FI98961C - Menetelmät ja määritysvälineet parodontaalisairauden aktiivisuuden ja/tai peri-implantiitin ja/tai niiden kohonneen riskin diagnosoimiseksi - Google Patents

Description

Menetelmät ja määritysvälineet parodontaalisairauden aktiivisuuden ja/tai peri-implantiitin ja/tai niiden kohonneen riskin diagnosoimiseksi 98961 Förfarande ooh testmedel för att diagnostisera parodontal-sjukdomsaktivitet och/eller peri-implantitis och/eller förhöjd risk för dessa

Keksintö koskee menetelmiä ja määritysvälineitä, joilla voidaan diagnostisoida parodontaalisairauden aktiivisuus ja/tai peri-implantiitti ja/tai mainittujen sairauksien kohonnutta riskiä käyttäen immunologisia määrityksiä ja niihin sopivia välineitä.

Parodontaalisairaudet ovat ihmisen hampaiston pääasiallinen huolen aihe. Nykyään menetetään hampaita enemmän parodontaalisairauden vaikutuksesta kuin karieksen takia. Tämän vuoksi on suuri tarve kehittää luotettavia diagnostisia määritysmenetelmiä parodontaalisairauksien diagnoosia ja seurantaa varten. Parodontaalisairaus sisältää ryhmän tulehdussairauksia, jotka johtuvat ikeneen ja • : : hampaita tukevan hammaskuopan (leuan) luurakenteisiin vaikuttavista infektioista. Parodontaalisairauksien pää- « « ;*·*; asiallinen syy on bakteeripeite eli plakki, joka aiheut- taa ikenen tulehtumisen, mikä saattaa johtaa varsinaisen • · hammasta tukevan rakenteen ja luun tuhoutumiseen. Parodon- * taalisairaudessa kertyy tavallisesti huomattava bakteeri- • · · peite hampaan pinnalle, sekä ienrajan yläpuolelle (supra-gingivaalinen) että alapuolelle (subgingivaalinen). Tämä • · plakki voi kalsifioitua koko syvyydeltään muodostaen ' hammaskivenä (calculus) tunnetun muotoutuman. Tämä kivi- kerrostuma· ja siihen liittyvä plakki voi synnyttää "tas-kun" hampaiden ja ikenen väliin, joka on tyypillistä parodontaalisairaudelle.

- 98961 2

Koska tulehdussairauksilla on monia syitä ja erilaisia oireita, parodontaalisairauksien toteamiseksi on kehitetty useita menetelmiä. Kuitenkaan mikään tämänhetkisistä tutkimusmenetelmistä ei ole riittävän tarkka ja spesifinen ollakseen luotettava työkalu diagnosoitaessa parodon-taalisairauden aktiivisuutta ja arvioitaessa peri-implan-tii ttia.

On tehty useita yrityksiä kehittää menetelmiä, joilla voitaisiin arvioida etenevää parodontiittia, kuten jäljempänä esitetään, mutta mikään niistä ei ole testivaiheessa osoittautunut riittävän nopeaksi ja luotettavaksi hammaslääkärin vastaanotolla suoritettavaksi testiksi.

1. Näköhavaintoon perustuva tutkimus

Kun parodontaalisairaus vaikuttaa ikeneen, voidaan todeta ikenen värin muuttumista (vaaleanpunaisesta punaiseksi) ja ikenen rakenteen muutoksia, s. o. punoitusta ja turvotusta, kuten myös lisääntynyttä taipumusta verenvuotoon _ ;. tällä nimenomaisella ienalueella. Parodontaalisairauden ! . pidemmällä oleviin vaiheisiin liittyy usein myös hampaan ; lisääntynyt liikkuvuus ja hampaiden siirtyminen.

- 98961 3 2. Parodontaalisen tilan kliininen arviointi ja parodon-taalisten vaurioiden tutkiminen

Taskun syvyys, s. o. etäisyys ikenen reunasta ientaskun pohjaan, mitataan asteikolla varustetun parodontaalisen koettimen avulla. Taskun syvyys arvioidaan hampaiston kaikkien hampaiden jokaiselta pinnalta. Parodontaalisella tutkimuksella saadut alle 4 mm olevat taskun syvyydet jätetään merkitsemättä mittaus karttaan, koska sellaisten taskujen katsotaan kuuluvan normaalivaihtelun piiriin. Täten yli 4 mm:n taskuja pidetään parodontiittitaskuina ja/tai parodontiittivaurioina. Sellaisia tutkimuksen mittausvirheitä, jotka johtuvat sellaisista tekijöistä kuten koettimen paksuus, hampaan pinnan ääriviiva ja koettimen väärä kulmaus, voidaan vähentää tai välttää valitsemalla oikea instrumentti ja suorittamalla tutkimus huolellisesti. Vaikeammin vältettäviä ovat kuitenkin virheet, jotka johtuvat tutkimuksessa käytetyn voiman vaihteluista ja parodontaalikudoksen tulehdusmuutosten laajuudesta. On huomattava, että gingiviitin (ientuleh-dus) erottaa parodontiitista se tosiasia, että gingivii-·'_ tissa, poiketen parodontiitista, ien on tulehtunut, mutta mitään syviä (yli 4 mm) parodontaalikudoksen taskuja ei . voida havaita; näin ollen gingivilttiin ei liity irrever- • ·' siibeliä hammasta tukevien rakenteiden degradaatiota • · · ··.: (tuhoutumista), joka olisi koettimella ja/tai röntgenku- • · · V * vista löydettävissä. Parodontiitille on tyypillistä tuleh tunut ien ja tuhoutuneet hammasta tukevat rakenteet; kuitenkin parodontiitti voi hyvin esiintyä "kliinisesti ·*:*: terveeltä näyttävän" ikenen alla.

• · ♦ · · ’ | Parodontaalikudoksen kiinnittymistasot voidaan arvioida • < « I « asteikolla varustetun koettimen avulla ja ilmoittaa etäi-: syytenä millimetreinä hammassementti-kiilleliitoksesta : ientaskun pohjaan. Muistiin merkitään pidempi etäisyys jokaiselta hammaspinnalta ja se saatetaan sisällyttää 4 98961 hampaan parodontiumkarttaan. Täten tällä hetkellä paro-dontaalisairaus diagnosoidaan tekemällä kliinisiä havaintoja sellaisista seikoista kuten hampaan parodontaalitas-kujen olemassaolo ja taskujen syvyys, hampaiden luuhun kiinnittymisen menetys ja ienten nystyverenvuoto. Kliiniset havainnot eivät kuitenkaan aina ole luotettavia osoittimia. Esimerkiksi syvät parodontiittitaskut - oletettujen parodontopatogeenien kanssa esiintyessäänkään - eivät välttämättä ole aktiivisia parodontaalisen kudoksen tulehduksen aiheuttamaa tuhoutumista ajatellen. Valitettavasti tällä hetkellä ei ole olemassa mitään luotettavaa, halpaa ja objektiivista menetelmää määrittää, onko parodontaali-tasku aktiivinen vai ei.

Sellaisen menetelmän puute, jolla voitaisiin paljastaa ja seurata parodontaalisairauden aktiivisuutta, on ollut vakava ongelma, erityisesti ajatellen parodontaalisairauden tyypillisesti vaatimien parannustoimenpiteiden vakavuutta.

3. Röntgenkuviin perustuva arviointi

Hammaskuopan (leuan) luun korkeutta ja luuharjun äärivii-' vaa voidaan tutkia röntgenkuvista. Röntgenkuvat tuottavat • ·’ diagnostisessa mielessä informaatiota interproksimaalisen m hammaskuopan luun korkeudesta ja muodosta. Pintarakenteet • · (luu, kudos, hampaat) tekevät kuitenkin usein vaikeaksi tunnistaa oikein poski- ja kielihammaskuoppien harjujen ··* ääriviivoja. Röntgenkuviin perustuva analysointi on yhdis- • # · · tettävä taskujen syvyyksien ja kiinni tystasotietoj en / . yksityiskohtaiseen arviointiin, jotta saataisiin oikea ja » · · *· ’* tarkka diagnoosi. Uusintakäynneillä (hoidettujen parodon- tiittipotilaiden tutkimuksissa) tarvitaan röntgenkuviin perustuvaa tutkimusta.

5 98961 4. Määritysmenetelmät oletettujen parodontopatogeenien toteamiseksi

Paljon työtä tehdään niiden suun/ikenenalaisten yksittäisten mikro-organismien tai mikro-organismiryhmien määrittämiseksi, jotka vahvimmin liittyvät eteneviin parodontiit-tivaurioihin/ -taskuihin. Hoitamattomille parodontiitti-potilaille seuraavia bakteereita (eri yhdistelminä) on ehdotettu mahdollisiksi ja tai oletettaviksi parodonto-patogeeneiksi: spirokeetat (kuten Treponema denticola),

Porphyromonas (Bacteroides) qingivalis, Bacteroides forsy-thus, Prevotella (Bacteroides) intermedia, Campylobacter rectus (Wolinella recta), Eikenella corrodens, Actino-bacillus actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum, Capnocytophaga sputiqena, Peptostreptococcus micros. Streptococcus mitis, Selenomonas sp. , Eubacterium sp. j a Haemophilus sp. Oletetut parodontopatogeenit voidaan identifioida ikenenalaisista plakkinäytteistä (i) vilje-lymäärityksinä, (ii) tutkimalla mikroskoopilla ja (iii) käyttämällä DNA-koettimia oletettujen patogeenien löytä-mi seksi.

Myös BANA/BAPNA-entsyymianalyysien merkkiaineiden, joita käytetään BANA/BAPNA-testinä tunnetussa määrityksessä, • ·' joka perustuu bentsyyliarginiininaftyyliamidin/ bentsyyli- arginiini-p-nitroanilidin hydrolyysiin ja joka on kuvattu • · · V · jäljempänä yksityiskohtaisemmin, on ehdotettu identifioi van joitakin oletettuja parodontopatogeeneja. Koska ei *·· tiedetä varmuudella, mitkä näistä organismeista ja/tai « · 1 · organismiryhmistä aiheuttavat parodontiitin etenemisen, / jonkin ja/tai joidenkin oletettujen parodontopatogeenien » · · *· 1; yhdistelmien olemassaolo ei ehkä riittävän selvästi kuvas- ' 1 ta todellista parodontaalisairauden aktiivisuutta.

• 6 98961 5. Määritysmenetelmät, jotka perustuvat isännästä peräisin oleviin entsyymeihin

Kudoksen tuhoutumistapahtumat, jotka liittyvät hammasta ympäröivän sairauden/parodontiittivaurioiden etenemiseen, johtuvat ilmeisesti sekä isännästä että bakteerista peräisin olevien proteolyyttisten entsyymien (proteinaasien) itsenäisestä ja yhteisvaikutuksesta. Parodontiittivaurioiden kehittymisen ja etenemisen aikana vapautuu pääasiassa aktivoiduista isäntäsoluista erilaisia entsyymejä, joihin kuuluu matriksimetalloproteinaaseja (MMP), elastaasi, katepsiineja ja trypsiinin kaltaisia proteinaaseja jne., ja jossakin määrin proteinaasit voivat myös olla peräisin suun bakteereista (Uitto et ai. Proc. Finn. Dent. Soc.

1 987; 83: 1 19-130). Tämän vuoksi useita tämän tyyppisiä entsyymejä on ehdotettu käytettäväksi biokemiallisina merkkiaineina seurattaessa parodontaalisairauksien etenemistä ja aktiivisuutta. On kehitetty monia menetelmiä, jotka perustuvat entsyymiaktiivisuuksien identifioimiseen ja mittaamiseen. Esimerkiksi aspartaattiaminotransferaa-sin (ASAT) on osoitettu liittyvän parodontaalisairauteen, . . kun sitä mitataan ikenestä erittyvästä ientaskunesteestä (gingival crevicular fluid [GCF] eli lähelläolevan eli . viereisen ikenen tulehdusneste, jonka tiedetään kuvasta- • ·’ van ienkudoksen todellista terveyttä). Aspartaattiamino- «·· ···· trans f eraasia tai ASAT: ia vapautuu kuitenkin melkein • · · V : kaikista eri parodontaalikudosten vahingoittuneista so luista ja sitä on myös veressä huomattavia määriä. Tämän vuoksi GCF-ASAT-määritystä vaikeuttaa korkea epäspesifi-nen tausta.

