JP6613241B2 - Ｍｍｐ−８活性化物質及び同物質の判定並びに使用 - Google Patents

Description

本発明は、診断法分野全般に係る。本発明は、特に、ＭＭＰ−８活性化物質、好ましくはＭＭＰ−８中間部分活性化物質と、被験者から得られた生体試料におけるＭＭＰ−８活性、ＭＭＰ−８活性化物質、又は活性型ＭＭＰ−８フラグメントの検出と、疾患又は疾患進行の素因又はリスクの判定とに係る。本発明はまた、活性型ＭＭＰ−８のレベル異常又は上昇に関連の疾患の診断におけるＭＭＰ−８活性化物質の使用に係る。

歯周病は、ヒトの歯における主要な問題である。実際、虫歯よりも歯周病によって失われる歯の方が多い。そこで信頼度の高い歯周病診断テストのニーズが高い。特に、早期の歯肉炎ステージであっても、疾患発症の早期ステージでの診断、すなわち明らかな破壊兆候が発生する前の組織破壊が開始する初期ステージでの診断のニーズがある。

歯周病は、歯肉（歯茎）及び歯を支える歯槽骨構造に影響する感染症に由来した炎症群である。

歯周病の主な原因は、歯に付着した歯垢及びバイオフィルムである。これらは歯茎の炎症を引き起こし、結果として歯周病となり、実際の歯列支持構造及び骨を破壊してしまう。一般的に、歯茎線の上（歯肉縁上）下（歯肉縁下）双方で歯垢及びバイオフィルムには大量の細菌が堆積している。

歯肉炎（歯茎炎）は、歯肉炎の中でも、歯肉が炎症を起こしているものの、深い（＞４ｍｍ）歯周ポケットが検出されない歯周炎と区別される。従って軟性及び硬性の（骨質）歯列支持構造の不可逆的破壊は歯肉炎とは関連付けられない。歯周炎は、歯肉の炎症と、軟性及び硬性の（骨質）歯列支持構造の破壊とに特徴付けられる。しかしながら歯周炎は、臨床的に健康に見える歯肉においては見落とされ得る。

出版物（例えば、Ｐｕｂｍｅｄ ｓｅａｒｃｈ、２０１０年４月／２０１３年７月：ＭＭＰ−８、引用６４０／８９１、歯周／インプラント学におけるＭＭＰ−８、引用９５／１３６）に反映されるように、過去２０年に亘って診断システムの改良のために多大な研究開発が行われてきたものの、歯科インプラントのインプラント周囲炎における歯周病とそれが進行した場合の歯科治療費は未だ莫大なものである。

認識が一層深まり、治療と、一方でチェアーサイド検査又は実験室検査で疾患を特定することのできる改良型テストシステムの能力とに関して多大な尽力がなされているにも関わらず、ドイツ等の先進工業国では疾患が劇的に蔓延、拡大している。

「近心面頬面部位および遠心舌側部位を考慮したＣＤＣの定義によると、歯周炎の有病率は、双方の年齢コホートで７０．９％及び８７．４％であり、各々、１／４及び１／２は深刻な状況であった」（Ｂ．Ｈｏｌｔｆｒｅｔｅｒら、２０１０年）。

過去２５年間、数年前の歯周炎及びその他の理由で喪失した歯を代替することのできる歯科インプラントが開発されたことにより、修復技術は劇的な発展を遂げてきた。

しかしながら、歯周炎の天然歯と同一又は類似の病理学が歯科インプラントにも当てはまる。

天然歯について上述したように、歯周炎は主に、インプラント面、インプラントと支台歯との間の接続部分、歯科補綴学上部構造とに付着したバイオフィルムの病原体によって引き起こされ、歯科インプラントの周囲組織には細菌残屑（ＬＰＳ）がトリガとなって類似の宿主反応が生じ、炎症反応が誘発されると制御が効かず、その途中で主としてＭＭＰ−８等の大量のプロテアーゼを排出するであろう。

天然歯と同様に、ＭＭＰ−８の不均衡な活性化により、インプラント周囲溝滲出液（ＰＩＳＦ）中の活性型ＭＭＰ−８（ａＭＭＰ−８）の過反応及び著しい高濃度化が生じ（Ｍａ Ｊら、２０００年。Ｘｕ Ｌら、２００８年）、個別に予測不能な期間で歯槽骨の顕著な喪失（インプラント周囲炎）と引いてはインプラントの喪失を生じる。

一旦インプラント周囲炎のステージになってしまうと、疾患を治療する選択肢はほぼない。歯周炎と同等に、インプラント周囲炎においては、臨床診断（Ｍａ Ｊら、２０００年。Ｘｕ Ｌら、２００８年）は、例えばアタッチメントロスのプロービング又はＸ線検査等により、疾患が既に引き起こした破壊のレベルを測定することを意味する。タンパク質解析等その他の方法が十分に特異性を有するかは証明されておらず、パラメータにはチェアーサイド診断でアクセスすることができず、関連生体試料はルーチン診断のために特定実験室に送られる程に安定的ではない。

従って、歯科専門家、医療専門家、及び患者のホームモニタリングにとっても、活性型プロテアーゼ（ＭＭＰ−８等）のみならず、活性化プロセスをも認識可能な検査システム、特に迅速なチェアーサイド検査の開発が未だに主な関心事となっている。これにより、個々の歯周状況の予測判断又は予後解析を改良することができるが、このことは天然歯において将来又は現在存在する歯周病のケース、及びインプラントについてはインプラント周囲障害のリスクの早期検出を行うために重要である。

これにより、医師らはできる限り早期にリスクのある患者を歯科専門家に紹介できるようになり、歯科専門家はより早期の予防治療を実施できるようになり、患者に一層の口腔衛生を実現するよう動機づけることとなろう。歯周病／障害の早期検出とそれに続く予防的治療を行うことにより、ヘルスケアシステムがかつて虫歯予防について学習した様に、莫大な治療及び修復コストを節約するのに役立つ。

さらに今日、（慢性）歯周炎が多数の全身性疾患と相互作用し、糖尿病、心筋梗塞（ＭＩ）、脳卒中、及びその他の心血管及び神経系疾患（ＣＶＤ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、リウマチ関節炎（ＲＡ）、クローン病（ＭＣ）、敗血症、ＨＩＶ、ボリレオ症、及びその他の全身性軽度炎症、メタボリック症候群、肥満、腎症、組織移植、整形外科的障害、及び早期産（ＰＴＤ）については低出生体重、及び勃起障害、精子数の減少、並びに精子細胞の可動性低下等の生殖リスク等、多数の全身性疾患の重大なリスク因子とみなされることが十分に実証されている。

例えば、オッズ比は、健康な歯周の患者に対して歯肉炎の患者で増え、糖尿病（死亡率）＝７．７、ＰＴＤ＝７．５、脳卒中＝８．５である。歯周炎は、ＭＩ、糖尿病、及び脳卒中のリスク因子としてよく認識されている。これらの研究の多くは、歯周病の全身及び局所（口腔）バイオマーカーとしてのＭＭＰ−８の関連性も示している。

このように、歯周病の早期発症診断と予後検査システムによる歯周障害の進展及び進行のリスクのある患者の特定とができるようになるということは、歯科産業／分野のみにとって重大なことではなく、実際には医療産業／分野全体及びヘルスケアシステムにとって重大なことである。

米国ヘルスケア保険のＡＥＴＮＡは、例えば歯周病治療を経験していない糖尿病の健康総コストに対する歯周病治療を経験した糖尿病の健康総コストは１６％低く、口腔疾患の重要性及び影響力を示しており、予防治療との組み合わせで歯周リスクの早期検出を改良することは、患者や将来のヘルスケアの総コストにとって意義のあることと言えよう。

全身ＭＭＰ−８は、他の疾患においても役割を果たしている。細胞外マトリクス再生、炎症反応の調節、及びその他の生理的プロセスにおけるＭＭＰ−８の優勢な役割、広範に亘る病理学におけるＭＭＰ−８の関与、及び一部の炎症及び癌進行における薬物標的又は疾患マーカーとしてのＭＭＰ−８の役割については十分に実証されている。ＭＭＰ−８は、広範に亘る炎症性障害において可能な薬物標的として記されており、患者のＭＭＰ−９レベルが上昇した場合、炎症性疾患の進行としばしば関連付けられる（Ｄｅｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ Ｅ．ら、２０１１年）。

早期の血清ＭＭＰ−８レベル上昇は、敗血症性感染症及び心血管疾患における致死的転帰を予期するものであることが分かっている。さらに細菌性髄膜炎（ＢＭ）の患者は、脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＭＭＰ−８レベルが高い、すなわち上昇していること、またＢＭの子供のＣＳＦ中のＭＭＰ−８レベルは、非死亡患者に比べて死亡患者において顕著に高いことが示されている。
羊水における炎症及び／又は感染症が早産及び異常新生児転帰のリスク因子であることも知られている。ＭＭＰ−８は、感染症／炎症の予測及び診断、並びに早産及び新生児合併症の進展のマーカーとしても使用されている。

本発明の目的は、歯周又はインプラント周囲組織の劣化、歯周又はインプラント周囲の炎症に関連の疾患のリスク増加、素因、又はこれに繋がる活性プロセスを判定する新規の方法を提供することである。

本発明の他の目的は、被験者から得た生体試料におけるＭＭＰ−８活性又は活性化プロセスの検出を行う新規の方法を提供することである。

本発明の他の目的は、異なる患者群から得た試料におけるＭＭＰ−８種の存在の検出を行う新規の方法を提供することである。

本発明の他の目的は、ＭＭＰ−８、特にＭＭＰ−８中間部分活性化物質等のＭＭＰ−８活性化物質の形成、存在、濃度上昇、又は活性化に関連の疾患の診断を行う新規の方法を開発することである。

ＭＭＰ−８中間部分活性化物質の個別の検出、群毎の検出、又はより大きな活性型ＭＭＰ−８種とともに検出を行う併用検定も設計することができる。併用検定は、抗体に認識されるエピトープが活性化物質及び活性型ＭＭＰ−８の双方において双方の分子又は一部の分子に存在する共通エピトープである場合、及び／又は、エピトープがより大きな活性型ＭＭＰ−８分子に比してＭＭＰ−８の活性物質に数倍存在する場合、及び／又は、活性化プロセスの立体増加作用と称される現象中、ＭＭＰ−８の多数の活性化物質が単一のＭＭＰ−８分子から生成される場合に特に有用である。

本発明の様態は、５〜３５ｋＤａ、好ましくは１０〜３０ｋＤａ、より好ましくは２０〜３５ｋＤａ、好適には約５ｋＤａ、６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ、１０ｋＤａ、１１ｋＤａ、１２ｋＤａ、１３ｋＤａ、１４ｋＤａ、１５ｋＤａ、１６ｋＤａ、１７ｋＤａ、１８ｋＤａ、１９ｋＤａ、２０ｋＤａ、２１ｋＤａ、２２ｋＤａ、２３ｋＤａ、２４ｋＤａ、２５ｋＤａ、２６ｋＤａ、２７ｋＤａ、２９ｋＤａ、３０ｋＤａ、３１ｋＤａ、３２ｋＤａ、３３ｋＤａ、３４ｋＤａ、及び／又は３５ｋＤａのサイズを有するＭＭＰ−８中間部分活性化物質等のＭＭＰ−８活性化物質と、試料におけるこのようなＭＭＰ−８活性化物質の検出とに係る。

