液（Ｄｉｓｏｄｉｕｍｐｈｅｎｙｌ−ｐｈｏｓｈａｔｅ０．２１５ｇと４−ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ０．０９ｇを炭酸緩衝液：０．０５Ｍ，ｐＨ１０．１５，１００ｍｌに溶解したもの）１００μｌを各ｗｅｌｌに加え、３７℃で３０分間反応させる。次いで、１００μｌの呈色液（２００ｍｌの脱イオン水に２．６ｇのホウ酸を溶解させた後、０．３８ｇのＰｏｔａｓｓｉｕｍｆｅｒｒｉｃｙａｎｉｄｅを溶解させたもの）を各ｗｅｌｌに加えて呈色させる。次に、マイクロプレート用比色計を用いて５１０／６３０ｎｍの波長で比色し、検量線から尿中のミエロペルオキシダーゼ濃度を算出する。
【０００６】
２．癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の測定
〔マイクロプレートへの抗体の固相化〕
先述のマイクロプレートの各ｗｅｌｌに、抗ヒト癌胎児性抗原抗体（モノクローン抗体でＣＥＡ以外にＮＣＡと僅かに反応する：特殊免疫研究所）５μｌ／ｍｌを含む０．１ＭＴｒｉｓ緩衝液を１００μｌずつ分注し、一夜４℃で放置して抗体を吸着させる。
〔尿中の癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の測定〕
各ｗｅｌｌに１００μｌの１％ＢＳＡを含むＴｒｉｓ緩衝液を分注し、次いで５０μｌの尿試料を加え混和した後、３７℃で１時間反応させる。
次に、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％含む脱イオン水で３回洗浄する。その後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＣＥＡ抗体（モノクローナル抗体でＣＥＡおよびＮＣＡ−２とは反応するが、ＮＣＡとは全く反応しない：特殊免疫研究所）溶液（１％ＢＳＡを含むＴｒｉｓ緩衝液）を各ｗｅｌｌに１００μｌずつ加え混和した後、３７℃で１時間反応させ、先と同様に３回洗浄する。次いで、呈色液（ＴＭＢＺ溶液と過酸化水素を混和したもの）を各ｗｅｌｌに１００μｌずつ加えて、室温に１５分放置後、反応停止液（２．６ｇ／ｄｌＮａＦ溶液）を各ｗｅｌｌに５０μｌずつ加える。
マイクロプレート用比色計を用いて６３０／４９２ｎｍの波長で比色し、検量線から尿中のＣＥＡ濃度を算出する。
【０００７】
３．分泌型ＩｇＡの測定
〔マイクロプレートへの抗体の固相化〕
マイクロプレートの各ｗｅｌｌに抗ヒトＳＣ抗体（ＤＡＫＯＰＡＴＴＳ，Ｄｅｎｍａｒｋ）５μｌ／ｍｌを含む０．１ＭＴｒｉｓ緩衝液を１００μｌずつ分注し、一夜４℃で放置して抗体を吸着させる。
〔尿中の分泌型ＩｇＡの測定〕
各ｗｅｌｌに１００μｌの１％ＢＳＡを含むＴｒｉｓ緩衝液を分注し、次いで、生理食塩水で１０倍希釈した尿試料５０μｌを加え、混和した後３７℃で１時間反応させる。次に、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％含む脱イオン水で３回洗浄する。その後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＡ抗体溶液（１％ＢＳＡを含むＴｒｉｓ緩衝液）を各ｗｅｌｌに１００μｌずつ加え混和した後、３７℃で１時間反応させ、先と同様に３回洗浄する。次いで、呈色液（ＴＭＢＺ溶液と過酸化水素を混和したもの）を各ｗｅｌｌに１００μｌずつ加えて室温に１５分放置後、反応停止液（２．６ｇ／ｄｌＮａＦ溶液）を各ｗｅｌｌに５０μｌずつ加える。
マイクロプレート用比色計を用いて６３０／４９２ｎｍの波長で比色し、検量線から尿中の分泌型ＩｇＡ濃度を算出する。
【０００８】
４．尿路感染症診断の方法
Ａ．ミエロペルオキシダーゼと癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を測定し、組み合わせ利用する方法：被検者の尿中ミエロペルオキシダーゼ濃度および癌胎児性抗原（ＣＥＡ）濃度のいずれか一方が、健常者（非感染者）群から求めた、尿中ミエロペルオキシダーゼのカットオフ値（例えば９５ｎｇ／ｍｌ）および癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のカットオフ値（例えば８ｎｇ／ｍｌ）以上であれば、尿路感染症の疑いがあるとする。
Ｂ．ミエロペルオキシダーゼと分泌型ＩｇＡを測定し、組み合わせ利用する方法：被検者の尿中ミエロペルオキシダーゼ濃度および分泌型ＩｇＡ濃度のいずれか一方が、健常者（非感染者）群から求めた、尿中ミエロペルオキシダーゼのカットオフ値（例えば９５ｎｇ／ｍｌ）および分泌型ＩｇＡのカットオフ値（例えば１３００ｎｇ／ｍｌ）以上であれば、尿路感染症の疑いがあるとする。
【０００９】
【発明の効果】
以上説明したように、尿中のミエロペルオキシダーゼと癌胎児性抗原（ＣＥＡ）または分泌型ＩｇＡを測定し、いずれか一方を組み合わせ利用することにより、尿路感染症を診断することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】細菌尿群およびコントロール群尿中のＣＥＡ，ＳＩｇＡ，ＭＰＯ濃度の比較を示す図面である。
【図２】細菌（菌種別）尿中のＣＥＡおよびＳＩｇＡの濃度を示す図面である。
【図３】細菌尿におけるＣＥＡとＳＩｇＡの相関を示す図面である。
【図４】尿路感染症例におけるＣＥＡ，ＳＩｇＡ，ＭＰＯ，Ｈｂの推移を示す図面である。

Claims

尿中のミエロペルオキシダーゼと、癌胎児性抗原(CEA)または分泌型IgAとを測定対象にすることを特徴とする、尿路感染症の経過状態の診断用キット。
免疫学的測定法を用いることを特徴とする請求項１に記載の診断用キット。