• · * · · 1 ' Väärät positiiviset, jotka johtuvat muissa tiloissa kuin • I · « · aktiivisessa parodontaalisairaudessa vapautuvista entsyy-meistä, ovat myös pääasiallisina ongelmina määritettäessä useimpia muita entsyymejä, joita on ehdotettu seurattavaksi (esimerkiksi β-glukuronidaasi, 1aktaattidehydrogenaa- 7 98961 si, aryylisulfataasi, eri proteinaasit). Vastaanotolla tehtäviksi määrityksiksi on kehitetty GCF-elastaasi (Prog-nostick, Dentsply Corp. , York, PA) ja yleisiä proteinaasi-aktiivisuuksia (PeriocheckR, Advanced Clinical Technologies Inc., Westword, MA). Molemmista näistä vastaanotolla tehtävistä GCF-proteinaasitesteistä puuttuu todellinen spesifisyys; melkein kaikki ihmis- ja bakteeriperäiset proteinaasit hajottavat substraatteina käytettyjä synteettisiä peptidejä ja gelatiinia. Tämän vuoksi on löydetty sekä korkeita tausta-aktiivisuuksia että vääriä positiivisia ja vääriä negatiivisia tuloksia, kun on verrattu entsyymiaktiivisuuslöydöksiä parodontaalisairau-den todelliseen kliiniseen kulkuun ja parodontaalisesti terveisiin kontrolleihin. On kehitetty myös vastaanotolla tehtävä kolorimetrinen proteaasitestisysteemi, jolla on ehdotettu diagnosoitavan parodontaalisairauksia syljestä/ suun huuhtelunesteestä, GCF: stä ja hampaan plakkinäyt-teis tä.

Määritysmenetelmä, joka tunnetaan BANA/BAPNA-testinä, ; perustuu bentsyyliarginiininaftyyliamidin/bentsyyliargi- niini-p-nitro anilidin hydrolyysiin, jossa syntyy puna-·;, oranssi väri, mikä osoittaa anaerobisten parodontopato- geenien, kuten Porphyromonas gingivalis. Treponema den- < * I ticola ja Bacteroides forsythus, olemassaoloa, joiden edellämainittujen patogeenien oletetaan kykenevän vapaut- • · · *·' tamaan trypsiininkaltaisia proteinaasej a, jotka kykenevät hydrolysoimaan synteettisiä BANA/BAPNA-peptidisubstraat-teja. Kuitenkaan tämä testi ei yksinkertaisesti ole spe- • · · : sifinen yksinomaan edellämainittujen oletettujen perio- 4·. ; dontopatogeenien bakteeriperäisille proteinaaseille, • · · [ ! jotka kykenevät hajottamaan trypsiininkaltaisten protei- . naasien synteettisiä substraatteja, ja monilla isäntä- soluista peräisin olevilla proteinaaseilla (kuten trypsii-- neillä, trypsiininkaltaisilla proteinaaseilla, syöttösolu- tryptaaseilla jne.) on samanlaisia spesifisyyksiä hajot- 8 98961 taa BANA/BAPNA-peptidejä (Ingman et ai. Oral Microbiol. Immunol. 1993; 8:298-305), ja on osoitettu ihmisen solu- peräisten trypsiininkaltaisten proteinaasien olemassaolo periodontiitti-ientaskunesteessä (Sorsa et ai. , J. Dent. Res. 1992; 71:732). Näin ollen tämän testin ongelmana on spesifisyyden puute isäntäsolusta peräisin olevien ja bakteeriperäisten proteinaasien välillä.

Yleisesti ottaen kaikissa edellä kuvatuissa määrityksissä eri isäntä- ja bakteeriperäisten proteinaasien epäspesifinen synteettisiä ja luonnollisia substraatteja (gelatiinia) hajottava vaikutus johtaa usein vääriin negatiivisiin ja vääriin positiivisiin tuloksiin.

6. Matriksimetalloproteinaasit (MMP) parodontaali-s airauksissa

Kollagenolyyttiset entsyymit (kollagenaasit, gelatinaasit ja stomelysiinit jne., matriksimetalloproteinaasi-, MMP-perheen jäsenet) on isäntäsolusta peräisin oleva protei-naasiryhmä, jota on tutkittu tarkasti tässä yhteydessä. Jos on mitattu kokonaiskollagenaasi- tai gelatinaasiaktii-visuuksia ientaskunesteestä ja syljestä, niillä on ha-; vaittu olevan positiivinen korrelaatio tulehtuneen ien- • ·' kudoksen kollagenaasi-j a gelatinaasiaktii visuuksiin ja näin kuvastavan parodontaali kudoksen tuhoutumista ja

• M

V · parodontaalisairauden aktiivisuutta (Kinane, Curr. op.

Dent. 1992; 2:25-32). Parodontaalihoito johtaa GCF: n, ·;· syljen/suun huuhtelunesteen PMNL MMP-aktiivisuuksien « * · · .‘;’j laskuun, katso Sorsa T. Human leucocyte collagenase; .* . Purification, Activation and its Role in Periodontal • · · *· *; Tissue Destruction, Thesis, Univ. Helsinki, 1989: Suoma- I I > · lainen K. , Interstitial collagenases in gingival crevicu-lar fluid and saliva in periodontal diseases, Thesis, Univ. Helsinki 1993; ja Ingman T. Neutral proteinases

I 4 I

inperiodontal disease. Functional and Immunological Measu- 9 98961 rement. Thesis, Univ. Helsinki 1994. Tätä koskien Sorsa T. et ai. , Parodontologian laitos, Helsingin yliopisto, Helsinki, Suomi ovat kyenneet tutkimuksissaan osoittamaan, että PMNL-solujen neutrofiilinen kollagenaasi (MMP-8) on kollagenaasi/MMP-ryhmän avaintekijä, joka vaikuttaa spesifisesti parodontaalisairauksissa nähdyn kudostuhon etenemiseen (Sorsa et ai., J. Periodont. Res. 1988; 23 : 386-393; Sorsa et ai., Arch. Oral. Biol. 1990; 35: 193- 6; Golub et ai. J. Clin. Periodont. , painossa, 1994;

Sorsa et ai. Ann. NY Acad. Sciences, painossa, 1994, ja yhteenvetona katso Ingman et ai., J. Periodontol. 1993; 64:82-88). Menetelmiä, joilla määritetään kollagenaaseja ja yleisemmin, GCF: n tai syljen/suun huuhtelunesteen MMP:ja/muita proteinaaseja käsitellään myöhemmin yksityis koht ai s emmi n.

Parodontiittipotilaiden GCF- ja sylkikollagenaasien (PMNL MMP-8) on todettu muuttuvan inaktiivisista, latenteista esimuodoista parodontaalitulehduksen vaikutuksesta kata-lyyttisesti aktiivisiksi muodoiksi (Sorsa et ai., J. Periodont. Res. 1988; 23:386-393; Uitto et ai., J. Perio- dont. Res. 1990; 25:135-142). Ientäskunesteen ja syljen i · « ' proMMP: n molekulaarinen aktivaatio voi johtua muiden ·.' ' ihmisen/ PMN-proteinaasien (katepsiini G), bakteeriperäis- ; ten (P. qinqivalis ja T. denticola) proteinaasien ja PMNL: n tuottamien reaktiivisten happiyhdisteiden (kuten ίΤ: hypokloorihappo, HOCL) itsenäisestä ja/tai yhteisvaikutuksesta ( Sorsa et ai. , N. Engl. J. Med. 1989; 321: 327- .j. 328; Sorsa et ai. , Infection and Immunity 1992; 60: 4491- 95; Sorsa et ai., Semin. Arth. Rheum. 1992; 22:44-53).

i i * « • » • · · • · · • · * « I · t · . 98961 10 7. Kudoksen hajoamistuotteiden mittaus

Parodontiumin ekstrasellulaarinen matriksi hajoaa valtavasti parodontaalisairauden aktiivivaiheissa ja parodon-tiittipotilaiden ientaskunesteestä (GCF:stä) on osoitettu lisääntyneitä pitoisuuksia hydroksiproliinia ja glykosami-noglykaaneita. Spesifisiä N- ja C-terminaalisia kollagee-nitelopeptidejä on tutkittu parodontiitti-GCF: stä. Näiden Ientaksunesteen kollageenin tyyppi I ja III propeptidien on esitettu kuvastavan sekä ikenen kollageenisynteeesiä että hajoamista (Talonpoika J. , Ann. Univ. Turku, Serie D 142, 1994). Kuitenkin, sen sijaan että ne kuvastaisivat ikenen kollageenin hajoamista, ne saattavat kuvastaa paremminkin kollageenisynteesia/turnoveria yleensä, ja ne ovat olleet arvokkaita seurattaessa parodontaalista paranemista parodontaalihoidon jälkeen ennemminkin kuin seurattaessa todellista parodontaalista hajoamista parodontaalisairauden aktiivisessa etenemisvaiheessa (Talonpoika J. ja Hämäläinen M, J. Clin. Periodontol. 1994; 21: 320-333 ).

8. Tulehduksen välittäjäaineiden mittaus i * * ; ' Parodontaalikudoksien eri solujen, joihin gingiviitti ja i · * • ·' parodontiitti vaikuttavat sairauden aikana, tiedetään 0 tuottavan monenlaisia tulehduksen välittäjäaineita, jois-V* ta joidenkin on esitetty olevan hyödyllisiä biokemiallisia/! mmunologisia merkkiaineita arvioitaessa sairauden ··· aktiivisuutta. Sairastuneesta ienkudoksesta ja GCF: stä ··«* näitä tulehduksen välittäjäaineita löydetään kohonneita t .* . määriä verrattuna parodontaalisesti terveiden ikenien ja • · 9 ’· ’! ientaskunesteen (GCF: n) pitoisuuksiin (Page R. C. , J.

Periodont. Res. 1991; 26:533-546). Erityisesti tumor necrosis factor-α, interleukiini-1-0 ja prostaglandiini I ( E2 ovat intensiivisen tutkimuksen kohteena. Koska nämä • · i välittäjäaineet kuvastavat tulehdusprosessin aktiivisuut- - 98961 11 ta, ne näyttävät lupaavilta merkkiaineilta, mutta mikään näistä ei tähän hetkeen mennessä ole osoittautunut tarpeeksi spesifiseksi parodontaalisairaudessa, eikä nopeita määrityksiä ole kehitetty. In vitro näiden tulehduksen välittäjäaineiden tiedetään kykenevän indusoimaan alusta MMP-ekspressio suussa olevissa soluissa (ikenen fibro-blasteissa ja keratinosyyteissä) (Birkedal-Hansen H., J. Periodontol. 1993; 64:474-484 ).

Kaikesta huolimatta in vivo parodontiitti-ikenen ja GCF: n suurentuneet tulehduksen välittäjäaineiden määrät eivät liity kasvaneisiin määriin fibroblastityyppistä MMP:a (tämän tyyppisiä MMP: a, eikä PMNL-tyyppisiä MMP: a, eks-pressoivat ja tuottavat olemassa olevat ikenen/suun fibro-blastit ja epiteelisolut); sen sijaan neutrofiileista peräisin olevia MMP:ja ja elastaasia löydetään parodon-tiitti-ikenistä ja GCF:stä suhteessa parodontaalisesti terveen ikenen ja GCF: n pitoisuuksiin (Suomalainen K., Thesis, Univ. Helsinki 1993; ja Ingman T. , Univ. Helsinki, Helsinki, Finland, Neutral proteinases in periodontal disease). Siksi tulehduksen välittäjäaineiden (kasvaimen nekroosi tekijä-α, interleukiini l-β ja prostaglandiini E2 jne. ) molekulaarinen ja kliininen suhde MMP: sta riippuvaan parodontaalikudoksen tuhoutumiseen, huolimatta lu- • V. paavista in vi tro-tul oksi s ta (Birkedal-Hansen H., J.