本発明の他の様態は、試料中のＭＭＰ−８活性を判定する方法に係り、被験者からの生体試料を提供するステップと、試料中における１つ以上のＭＭＰ−８活性化物質、特にＭＭＰ−８中間部分活性化物質の存在を検出するステップと、任意で試料中のＭＭＰ−８活性化物質又はＭＭＰ−８中間部分活性化物質の存在を試料中のより多くの部分を占める活性型ＭＭＰ−８の存在とを関連付けるステップとを備え、試料中のＭＭＰ−８活性化物質又はＭＭＰ−８中間部分活性化物質の存在は、試料中の活性型ＭＭＰ−８の存在を表示、予測、及び／又は確認するものであり、これによって、例えば活性型ＭＭＰ−８の分析検出及び検定におけるその予測力を改良する。例えば、反復的又は慢性的な口腔液のＭＭＰ−８活性化物質の増加は治療反応を予測するものであり、例えば歯周炎のアタッチメントロス等、疾患進行のリスクのある部位及び／又は患者を示す。

本発明の他の様態は、さらなる疾患又は疾患進行の素因の存在の診断に係り、被験者から得た生体試料中における１つ以上のＭＭＰ−８中間部分活性化物質等のＭＭＰ−８活性化物質の存在を判定するステップと、検出結果を参照試料と比較することにより、疾患の存在又は素因を診断するステップとを備え、
ａ）参照試料は、通常レベルのＭＭＰ−８を有することが分かっている被験者群又は患者群より得て、生体試料と参照試料とで結果が類似していた場合、被験者が現在罹患していない、又は罹患し易くないこと、若しくは疾患が進展又は進行するリスクを有していない、又はそのリスクが生じ易くないことを示し、生体試料中のＭＭＰ−８活性物質又はＭＭＰ−８中間部分活性化物質のレベルが参照試料に比して上昇している場合、被験者が現在（検査時）罹患している、又は罹患し易いこと、若しくは疾患が進展又は進行するリスクが増加し易いことを示し、又は、
ｂ）参照試料は、現在罹患している、又は罹患し易いことが分かっている被験者群又は患者群より得て、生体試料と参照試料とで結果が類似していた場合、被験者が罹患している、又は罹患し易いこと、若しくは疾患が進展又は進行するリスクを有している、又はそのリスクが生じ易いことを示す。

本発明を特徴付ける特性を添付のクレームに示す。

本発明の他の目的は、ＭＭＰ−８活性フラグメントを示すＭＭＰ−８分子種と、時間分解免疫蛍光分析検定（ＩＦＭＡ）及び免疫ＥＬＩＳＡ法（ＩＥＭＡ、ＥＬＩＳＡ）によって解析された異なる歯周組織炎症負荷レベルのＭＭＰ−８免疫反応性レベルとの相関を見出すことである。

図１Ａは、歯数を考慮に入れた場合の喫煙ステータスに応じた検査群１〜４（実施例１）のＭＭＰ−８ＩＦＭＡを示し、図１Ｂは、ＭＭＰ−８ＩＥＭレベルを示している。群１〜４までの非喫煙者の動向は、ＩＦＭＡ（ｐ＝０．０１０）及びＩＥＭＡ（ｐ＝０．０２８）の双方において顕著である。 図１Ａは、歯数を考慮に入れた場合の喫煙ステータスに応じた検査群１〜４（実施例１）のＭＭＰ−８ＩＦＭＡを示し、図１Ｂは、ＭＭＰ−８ＩＥＭレベルを示している。群１〜４までの非喫煙者の動向は、ＩＦＭＡ（ｐ＝０．０１０）及びＩＥＭＡ（ｐ＝０．０２８）の双方において顕著である。 図２Ａは、ＭＭＰ−８種及びそれらの組み合わせを示している。フォレストブロットは、ＭＭＰ−８ｋＤａ種の有病率のオッズ比（９５％の信頼水準ｃｌ）を示している。従変数：ＩＦＭＡレベル（歯数で調整）＞群４（高度歯周組織炎症負荷）における中間レベル。相関が有意である。図２Ｂは、ＭＭＰ−８種及びそれらの組み合わせを示している。フォレストブロットは、ＭＭＰ−８ｋＤａ種の有病率のオッズ比（９５％ｃｌ）を示している。従変数：喫煙。相関が有意である。図２Ｃは、ＭＭＰ−８ｋＤａ種及びそれらの組み合わせを示している。フォレストブロットは、ＭＭＰ−８ｋＤａ種の有病率のオッズ比（９５％ｃｌ）を示している。従変数：喫煙。相関が有意である。 図２Ａは、ＭＭＰ−８種及びそれらの組み合わせを示している。フォレストブロットは、ＭＭＰ−８ｋＤａ種の有病率のオッズ比（９５％の信頼水準ｃｌ）を示している。従変数：ＩＦＭＡレベル（歯数で調整）＞群４（高度歯周組織炎症負荷）における中間レベル。相関が有意である。図２Ｂは、ＭＭＰ−８種及びそれらの組み合わせを示している。フォレストブロットは、ＭＭＰ−８ｋＤａ種の有病率のオッズ比（９５％ｃｌ）を示している。従変数：喫煙。相関が有意である。図２Ｃは、ＭＭＰ−８ｋＤａ種及びそれらの組み合わせを示している。フォレストブロットは、ＭＭＰ−８ｋＤａ種の有病率のオッズ比（９５％ｃｌ）を示している。従変数：喫煙。相関が有意である。 図２Ａは、ＭＭＰ−８種及びそれらの組み合わせを示している。フォレストブロットは、ＭＭＰ−８ｋＤａ種の有病率のオッズ比（９５％の信頼水準ｃｌ）を示している。従変数：ＩＦＭＡレベル（歯数で調整）＞群４（高度歯周組織炎症負荷）における中間レベル。相関が有意である。図２Ｂは、ＭＭＰ−８種及びそれらの組み合わせを示している。フォレストブロットは、ＭＭＰ−８ｋＤａ種の有病率のオッズ比（９５％ｃｌ）を示している。従変数：喫煙。相関が有意である。図２Ｃは、ＭＭＰ−８ｋＤａ種及びそれらの組み合わせを示している。フォレストブロットは、ＭＭＰ−８ｋＤａ種の有病率のオッズ比（９５％ｃｌ）を示している。従変数：喫煙。相関が有意である。 図３は、ＭＭＰ−８ＩＦＭＡ及びＩＥＭＡの診断感度及び特異度の評価を行う受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析（図３Ａ）と、状態変数として高度歯周組織炎症負荷を与えた群４における２５＋３５ｋＤａのＭＭＰ−８種の有病率（図３Ｂ）とを示している。ＲＯＣ曲線下の領域については、９５％の信頼区間及びｐ値である。実施例１を参照のこと。 図３は、ＭＭＰ−８ＩＦＭＡ及びＩＥＭＡの診断感度及び特異度の評価を行う受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析（図３Ａ）と、状態変数として高度歯周組織炎症負荷を与えた群４における２５＋３５ｋＤａのＭＭＰ−８種の有病率（図３Ｂ）とを示している。ＲＯＣ曲線下の領域については、９５％の信頼区間及びｐ値である。実施例１を参照のこと。 図４は、組み換えヒトＭＭＰ−８（Ｐｒｏｔｅａｉｍｍｕｎ社）の有機水銀化合物ＡＰＭＡ（図４Ａ）及び酸化物ＮａＯＣｌ（図４Ｂ）活性化因子の作用のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）解析を示す。ｒｈＭＭＰ−８の量及び培養時間を示す。ＡＰＭＡ及びＮａＯＣｌは双方ともに、活性化に際して低分子量のＭＭＰ−８種の生成を誘発する。矢印によって示される２０〜３０ｋＤａ活性化フラグメントの時間依存形成を観察されたい。図４Ｃは、ＡＰＭＡ及びＮａＯＣｌ、ヒトの体液及び血清による、３つの異なる製造元（Ｐｒｏｔｅａｉｍｍｕｎ、Ｍｅｒｃｋ、及びＩｎｖｅｎｔ）から入手のｒｈＭＭＰ−８を使用したウェスタンイムノブロット解析を示す。レーン１：ＰｒｏｔｅａｉｍｍｕｎによるｒＭＭＰ−８、レーン２：レーン１と同一のものプラスＡＰＭＡ、レーン３：レーン１と同一のものプラスＮａＯＣｌ、レーン４：ＭｅｒｃｋによるｒｈＭＭＰ−８、レーン５：レーン４と同一のものプラスＡＰＭＡ、レーン６：レーン４と同一のものプラスＮａＯＣｌ、レーン７：本発明のＭＭＰ−８抗原、レーン８：レーン７と同一のものプラスＡＰＭＡ、レーン９：レーン７と同一のものプラスＮａＯＣｌ、レーン１０：ヒトの歯周炎歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）、レーン１１：ヒトのインプラント周囲炎内縁流体（ＰＩＳＦ）、レーン１２：ヒトの矯正治療を行った歯のＧＣＦ、レーン１３：ヒトの歯周炎唾液、レーン１４：ヒトの歯周炎口濯ぎ液、レーン１５：感染したヒトの羊水、レーン１６：ヒトの脳脊髄液、レーン１７：ヒトの敗血症血清。ＭＭＰ−８の活性化に際して形成される優勢な２０〜３０ｋＤａフラグメントを矢印で示す。実施例２を参照のこと。 図４は、組み換えヒトＭＭＰ−８（Ｐｒｏｔｅａｉｍｍｕｎ社）の有機水銀化合物ＡＰＭＡ（図４Ａ）及び酸化物ＮａＯＣｌ（図４Ｂ）活性化因子の作用のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）解析を示す。ｒｈＭＭＰ−８の量及び培養時間を示す。ＡＰＭＡ及びＮａＯＣｌは双方ともに、活性化に際して低分子量のＭＭＰ−８種の生成を誘発する。矢印によって示される２０〜３０ｋＤａ活性化フラグメントの時間依存形成を観察されたい。図４Ｃは、ＡＰＭＡ及びＮａＯＣｌ、ヒトの体液及び血清による、３つの異なる製造元（Ｐｒｏｔｅａｉｍｍｕｎ、Ｍｅｒｃｋ、及びＩｎｖｅｎｔ）から入手のｒｈＭＭＰ−８を使用したウェスタンイムノブロット解析を示す。レーン１：ＰｒｏｔｅａｉｍｍｕｎによるｒＭＭＰ−８、レーン２：レーン１と同一のものプラスＡＰＭＡ、レーン３：レーン１と同一のものプラスＮａＯＣｌ、レーン４：ＭｅｒｃｋによるｒｈＭＭＰ−８、レーン５：レーン４と同一のものプラスＡＰＭＡ、レーン６：レーン４と同一のものプラスＮａＯＣｌ、レーン７：本発明のＭＭＰ−８抗原、レーン８：レーン７と同一のものプラスＡＰＭＡ、レーン９：レーン７と同一のものプラスＮａＯＣｌ、レーン１０：ヒトの歯周炎歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）、レーン１１：ヒトのインプラント周囲炎内縁流体（ＰＩＳＦ）、レーン１２：ヒトの矯正治療を行った歯のＧＣＦ、レーン１３：ヒトの歯周炎唾液、レーン１４：ヒトの歯周炎口濯ぎ液、レーン１５：感染したヒトの羊水、レーン１６：ヒトの脳脊髄液、レーン１７：ヒトの敗血症血清。ＭＭＰ−８の活性化に際して形成される優勢な２０〜３０ｋＤａフラグメントを矢印で示す。実施例２を参照のこと。 図４は、組み換えヒトＭＭＰ−８（Ｐｒｏｔｅａｉｍｍｕｎ社）の有機水銀化合物ＡＰＭＡ（図４Ａ）及び酸化物ＮａＯＣｌ（図４Ｂ）活性化因子の作用のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）解析を示す。ｒｈＭＭＰ−８の量及び培養時間を示す。ＡＰＭＡ及びＮａＯＣｌは双方ともに、活性化に際して低分子量のＭＭＰ−８種の生成を誘発する。矢印によって示される２０〜３０ｋＤａ活性化フラグメントの時間依存形成を観察されたい。図４Ｃは、ＡＰＭＡ及びＮａＯＣｌ、ヒトの体液及び血清による、３つの異なる製造元（Ｐｒｏｔｅａｉｍｍｕｎ、Ｍｅｒｃｋ、及びＩｎｖｅｎｔ）から入手のｒｈＭＭＰ−８を使用したウェスタンイムノブロット解析を示す。レーン１：ＰｒｏｔｅａｉｍｍｕｎによるｒＭＭＰ−８、レーン２：レーン１と同一のものプラスＡＰＭＡ、レーン３：レーン１と同一のものプラスＮａＯＣｌ、レーン４：ＭｅｒｃｋによるｒｈＭＭＰ−８、レーン５：レーン４と同一のものプラスＡＰＭＡ、レーン６：レーン４と同一のものプラスＮａＯＣｌ、レーン７：本発明のＭＭＰ−８抗原、レーン８：レーン７と同一のものプラスＡＰＭＡ、レーン９：レーン７と同一のものプラスＮａＯＣｌ、レーン１０：ヒトの歯周炎歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）、レーン１１：ヒトのインプラント周囲炎内縁流体（ＰＩＳＦ）、レーン１２：ヒトの矯正治療を行った歯のＧＣＦ、レーン１３：ヒトの歯周炎唾液、レーン１４：ヒトの歯周炎口濯ぎ液、レーン１５：感染したヒトの羊水、レーン１６：ヒトの脳脊髄液、レーン１７：ヒトの敗血症血清。ＭＭＰ−８の活性化に際して形成される優勢な２０〜３０ｋＤａフラグメントを矢印で示す。実施例２を参照のこと。 図５は、ＭＭＰ−８抗体及びＭＭＰ−８濃度を異ならせた非感染（＃１６）及び感染（＃１２、＃１３、及び＃１９）ヒト羊水試料のウェスタンイムノブロット解析を示している。 図６は、培養時間を異ならせてＡＰＭＡによって活性化した組み換えヒトＭＭＰ−８（Ｐｒｏｔｅａｉｍｍｕｎ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示している。シークエンシングに使用したバンドを図中に示す。 図７は、種々の画分の精製活性型ＭＭＰ−８のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。試料は、左から右に向かって、分子量マーカーＰＡＧＥ Ｒｕｌｅｒ、１）〜４）種々の画分の精製ｈＭＭＰ−８、分子量マーカーＳｐｅｃｔｒａ Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒである。 図８は、ａｎｔｉ−ｈＭＭＰ−８−ＭｏＡｂ１４９１−Ｅ６−Ｆ７で染色した種々のアリコートの精製ヒトａＭＭＰ−８のウェスタンブロットを示している。試料は、左から右に向かって、分子量マーカーＤｕａｌ Ｘｔｒａ、１）〜４）種々の画分の精製ｈＭＭＰ−８、５）精製前の胎盤抽出物である。