• ·

Periodontol. 1993; 64:474-484) on epäselvä (Sorsa et ai., • ♦ · ·

Ann. NY Acad. Sei., painossa, 1994).

« « . Kuten edellä on esitetty, monia menetelmiä on kehitetty parodontaalisairauden aktiivisuuden arvioimiseksi. Kui- • · * ’·’ ' tenkaan mikään näistä menetelmistä ei ole täysin tyydyt- :*v; tävä. Näköhavaintoon perustuvalla tutkimuksella ei kyetä ;·<· löytämään kaikkia tyyppejä ja kaikkia parodontiitin vai- ,* . heitä. Kliiniset havainnot eivät ole riittävän luotet- ;/’· tavia, koska syvät taskutkaan eivät ole välttämättä ’···* tulehduksellisesti aktiivisia. Röntgenkuviin perustuvat - 98961 12 arvioinnit on yhdistettävä yksityiskohtaisiin kliinisiin havaintoihin ja näköhavaintoon perustuviin tutkimuksiin. Patogeenisten mikro-organismien olemassaolo ei täysin kuvasta todellista parodontaalisairauden aktiivisuutta.

Yritykset käyttää pilkkoutumistuotteisiin, esim kollageeniin, perustuvaa diagnosointia eivät myöskään ole olleet tyydyttäviä, koska pilkkoutumistuotteiden olemassaolo ei välttämättä kuvasta hajoamista vaan se voi olla osoituksena myös kollageenin nopeasta turnoverista tai synteesistä. Tulehduksen välittäjäaineita on tutkittu, mutta toistaiseksi ei ole kehitetty riittävän nopeaa ja spesifistä määritysmenetelmää. Viime aikoina on kehitetty useisiin isännästä peräisin oleviin entsyymeihin perustuvia määritysmenetelmiä, mutta ne eivät ole riittävän spesifisiä, erityisesti johtuen vääristä positiivisista, joita aiheuttavat bakteereista vapautuvat entsyymit.

Tällä hetkellä etsitään kiihkeästi tarkkoja tutkimusmenetelmiä parodontiitin arvioimiseksi, mutta ei edes yhdelle lupaavimmista isännästä peräisin olevista entsyymeistä, s. o. matriksimetalloproteinaasille, ole toistaiseksi , kehitetty täysin hyväksyttävää menetelmää. Vaikka on olemassa monia biokemiallisia menetelmiä kollagenaasien • V. mittaamiseksi, mikään niistä ei ole osoittautunut riit- • · tävän tyydyttäväksi ollakseen toivotunlainen helppo, « « · · nopea ja luotettava, vastaanotolla suoritettava menetel- ♦ ♦ · mä, mikä on menestyvän määrityskitin edellytys. Ne poly- . klonaaliset vasta-aineet, joita on käytetty, eivät ole • · · *"* olleet riittävän spesifisiä, ja tähän mennessä käytetyt • ♦ ♦

*·[ * immunologiset menetelmät, kuten Western-blottaus, ELISA

ja muut edellä käsitellyt menetelmät, vaativat kalliita välineitä ja laitteita. Ne ovat liian aikaa vieviä ja .* . vaikeita suorittaa, ja sen vuoksi niistä ei ole helpoksi ; / ja nopeaksi vastaanotolla suoritettavaksi testiksi, jota • · ' tarvitaan.

II

13 98961

Tosiasiassa totuus on se, että vaikka joitakin diagnostisia menetelmiä onkin olemassa, tällä hetkellä ei ole mitään riittävän luotettavaa ja herkkää määritysmenetelmää. Olemassaolevat testit on yhdistettävä kliinisiin havaintoihin ja tarkistettava niillä. Tätä tunnettua tekniikkaa käsitellään ja tuetaan yhteenvetoartikkelissa (McCulloch C. A. G., J. Clin. Periodontol. 1994; 21:497-506), joka kattaa useimmat edellä käsitellyt menetelmät ja jossa todetaan että "diagnostiset tosiseikat, jotka saadaan huolellisesti laaditusta potilaskertomuksesta ja suorittamalla kurinalainen kliininen tutkimus, ovat hyödyllisempää kuin mikään diagnostisesta laboratoriosta tällä hetkellä saatavissa oleva tieto. Kuitenkin on tarvetta perinteistä tutkimusta pidemmälle menevälle diagnostiselle informaatiolle."

Nyt on havaittu, että käyttämällä monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tunnistavat nisäkkäiden matriksimetallo-proteinaasi-8:n aktiivisen muodon ja jotka kykenevät erottamaan entsyymien aktiiviset ja latentit muodot, kyetään valmistamaan luotettavia ja herkkiä määrityskitte-jä ja kehittämään vastaavia menetelmiä parodontiitin diagnosoimiseksi.

• ti • · · • · · 1 . Keksintö on vastaus edellä mainitussa yhteenvetoartikke- ' 1 lissa esitettyyn tarpeeseen, ja se ratkaisee myös vastaan- ···; otolla suoritettavaan määritysmenetelmään perustuvan *·’ ‘ parodontiitin diagnosointiongelman.

• · • 1·· Täten keksinnön pääasiallinen tarkoitus on esittää mene- «·· :: : telmiä ja keinoja parodontaalisairauden aktiivisuuden luotettavaksi, herkäksi ja spesifiseksi diagnosoimiseksi, \ '. perustuen monoklonaalisiin vasta-aineisiin, jotka tunnis- 14 98961 tavat aktiivisen nisäkkäiden matriksimetalloproteinaasi 8:n. Menetelmät ja määrityskitit ovat toistettavia ja diagnostisesti tarkkoja.

Keksinnön toinen päämäärä on kehittää edellä esitettyihin luotettaviin, herkkiin ja spesifisiin keinoihin ja menetelmiin perustuvia määrityskittejä ja menetelmiä, joita voidaan käyttää vastaanotolla suoritettavina testeinä, jotka herkkyyden ja luotettavuuden lisäksi ovat nopeita ja helppoja suorittaa. Nämä vastaanotolla suoritettavat menetelmät ja määrityskitit eivät vaadi mutkikkaita välineitä ja laitteita. Näytteenotto on ei-vammoja tuottavaa ja helppoa suorittaa. Keksinnön määrityskitit ja menetelmät ovat sovellettavissa paikkakohtaiseen näytteenottoon ja myös helppoihin esiseulontamenetelmiin.

Keksinnön seuraava päämäärä on esittää määrityskittejä ja menetelmiä, joita ei haittaa suun huuhtelunäytteistä johtuva laimennusongelma eikä paikkakohtaisten näytteiden pieni näytekoko.

Keksinnön päämääränä on lisäksi, ei ainoastaan antaa keinoja parodontiitin aikaista ja luotettavaa diagnosoin-tia varten, vaan esittämällä monoklonaalinen vasta-aine, joka kykenee tunnistamaan aktiivisen MMP-8:n, esittää menetelmä ja keinoja hoitaa ja arvioida peri-implantiit- • · • · . tia.

• · · • ♦ · · • « · * « · * Keksinnön tunnusomaiset piirteet on kuvattu patenttivaatimuksissa. Keksintö koskee menetelmää ja määrityskittiä • ♦ l ** parodontaalisairauden ja/tai peri-implantiitin js/tai • ♦ · v : näiden sairauksien kohonneen riskin diagnosoimiseksi.

Keksinnön mukaiset määrityskitit sisältävät vähintäin yhden monoklonaalisen vasta-aineen, joka tunnistaa ak- 1 · 15 98961 tiivisen nisäkkäiden, edullisesti ihmisen metalloprotei-naasi 8:n, jota tuottavat polymorfonukleaariset neutro-fiiliset leukosyytit (PMNL).

Keksinnön määrityskitti sisältää valinnaisesti muita monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tunnistavat inaktiivisen nisäkkäiden proMMP-8:n, s.o. nämä monoklonaaliset vasta-aineet eivät erota nisäkkäiden ja/tai ihmisen MMP-8:n inaktiivisia ja aktiivisia muotoja toisistaan.

Sellaisten monoklonaalisten vasta-aineiden lisäksi, jotka tunnistavat aktiivisen nisäkkäiden MMP-8:n, voidaan käyttää valinnaisesti polyklonaalisia vasta-aineita, kun kehitetään spesifisiä määrityskittejä.

Keksinnön mukainen määrityskitti sisältää myös valinnaisia detektioon tarvittavia suoria tai epäsuoria leimoja ja valinnaisia kiinteitä tai nestemäisiä kantajia, joita tarvitaan käytetyn immunologisen määrityksen suorittamiseen. Määrityskitti on rakennettu niin, että se voi erottaa aktiivisen ja latentin nisäkkäiden MMP-8:n luotettavasti toisistaan.

: . Useimmat tunnetut immunologiset määritysmenetelmät ovat sovellettavissa määritykseen, mutta edullisimpia tapoja, • · · kuten immunokromatografisiä menetelmiä, jotka perustuvat • · sivuvirtaus- eli "lateral f low"-periaatteeseen kuten myös ’ll! immunokemiallisia menetelmiä, jotka perustuvat läpivir- • · · taus eli "flow through"-periaatteeseen, kuvataan keksinnön yksityiskohtaisessa kuvauksessa.

• · • · • · · • · 1 v r Monoklonaaliset vasta-aineet, jotka tunnistavat aktiivi- sen nisäkkäiden MMP-8:n, ovat monoklonaalisia vasta-ai-,···, neita, jotka ovat saatavissa menetelmällä, jossa inak-

I

'·' tiivinen nisäkkäiden ja/tai ihmisen MMP-8 aktivoidaan ja : V seuraava immunisaatio suoritetaan aktivoidun nisäkkäiden - 98961 16 ja/tai ihmisen MMP-8:n eri isomuotojen seoksella. Solu-linjat tuotetaan tavanomaisilla hybridomatekniikoilla, joita seuraa solulinjojen seulonta, mikä tuottaa erilaisia monoklonaalisia vasta-aineita, joita tarvitaan keksinnön määrityskitteihin ja menetelmiin.

Keksintö koskee myös menetelmiä parodontalisairauden aktiivisuuden diagnosoimiseksi. Tutkimusmenetelmät suoritetaan immunologisina määrityksinä, jotka pohjimmiltaan sisältävät vaiheet, joissa kerätään näytteet ja saatetaan yhteen monoklonaaliseen vasta-aineeseen kanssa, joka tunnistaa aktiivisen nisäkkäid ja/tai ihmisen MMP-8:n, joka on sisällytetty määrityskittiin sopivalla tavalla ja käytetään detektiomenetelmiä, jotka mahdollistavat aktiivisen MMP-8:n ja inaktiivisen proMMP-8:n erottamisen toisistaan.

Tätä helpotetaan käyttämällä ainakin yhtä toista vasta-ainetta, joka voi olla monoklonaalinen tai polyklonaali-nen vasta-aine, joka tunnistaa inaktiivisen nisäkkäiden proMMP-8:n.

Keksinnön toisen suoritusmuodon mukaan parodontiitin riskiä esiseulotaan testaamalla sylkinäyte tai suun huuh-telunäyte. Positiivisia tapauksia seurataan paikkaspesifi-sillä (site-spesifie) menetelmillä, joissa näytteen ke- • « räys suoritetaan kiinteällä, absorboivalla näytteenotto-välineellä, joka keksinnön edullisessa suoritusmuodossa • « · • · v sisältää itsessään immunologisen määrityksen.