配列一覧
配列番号１：図６に示すバンド３、４、５、及び６のＭＭＰ−８活性化物質に見出されるＭＭＰ−８中間部分配列であって、例えばバンド３の場合、２５ｋＤａのサイズを有する。
配列番号２：図６に示すバンド２、３，４、５、及び８のＭＭＰ−８活性化物質に見出されるＭＭＰ−８中間部分配列であって、例えばバンド４の場合、２１ｋＤａのサイズを有する。

本発明の詳細な説明
本発明者らは、驚くべきことに、５〜３５ｋＤａ、好ましくは約１０〜３０ｋＤａ、より好ましくは約２０〜３５ｋＤａのサイズを有するＭＭＰ−８中間部分活性化物質等、新規に発見したＭＭＰ−活性化物質を検出することにより、活性型ＭＭＰ−８の存在が種々の生体試料において検出できることを見出した。断片化ＭＭＰ−８は、５ｋＤａ、６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ、１０ｋＤａ、１１ｋＤａ、１２ｋＤａ、１３ｋＤａ、１４ｋＤａ、１５ｋＤａ、１６ｋＤａ、１７ｋＤａ、１８ｋＤａ、１９ｋＤａ、２０ｋＤａ、２１ｋＤａ、２２ｋＤａ、２３ｋＤａ、２４ｋＤａ、２５ｋＤａ、２６ｋＤａ、２７ｋＤａ、２９ｋＤａ、３０ｋＤａ、３１ｋＤａ、３２ｋＤａ、３３ｋＤａ、３４ｋＤａ、及び３５ｋＤａのサイズを有し、配列番号１又は配列番号２の配列を備える、種々に規定された分子形態で存在する。
一様態において、フラグメントの異なる分子種を試料種別と相互に関連付けることができ、フラグメントの特定の組み合わせを使用して、試料を得た被験者における特定の状態、疾患の存在、疾患進展のリスクを示すことができる。

少なくとも１つのＭＭＰ−８のフラグメントを含むＭＭＰ−８活性化物質又はＭＭＰ−８中間部分活性化物質は、従来既知のいずれかの方法を使用して試料中に検出することができる。検定は、定性的、半定量的、又は定量的な免疫学的測定法とすることができる。本発明に係る好適な検出方法の非限定的例として、ウェスタンブロッティング、ＩＦＭＡ、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ラテラルフロー検定、ディップスティック検定、表面プラズモン共鳴検定、電気化学検定、又はその他既知のリガンド結合、又は直接検出検定システムが挙げられる。直接検出検定システム又は技術とは、解析のためのリガンド結合に基づかないいずれかの方法、すなわち、高圧液体クロマトグラフィー［ＨＰＬＣ］等のサイズ排除クロマトグラフィー［ＳＥＣ］、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等のゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、核磁気共鳴分光学（ＮＭＲ）、ＵＶ／ＶＩＳ−分光学、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）等の分子分光法等の技術を意味する。

指摘の無い限り、明細書及びクレームで使用される用語は、診断分野において通常使用される意味を有するものである。具体的には、以下の用語は次に示す意味を有する。

ＭＭＰ−８活性化物質とは、生体内又は生体外においてＭＭＰ−８活性化中、自然形成されるマトリクスメタロプロテアーゼの１つ以上のフラグメントを含む物質をいう。ＭＭＰ−活性化物質は、内生的に（すなわち、自動活性化により）生成可能であり、又はＡＰＭＡ、ＮａＯＣｌ、その他の酸化剤、及び／又は宿主由来及び微生物由来のプロテアーゼ等の活性化剤又は活性化因子を使用して生成可能である。

ＭＭＰ−中間部分活性化物質とは、１つ以上の配列が実質的にＣ末端又はＮ末端部分の一部でない、すなわち、完全にはＣ末端又はＮ末端の一部でないＭＭＰ−８配列全体の中間領域ドメインから１つ以上の配列を有するマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ−８）の少なくとも１つのフラグメントを含む物質をいう。これらの配列は、例えば、全長タンパク質のアミノ酸Ａｓｎ^１１９〜Ａｌａ^１３２又はアミノ酸Ｉｌｅ^１５１〜Ａｓｐ^１６５に亘るものであってもよい。

活性型ＭＭＰ−８とは、その潜在型又は前駆体の形態に対して異なる形態の活性型コラゲナーゼをいう。

ＭＭＰ−８活性とは、ＭＭＰ−８のプリフォームを活性型ＭＭＰ−８に転換する生物学的又は生化学的プロセスをいう。

本発明者らは、驚くべきことに、高分子量種の活性型ＭＭＰ−８でなくＭＭＰ−８中間部分活性化物質等のＭＭＰ−８活性化物質を検出することにより、活性型ＭＭＰ−８の検出を改良できることを見出した。いかなる理論にも拘束されるものでないが、ＭＭＰ−８活性化物質又はＭＭＰ−８中間部分活性化物質は絶対濃度がより高く、生体試料中、５５〜９５ｋＤａの通常サイズを有してより多くの部分を占める活性型ＭＭＰ−８分子の数に比してエピトープの数が多いと考えられる。従ってバイオマーカーとして低分子量ＭＭＰ−８中間部分活性化物質を使用することにより、例えば、免疫学的測定法における捕捉抗体により、予後値又は診断値をより容易に得ることができるようになる。

なぜより小さなＭＭＰ−８フラグメントの検出が高分子量種の活性型ＭＭＰ−８の検出に比して診断及び予測の目的においてより効果的であるかは完全には明らかとなっていない。何等かの説明モデルを確約するものでないが、予備的観察により、細菌をトリガとして環境的、後天的、及び遺伝的因子によって支持され、バイオフィルムＰＭＮ内の病原体に対する免疫学的宿主応答を生じ、細菌攻撃部分にＭＭＰ−８の８５ｋＤａのプロ酵素を運び、この８５ｋＤａプロ酵素を活性化するものであることを提案する。そしてこの８５ｋＤａプロ酵素は、６４ｋＤａフラグメントに転換され、６４ｋＤａはコラーゲン及び細菌／バイオフィルムに結合し、歯肉組織及び歯槽骨にコラーゲン分解を生じる。コラーゲンと結合可能な量を超えて６４ｋＤａが生成された場合、６４ｋＤａの過剰分は天然のＭＭＰシステムレギュレータであるＴＩＭＰに結合するであろう。

その後、６４ｋＤａの過剰分が依然として形成される場合、これらは内生的に、且つ／又は、酸化剤及び宿主由来及び／又は細菌由来のプロテアーゼの作用により、自己分解でフラグメントが４０ｋＤａフラグメント及び２４ｋＤａフラグメントとなり、恐らくは、例えば、５ｋＤａ、９ｋＤａ、１４ｋＤａ等の小さな多数のＭＭＰ−８フラグメントにもなる。

４０ｋＤａフラグメントが８５ｋＤａプロ酵素のさらなる活性化のトリガとなり、これを支持するものの、活性は低減してしまうことが知られている。
生理的状況として、まずフェーズＩにおいて、最初に活性化された６４ｋＤａの大部分が歯周病変におけるコラーゲン種別１に結合され、バイオフィルムの細菌と結合されてコラーゲン分解を起こすと考えらえれる。

次にフェーズＩＩにおいて、６４ｋＤａの過剰分があれば、これらがＴＩＭＰ（ＴＩＭＰ１及びＴＩＭＰ２）に結合し、４０ｋＤａへの断片化が開始し、これもＴＩＭＰに結合するであろう。６４ｋＤａ及び４０ｋＤａはともに、約１：１の分子比の複合体を形成し、ＴＩＭＰ１／ＴＩＭＰ２により阻害される。６４ｋＤａ及び４０ｋＤａは、歯肉マトリクス及びバイオフィルムに結合されているため、恐らく歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）及びインプラント周囲溝滲出液（ＰＩＳＦ）又は唾液若しくは口洗浄液に溶解したＧＣＦ等の検体に存在する量が少ない。しかしながら２４ｋＤａ及びその他の微小なＭＭＰ−８フラグメント等、「自由な」非結合フラグメントが上昇濃度、すなわち高濃度で存在することとなり、ＭＭＰ−８の早期活性化プロセスのフェーズを表示及び反映する。