• · • · 1 " Keksintö koskee yleisesti järjestelmiä biokemiallisten • · » : erityisesti immunologisten menettelyjen ja menetelmien kehittämiseksi ja tarkemmin sanottuna herkkiä ja spesi-fisiä määritysvälineitä, käyttäen monoklonaalisia vasta-·_ aineita ja immunologisia menetelmiä parodontaalisairauk- : ·' sien diagnosoimiseen nisäkkäillä, ja erityisesti ihmisten 17 98961 ja eläinten parodontaalisairauden aktiivisuuden arviointiin luotettavalla, vastaanotolla suoritettavalla testillä. Keksinnön menetelmät ja määrityskitit ovat sovellettavissa myös peri-implantiitin arvioimiseen.

Yksi parodontiitin pääpiirteistä on parodontiumin ekst-rasellulaarisen matriksin (s.o. kollageenin) hajoaminen. Tyypin I ja III kollageenit ovat parodontiumissa pääasiassa esiintyvät kollageenityypit. Kuten edellä on esitetty parodontaalikudokset ja parodontiumin solut, joita vaivaa-vat gingiviitti ja parodontiitti, tuottavat suuren valikoiman isäntäsolusta peräisin olevia välittäjäaineita. Se yhteensattuma, että joillakin näistä isännästä peräisin olevista tulehduksen välittäjäaineista näyttää olevan keskeisempi merkitys parodontiitin yhteydessä havaituissa kudoksen tuhoutumistapahtumissa kuin muilla, on johtanut tutkijat tutkimaan mahdollisuutta, että joitakin näistä tulehduksen välittäjäaineista voitaisiin käyttää etenevien vaurioiden biokemiallisina merkkiaineina. Parodontaalisairauden aktiivisuuden biokemiallisten merkkiaineiden tutkimus on keskittynyt joko ientaskunesteeseen (GCF, tulehduserite, joka on lähellä olevan ikenen erittämä, spesifinen koostumus) tai sylki/suun huuhtomisnäyttei-siin. GCF-analyysin etuna on paikkaspesif isyys (site-specificity) ajatellen vahingoittumattomia ja vahingoit-tuneita kohtia/hampaita ja haittana voi joissain tapauk-sissa olla käsiteltävien näytteiden pieni tilavuus kuten **" myös näytteenoton tekniset vaikeudet. Toisaalta testat- ♦ ♦ ♦ tujen, isäntäsolusta peräisin olevien tulehduksen välit- täjäaineiden/entsyymien (joka tapauksessa GCF:sta peräi- : *' sin) sylki/suun huuhtelunäytteissä olevat pitoisuudet »·· ovat usein laimentuneita eivätkä syljen/suun huuhtomis-nesteen määritykset eivät ole paikkaspesifisiä.

i : - 98961 18

Ekstrasellulaarisen matriksin hajoamis nopeus on kasvanut sairastuneessa ihmisen ikenen kudoksessa. Läheisen ien-taskuneste (GCF) kuvastaa näitä sairastuneen, tulehtuneen ihmisen parodontiumin hajoamisprosesseja. Ikenen hajoamisprosessien ajatellaan välittyvän pääasiassa sekä ihmisestä että isännästä peräisin olevien proteolyyttisten entsyymien vaikutuksen kautta, koska ei ole mitään suoraa todistetta mikrobeista peräisin olevien proteinaasien suorasta vaikutuksesta/osallistumisesta parodontaalikudok-sen hajoamiseen. Useiden hampaan plakkien bakteereiden/-bakteeriperäisten tuotteiden yhteisvaikutus isännän tulehdussolujen (neutrofiilien ja/tai monosyyttien/makrofaa-gien) kuten myös olemassa olevien ikenen fibroblastien ja epiteelisolujen kanssa johtaa lisääntyneeseen proteinaasien vapautumiseen tällaisista aktivoiduista isäntäsoluis-ta, ja jälkeenpäin on löydetty isäntäsolusta peräisin olevien proteinaasien kohonneita tasoja tulehtuneesta ihmisen ienkudoksesta, GCF: sta ja syljestä: siitä lähtien kun kaikkien mahdollisten isännästä peräisin olevien solulähteiden, s.o. neutrofiilien monosyyttien/makrofaa-gien, ikenen fibroblastien, suun keratinosyyttien ja jopa luusolujen, on tiedetty (kun pääasiallisten parodontopato-geenisten bakteerien erilaiset stimulaatiot aktivoivat ne joko suorasti tai epäsuorasti) alkavan de novo ekspres- iV. soida ja vapauttaa proteinaasejaan, eri proteinaasien • e tarkat merkitykset ja solulähteet in vivo ovat olleet » • e · · ,«··, epäselviä parodontaalisairauksissa.

t « ( , Kaikesta huolimatta monet in vivo todisteet osoittavat,

< « I

että isäntäsolusta peräisin olevilla matriksimetallopro- • * * *·* ' teinaaseilla (MMP: t) on keskeinen merkitys ihmisen paro- *,*·.* dontaalikudoksen hajoamisessa. Tämä todiste sisältää (i) ;··· patologisesti kohonneen (normaalikudokseen verrattuna) . kollagenaasi- (MMP-1 ja MMP-8) ja gelatinaasi- (MMP-2 ja MMP-9) aktiivisuuden toteamisen parodontiittipotilaiden • · tulehtuneista ienkudoksista otetuista ekstrakteista, 19 98961 ientasku ja sylki-/suun huuhtomisnäytteistä; näiden pro-teinaasien aktiivisuuksilla ei ole havaittu olevan positiivista korrelaatiota vain parodontaalitulehduksen vakavuuteen ja taskun syvyyteen niissä parodontiittivaurion kohdissa, jotka tuottavat näitä proteinaaseja ikenen ekstrasellulaariseen matriksiin ja läheiseen ikeneen, vaan näiden proteinaasien aktiivisen ennemmin kuin latentin muodon suhteellisen osuuden on myös havaittu kasvavan, kun parodontaalisairaus pahenee. Edelleen, näiden MMP: ien aktiivisuudet parodontiittikohdissa (kerätyissä GCF-näytteissä) laskevat instrumenttihoidon jälkeen (ham-maskiven poisto ja juuren istutus). Näiden tulosten on ajateltu kuvastavan suurelta osalta muutoksia ennemminkin imettäväisten kuin bakteerien metalloproteinaasiaktii-visuudessa, koska parodontaalisairauskohdista löydetyt neutraalit proteinaasit hajottavat kolmoishelikaalisen kollageenin tyypillisiin 3/4- ja 1/4-fragmentteihin. Ikenen kudoksen, ientaskunesteen ja syljen kollagenaasien edelleen karakterisointi on osoittanut, että parodontaa-lisen tulehduksen aikana tämän entsyymin pääasiallinen lähde ovat polymorfonukleaariset neutrofiiliset leukosyytit. Tämä perustuu tutkimuksiin, jotka käsittelevät (i) substraattispesifisyyttä tyyppi I-III kollageeneille, (ii) vastetta spesifisille/erilaisille prokollagenaasi- ,!, aktivaattoreille sekä (iii) Western blottausta ja immuno- t * · * · * * histokemiallisia analyysejä, joissa käytetään spesifisiä » Ψ 4 ♦'·* anti-MMP-vas ta-aineita.

• « · I « 4 * · I • Täten johtopäätöksenä on, että huomattava osa kollagenaa-.,)·* siaktii visuudesta, joka esiintyy parodontii ttipotilaan ! : : tulehtuneessa ihmisen ikenessä ja ientaskunesteessä, on ,·* ; peräisin ihmisen neutrofiileista ja täten edustaa MMP- *!,!: 8; aa- » « « * 20 98961

Sellaisen biokemiallisen merkkiaineen määritysmenetelmän tarve, joka osoittaisi parodontaalisairauden aktiivisuutta yksinkertaisella, käytännöllisellä ja luotettavalla tavalla, on tunnistettu useita vuosikymmeniä sitten. Tällaisten diagnostisten testien arviointi on tavallisesti perustunut laskettuihin arvioihin niiden herkkyydestä ja spesifisyydestä. Herkkyys on se todennäköisyys, että tauti on olemassa, kun määritystulokset ovat positiivisia. Spesifisyys on se todennäköisyys, että tautia ei ole, kun testitulokset ovat negatiivisia. Täydelli-nen/optimaalinen testi kykenisi löytämään kaikki etenevän parodontiitin kohdat antamatta vääriä negatiivisia tuloksia (optimaalinen herkkyys) ja löytämään kaikki etenemät-tömät kohdat antamatta vääriä positiivisia tuloksia (optimaalinen spesifisyys). Kuten edellä on esitetty, neutro-fiilisen (PMNL) kollagenaasin/MMP-8: n on osoitettu olevan suoraan verrannollinen parodontiitin aikana tapahtuvaan tukikudoksen hajoamiseen ja MMP-8 diffundoituu suuonteloon ientaskujen kautta ientaskunesteessä. Näin ollen on mahdollista määrittää paikkaspesifisesti (site-specific) parodontaalisairauden aktiivisuus arvioimalla MMP-8: n kokonaismäärät/aktiivisuudet ientaskunesteessä. ProMMP-8: n (latentti ihmisen neutrofiilinen prokollagenaasi) \ tiedetään muuttuvan katalyyttisesti aktiiviseen muotoon ’ (endogeenisesti aktiivinen/autoaktiivinen muoto) paro- • · · : .* dontaalitulehdukseen liittyvän tulehdusprosessin aikana.

«

« I I

• · · f « < » 5.·’ ’ Tämän vuoksi menetelmä, jolla määritetään inaktiivisen MMP-8: n muuttumista aktiiviseksi parodontiittikohdista ··· kerätyissä GCF-näytteissä, olisi ihanteellinen, spesi- • · · · .*·.·. finen ja herkkä biokemiallinen jatkuvan parodontaalisai- • * · » rauden aktiivisuuden tai peri-implantiitin indikaattori.

'· Western blottaustulokset, jotka on saatu polyklonaali- : sella anti-MMP-8:11a parodontaalisesti terveiden ja pa- rodontiittia sairastavien ientaskunes tenäytteistä, edel-.···. lyttävät, että MMP-8: n olemassaolo osoittaa parodontiitin

II

98961 21 olemassaoloa ja väärien positiivisten ja väärien negatiivisten määrä on hyvin pieni. Polyklonaalinen anti-MMP-8 ei kuitenkaan kykene erottamaan aktiivista MMP-8:a ja inaktiivista proMMP-8:a toisistaan. Tämän vuoksi keksinnön määritysmenetelmä, joka käyttämällä spesifisiä mono-klonaalisia vasta-aineita kykenee identifioimaan aktiivisen MMP-8:n GCFissa, on optimaalinen parodontaalisairau-den aktiivisuuden seulontaan, ja siinä on ratkaistu myös paikkaspesifiseen (site-spesifie) näytteenottoon liittyvän pienen näytekoon ongelma ja suun huuhtelunäytteenot-toon liittyvät laimennusongelmat.

Määrityskitin, jolla voidaan keksinnön mukaisesti diagnosoida herkästi ja selektiivisesti parodontaalisairauden aktiivisuuksia ja jonka on kyettävä erottamaan aktiivinen MMP-8 ja inaktiivinen proMMP-8 toisistaan, täytyy sisältää ainakin yksi monoklonaalinen vasta-aine, joka tunnistaa aktiivisen väisten, edullisesti ihmisen metallopro-teinaasi 8:n (MMP-8), vaikka se voi sisältää useita mono-klonaalisia vasta-aineita, ja ainakin yksi detektioleima, joka voi olla kiinnittyneenä vasta-aineeseen tai erotus-reagenssiin, ja valinnaisesti kiinteitä tai nestemäisiä : kantaja-aineita, joita tarvitaan immunologisen määrityk- : · : sen suorittamiseen.