フェーズＩＩＩにおいて、進行中の８５ｋＤａから６４ｋＤａへの活性化により６４ｋＤａの過剰分が生成された場合、これらは４０ｋＤａフラグメントへと自己分解され（これが活性化を支持し、状況をさらに悪化させるであろう）、微小なＭＭＰ−８活性化物質又はＭＭＰ−８中間部分活性化物質を含むその他のフラグメントへと自己分解されるであろう。より微小なフラグメント、すなわち、恐らくはその他のフラグメントである５ｋＤａ〜３５ｋＤａのすべてが検体に存在し、急速に軟質及び硬質の組織が崩壊するリスクが増加しているフェーズであることを表示、反映、又は提示するであろう。
診断情報、バイオマーカー情報にとって、このことは引いては、「結合」又は「阻害」された６４ｋＤａの自然平衡が均衡を失う、又は既に失っており、６４ｋＤａの過剰分の自己分解又はさらなる断片化が可能であるときに、生体内で自己分解によって形成されたこれらのより微小なフラグメントが臨床状況でのみ高濃度となって現れることを意味し、疾患の形成又は進行のリスクが高まっていることを示す。

本発明の第１実施形態は、ＭＭＰ−８活性化物質又はＭＭＰ−８中間部分活性化物質がＭＭＰ−８の活性化フラグメントを含み、２０〜３５ｋＤａ、好ましくは約２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、３０ｋＤａ、又は３５ｋＤａのサイズを有することを特徴とするＭＭＰ−８活性化物質、好ましくはＭＭＰ−８中間部分活性化物質を提供するものである。

第２実施形態は、第１実施形態のＭＭＰ−８活性化物質又はＭＭＰ−８中間部分活性化物質において、活性化物質及び活性化物質のサイズが、天然ＭＭＰ−８をＡＰＭＡで活性化して得られた活性化物質に対応するものを提供する。

第３実施形態は、第１実施形態のＭＭＰ−８活性化物質又はＭＭＰ−８中間部分活性化物質において、活性化物質及び活性化物質のサイズが、タンパク質分解除去、又はＮａＯＣｌ若しくは反応性酸素主による酸化的活性化による化学的修飾で天然ＭＭＰ−８を活性化して得られた活性化物質に対応するものを提供する。

第４実施形態は、第１〜第３実施形態のいずれかのＭＭＰ−８活性化物質又はＭＭＰ−８中間部分活性化物質において、活性化物質が、ＭＭＰ−８の中間部分ドメイン（Ｃ末端又はＮ末端でない）となる配列番号１の配列を含むものを提供する。

第５実施形態は、第１〜第４実施形態のＭＭＰ−８活性化物質又はＭＭＰ−８中間部分活性化物質において、活性化物質が、ＭＭＰ−８の中間部分ドメイン（Ｃ末端又はＮ末端でない）となる配列番号２の配列を含むものを提供する。

本発明のさらに他の実施形態は、試料中のＭＭＰ−８活性の判定方法であって、
Ａ．被験者からの生体試料を提供するステップと、
Ｂ．生体試料において、１つ以上のＭＭＰ−８活性フラグメントを含み、５〜３５ｋＤａ、好ましくは１０〜３０、さらに好ましくは約１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、３０ｋＤａ、又は３５ｋＤａのサイズを有する１つ以上のＭＭＰ−８活性化物質、好ましくはＭＭＰ−８中間部分活性化物質の存在を検出するステップと、
Ｃ．選択的に、ＭＭＰ−８活性化物質又はＭＭＰ−８中間部分活性化物質の存在を試料中の活性型ＭＭＰ−８の存在と相互に関連付けるステップと、及び／又は、
Ｄ．選択的に、ＭＭＰ−８活性化物質又はＭＭＰ−８中間部分活性化物質の存在を試料中の他のより多くの部分を占める活性型ＭＭＰ−８の存在と相互に関連付けるステップを備え、
生体試料中の１つ以上のＭＭＰ−８活性化物質又はＭＭＰ−８中間部分活性化物質の存在は、試料中の活性型ＭＭＰ−８の存在を表示、及び／又は、確認、及び／又は、予測するものであり、検定における活性型ＭＭＰ−８の解析的検出及び／又はその予測力を向上するものである。

１つ以上のＭＭＰ−８活性化物質又はＭＭＰ−８中間部分活性化物質の存在は、通常、生体試料中のＭＭＰ−８の活性化物質の検出にリガンドシステムを使用することによって判定される。リガンドシステムは、１つ以上の抗体、抗体対、及び／又は抗体フラグメントを含むことが好ましく、この検定は、ウェスタンブロッティング、ＩＦＭＡ、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ラテラルフロー検定、ディップスティック検定、表面プラズモン共鳴検定、電気化学検定、又はその他既知のリガンド結合検定システム等、定量的、半定量的、又は定性的な免疫学的測定法である。本発明の異なる様態において使用される抗体は、単クローン性、及び／又は多クローン性とすることができ、選択的に組み換えとすることができる。

本発明の他の様態によると、１つ以上のＭＭＰ−８活性化物質又はＭＭＰ−８中間部分活性化物質の存在は、生体試料中のＭＭＰ−８の活性化物質の直接タンパク質検出技術を使用して判定される。

本発明の一実施形態によると、この方法は疾患又は疾患進行の素因又はリスクの診断に使用され、
Ｉ．被験者から得た生体試料中におけるＭＭＰ−８活性化物質又はＭＭＰ−８中間部分活性化物質の存在を判定するステップと、
ＩＩ．ステップＩで得られた結果を参照試料と比較することにより、疾患又は疾患進行の素因又はリスクを診断するステップとを備え、
ａ）参照試料は、通常レベルのＭＭＰ−８を有することが分かっている被験者群又は患者群より得て、生体試料と参照試料とで結果が類似していた場合、被験者が現在罹患していない、又は罹患し易くないこと、若しくは疾患が進展又は進行するリスクを有していない、又はそのリスクが生じ易くないことを示し、生体試料中のＭＭＰ−８活性物質又はＭＭＰ−８中間部分活性化物質のレベルが参照試料に比して上昇している場合、被験者が現在罹患している、又は罹患し易いこと、若しくは疾患が進展又は進行するリスクが増加し易いことを示し、又は、
ｂ）参照試料は、現在罹患している、又は罹患し易いことが分かっている被験者群又は患者群より得て、生体試料と参照試料とで結果が類似していた場合、被験者が罹患している、又は罹患し易いこと、若しくは疾患が進展又は進行するリスクを有している、又はそのリスクが生じやすくなっていることを示す。

本発明の異なる実施形態によると、試料は、通常、歯肉溝滲出液、インプラント周囲内縁流体、オーラルプラーク、歯垢、口濯ぎ液、口洗浄液、唾液、根管流体、傷からの滲出液、ＰＵＳ、オーラルバイオフィルム、組織バイオプシー、オーラルスワップ、口腔病斑からの血液から得られ、或いは、口腔からでなく、羊水、血清、血漿、膣洗浄、鼻洗浄、副鼻腔、耳、静脈洞、尿、関節液、脳脊髄液、排泄物、スワップ、涙液、洗浄（肺）、唾液、組織バイオプシー、傷からの滲出液、及び／又は汗から得られる。

本発明の好適な実施形態において、疾患は、口腔内細菌によって引き起こされる歯周組織炎、歯周組織喪失（劣化）、歯肉炎、歯周炎、インプラント周囲炎、歯の喪失、歯科インプラント寛解、歯槽骨喪失、粘膜炎、粘膜の変化、根尖性歯周組織炎、歯根管炎症、虫歯、上下顎骨断裂、歯の矯正移動、アレルギー炎症反応、及び／又は菌血症のうちの１つ以上である。

本発明のさらに他の実施形態によると、１つ以上のＭＭＰ−８活性化物質又はＭＭＰ−８中間部分活性化物質の存在は、慢性又は急性の歯周炎又はインプラント周囲炎等の歯周病を表示または予測するものであり、これらの口腔疾患はさらに、糖尿病Ｉ、糖尿病ＩＩ、ＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、メタボリック症候群、肥満、リウマチ疾患、関節炎疾患、骨粗鬆症、整形外科的疾患、自己免疫疾患、組織移植疾患、関節炎、感染症、又はエンドプロテーゼの寛解等の全身性疾患又は障害、脳卒中、心筋梗塞、動脈硬化等の心血管疾患、早期残、低出生体重を含むがこれに限られない妊娠関連リスク、勃起障害、精子数の減少、及び精子細胞の可動性低下等の生殖リスク等の表示、増強、又は既知のリスク因子である。

本発明のさらに他の実施形態によると、疾患は、
ａ）羊膜内炎症、母体炎症、新生児疾患、早期分娩、低出生体重、及び羊膜病理等の婦人科疾患、
ｂ）例えば、乳癌及び白血病など悪性腫瘍等の癌疾患、
ｃ）リウマチ関節炎及び関節症等の関節炎／リウマチ疾患、
ｄ）すべての形態の糖尿病、腎症疾患、腎疾患、及び難治性糖尿病創傷を含む糖尿病疾患、
ｅ）円錐角膜及びペルーシド角膜変性等の（例えば、涙液からの）眼球疾患、
ｆ）（例えば、耳、副鼻腔からの）耳鼻咽喉科的疾患、
ｇ）ボリレオ症、敗血症、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲ）、ＨＩＶ、ヘリコバクターピロリ感染症、全身性炎症、全身性軽度炎症等の感染症又は炎症、気管支炎、気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、小児感染症／炎症等の肺感染症及び炎症等の肺感染症及び炎症、髄膜炎、クローン病等の神経系感染症及び炎症、
ｈ）血管疾患等の心血管疾患、動脈内プラーク炎症、塞栓症、及び脳卒中等のアテローム性動脈硬化、
ｉ）重症、慢性創傷、難治性創傷、皮膚熱傷等の創傷（例えば、傷からの滲出液）、
ｊ）（糞便検査からの）腸管疾患、
ｋ）トラウマ又は事故後の疾患、及び／又は、
ｌ）メタボリック症候群及び肥満である。

本発明の実施形態はまた、ＭＭＰ−８活性化物質又はＭＭＰ−８中間部分活性化物質の判定又は配列情報に基づき、コンピュータシステムに個人が特定の（以上に規定の）疾患、障害、又は特定疾患又は障害の素因を有するか否かの判定方法を実施させるシステム及びコンピュータの可読媒体も提供する。

特に、本発明はさらに、生体試料の解析システムに係り、
ａ）生体試料を受容し、ＭＭＰ−８の活性化フラグメントを含み、５〜３５ｋＤａのサイズを有するＭＭＰ−８活性化物質又はＭＭＰ−８中間部分活性化物質を判定するよう構成された判定モジュール、及び／又は、
ｂ）配列番号１及び／又は配列番号２を含む配列情報、
ｃ）判定モジュールからの配列情報を記憶する記憶装置、
ｄ）記憶装置に記憶された配列情報を参照データと比較し、
現在通常レベルのＭＭＰ−８を有することが分かっている被験者群又は患者群であり、生体試料と参照試料とで結果が類似していた場合、被験者が現在罹患していない、又は罹患し易くないこと、若しくは疾患が進展又は進行するリスクを有していない、又はそのリスクが生じ易くないことを示し、及び／又は、
罹患している、又は罹患し易いことが分かっている被験者群又は患者群であり、生体試料と参照試料とで結果が類似していた場合、被験者が罹患している、又は罹患し易いこと、若しくは疾患が進展又は進行するリスクを有すること、又はそのリスクが生じ易いことを示すよう、
対象から得られた参照試料より得た比較結果を提供するよう適応された比較モジュール、及び
ｅ）ユーザに対して比較結果に部分的に基づく内容を表示する表示モジュールとを備え、この内容は、参照試料と比較した場合の生体試料中のＭＭＰ−８活性化物質又はＭＭＰ−８中間部分活性化物質の存在又はレベル上昇を示す信号であり、これは被験者が現在罹患している、又は罹患し易いこと、若しくは疾患が進展又は進行するリスクが増加し易いことを示す。

本発明の他の実施形態によると、本発明はさらに、コンピュータ上で方法を実行するための比較モジュール及び表示モジュールを含むソフトウェアモジュールを規定するコンピュータ可読指示を記録したコンピュータ可読媒体によっても利用することができ、当該方法は、
ａ）比較モジュールにより、記憶装置に記憶されたデータを参照データと比較することにより、比較結果を提供するステップを備え、比較結果、すなわち参照試料と比較した場合の生体試料中のＭＭＰ−８活性化物質又はＭＭＰ−８中間部分活性化物質の存在又はレベル上昇は、被験者が現在罹患している、又は罹患し易いこと、若しくは疾患の進展又は進行のリスク増加が生じ易いこと、又はそのリスクが増加したことを示し、
ｂ）ユーザに対して部分的に比較結果に基づく内容を表示するステップとを備え、この内容は、罹患している、又は罹患し易いこと、若しくは疾患が進展又は進行するリスクが増加し易い、又はそのリスクが増加したことを示す。

以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を説明する目的のみのために示されるものであり、いずれの意味においても本発明を限定するものでない。当業者は、添付のクレームによって規定される本発明が目的を達成し、上述の結果及び効果を得るよう十分に適応されることを容易に理解するであろう。

ＭＭＰ−８の免疫蛍光分析検査
ＭＭＰ−８濃度は、時間分解免疫蛍光分析検定（ＩＦＭＡ）によって判定した。単クローン性ＭＭＰ−８フラグメント特定抗体１４９１−Ｅ６−Ｆ７及び１４９２−Ｂ３−Ｃ１１（Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、フィンランド、カウニアイネン）を各々、捕捉抗体及びトレーサー抗体として使用した。トレーサー抗体は、ユーロピウムキレートを使用してラベル付けした（Ｈｅｍｍｉｌaら、１９８４年）。検定緩衝剤は、２０ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）と、０．５ＭのＮａＣｌと、５ｍＭのＣａＣｌ２と、５０μＭのＺｎＣｌ２と、０．５％ＢＳＡと、０．０５％アジ化ナトリウムと、２０ｍｇ／ｌのジエチレントリアミンペンタアセテート酸（ＤＴＰＡ）とを含有した。試料を検定緩衝剤中で希釈し、１時間培養した後、トレーサ抗体とともに１時間培養した。増進剤を添加し、５分後、１２３４Ｄｅｌｆｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｗａｌｌａｃ、フィンランド、トゥルク）を使用して蛍光を測定した。ＭＭＰ−８に対する単クローン性抗体の特異度は、多クローン性ＭＭＰ−８に対する特異度に対応するものであった。

ウェスタンイムノブロッティング
製造メーカー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国、アマシャム）により推奨されたプロトコルに準じ、改定ＥＣＬウェスタンブロッティングキットでＭＭＰ−８の分子形態を検出した。指摘の組み換えヒトＭＭＰ−８と、指摘の体液／分泌液と、血清試料とを、還元剤を用いることなくＬａｅｍｍｌｉの緩衝剤と混合し、５分間加熱した後、１１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲルでタンパク質分離を行った。電気泳動後、タンパク質をニトロセルロース膜（Ｐｒｏｔｒａｎ、Ｗｈａｔｍａｎ ＧｍｂＨ、ドイツ、ダッセル）上に電気泳動転写した。ＴＢＳＴ緩衝剤（２２ｍＭのＮａＣｌ及び０．０５％ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含有した１０ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））中、５％粉乳（Ｖａｌｉｏ Ｌｔｄ．、フィンランド、ヘルシンキ）で１時間、非特異結合を妨害した。その後、膜を一晩、１次抗体１４９１−Ｅ６−Ｆ７（Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、フィンランド、カウニアイネン）で培養した後、西洋わさびペルオキシダーゼ結合２次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国、バッキンガムシャー）で１時間、培養した。この膜は、各ステップの間にＴＢＳＴにおいて、１５分間４回洗浄した。改良化学発光（ＥＣＬ）システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してタンパク質を可視化した。

密度計解析
異なる分子量形態のＭＭＰ−８の強度を走査し、ＧＳ−７００Ｉｍａｇｉｎｇ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国、カリフォルニア州ハーキュリーズ）と、バックグランド値に合わせて補正したＢｉｏ−Ｒａｄ Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅプログラムを使用して解析した。

シークエンシング
Ｔｕｒｕｎｅｎら（２０１２年）によって説明された方法に準じて、タンパク質特定及びプロテオームデータ解析を実施した。

ＭＤｍＡｂ免疫染色に匹敵する切除ゲルバンドを洗浄し、アセトニトリル（ＡＣＮ）で脱水した。タンパク質を２０ｍＭのジチオトレイトールで還元し、室温の暗所にて１５分間、５５ｍＭのイオドアセトアミド−０．１Ｍの炭化水素アンモニウム（ＮＨ_４ＨＣＯ_３）でアルキル化を行うのに先立ち、５６℃で３０分間、培養した。０．１ＭのＮＨ_４ＨＣＯ_３で洗浄し、ＡＣＮで脱水した後、最終的なトリプシンの濃度が０．０１μｇ／μｌとなるまで、０．１ＭのＮＨ_４ＨＣＯ_３中において１０〜１５μｌシークエンシンググレード修飾トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）中でゲル片を再水和し、消化のため、３７℃で一晩培養を行った。各々室温で１５分間、２５ｍＭのＮＨ_４ＨＣＯ_３中と５％ギ酸で２度、連続培養を行うことにより、ゲル片からトリプシンペプチドを溶出した。結果として得られたトリプシン消化ペプチドを、Ｚｉｐ ＴｉｐのμＣ−１８逆フェーズカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）を使用して脱塩し、ＭＡＬＤＩ標的板上に５０％ＡＣＮ−０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で直接溶出した。３３％ＡＣＮ−０．１％ＴＦＡ中のα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）（Ｓｉｇｍａ、米国）の飽和マトリクス溶液を添加した。

ＳｍａｒｔＢｅａｍ（登録商標）レーザー（３５５ｎｍ）を備え、ポジティブモード及びリフレクティブモードで作動するＡｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、ドイツ、ブレーメン）により、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析を実施した。通常、ＭＳ／ＭＳスペクトルについては２０００レーザーショットと１００００までのスペクトルを積算することにより、マススペクトルを得た。ペプチドキャリブレーション標準（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ ＧｍｂＨ、ドイツ、ライプツィヒ）を使用して、分子配置を行うために外部キャリブレーションを実施した。トリプシン自己分解ペプチドの質量を使用して、キャリブレーションのチェック又は補正を行った。これらの自己分解ペプチドと、存在する場合には派生したものであるがケラチンとを、検索に供する前に除去した。ファイル（同一箇所から得たＰＭＦ及び僅かなＬｉｆｔスペクトル（ＭＳＭＳ））とＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースの検索とを組み合わせることにより、タンパク質の特定を実施した。Ｍａｔｒｉｘ ＳｃｉｅｎｃｅのＭａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．、英国）を使用して、「その他の細菌」を分類法フィールド（４２１００を上回る配列）から選択した。ＦｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓ（登録商標）ｖ３．０及びＢｉｏｔｏｏｌｓ（登録商標）ｖ３．１ソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を分子同位体質量のＭＳスペクトルのピークへの割り当てに使用し、各々、マスリストデータ転送とＭａｓｃｏｔサーバ内のデータベースとの間の検索エンジンインタフェースとして使用した。検索には、以下のパラメータを設定した。ＭＳ及びＭＳ／ＭＳの組み合わせ検索には、０．１Ｄａの前駆体トレランスと０．５Ｄａ又は１ＤａのＭＳ／ＭＳフラグメントトレランスを設定し、固定及び可変の修飾を考慮し（各々、カルバミドメチル化システイン及び酸化メチオニン）、１つのトリプシン切断部位を許容した。算出分子質量及び観察分子質量と、ＭＳ／ＭＳ質量スペクトルと特定したペプチドに匹敵するアミノ酸配列の評価とを比較することにより、タンパク質特定をさらに評価した。

実施例１
材料及び方法
ランダムに選択した一般の歯科診療所の１９２名の患者をこの横断的研究の対象とした。研究プロトコルは、Ｌｅｐｐｉｌａｈｔｉ ＪＭら（２０１１年）により詳述されている。簡潔に述べると、口腔検査は、２名の適応一般歯科医師によるフロリダプローブによる歯周ポケット深さ（ＰＰＤ）の測定とプロービング値の出血（ＢＯＰ）の測定とからなる。背景特性を質問票で記録し、すべての患者から口濯ぎ液試料を回収した。すべての患者がインフォームドコンセントを与え、歯科医療研究所、ヘルシンキ大学、及びヘルシンキ大学中央病院の倫理委員会によって研究プロトコルを承認された。
研究対象患者は、歯周組織炎症負荷指標（Ｌｉｎｄｙ Ｏら、２００８年）とＢＯＰ％（Ｌｅｐｐｉｌａｈｔｉ ＪＭら、２０１１年）の組み合わせによる歯周組織炎症負荷レベルに基づき、４つの群に分類した。形成された患者群は、１）深い（≧４ｍｍ）歯周ポケットが無く、且つ、ＢＯＰ＜１０％である３１名の健康な歯周の被験者（群１）と、２）ＢＯＰ≧１０％であるものの、軽度の歯周組織炎症負荷とみなされる深い歯周ポケットの無い１７名の患者（群２）と、３）ＰＩＢＩ×ＢＯＰ≦１００の９７名の患者（中程度歯周組織炎症負荷レベル：群３）と、４）ＰＩＢＩ×ＢＯＰ＞１００の４７名の患者（高度歯周炎症レベル：群４）とである。

口濯ぎ液試料
使い捨てプラスチックピペットにより、１ｍｌの水道水を患者の口に入れ、１分間濯いだ後、濯ぎ液をチューブ内に回収した。この試料は、さらなる解析のため直ちに冷凍した（Ｌｅｐｐｉｌａｈｔｉ ＪＭら、２０１１年）。