• · « • · ·

Monoklonaalinen vasta-aine, joka tunnistaa aktiivisen • « imettäväisten MMP-8 :n, on saatavissa menetelmällä, joka t ··· sisältää seuraavat vaiheet. Ensiksi aktivoidaan inaktii- • · ‘ • · f vinen nisäkkäiden tai/ja ihmisen proMMP-8, joka voi olla .. raaka tai pitkälle puhdistettu preparaatti. Aktivaatio • · • ]" voi tapahtua autoaktivaatiomenetelmällä, mutta edulli- • · · *·* ’ sesti preparaatti aktivoidaan in vitro menetelmillä. Nämä menetelmät sisältävät aktivaattoreiden käytön, esim.

. entsyymeistä sellaisten kuin trypsiini, kymotrypsiini tai katepsiini G. Kemiallisista aineista voidaan myös käyttää : ·’ sellaisia yhdisteitä kuten orgaaniset elohopeayhdisteet 22 98961 ja/tai hapettavat aineet kuten NaOCl. Näitä aineita voidaan käyttää erikseen tai yhdistelmänä. Samaan näytteeseen voidaan käyttää myös erilaisia aktivointimenetelmiä.

Aktivoinnin jälkeen hiiret immunisoidaan aktivoidun nisäkkäiden MMP-8:n eri iso-muotojen seoksella. Hybridoma-solulinjat tuotetaan tavanomaisilla hybridomatekniikoilla ja ne seulotaan erilaisten monoklonaalisten vasta-aineiden löytämiseksi. Halutuimmat monoklonaaliset vasta-aineet tunnistavat aktiivisen nisäkkäiden MMP-8:n. Ne ovat herkkiä ja niillä on mahdollisimman vähäinen ristireaktio inaktiivisen proMMP-8:n ja muiden rakenteellisesti samankaltaisten entsyymien kanssa.

Monoklonaaliset vasta-aineet, joilla on oleellisesti samat ominaisuudet ja jotka saadaan oleellisilta osin edellä kuvatun kaltaisella menetelmällä tai tavanomaisilla monoklonaalisten vasta-aineiden valmistusmenetelmillä, sisältyvät luonnollisesti tämän keksinnön piiriin.

Keksinnön mukainen määrityskitti voi, sellaisen monoklo-naalisen vasta-aineen lisäksi, joka tunnistaa aktiivisen nisäkkäiden ja/tai ihmisen MMP-8-.n, sisältää ainakin : yhden monoklonaalisen toisen vasta-aineen, joka risti- reagoi inaktiivisen nisäkkäiden tai/ja ihmisen proMMP-8:n kanssa ja joka saadaan käyttämällä tavanomaisia hybri- • · domatekniikoita tai tekniikoilla, jotka ovat oleellisesti i samoja kuin edellä kuvatut, mutta joissa käytetään eri I « · seulontakriteerejä.

23 98961 immunologiset määritykset, immunoagglutinaatiomenetelmät, turbidometriset immunologiset määritykset ja nefelometri-set immunologiset määritykset. Detektioleimat ja vaihtoehtoiset kantajat valitaan sopivan menetelmän mukaan.

Keksinnön edullisimmat vastaanotolla käytettävät määritys-kitit on kehitetty "lateral flow"-periaatteeseen perustuvien immunokromatograafisten menetelmien mukaan tai "flow through"-periaatteeseen perustuvan immunometrisen menetelmän mukaan.

Keksinnön mukainen määrityskitti voi sellaisen monoklonaa-lisen vasta-aineen lisäksi, joka tunnistaa aktiivisen nisäkkäiden MMP-8:n, sisältää ainakin yhden toisen vasta-aineen, joka voi olla joko monoklonaalinen tai polyklo-naalinen vasta-aine, jonka ei tarvitse erottaa latenttia ja aktiivista nisäkkäiden MMP-8:a.

Parodontaalisairauden aktiivisuuden diagnosointimenetelmä suoritetaan pääasiassa immunologisena määrityksenä sisältäen seuraavat vaiheet. Ensiksi kerätään ientaskunestees-tä näyte näytteenkeräysvälineellä, jota voidaan käyttää myös testivälineenä. Yksinkertaisia kiinteitä laitteita voidaan käyttää paikkaspesifisten näytteiden keräämiseen.

: Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa näytteenottoväli- ;1·1: nettä käytetään myös mittausvälineenä. Näyte yhdistetään • « sitten ainakin yhden monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, ·· · · joka on jo kiinnitetty näytteenotto- tai määritysvälinee- seen, tai se voidaan lisätä yhdistettyyn näytteenotto- ja .. määritysvälineeseen. Vaihtoehtoisesti näytteenottoväline • · · *... voidaan lisätä määritysvälineeseen, joka sisältää mono- • · · klonaalisen vasta-aineen, joka tunnistaa aktiivisen ni-! · : säkkäidem tai edullisesti ihmisen matriksi metalloprotei- naasi 8 (MMP-8) .

• · • φ « 24 98961

Mainitun nisäkkäiden MMP-8:n olemassaolo todetaan edullisesti sellaisen immunologisen menetelmän avulla, joka kykenee erottamaan aktiivisen MMP-8:n ja inaktiivisen proMMP-8:n toisistaan.

Edullisimmassa menetelmässä parodontaalisairauden aktiivisuuden olemassaolo todetaan paikkaspesifisellä menetelmällä, jossa näyte kerätään kiinteällä, absorboivalla näytteenotto- ja määritysvälineellä.

Sellaisen monoklonaalisen vasta-aineen lisäksi, joka tunnistaa aktiivisen nisäkkäiden MMP-8:n, määrityskitti voi sisältää valinnaisen toisen vasta-aineen, joka tunnistaa inaktiivisen nisäkkäiden proMMP-8:n. Tämä toinen vasta-aine on edullisesti leimattu vähintäin yhdellä detektioleimalla, joka on valittu suoria ja epäsuoria leimoja sisältävästä ryhmästä.

Keksinnön yhden menetelmän suoritusmuodon mukaan parodontaalisairauden aktiivisuuden riski voidaan esiseuloa mittaamalla MMP-8:n kohonnut taso sylkinäytteestä tai näytteestä , joka on kerätty suun huuhtelun avulla.

Parodontaalisairauden aktiivisuuden esiseulonta voidaan . . . suorittaa immunologisena määrityksenä käyttäen seuraavia .V. vaiheita. Ientaskunestettä (GCF) sisältävä näyte kerätään • · t|t jollakin menetelmällä ja näyte saatetaan yhteyteen vähin- täin yhteen vasta-aineeseen, joka tunnistaa nisäkkäiden ( * · * ja/tai ihmisen MMP-8:n. Mainitun MMP-8:n kohonnut taso todetaan immunologisen menetelmän avulla. Jos suoran • · J ** paikkaspesifisen GCF-näytteen kohonnut MMP-8:n taso on * vähintäin 1 ug/ml, se osoittaa, että parodontaalisairau- den aktiivisuuden tai peri-implantiitin riski on olemas- ,···, sa. Sylkinäytteessä vastaava, riskiä osoittava taso on • · $ t 25 98961 noin 2 ug/ml, johtuen muista MMP-8 lähteistä. Minkä vuoksi noin 2 ug/ml ylittäviä arvoja pidetään osoituksina kohonneesta tasosta.

Keksinnön mukaisia määrityskittejä voidaan käyttää määri-tyskittisarjana parodontaalisairauden aktiivisuuden diagnosointiin vastaanotolla immunologisella määritysmenetelmällä, jolloin määrityskittien sarja sisältää jokaisessa määrityskitissä ainakin yhden monoklonaalisen vasta-aineen, joka tunnistaa aktiivisen nisäkkäiden MMP-8:n. Mainittu sarja voidaan tarjota yhdistelmäpakkauksessa, joka voi sisältää esiseulontaa varten yhden tai useampia määrityskittejä, jotka on yhdistetty suunhuuhtomispulloi-hin tai jotka sisältävät niitä yhden tai useampia, ja yhden tai useampia paikkaspesifisiä diagnostisia määritys-kittejä, jotka mainitun monoklonaalisen vasta-aineen lisäksi sisältävät yhden tai useampia näytteenottolaittei-ta, joita voidaan käyttää myös määrityskitteinä. Näitä esiseulonta ja paikkaspesifisiä määrityskittejä voidaan toimittaa monenlaisina yhdistelminä.

Määrityskittien kehittämisessä käytettyjä menetelmiä ja ’ materiaaleja ja keksinnön menetelmiä käsitellään jäljem- : pänä yksityiskohtaisemmin.

« i ·

• · I

* « • On kuvattu useita menetelmiä, joilla mitataan kollageno- •j* lyyttisiä entsyymiaktiivisuuksia syljessä ja ientaskunes- j*;': teessä. Alla annetaan lyhyt kuvaus funktionaalisen kolla- genaasiaktiivisuuden mittauksista.

• * ♦ 9 9 *9 « .···. Kollagenaasiaktnvisuutta voidaan mitata spektrofotometri- • i · sesti seuraamalla absorbanssin kasvua 227 nm:ssa, mikä kuvastaa kollagenaasin aiheuttamaa kollageenin hajoamista (Lindy et ai., Eur. J. Biochem. 1986; 158:1-4). Subs- traatteina on myös käytetty synteettisten peptidien hajoa-____; mistä, kun ne on liitetty väriä tai fluoresenssia muodos- 26 98961 tavaan järjestelmään, voidaan seurata spektrofotometri-sesti tai vastaavasti fluorometrisesti (Tscheshe H. et ai., julkaisussa Methods in Enzymatic analysis, sivut 239-248, Bergmeyer U. H. toim. , Verlag Chemie, Weinheim, Germany 1985). Radioaktiivisesti leimattua natiivia kol-moishelikaalista kollageeni I: tä käytetään usein substraattina tämän alan tutkimuksissa (Lindy S. et ai. , Eur. J. Biochem. 1986; 158: 1-4). Radioaktiivisesti lei mattua kollageenia (tyyppi I, III tai IV) inkuboidaan tutkittavan entsyymipreparaatin kanssa ja merkitään muistiin natriumdodekyylisui faattipolyakryyliamidigeelielek troforeesissa (SDS-PAGE) syntyvät tyypilliset vyöhykkeet tai viivat (band). Tämän määrityksen ei-isotooppisessa muodossa, jota keksijä T. Sorsa on käyttänyt, kollageeni-fragmenttien vyöhykkeet saadaan näkyviksi värjäämällä ne Coomasie brilliant blue-värillä SDS-PAGE: n jälkeen (Sorsa T. et ai., Med. Biol. 1985; 63:66-72 ). Tämän määrityksen kvantitointi tehdään laserdensitometrilla (Ingman T. , Thesis, Univ. Helsinki 1994). Muiden proteinaasiaktii-visuuksien mittaamiseen käytetään myös muita spesifisiä substraatteja kuin kollageenia.

' Näissä menetelmissä yksittäisten kollagenaasien erottami- : nen toisistaan on mahdollista ja siihen päästään käyttä- ·.· : mällä spesifisiä inhibiittoreita ja aktivaattoreita (Sor- ·« · • V sa T. , Thesis, Univ. Helsinki, Finland 1989; Suomalainen ^1* K., Thesis, Univ. Helsinki 1993). Jos tyypilliset nauhat :*·*: mitataan sopivilla laitteilla kuten laserdensitometrilla, jonkin asteinen kvantitointi on mahdollista, vaikkakin näitä menetelmiä käytetään tavallisesti tietynlaisten ’··*· aktiivisuuksien olemassaolon kvalitatiiviseen identifioin- • · · t · · tiin.

27 98961

Yleisesti edellä kuvatuista menetelmistä puuttuu kuitenkin kyky erottaa toisistaan ihmisen neutrofiilityyppiset (MMP-8) ja fibroblastityyppiset (MMP-1) kollagenaasiaktii-visuudet. Keksijä T. Sorsan löydösten mukaan ihmisen neu-trofiilinen kollagenaasi (MMP-8) on ensisijainen MMP gingivaalisen/parodontaalisen kuten myös alveolaarisen luukudoksen tuhoutumisen initiaatiossa parodontaalisai-rauksissa. Muista lähteistä peräisin olevilla kollagenaa-seilla (monosyyteistä/makrofaageista, epiteelisoluista ja ikenen fibroblasteista) näyttää olevan vähemmän tärkeä merkitys tässä yhteydessä (Sorsa T. , Thesis, Univ. Helsinki, Finland 1989; Sorsa T. et ai. , Ann. NY Acad. Sciences, painossa, 1994; Golub et ai., J. Clin. Periodontol. , painossa, 1994).