ＭＭＰ−８解析
口濯ぎ液試料を解凍した後、Ｈａｎｅｍａａｉｊｅｒ Ｒら（１９９７年）らによって述べられるとおり、時間分解免疫蛍光検定（ＩＦＭＡ）によってＭＭＰ−８レベルの解析を行った。簡単に述べると、単クローン性ＭＭＰ−８フラグメント特定抗体１４９１−Ｅ６−Ｆ７及び１４９２−Ｂ３−Ｃ１１を各々、捕捉抗体及びトレーサ抗体として使用した。トレーサ抗体をユーロピウムキレートを使用してラベル付けした（Ｈｅｍｍｉｌaら、１９８４年。時間分解免疫蛍光分析検定におけるラベルとしてのユーロピウム。Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ１３７：３３５〜３４３）。検定緩衝剤は、２０ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ＭのＮａＣｌと、５ｍＭのＣａＣｌ_２と、５０μＭのＺｎＣｌ_２と、０．５％ウシ血清アルブミンと、０．０５％アジ化ナトリウムと、２０ｍｇ／リットルのＤＴＰＡとを含有させた。試料を検定緩衝剤で希釈し、１時間培養した後、トレーサ抗体で１時間培養した。増強液を添加し、５分後、１２３４Ｄｅｌｆｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｗａｌｌａｃ、フィンランド、トゥルク）を使用して蛍光を測定した。上述のＩＥＭＡ法により、ＭＭＰ−８レベルも解析した。また走査画像解析により異なる分子形態（２１、２５、３５、４５、５５、及び６０〜７０ｋＤａ）のＭＭＰ−８を特定するＩＦＭＡ法のトレーサ抗体（１４９２−Ｂ３−Ｃ１１）を使用し、上述のようなウェスタンイムノブロッテイングで試料を解析した。

データ解析
異なるＭＭＰ−８分子形態の有病率と全ＭＭＰ−８の割合を走査画像より解析し、すべての患者について算出した。ＭＭＰ−８のＩＦＭＡ及びＩＥＭＡレベル、各ＭＭＰ−８分子形態の絶対量、それらの割合、及び組み合わせについて、異なる試験群と、喫煙者及び非喫煙者との間でノンパラメトリック検査（一対比較のためのマンホイットニー検査、複数の群についてのクラスカルウォリス検査、順序付対立の動向を調べるヨンクヒールタプストラ検査）を行って比較した。異なる検査群における異なるＭＭＰ−８ｋＤａ種の有病率／発現をカイ２乗検査で解析した。

以下のロジスティック回帰を非調整及び多変量調整で実施した。
１）ＩＦＭＡレベル及びＩＥＭＡレベルと異なるＭＭＰ−８ｋＤａ種（従変数）との相関。多変量調整ロジスティック回帰分析では、歯数、ＢＯＰ％、連続変数としての４〜５ｍｍ及び≧６ｍｍのポケット数、及び二分（ｙｅｓ／ｎｏ）変数としての喫煙。
２）ＭＭＰ−８ｋＤａ種の割合及び絶対走査単位と、その高度ＩＦＭＡレベル及びＩＥＭＡレベル（≧高度歯周組織炎症負荷を伴う群４の歯数レベルを考慮した中央値ＩＦＭＡ及びＩＥＭＡ）との組み合わせの相関。多変量調整では、モデルＢＯＰ％、連続変数としての４〜５ｍｍ及び≧６ｍｍのポケット数、及び二分（ｙｅｓ／ｎｏ）変数としての喫煙。
３）ＭＭＰ−８ｋＤａ種と高度歯周組織炎症負荷レベル（群４）との相関。多変量調整では、モデルＢＯＰ％、連続変数としての４〜５ｍｍ及び≧６ｍｍのポケット数、及び二分（ｙｅｓ／ｎｏ）変数としての喫煙。
４）ＭＭＰ−８ｋＤａ種と喫煙との相関。多変量調整では、モデル歯数、ＢＯＰ、連続変数としての４〜５ｍｍ及び≧６ｍｍのポケット数。
高度歯周組織炎症負荷下の患者の認識モデルを前進型段階的ロジスティック回帰解析で実施した。ＩＦＭＡレベル及びＩＥＭＡレベル（歯数を考慮）、ＢＯＰ％、及び喫煙ステータス（ｙｅｓ／ｎｏ）を有病率、２１ｋＤａ、２５ｋＤａ、３５ｋＤａのＭＭＰ−８種の絶対量及び割合とともに１つずつ、及び組み合わせにより検査した。

受信者動作特性（ＲＯＣ）解析を実施し、ＭＭＰ−８のＩＦＭＡレベル及びＩＥＭＡレベルの診断感度及び特異度と、試験群における２５＋３５ｋＤａ種の有病率とを評価した。

ｐ値＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。ＩＢＭのＳＰＳＳ統計バージョン２０で統計解析を実施した。

結果
表１は、歯周組織炎症負荷に基づく、４つの試験群の特性を表示している。群１及び群２では、喫煙者が４名（１２．９％）及び３名（１７．６％）であり、喫煙者全員につき≦１０本／日であった。群３及び群４では、喫煙がより一般的であり［各々、２０名（２０．６％）及び２３名（４８．９％）］、群３では１０名（５０％）の患者と群４では１７名（７３．９％）の患者につき＞１０本／日であった。男性患者数は、歯周組織炎症負荷（ｐ＝０．０１１）の増加に合わせて増加した。

ＭＭＰ−８ｋＤａ種の有病率、絶対量、及び割合
すべての試験群につき、異なるＭＭＰ−８ｋＤａ種の有病率パーセンテージ、絶対量（走査単位）の中央値（ＩＱＲ）レベル、及び割合を表３に示した。さらに、すべての試験群の間で顕著な差を示したＭＭＰ−８分子形態、すなわち２５ｋＤａ種と３５ｋＤａ種の有病率及び絶対量を、喫煙者及び非喫煙者について別々に計算し、表２に示した。

群４では、喫煙者で、２５ｋＤａ種、３５ｋＤａ種、及び２５＋３５ｋＤａ種の有病率及び絶対量がともに著しく高かった。２４ｋＤａ種の有病率はすべての群（ｐ＝０．０２５）の間で著しく異なり、喫煙者（ｐ＝０．０１１）及び非喫煙者（ｐ＝０．０４６）のいずれの２５＋３５ｋＤａ有病率も群４で高かった。非喫煙者中、３５ｋＤａ種の総量はすべての試験群間で著しく異なった。組み合わせ群１〜３対群４で差異を解析したとき、群４の喫煙者の２５ｋＤａ種、３５ｋＤａ種、及び２５＋３５ｋＤａ種の有病率が著しく高かった（各ｐ値は、０．０１１、０．０３８、及び０．００５）。

ＭＭＰ−８ＩＦＭＡレベル及びＩＥＭＡレベル
ＩＦＭＡ解析結果とＩＥＭＡ解析結果の相関は非常に高かった（ピアソン相関係数は０．９５４、ｐ＜０．０１レベルで有意）。現在のＩＦＭＡ解析と依然のＩＦＭＡ解析（Ｌｅｐｐｉｌａｈｔｉら、２０１１年）の間のピアソン相関係数は０．６２７でｐ＜０．０１レベルで有意であった。

表４は、すべての試験群について、歯数及び喫煙ステータスを考慮に入れた際のＩＦＭＡ及びＩＥＭＡで解析したＭＭＰ−８レベルを示している。ＭＭＰ−８ＩＦＭＡレベルの上昇に対して群１〜４で有意な動向が存在し、動向は順序付対立について検査した際（ｐ＝０．０３５）で有意となり、ＩＦＭＡについて検査した際（ｐ＝０．０５８）で有意となった。歯数を考慮した場合、ＩＦＭＡ及びＩＥＭＡの双方についての動向が群１〜４で有意であった（各々、ｐ＝０．０１６及びｐ＝０．０２５）。群４のレベルを群１〜３のレベルと比較したとき、すべての比較において、ｐ値０．０３５、０．０３３、０．０１３、及び０．０１１で有意な結果となった。群１〜３の間のレベルは類似していた（各々、ｐ値０．６４３、０．８２２、０．６４７、及び０．８１６）。

喫煙を考慮にいれたとき、非喫煙者において動向はより強くなり、ＩＦＭＡについてはｐ＝０．０２０、ＩＥＭＡについてはｐ＝０．０３８であり、歯数も考慮に入れたとき、ＩＦＭＡについてはｐ＝０．０１０、ＩＥＭＡについてはｐ＝０．０２８であった（表４、図１）。喫煙者については有意な動向が見られなかった。群４の喫煙者レベル及び非喫煙者レベルを考慮し、歯数を群１〜３の喫煙者レベル及び非喫煙者レベルと比較したとき、群４の非喫煙患者のＩＦＭＡレベル及びＩＥＭＡレベルは他の試験群（各々、ｐ値が０．００９及び０．０１３）より著しく高かった。しかしながら、群３及び４の研究被験者を非喫煙者、≦１０本／日の喫煙患者、又は＞１０本／日の喫煙患者に分けたとき、統計的有意性は見られなかったものの、＞１０本／日の喫煙者における分布が≦１０本／日の喫煙患者における分布より幅広く、特に群４の非喫煙者と類似していた（図１）。

異なるＭＭＰ−８ｋＤａ種との関連におけるＩＦＭＡレベル及びＩＥＭＡレベル
ＩＦＭＡレベル及びＩＥＭＡレベルは、２１ｋＤａＭＭＰ−８種陽性患者において著しく高レベルであった（各々、ｐ値は０．０１１及び０．００３であった。非喫煙者については、０．００５及び０．００２であった。喫煙者については、差は顕著でなかった）。しかしながら、喫煙は２１ｋＤａ種の有病率に顕著な作用を及ぼすことはなかった。

多変量調整ロジスティック回帰解析では、ＩＦＭＡレベル及びＩＥＭＡレベルは、２１ｋＤａ（ＩＦＭＡについてはＯＲ＝１、９５％ＣＩ１〜１．００１、ｐ＝０．００８。ＩＥＭＡについてはＯＲ＝１、９５％ＣＩ１〜１．００１、ｐ＝０．００４）と、２１及び２５ｋＤａの組み合わせ（ＩＦＭＡについてはＯＲ＝１、９５％ＣＩ１〜１．００１、ｐ＝０．００２。ＩＥＭＡについてはＯＲ＝１、９５％ＣＩ１〜１．００１、ｐ＝０．００１）と、２５及び３５ｋＤａ種（２１〜３５ｋＤａ）（ＩＦＭＡについてはＯＲ＝１、９５％ＣＩ１〜１．００１、ｐ＝０．００２。ＩＥＭＡについてはＯＲ＝１、９５％ＣＩ１〜１．００１、ｐ＝０．００１）を合わせたものとの有病率とに相関したものの、２５ｋＤａ種及び３５ｋＤａ種単独の有病率とは相関しなかった。また非調整ロジスティック回帰解析（双方について、ＯＲ＝１、９５％ＣＩ１〜１．００１、ｐ＝０．０２８）では、２１＋４５ｋＤａ種の組み合わせがＩＦＭＡレベル及びＩＥＭＡレベルと相関した。多変量調整ロジスティック回帰解析における他の共変量のうち、ＩＦＭＡが共変量であるとき、又はＩＥＭＡが共変量であるときの双方で、喫煙は２５、３５、２５＋３５、２１＋３５ｋＤａ種と有意に相関し、ＢＯＰは４５、２１＋４５、２１−４５、２５＋４５、及び３５＋４５ｋＤａ種と相関した。

さらに有病率、ＭＭＰ−８ｋＤａ種の総走査単位及び絶対走査単位からの有病率、割合、及び高ＩＦＭＡレベル（≧歯数を考慮した群４の中間レベル）との組み合わせの相関について解析した。非調整回帰解析及び多変量回帰解析の双方において、２１ｋＤａ（ｐ＝０．０１１）、２５ｋＤａ（ｐ＝０．０５０）、２１＋２５ｋＤａ（ｐ＝０．０１１）、２１＋３５ｋＤａ（ｐ＝０．００６）、２１＋４５ｋＤａ（ｐ＝０．０１２）、２１−３５ｋＤａ（ｐ＝０．００９）、及び２１−４５ｋＤａ（ｐ＝０．０１０）の絶対量（多変量回帰解析のｐ値については括弧内）と、ＭＭＰ−８総量（ｐ＝０．０１０）が高ＩＦＭＡレベル（図２Ａ）と相関した。

高ＩＥＭＡレベルについても同様の検査を実施した。多変量調整回帰解析では、２１ｋＤａ（ｐ＝０．０１３）、２５ｋＤａ（ｐ＝０．０４４）、２１＋２５ｋＤａ（ｐ＝０．０１１）、２１＋３５ｋＤａ（ｐ＝０．００６）、２１＋４５ｋＤａ（ｐ＝０．０１４）、２１−３５ｋＤａ（ｐ＝０．００７）、及び２１−４５ｋＤａ（ｐ＝０．００８）の総量並びにＭＭＰ−８（ｐ＝０．００７）の総量が有意であった。

２１ｋＤａ種に対する他のＭＭＰ−８分子形態の有病率
２５ｋＤａ種及び３５ｋＤａ種の有病率を、２１ｋＤａ種陽性被験者及び２１ｋＤａ種陰性被験者について解析した。すべての研究被験者をともに解析したとき、３５ｋＤａ種有病率は、２１ｋＤａ陰性患者（５６．５％）に比して２１ｋＤａ陽性患者（８９．６％）において著しく高かった（ｐ＜０．００１）。２１ｋＤａ種が陽性／陰性であるとき（ｐ＜０．００１）、群３における２５ｋＤａ種別は８８．３％／４４．３％と顕著な差が見られた。また群４における各値は、２１ｋＤａ種が陽性／陰性であるとき、３５ｋＤａ種については９４．７％／７１．４％（ｐ＝０．０４６）であり、２５ｋＤａ種については１００％／７１．４％（ｐ＝０．０１１）であった。

ＩＦＭＡ、ＩＥＭＡ、及びＭＭＰ−８分子形態の高度歯周組織炎症負荷との相関
２５ｋＤａ（ＯＲ２.５６６、９５％ＣＩ１．１１４〜５．９０９、ｐ＝０．０２７）、２５＋３５ｋＤａ（ＯＲ２．５８６、９５％ＣＩ１．２２１〜５．４７７、ｐ＝０．０１３）、及び２１−４５ｋＤａ（ＯＲ３．１０、９５％ＣＩ１．１２１〜８．５６８、ｐ＝０．０２９）種の有病率は、高度歯周組織炎症負荷（群４）と有意に相関した。しかしながらこの相関は、多変量調整解析では有意でなかった（２５＋３５ｋＤａ種の組み合わせで有意となった。ｐ＝０．０５３）。

非調整解析において、ＩＦＭＡレベル及びＩＥＭＡレベルの双方は、高度歯周組織炎症負荷の群４に相関した。ＩＦＭＡについては、ＯＲ１、９５％ＣＩ１．０〜１．００１、ｐ＝０．０２９であり、ＩＥＭＡについては、ＯＲ１、９５％ＣＩ１．０〜１．００１、ｐ＝０．０４６であった。
代わりに、共変量ＢＯＰ％及び喫煙が高度歯周組織炎症負荷の群４と強く相関し、すべての解析において、ＢＯＰ％についてはｐ値＜０．００１であり、喫煙については＜０．００１〜０．００２であった。

ＩＦＭａ及びＭＭＰ−８ｋＤａ種と喫煙との相関
非調整ロジスティック回帰解析及び調整ロジスティック回帰解析の双方において、３５ｋＤａＭＭＰ−８種と２５＋３５ｋＤａＭＭＰ−８種の有病率は喫煙と有意に相関しており、多変量調整モデルにおいてｐ値は各々０．０３３及び０．００８であった。４５ｋＤａ種は、非調整解析においては有意でなかったものの、調整モデルでは防御可能であった（ｐ＝０．０３３）（図３Ｂ）。

また３５ｋＤａ（ｐ＜０．００１）の割合、２５＋３５（ｐ＜０．００１）、２５−４５（０．００３）、３５＋４５（０．０１０）、２１−４５（ｐ＝０．０１２）、及び２１＋３５（ｐ＝０．００２）ｋＤａ種の組み合わせの割合が喫煙と相関した（図３Ｃ）（各々、ＭＭＰ−８種について述べた後、多変量調整モデルのｐ値を括弧内に示した）。いずれのＭＭＰ−８種別の絶対量も、喫煙とは有意に相関しなかった。すべての多変量調整回帰解析において、４〜５ｍｍのポケット数は喫煙と有意に相関した。

ＢＯＰ％と異なるＭＭＰ−８種別の相関
すべての研究被験者において、４５ｋＤａ種の有病率は、ＢＯＰ≧２５％の患者でＢＯＰ＜２５％の患者より高かった（ｐ＝０．００３、カイ２乗）。この差は、４５ｋＤａ種別（ｐ＝０．００２）の少量についても、非喫煙者（ｐ＝０．００１）においても統計的に有意であった。しかしながら有病率≧２５％のプロービング値の出血は、群１において０、群２及び３の双方において９．１％、群４において８１．８％であった。従って≧２５％のケースの最大ＢＯＰは、主として群４に属するものであった。群４では、４５ｋＤａ種の絶対量、有病率、及び割合が、ＢＯＰ＜２５％の患者に比してＢＯＰ≧２５％の患者において顕著に高かった（各々、ｐ値は０．００９、０．０２２、及び０．０３７）。群４の喫煙者と非喫煙者との間には有意な差は見られなかった。

非調整ロジスティック回帰解析では、４５ｋＤａ種別のＭＭＰ−８の有病率がＢＯＰ≧２５％と相関し、ＯＲ３．６６、９５％ＣＩ１．５２３〜８．７９７、ｐ＝０．００４であった。多変量調整ロジスティック回帰解析では、４５ｋＤａ種別の有病率がＢＯＰ≧２５％と相関し、ＯＲ３．６６、９５％ＣＩ１．３０９〜８．６３４、ｐ＝０．０１２であった。その他の共変量は有意でなかった。その他のＭＭＰ＝８分子形態はＢＯＰ≧２５％と相関しなかった。

モデル化及び受信者動作特性解析
前進型段階的ロジスティック回帰解析により、口濯ぎ液試料から高度歯周組織炎症負荷下の患者（群４）の認識モデルを実行した。ＩＦＭＡ及びＩＥＭＡ（歯数を考慮）、ＢＯＰ％、及び喫煙ステータス（ｙｅｓ／ｎｏ）とともに、２１、２５、及び３５ｋＤａ種１つずつ、及びその組み合わせの有病率、絶対量、及び割合を検査した。ベストモデルは、２５＋３５ｋＤａ種のＢＯＰ％、喫煙ステータス、及び有病率の組み合わせであり、各々、ｐ値が＜０．００１、０．００６、及び０．０４４であった。

受信者動作特性（ＲＯＣ）解析を実施し、試験群におけるＭＭＰ−８のＩＦＭＡレベル及びＩＥＭＡレベル、２５＋３５ｋＤａ種の有病率の診断感度及び特異度を評価した。群４のＩＦＭＡ、ＩＥＭＡ、及び２５＋３５ｋＤａ種について、相違は状態変数として有意であった（図４）。群４のＩＦＭＡについては、ＲＯＣ曲線下方の領域が０．６０２であり、９５％信頼区間（ＣＩ）が０．５０７〜０．６９８、ｐ値が０．０３５であった。ＩＥＭＡについては、ＲＯＣ下方の領域が０．６０４であり、９５％ＣＩが０．５１０〜０．６９７、ｐ値が０．０３３であった。２５＋３５ｋＤａの有病率については、ＲＯＣ曲線下方の領域が０．６０４、９５％ＣＩが０．５１４〜０．６９３、ｐ値が０．０３３であった。ＢＯＰ値については、ＲＯＣ曲線下方の領域が０．８８０、９５％ＣＩが０．８３２〜０．９２８、ｐ値が０．０２５であった。ＲＯＣ解析により、２５＋３５ｋＤａＭＭＰ−８活性化物質は、５５〜７０ｋＤａＭＭＰ−８種とは異なり、ＩＦＭＡ及びＩＥＭＡの解析とともに歯周炎患者を識別するものであることを明らかにした。

実施例２
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）解析をＫｉｉｌｉ Ｍら（２００２年）に準じて実施した。

ｒｈＭＭＰ−８の量及び培養時間を図４に示す。図４Ａは、組み換えヒトＭＭＰ−８（Ｐｒｏｔｅａｉｍｍｕｎ）に対する有機水銀化合物ＡＰＭＡの作用を示し、図４Ｂは、ＮａＯＣｌ活性化因子の作用を示す。ＡＰＭＡ及びＮａＯＣｌはともに活性化に際して低分子量ＭＭＰ−８種の生成を誘発する。２０〜３０ｋＤａ活性化フラグメントの時間依存形成を矢印で示す。
上述のウェスタンイムノブロッティング法を使用してウェスタンイムノブロット解析を実施した。図４Ｃは、ＡＰＭＡ及びＮａＯＣｌ並びに血清及び異なるヒトの体液により、活性化ｒｈＭＭＰ−８の１４９１−Ｅ６−Ｆ７−単クローン性ａｎｔｉ−ＭＭＰ−８抗体（Ｐｒｏｔｅａｉｍｍｕｎ、Ｍｅｒｃｋ、及び本発明のＭＭＰ−８抗原）を使用したウェスタンイムノブロット解析を示す。

ヒトの歯周炎歯肉溝浸出液（ＧＣＦ）、ヒトのインプラント周囲炎内縁流体（ＰＩＳＦ）、ヒトの矯正治療歯のＧＣＦ、ヒトの歯周炎唾液、ヒトの歯周炎口濯ぎ液、ヒトの羊水の感染試料、ヒトの脳脊髄液、及びヒトの敗血症血清の試料を以下のレーン１０〜レーン１７に使用した。

レーン１：ＰｒｏｔｅａｉｍｍｕｎによるｒＭＭＰ−８
レーン２：レーン１と同一のものプラスＡＰＭＡ
レーン３：レーン１と同一のものプラスＮａＯＣｌ
レーン４：ＭｅｒｃｋによるｒｈＭＭＰ−８
レーン５：レーン４と同一のものプラスＡＰＭＡ
レーン６：レーン４と同一のものプラスＮａＯＣｌ
レーン７：本発明のＭＭＰ−８抗原
レーン８：レーン７と同一のものプラスＡＰＭＡ
レーン９：レーン７と同一のものプラスＮａＯＣｌ
レーン１０：ヒトの歯周炎歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）
レーン１１：ヒトのインプラント周囲炎内縁流体（ＰＩＳＦ）
レーン１２：ヒトの矯正治療を行った歯のＧＣＦ
レーン１３：ヒトの歯周炎唾液
レーン１４：ヒトの歯周炎口濯ぎ液
レーン１５：感染したヒトの羊水
レーン１６：ヒトの脳脊髄液
レーン１７：ヒトの敗血症血清