Tämän vuoksi menetelmä, joka olisi spesifinen PMNL MMP-8: lie parodontiitti-GCF: ssa, olisi paras tutkittaessa syitä ja kudoksen tuhoutumistapahtumia, joita nähdään parodontiitissa.

Sorsa T. et ai. (julkaisematon tieto) ovat käyttäneet polyklonaalista kanin antiseerumia, joka reagoi sekä latentin että aktiivisen MMP-8: n kanssa, ELISA-menetelmäs- sä (enzyme linked immunosorbent assay) kokonais MMP-8 . pitoisuuksien kvantitatiiviseen mittaamiseen parodontiit- ·· · • ’.· ti-GCF:stä ja syljestä verrattuna parodontaalisesti ter- *:1 veisiin kontrolleihin.

« € | |

* · I

·· t 1 « ( ·

Eri kollagenaaseja on identifioitu myös Western blottauk-.:. sella; s. o. entsyymipreparaattien SDS-PAGE-aj on jälkeen .·"·. nauhat on siirretty nitroselluloosalle j a ne tunnistetaan • · « fluoroimmunologisella värjäyksellä käyttäen leimattuja polyklonaalisia vasta-aineita MMP-8: lie, MMP-1: lie ja '·"· muille entsyymeille, joita on tarkoitus tutkia.

28 98961 Tämän kaltaisilla menetelmillä saadaan spesifisempiä tuloksia koskien todellista solulähdettä ja kollagenaa-sin/MMP: ien aktivaation astetta, mutta ne ovat aivan liian työläitä ja aikaavieviä käytettäväksi rutiinissa laboratoriotyöskentelyssä. Edelleen on mahdotonta, että nopea vastaanotolla tehtävä määritys perustuisi minkäänlaiseen elektroforeesiin.

Yhdistämällä tutkimustensa tulokset keksijä, tohtori Timo Sorsa kykeni arvioimaan latentin ja aktiivisen MMP-8:n määrät syljessä ja GCF:ssa aikuisilta parodontiittipoti-lailta ja parodontaalisesti terveiltä yksilöiltä. ELISA-määrityksllä saatuja aikuisten parodontiittipotilaiden ja parodontaalisesti terveiden kontrollien sylki- ja GCF-kokoomatuloksia tulkittiin yhdessä SDS-PAGE/ toiminnan määrityksen ja Western blottaustulosten kanssa. Voidaan arvioida, että aikuisten parodontiittipotilaiden GCF sisältää noin 11-16 ug/ml kokonais MMP-8:aa ja vastaavasti aktiivista 10-15 ug/ml. Vastaavasti terveiden yksilöiden GCF sisältää 0. 2-0. 8 ug/ml kokonais ja alle 0.05 ug/ml aktiivista MMP-8: aa. Katso yksityiskohdat ja vastaavat syljen MMP-8-arvot jäljempänä olevasta taulukosta 1.

' Western blot-määritykset, joissa käytettiin anti-humaani ·· · • V MMP-8 ja anti-humaani MMP-1, osoitti taulukossa 1 olevas- ta näytemateriaalista, että MMP-8 oli 70-75 kD inaktiivi-!1:1: sinä tai latentteina ja 65 kD aktiivisina muotoina, ja MMP-1: tä ei löydetty; MMP-1: tä ei löydetty myöskään spesi-fisissä ELISA-tutkimuksissa.

• · · · • · · • ♦ · « « · Nämä tulokset sopivat yhteen Haerianin et ai. viimeaikais-ten tulosten kanssa (J. Dent. Res. 1993; 73:208) merkiten • : sitä, että vaikka parodontiitti-GCF sisältääkin kohonnei-

j ta määriä toiminnaltaan määritettyä kollagenaasia (PMNL

• · li 29 98961 MMP-8), se tuskin sisältää mitään fibroblastityyppistä MMP-l:tä. MMP-l:tä ei löydetty periodontaalisesti terveiden kontrollien GCF: stä.

On myös havaittu, että MMP-8: 11a on keskeinen merkitys peri-implantiitissa. Tämä on yhdenlainen hammassiirrän-näistä ympäröivien sidekudosten tulehdus.

Taulukko 1.

Kudosta hajottava ihmisen neutrofiilinen kollagenaasi (PMN MMP-8) hoitamattomien aikuisten parodontiittipotilai-den (n=15) ja parodontaalisesti terveiden yksilöiden (n=15) ientaskunesteessä (GCF) ja syljessä.

Potilasryhmä Suun neste MMP-8 pitoisuus (ug/ml) aktiivinen totaali

Terveet kontrollit GCF <0.05 0.2-0. 8 i " " sylki 1-3 1. 2-3. 4

Aikuisten parodontiitit GCF 10-15 11-16 " M sylki 2-6 3-8 • · · • - . -·«·· 1 ♦ · · « « « · • « ·

Sidekudoksen makromolekyylien hajoamisen peri-impiantii- tissa on havaittu välittyvän ihmisen matriksi metallopro- *1!’ teinaasien kautta, erityisesti neutrofiili (PMN) -peräisten • · · * · · *4 matriksi metalloproteinaasien kautta (Ingman et ai. , J.

*·,'; Clin. Periodontol. , 1994; 21:301-307). Täten on mahdol- ; lista arvioida peri-implantiittia keksinnön määrityski- ; tiliä ja menetelmällä.

* 30 98961 1. Monoklonaaliset vasta-aineet aktiivista MMP-8 vastaan

Matriksimetalloproteinaasi 8 (jota aikaisemmin kutsuttiin kollagenaasiksi/soluvälikollagenaasiksi), jota tuottavat ihmisen polymorfonukleaariset neutrofiiliset leukosyytit (PMNL-kollagenaasi, matriksimetalloproteinaasi (MMP-8)) latenttina tai inaktiivisena prokollagenaasin esimuotona (proMMP-8), puhdistetaan polymorfonukleaarisista neutro-fiilisista leukosyyteistä (PMNL:t) inaktiivisena proent-syymimuotona proMMP-8. ProMMP-8 on stabiili polypeptidi, joka on erittäin glykosyloitunut ja jonka molekyylipaino on noin 85000. Inaktiivinen muoto voidaan in vitro aktivoida erilaisilla proteinaaseilla kuten trypsiinillä, kymotrypsiinillä ja katepsiini G:llä mutta ei plasmii-nilla, ja käsittelemällä muilla aineilla kuten orgaanisilla elohopeayhdisteillä. Aktivaatiomekanismi on suurelta osin tuntematon in vivo, mutta se tapahtuu todennäköisesti tulehduskohdissa ainakin PMNL-solujen tuottamien reaktiivisten happimetaboliittien vaikutuksesta sekä aktivoitujen PMN: ien tuottamien oksidanttien (hydroksyy-liradikaali ja hypokloorihappo) vaikutuksesta. Aktivaatio sisältää tavallisesti proentsyymimolekyylin pilkkoutumisen, jolloin syntyy aktiivinen kollagenaasi, jonka mole-: kyylipaino saattaa olla 60000-70000, riippuen aktivaa- . tiotavasta (Knäuper V. et ai. , Eur. J. Biochem. 1990; · • 1.: 189: 295-300). Kun prokollagenaasin N-terminaalinen pää (N-terminaalinen propeptidi) pilkotaan pois, siitä seu- ;T' raa, että entsyymin aktiivinen kohta syntyy tai paljas- tuu. ProMMP-8: n autoaktivaatio saattaa tapahtua myös ilman että molekyylin pilkkoutuminen olisi tarpeellista.

**|1# (Saari H. et ai. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990; \ 171: 979-987).

« « · · • 1 · • · t « · 31 98961

Paljastunut entsymaattisesti aktiivinen kohta on yhteinen kaikille aktiivisen MMP-8: n eri molekyylimuodoille, ja keksintö perustuu immunokemikaaliseen määritykseen, joka kykenee tunnistamaan mainitun aktiivisen kohdan. Spesifisyys, jota keksinnön mukaan menetelmältä vaaditaan, saavutetaan käyttämällä monoklonaalisia vasta-aineita, jotka on kohdistettu tiettyyn rakenteeseen (epitooppiin) mainitussa aktiivisessa kohdassa. Vasta-aineiden täytyy sitoutua samalla tavalla aktiiviseen kohtaan ja riippumatta muun molekyylin koosta.

Monoklonaaliset vasta-aineet keksinnön määritysmenetelmää varten on kehitetty alunperin Köhlerin ja Milsteinin tekniikan mukaan (Nature 1975; 255:495). Keksijät käyttä vät spesifistä sovellutusta, jonka ovat julkaisseet Stenman et ai. (J. Immunol. Meth. 1981; 46: 337 ).

2. Vasta-aineiden kehittäminen

Aktiivinen MMP-8 saattaa poiketa molekyylikonfiguraatiol- taan yksilöstä toiseen. In vivo proMMP-8: n aktivaatio voi tapahtua, paitsi eri isännän solunsisäisten tekijöiden vaikutuksesta, myös tiettyjen oletetuista parodontopato- : ' : geeneistä peräisin olevien bakteeriproteaasien vaikutuk- sesta. Ientulehdusta aiheuttavat bakteerilajit (ja niiden ·*·*; proteinaasit) poikkeavat eri yksilöillä toisistaan. Toi- • » saalta kokeelliset in vitro aktivaatiomenetelmät voivat • · · φ ,·;· tuottaa aktiivisen MMP-8: n isomuotoja, joita esiintyy • · « potilaan kudoksissa vain harvoin tai ei ollenkaan.

« • · · ··'* Tämä vaihtelu on otettu huomioon menetelmässä, jolla on • · · * • · · *·* ’ kehitetty keksinnön monoklonaaliset vasta-aineet. Jos ; ·.; hiiret olisi immunisoitu yhdellä aktiivisella isomuodolla ·;··· ja samaa isomuotoa olisi käytetty seulonnassa, olisi .* . mahdollisesti päädytty vasta-aineeseen, joka reagoi vain 32 98961 tämän isomuodon kanssa, joka saattaa olla luonnoton tai esiintyä vain osalla potilaista. Niiden käyttöön perustuva testi antaisi vääriä tuloksia.

Keksinnössä immunisaatio on tehty käyttäen aktiivisen MMP-8: n eri molekyylimuotoja. Ratkaiseva on kuitenkin menetelmä, jolla testataan hybridoomia ja klooneja. Hybri-doomat seulotaan sellaisen isomuodon avulla, jonka tiedetään esiintyvän niin usealla potilaalla kuin mahdollista. Tällä tavalla kehitettyjen kloonien reaktiivisuus erilaisia aktiivisia MMP-8:ia vastaan testataan edelleen ennen lopullista valintaa.

3. Immunisoimiseen käytetty antigeeni Tämän keksinnön kannalta ihanteelliset vasta-aineet tunnistavat MMP-8: n aktiivisen kohdan yhtä hyvin riippumatta aktiivisen entsyymin kaikista mahdollisista molekyylikon-figuraatioista. Immunisaatiossa käytetään aluksi MMP-8:n raakapreparaattia, mutta viimeisessä tehosteannoksessa varmistetaan olevan erilaisia aktiivisia muotoja käyttämällä pitkälle puhdistettujen antigeenivalmisteiden (ak-tiivinen MMP-8) seosta, jolloin ne on aktivoitu in vitro t.': esimerkiksi kolmella eri tekniikalla. Tämä johtaa ihan- ·;·. teelliseen aktiiviselle kohdalle spesifistä vasta-ainetta tuottavien hybridoomien moninaisuuteen, niin että voidaan • · I valita ne, jotka eivät tunnista molekyylin loppuosaa.

»·« 9 t 9 '* ProMMP-8 puhdistetaan ihmisen PMN-leukosyyteistä buffy coateissa (Sorsa T. , Scand. J. Rheumatol. 1987; 16: 167- ·./. 175; Knäuper V. et ai., Eur. J. Biochem 1990; 189:295-

• M

·.· · 300). Viimeistä tehosteannosta varten antigeeniä puhdis- .·. : tetaan edelleen ja sitä käytetään isomuotojen seoksena (esim. molaarisina suhteina 1:1:1), jotka on aktivoitu esimerkiksi 1) autoaktivaatiolla, 2) käsittelemällä ha-: pettimella ja 3) ihmis- ja bakteeriperäisen proteinaasin li 33 98961 entsymaattisella pilkkomisella (ihmisen katepsiini G:stä: Saari H. et ai. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990; 171:979-987; ja T. denticola kymotrypsiinin kaltaisesta proteinaasista: Sorsa T. et ai. , Infection and Immunity 1992; 60:4491-95). Vaihtoehtoisesti yksittäisille hii rille voidaan antaa tehosteannos yhdellä isomuodolla.

Valmistuksen autoaktivaatio suoritetaan, kuten yksi keksijöistä on julkaisussaan esittänyt (Sorsa T. , Thesis, Univ. Helsinki, Finland 1989). Hapetinaktivaatioss a ha-pettimena käytetään NaOCl: a ja aktivointi suoritetaan olennaisilta osin kuten Saari et ai. on kuvannut (Biochem. Biophys. Res. Commun 1990; 171:979-987). Keksijän (Sorsa T. et ai., Infection and Immunity 1992; 60:4491- 95) julkaisemaa menetelmää käytetään aktivoimiseen protei-naasilla, joka on saatu ihmisen neutrofiileista ja T. denticolas ta.

4. Immunisointi, fuusiointi, kloonaus ja kloonien transplantaatio BALB/c-hiiret immunisoidaan ja niille annetaan tehosteannos intraperitoneaalisesti 50-100 ug/ml:11a aktiivista : : MMP-8:a. Tämä suoritetaan antamalla pistos Freundin epä- täydellisessä adjuvantissa 2-4 viikon välein. Jos hii- « ·*·’: rillä on vasta-ainetitteri (katso testausmenetelmää jäi- • · .:. jempänä) ensimmäisen tehosteen jälkeen, niille annetaan • · · t .···. tehosteannoksina intravenöösisesti 50-100 ug antigeeni- • · · seosta keittosuolassa, kuten edellä on kuvattu. Perna . poistetaan 3-4 päivää viimeisen tehosteannoksen jälkeen, • · · ***· ja 1-2x10® pernasolua fuusioidaan polyetyleeniglykolissa • * * *’* (PEG, Boehringer Mannheim, Kataloginumero 1243268) eks- ponentiaalisessa kasvussa olevien 2. 5-5. 0 x 107 P3x63- ·;··· Ag8. 653 myeloomasolujen (Syngeneic) kanssa. Fuusion jäl- . keen solut levitetään pohjastaan U: n muotoisille mikro- titterilevyille Dulbeccon modifioimassa Eaglen ravinto- a · · 34 98961 liuoksessa (DME), jossa on 15% hevosen seerumia, jolloin solutiheytenä on 2x10® solua/ml. Jokainen kuoppa sisältää 0. 1 ml viljelyravintoliuosta. Yhden päivän jälkeen lisätään viljelmiin 0.1 ml selektiivistä HAT-ravintoliuosta (2 %: inen seos hypoks antiini a, aminopteriinia ja tyrni-diinia DMEM: issä, Gibco 50 x HAT, Kataloginumero 043-01060H). Tämän jälkeen puolet ravintoliuoksesta poistetaan joka toinen päivä ja korvataan tuoreella HAT-ravinto-liuoksella.

Kahden viikon viljelyn jälkeen solut siirretään HT-vilje-lyravintoliuokseen (2 % HAT, jossa ei ole aminopteriiniä, Gibco 50 x HT, Kataloginumero 043-01065H), joka vaihdetaan kolme kertaa viikossa, ja kahden viikon kuluttua solut siirretään lopuksi takaisin DME: hen, jossa on 15% hevosen seerumia. Voimakkaasti kasvavat vasta-ainetta tuottavat viljelmät seulotaan ja karakterisoidaan (katso menetelmät jäljempänä). Valikoitujen hybridomien viljelmät kloonataan sitten rajoittavana laimennoksena tasapohjaisissa mikrotitterilevyissä ihmisen fibroblasti fee-dereiden päälle. Vasta-ainetta tuottavat kloonit kloonataan uudelleen 95 kuoppaisissa levyissä. Subklooneja : : : lisätään koeputkessa ja myöhemmin Falconin kudosviljely- pulloissa.

• * • · ·

Hybridikl oonien transplantaatiota varten vasta-ainetta φ · tuottavat solut (Ixl0e/eläin) injisoidaan intraperito- « *!!* neaalisesti BALB/c vastaanottajiin, jotka on esikäsitelty • pristiinillä (2, 6,10,14-tetrametyylipentadekaani, Aid-rich). Askiites kehittyy 3-4 viikossa. Askii tesnes te «· · ··.*· otetaan pois ja testataan nesteessä oleva vasta-aine.

• · · • · · • · · 35 98961 5. Seulonta ja titraus

Viljelmien supernatantteja seulotaan viikottain vasta-ainetuotannon seuraamiseksi hybridisaatiosta ja kloonauksesta. Vasta-aineiden titraukset suoritetaan viikottain. Vasta-aineen titraus tehdään myös immunisoitujen hiirien antiseerumista ja askiitesnesteestä.

Radioanalyysimenetelmää käytetään, jotta havaittaisi vasta-ainetuotanto mainitun MMP-8: n aktiivista kohtaa vastaan. Tässä analyysissä käytetään pitkälle puhdistettua, radioaktiivisella jodilla leimattua MMP-8; joka on aktivoitu erilaisella tai samanlaisella menetelmällä kuin mitä on käytetty immunisointiin käytetyn antigeenin valmistukseen. Aktivointimenetelmä on valittu niin, että tuotettu isomuoto muistuttaa niin paljon kuin mahdollista muotoa, joka kirjallisuuden mukaan esiintyy yleisimmin potilailla. Esimerkiksi voidaan käyttää ihmisen PMNL-katepsiiniG: llä pilkkomista. PMNL-katepsiini-G voi vastata endogeenista proteolyyttistä proMMP-8:n aktivaatto-ria (Suomalainen K. , Thesis, Univ. Helsinki, Finland 1993 ).

PMNL-katepsiini-G aktivoi proMMP-8: n proteolyyttisellä t'j . vaikutuksella proMMP-8: n N-terminaaliin pilkkomalla phe- • 79-met80-peptidin , jolloin 85 kD latentti proMMP-8 muut- • · • « tuu 64 kD MMP-8 aktiiviseksi muodoksi. Vastaavan proMMP-8 N-terminaalin pilkkoutumisen on havaittu tapahtuvan pro- • · » ' MMP-8: n aktivoituessa T. denticolan kymotrypsiinin kal taisen proteinaasin vaikutuksesta (Sorsa et ai., julkai- • · · ···· sematon tieto). Katepsiini-G: llä aktivoitu MMP-8 leima- • · 1 taan radioaktiivisella jodilla käyttäen kloramiini T- t menetelmää (Greenwood F. C. et ai., Biochem. J. 1963; 8 9: — 114) ja sitä käytetään leimana seulontatutkimuksissa.

^ f Määrityksessä 50 ui supernatanttia inkuboidaan 150 ui 125I-antigeenin (noin 10000 cpm) kanssa fosfaatti-EDTA- 36 98961

NaCl-puskurissa, jossa on 0.33% BSA: a, pH 7.4. Yön yli inkuboinnin jälkeen sitoutunut leima saostetaan lisäämällä 100 ui naudan gammaglobuliinia fosfaattipuskurissa ja 1 ml 20% PEG 6000 fosfaattipuskurissa. Sentrifugoinnin jälkeen supernatantti imetään pois ja presipitaatin radioaktiivisuus mitataan. Näytettä pidetään vasta-ainetuotannon kannalta positiivisena, jos presipitaatin aktiivisuus on huomattavasti suurempi kuin tausta (kasvuravinto-liuos viljelmäsupernatantin tilalla), s. o. sitoutunut aktiivisuus on enemmän kuin 50 % kontrollina käytetyn polyklonaalisen preparaatin maksimisitoutumisesta. Tit-rauksessa titterillä tarkoitetaan laimennosta, joka sitoo 50% maksimimäärästä leimaa, jota suuri ylimäärä vasta-ainetta sitoo spesifisesti. Polyklonaalista anti-MMP-8:a, joka tunnistaa sekä latentit että aktiiviset muodot, käytetään kontrollivasta-aineena.

6. Testausmenetelmät ja karakterisointi

Hybridomaviljelmistä, jotka on seulonnassa havaittu positiivisiksi, testataan edelleen niiden herkkyys löytää aktiivinen MMP-8 ja niiden ristireaktio proentsyymin kanssa. Käytetään RlA-menetelmää, jossa leimana on sama radioaktiivisella jodilla leimattu, katepsiini G:llä aktivoitu MMP-8-valmiste, jota käytetään myös seulonta- • · tutkimuksessa. 100 ui leimaa, 50 ui standardia tai testat- • · tavaa, ristireagoivaa ainetta ja 50 ui vasta-aineliuosta < (kaikki f os f aatti-EDTA-NaCl -puskurissa, joka sisältää » < - 0.33% BSA: a, pH 7.4) inkuboidaan yön yli. Sitoutuneen radioaktiivisuuden erottaminen suoritetaan samalla taval- • · · la kuin seulontamenetelmässä. Jokainen vasta-aine laimen- • · · · netaan sitomaan noin 50 % maksimisitomismäärästään. Stan- .·. : dardit valmistetaan katepsiini G: llä aktivoidusta MMP- 8: sta pitoisuuksina 10-1000 ug/1.

37 98961

Ne hybridomat, joilla on paras herkkyys eikä ristireak-tiota pro-MMP-8: n kanssa, valitaan kloonattaviksi. Uusien monokloonien spesifisyyttä karakterisoidaan edelleen. RIA: 11a määritetään niiden sitoutuminen kolmeen immunisoinnissa käytettyyn MMP-8 isoentsyymiin. Keksinnön diagnostisissa menetelmissä käytettäväksi valitaan ne kloonit, jotka reagoivat mahdollisimman samanlaisesti kaikkien muotojen kanssa ja ovat täten spesifisiä vain aktiiviselle kohdalle. Klooneista testataan myös niiden risti-reaktio sellaisten MMP-8: n kanssa rakenteellisesti samankaltaisten entsyymien kanssa, joita mahdollisesti on ike-nen krevikulaarinestenäytteissä (ainakin PMNL-gelatinaasi (MMP-9), fibroblastityyppinen kollagenaasi (MMP-1) ja stromelysiini-1 (MMP-3)). Valittaville klooneille ei sallita yli 0.01% ristireaktioita (se määritellään ris-tiinreagoivan aineen pitoisuuden prosenttina standardi-pitoisuudesta, joka aiheuttaa 50% leiman korvautumisen).

Valittujen kloonien tuottama immunoglobuliinin isotyyppi määritetään kittimenetelmällä (Mouse Typer, BioRad, CA). Vasta-aineet puhdistetaan käyttäen affiniteettikromato-grafiaa Protein A:11a (Pharmacia, Sweden). Niiden iso-elektriset pisteet tutkitaan isoelektrisellä fokusoinnil-la (Phast System, Pharmacia, Sweden).