ＭＭＰ−８の活性化に際して形成される優勢な２０〜３０ｋＤａフラグメントを矢印で示す。

実施例３
非感染（＃１６）及び感染（＃１２、＃１３、及び＃１９）ヒト羊水試料を使用し、上述のウェスタンイムノブロッティング法によりウェスタンイムノブロット解析を実施した。解析に用いたＩＦＭＡで査定の異なる試料、及び異なるＭＭＰ−８濃度について次の各レーンに示す。使用したゲルは１１％であった。検査は３つの異なる抗体、すなわち単クローン性ＭＭＰ−８特定抗体１４９１−Ｅ６−Ｆ７（７．）、１４９２−Ｂ３−Ｃ１１（４．）（Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、フィンランド、カウニアイネン）、及び多クローン性抗体（３．）（Ｌａｕｈｉｏ Ａら、１９９４年）を使用して実施した。その他、使用したすべての抗体についてレーンは同一であったが、多クローン性ａｎｔｉ−ＭＭＰ−８についてレーン８及び１０には試料がなかった。結果を図５に示す。ＭＭＰ−８フラグメント２５ｋＤａ＋３５ｋＤａのレベルは、ＩＦＭＡで査定したＭＭＰ−９レベルに相関した。

レーン１ 標準
レーン２ ＃１６、２１０μｇ／ｌ ＭＭＰ−８（１４μｌ×１５μｇ・ｌ）／ｗｅｌｌ
レーン３ ＃１２、２１０μｇ／ｌ ＭＭＰ−８
レーン４ ＃１２、２０００μｇ／ｌ ＭＭＰ−８
レーン５ ＃１２、４００００μｇ／ｌ ＭＭＰ−８
レーン６ ＃１２、７６１６０μｇ／ｌ ＭＭＰ−８（１４μｌ×５４４０μｇ・ｌ）／ｗｅｌｌ
レーン７ ＃１３、２１０μｇ／ｌ ＭＭＰ−８
レーン８ ＃１３、２０００μｇ／ｌ ＭＭＰ−８
レーン９ ＃１３、４００００μｇ／ｌ ＭＭＰ−８
レーン１０ ＃１３、１８６０８８μｇ／ｌ ＭＭＰ−８（１４μｌ×１３２９２μｇ・ｌ）／ｗｅｌｌ
レーン１１ ＃１９、２１０μｇ／ｌ ＭＭＰ−８
レーン１２ ＃１９、２０００μｇ／ｌ ＭＭＰ−８
レーン１３ ＃１９、４００００μｇ／ｌ ＭＭＰ−８
レーン１４ ＃１９、１２７６６６μｇ／ｌ ＭＭＰ−８（１４μｌ×９１１９μｇ・ｌ）／ｗｅｌｌ

実施例４
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）解析をＫｉｉｌｉ Ｍら（２００２年）に準じて実施した。組み換えヒトＭＭＰ−８（Ｐｒｏｔｅａｉｍｍｕｎ）をＡＰＭＡで活性化した。ｒｈＭＭＰ−８の量と培養時間を次に示す。シークエンシングに使用したバンドを図６に示す。

レーン１ １．５μＬ分子量基準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
レーン２ ２μｌ分子量基準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
レーン３ １μｌ ＭＭＰ−８（０．１５μｇ／μｌ）＋３μｌ ＴＮＣ緩衝剤（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ7．８：０．２Ｍ ＮａＣｌ：０．７５ｍＭ ＣａＣｌ_２）
レーン４ 空
レーン５ １μｌ ＭＭＰ−８（０．１５μｇ／μｌ）＋４μｌ ２ｍＭ ＡＰＭＡ＋３μｌ ＴＮＣ緩衝剤、培養時間２時間（３７℃）
レーン６ 空
レーン７ １μｌ ＭＭＰ−８（０．１５μｇ／μｌ）＋４μｌ ２ｍＭ ＡＰＭＡ＋３μｌ ＴＮＣ緩衝剤、培養時間５．５時間（３７℃）

シークエンシングは、上述のシークエンシング法に準じて実施した。図６のゲルバンド１〜８にシークエンシングを施した。バンドのサイズは次のとおりであった。

バンド２＝３２ｋＤａ
バンド３＝２５ｋＤａ
バンド４＝２１ｋＤａ
バンド５＝２５ｋＤａ
バンド６＝２１ｋＤａ
バンド７＝１２ｋＤａ
バンド８＝５ｋＤａ

バンド３、４、５、及び８は配列番号１を含み、バンド２、３、４、５、及び６は配列番号２を含む。バンド７はＭＭＰ−８のその他のフラグメントを特定した。バンド１にはいずれのＭＭＰ−８フラグメントも特定されなかった。バンド３、４、及び５のＭＭＰ−８活性化物質は配列番号１及び配列番号２の双方を含む。配列番号１のアミノ酸１１９〜１３２と配列番号２のアミノ酸１５１〜１６５は全体ＭＭＰ−８配列の中間領域ドメインからであった。

実施例５
実施例２及び実施例３でフラグメントを示すのに使用した単クローン性抗体により、ヒトの胎盤から抽出した精製ヒトａＭＭＰ−８にＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析及びウェスタンブロット解析を実施した。

アフィニティクロマトグラフィーカラム（３０ｍｌセファロースカラム（Ｂｉｏ Ｒａｄ）用にａｎｔｉ−ｈＭＭＰ−８−Ａｂ（マウスａｎｔｉ−ｈＭＭＰ８ＭｏＡＢ１４９１−Ｅ６−Ｆ７（Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ）をＮＨＳ−セファロース（ＮＨＳ−活性化セファロース４Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））に結合した。胎盤素材（ヒトのＭＭＰ−８−胎盤抽出物（ｉｎ．ｖｅｎｔ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ））の濃縮は、遠心濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ１５及びＶｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）２ （Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ））により実施した。アフィニティクロマトグラフィは、各ラン（ゲル電気泳動「Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅａｎ ３ ｃｅｌｌ」及びブロッティング機器「Ｍｉｎｉ Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ ｃｅｌｌ」（Ｂｉｏ Ｒａｄ））につき１０ｍｌの濃縮素材胎盤抽出物を使用して実施した。酸性溶出は、ｐＨ２．２のクエン酸緩衝剤によって実施した。５ｍｌの画分を回収した。画分をプールし、遠心濃縮器で濃縮した。緩衝剤塑性を調整して（ミニダイアライザーＭＤ１０００（Ｓｃｉｅｎｏｖａ）精製ヒトａＭＭＰ−８を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））及びウェスタンブロット（Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｕａｌ Ｘｔｒａ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）を使用したｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ膜０，２μｍ、７×８，４ｃｍ（Ｂｉｏ Ｒａｄ））を実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＷＢには、分離ゲル１２％及び回収ゲル４％のＳＤＳゲルを利用した。

その結果を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥについては図７に、ウェスタンブロットについては図８に示す。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥの銀色染色ゲルは、全試料の比較バンドを表示しており、これまで知られていた３５ｋＤａ超のフラグメントとともに、１０〜１５ｋＤａのフラグメント及び２０〜３５ｋＤａのフラグメントを顕著に示している。丸で囲んだウェスタンブロットバンドは比較的弱いものの、本来のブロット上に観察することができた。「＊」マークを付した分子量マーカーの７５ｋＤａ及び２５ｋＤａバンドは、赤色であり、本来のブロット内に明らかに見ることができる。免疫学的染色では、１０〜１５ｋＤａを増幅し、より高度に濃縮された試料中では２０〜３５ｋＤａフラグメントもマークする。

結果を実施例２及び３で示した結果と相互に関連づけ、確認する。

・参照文献
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・Ｌｉｎｄｙ Ｏら「スタチン使用が歯肉病変抑制に関連する」ＢＭＣ Ｏｒａｌ Ｈｅａｌｔｈ１５；８：１６、２００８年
・Ｍａ Ｊら「異なるカテゴリーのインプラント周囲上下骨喪失におけるコラゲナーゼ」Ｊ Ｄｅｎｔ Ｒｅｓ；７９：１８７０〜１８７３、２０００年
・Ｔｕｒｕｎｅｎら「マロンジアルデヒド修飾低密度リポタンパク質への天然ＩｇＭ結合によるポリフィロモナスジンジルバリスジンジパインエピトープの認識」ＰｌｏＳ ＯＮＥ７（４）：ｅ３４９１０．Ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００３４９１０、２０１２年
・Ｘｕ Ｌら「歯周炎及びインプラント周囲炎の患者における歯肉溝滲出液及びインプラント周囲内縁流体から得たコラゲナーゼ−２の特性」Ａｃｔａ Ｏｄｏｎｔ Ｓｃａｎｄ；６６：２１９−２２４、２００８年

Claims (6)

1. 試料中のＭＭＰ−８活性の判定方法であって、
   ａ）被験者からの生体試料を提供するステップと、
   ｂ）前記生体試料において、好ましくは全体ＭＭＰ−８配列の中間領域ドメインから１つ以上のＭＭＰ−８活性フラグメントを含み、１０〜３５ｋＤａ、好ましくは２０〜３０ｋＤａ、より好ましくは約１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、３０ｋＤａ、又は３５ｋＤａのサイズを有する１つ以上のＭＭＰ−８活性化物質の存在を検出するステップであって、１つ以上の活性化物質が配列番号１及び／又は配列番号２の配列を含むステップと、
   ｃ）選択的に、ＭＭＰ−８活性化物質の存在を前記試料中の活性型ＭＭＰ−８の存在と相互に関連付けるステップと、及び／又は、
   ｄ）選択的に、ＭＭＰ−８活性化物質の存在を前記試料中のより大きな活性型ＭＭＰ−８フラグメントの存在と相互に関連付けるステップを備え、
   前記生体試料中のＭＭＰ−８活性化物質の存在は、前記試料中の活性型ＭＭＰ−８の存在を表示、確認、及び／又は予測するものである方法。
2. 前記試料は、口腔、歯肉溝滲出液、インプラント周囲内縁流体、オーラルプラーク、歯垢、口濯ぎ液、口洗浄液、唾液、根管流体、傷からの滲出液、ＰＵＳ、オーラルバイオフィルム、組織バイオプシー、口腔スワップ、口腔病斑からの血液より得られる請求項１に記載の方法。
3. 前記試料は、羊水、血清、血漿、膣洗浄、鼻洗浄、副鼻腔、耳腔、尿、関節液、脳脊髄液、排泄物、スワップ、涙液、洗浄（肺）、組織バイオプシー、及び／又は汗より得られる請求項１に記載の方法。
4. 前記ＭＭＰ−８活性化物質の存在は、前記生体試料中のＭＭＰ−８フラグメントの検出を行うリガンドシステムを使用して判定される請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記リガンドシステムは、１つ以上の抗体、抗体対、及び／又は抗体フラグメントからなり、検定は、好ましくはウェスタンブロッティング、ＩＦＭＡ、ＥＩＡ、ＩＥＭＡ、ＥＬＩＳＡ、ラテラルフロー検定、表面プラズモン共鳴検定、及び電気化学検定からなる群より選択される定量的、半定量的、又は定性的な免疫学的測定法である請求項４に記載の方法。
6. 前記ＭＭＰ−８活性化物質の存在は、前記全体ＭＭＰ−８配列の中間領域ドメインからの１つ以上のＭＭＰ−８活性化フラグメントを前記生体試料中に検出する直接的タンパク質検出技術を使用して判定される請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。