• « · • · • « ♦ 7. Monoklonaaliset vasta-aineet PMNL prokoll agenaasi a • · (proMMP-8) vastaan.

t * · · · tr' • f · • » · • Immunometristä menetelmää varten tarvitaan vasta-aine-pari, jossa vasta-aineet voivat sitoutua samanaikaisesti • · * samaan antigeenimolekyyliin. Tämän vuoksi vasta-aineiden • · · * täytyy tunnistaa molekyylistä eri epitoopit, ja näiden .·. : epitooppien on oltava riittävän kaukana toisistaan, jotta sitoutuminen voi tapahtua ilman steeristä estettä, joka I « • aiheuttaisi affiniteetin menetyksen. Aktiivisessa MMP- "· 8: ssa aktiivinen kohta ei ole riittävän suuri, jotta i t 38 98961 voisi odottaa löytyvän vasta-aineparin, jossa molemmat vasta-aineet ovat aktiiviselle kohdalle spesifisiä ja voisivat silti sitoutua siihen samanaikaisesti. Sen vuoksi tämän määrityksen kannalta riittää se, että toinen vasta-aineista on spesifinen. Parodontaalisairauden aktiivisuutta arvioivan testin toinen vasta-aine voi tunnistaa epitoopin, joka sijaitsee siinä kohdassa MMP-8-molekyyliä, joka on yhteinen kaikille aktiivisille ja inaktiivisille muodoille.

Toisen vasta-aineen tuottamiseksi valitaan kloonattaviksi myös joitakin hybridomia, joilla testauksissa oli voimakas ristireaktio prokollagenaasin kanssa. Näistä klooneista valitaan lopulta ne, joilla on laajin spesifisyys kaikkia aktiivisia ja inaktiivisia muotoja kohtaan. Ko-konaiskollagenaasia (aktiivinen MMP-8 ja inaktiivinen proMMP-8 samanaikaisesti) mittaavassa määrityksessä käytetään kahta näistä klooneista, jotka kykenevät toimimaan vasta-aineparina määrityskitissä.

8. Diagnostiset määritysmenetelmät parodontaalisairauden aktiivisuuden määrittämiseksi « 1 < : ,'· Monoklonaaliset vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä

4 I I

! aktiiviselle ihmisen ja/tai nisäkkäiden MMP-8:lle ja j‘*’i jotka on kehitetty edellä olevan menetelmän mukaisesti, ··· käytetään suunniteltaessa erilaisia määritysmenetelmiä * · · < parodontaalisairauden aktiivisuuden arvioimiseksi. Vaih- « toehtoisia kvantitatiivisia ja kvalitatiivisia menetelmiä .. kuvataan alla.

• · • · · • f ·« • ψ % tm»

Erittäin perinteinen menetelmä todeta antigeenin olemassaolo immuno.logisesti, on todeta näköhavaintoon perustuen antigeenin sitoutumisen aiheuttama vasta-aineella päällys-tettyjen partikkelien agglutinaatio. Käytetyt partikkelit voivat olla esimerkiksi lateksipartikkeleja. Keksinnön 39 98961 mukaisessa parodontiitin aktiivisuusmäärityksessä osa lateksipartikkeleista on päällystetty monoklonaalisilla vasta-aineilla, jotka ovat spesifisiä MMP-8: n aktiiviselle kohdalle, ja osa niistä on päällystetty monoklonaa-lisella vasta-aineella, joka on spesifinen molekyylin loppuosan epitoopille. Kun aktiivista MMP-8:a on läsnä, nämä kahdenlaiset partikkelit sitoutuvat verkoksi antigeenin muodostaman sillan avulla ja näin muodostuu nähtävissä oleva agglutinaatio. Punaisia verisoluja voidaan käyttää partikkeleina, jos niin sanottu hemagglutinaatio-testi on käytössä. Kääntäen voidaan käyttää agglutinaa-tion inhibitioperiaatetta.

Uudenaikaisempi periaate, jota voidaan käyttää keksinnön mukaisessa määrityksessä, on käyttää kahta vasta-ainetta immunometrisessä "flow through"-tekniikassa (US 4, 366, 241). Tässä määritys suoritetaan parhaiten laitteessa, jossa absorboivaa ainetta oleva alusta on päällystetty membraa-nilla, joka on esimerkiksi nitroselluloosaa tai nailonia. Tässä membraanissa on alue, johon on kiinnitetty yhdenlaisia vasta-aineita (esimerkiksi niitä, jotka tunnistavat MMP-8: n aktiivisen kohdan). Nestemäinen näyte pipe-toidaan membraanille ja näytteessä mahdollisesti oleva aktiivinen MMP-8 sitoutuu vasta-aineisiin lopun näytteestä virratessa membraanin läpi. Sitten lisätään leima- • · · . aine. Tämä leima voi olla toisen vasta-aineen konj ugaatti • · · 40 98961 resenssi tai kemiluminesenssi voidaan mitata sopivilla laitteilla ja tässä tapauksessa, jos on käytetty pitoi-suuskalibraatiota, määritys voidaan tulostaa kvantitatiivisesti. Leimareagenssi voi olla myös värillisten (tai muuten signaalin tuottavien) partikkelien suspensio (tehty esimerkiksi lateksista), jotka on päällystetty toisella vasta-aineella. Tässä membraanin huokoskoko on tehty sellaiseksi, että ne partikkelit, jotka eivät sitoudu immunokemiallisesti membraanin pinnalle, virtaavat huokosten läpi. Pesuvaiheen jälkeen sitoutuneet partikkelit voidaan mitata suoraan visuaalisesti tai epäsuorasti signaalimi ttauksella.

Parodontaalisairauden aktiivisuusmääritystä suunnitel taessa voidaan käyttää immunokromatografista periaatetta hyvin edullisesti. Tämä tekniikka, jota usein kutsutaan "lateral flow"-tekniikaksi, on kuvattu yksityiskohtaisesti EP 291 194: ssä (joka sisältää suoritusmuotoja tes- tauslaitteella, joka sisältää pääasiassa membraanin ja absorboivaa materiaalia olevan alustan ontossa kotelossa) ja WO 94/15215: ssä (joka sisältää suoritusmuotoja testaus-laitteella, joka sisältää pääasiassa membraanin ja absorboivan alustan testitikku eli "dip-stick"-välineessä, johon on rakennettu kammiomainen aukko). Immunometrisessa : . menetelmässä, jossa käytetään kahta erilaista vasta-ainet- ’·'· ta, ensimmäinen vasta-aineella (esimerkiksi sellainen, • * ,i joka tunnistaa MMP-8: n aktiivisen kohdan) on päällystetty ·* « partikkeleja, jotka toimivat leimana, joka voidaan havai- t · - ta silmällä, jos ne ovat värillisiä, tai sopivilla lait- . teillä, jos ne tuottavat fluoresenssi- tai kemilumine- « · * *;·* senssisignaalin. Partikkelit voidaan tehdä esimerkiksi 0 · * **! lateksista, kolloidisesta metallista (kulta, seleeni) tai 1 ·.: dispergoi vasta väriaineesta. Nämä leimapartikkeli t on kiinnitetty testauslaitteeseen niin että, kun laitteen . absorboiva osa saatetaan kontaktiin nestemäisen näytteen » » » Λ

• « I

kanssa ja näyte on absorboitu, partikkelit kulkeutuvat * t < I · 41 98961 nestevirtauksen mukana ja samanaikaisesti leimavasta-aine sitoo antigeenin (aktiivisen MMP-8:n), jos sitä on näytteessä. Neste absorboituu edelleen laitteen membraaniin. Membraanille kiinnitetty toinen vasta-aine (monoklonaa-linen tai polyklonaalinen antiMMP-8, joka tunnistaa eri epitoopin kuin ensimmäinen vasta-aine) vyöhykemäiselle alueelle. Kun nestevirtaus, joka kuljettaa leimaa, kulkee tämän alueen läpi, ne leimapartikkelit, joihin on sitoutunut antigeeniä, sitoutuvat vyöhykkeeseen. Näin vyöhyke on havaittavissa, jos näytteessä oli antigeeniä.

Tämä tekniikka voi perustua myös vain yhden vasta-aineen käyttöön. Tämä voidaan tehdä esimerkiksi käyttämällä antigeenillä päällystettyjä leimapartikkeleita, jotka kilpailevat näytteessä mahdollisesti olevan antigeenin kanssa. Monoklonaalinen vasta-aine, joka on spesifinen MMP-8: n aktiiviselle kohdalle, on kiinnitetty vyöhykkeeksi membraanille. Näytteen antigeeni valtaa vyöhykkeen vasta-aineen sitomiskohdat, eikä näin ilmesty mitään havaittavaa vyöhykettä. Toisessa versiossa leimatut partikkelit, jotka on päällystetty antigeenin analogilla, on löyhästi sidottu vasta-aineeseen, joka on kiinnitetty i · i ' absorboivalle alueelle. Näytteen antigeeni korvaa vasta- | . aineeseen sitoutumisessa analogin ja leimapartikkelit I* : kykenevät vaeltamaan vyöhykkeelle, joka sisältää sieppaus- ·’·*; reagenssin.

• « • • r ·

L

• I **

Immunokromatografiasta voidaan tehdä myös kvantitatii- * t · vista mittaamalla membraaniin sidotun leiman tuottamaa . signaalia, kun ajetaan tunnettuja standardeja tai tunte- ··” mattomia näytteitä. Näköhavaintoon perustuva semikvanti- « * · *·* tointi on mahdollista, jos testilaitteessa käytetään useita vasta-ainevyöhykkeitä kasvavin vasta-ainemäärin « · ·; « vyöhykkeessä.

< · * · » 42 98961

Edellä mainitut menetelmät ovat hyödyllisiä kehitettäessä nopeaa vastaanotolla suoritettavaa testiä, jonka suoritus -aika on lyhyt (usein vain muutamia minuutteja). Uudemmat menetelmät ("lateral flow" ja "flow through") ovat menetelmiä, jotka laboratoriotyöskentelyyn harjaantumaton henkilökunta kykenee suorittamaan ja tulkitsemaan hyvin luotettavasti. Niistä puuttuu myös joitakin agglutinaa-tiomenetelmien suuremmista haitoista, kuten väärät positiiviset, jotka johtuvat reumafaktorista, ja erityisesti sameiden näytteiden vaikea arviointi.

Kuitenkin muitakin immunologisia menetelmiä voidaan soveltaa parodontaalisairauden aktiivisuuden arvioinnin määritykseen, jolloin nämä menetelmät suoritetaan tavallisesti laboratoriossa, koska niihin tarvitaan spesifistä, mahdollisesti automatisoitua laitteistoa ja/tai erityisesti koulutettua henkilökuntaa. Seuraavat menetelmät ovat erityisen sopivia, jos tarvitaan kvantitatiivista mittaustulosta. Turbidometrisiä ja nefelometrisiä menetelmiä voidaan käyttää. Ne sisältävät tavallisesti polyklonaali-siä vasta-aineita, mutta tällaisessa testissä, jossa ; : tarvittava spesifisyys perustuu monoklonaalisiin vasta- aineisiin, käytetään edullisesti reagenssia, joka koostuu sopivan kokoisten lateksipartikkelien seoksesta, jotka on päällystetty kahdella vasta-aineella. Klassisia immuno- • ♦ • kemiallisia menetelmiä radioisotooppisine leimoineen voidaan käyttää (radioimmunoanalyysi, joka sisältää kompe- « · titiivisen analyysirakenteen ja yhden vasta-aineen, ja immunoradiometrinen analyysi, jossa on vasta-ainepari).

« ♦ · *..i Isotooppileimojen sijasta monet muut leimatut yhdisteet • · · V · ovat käyttökelpoisia samankaltaisissa menetelmissä. Ent- ·/. : syymi-immunoanalyysin tai immunoentsymometrisen analyysin leimoiksi voidaan konjugoida vasta-aineisiin entsyymejä, kuten piparjuuriperoksidaasi tai alkaalinen fosfataasi, '. jolloin leimat detektoidaan kolorimetris ten, f luorometris- ten tai kemiluminometristen substraattien avulla. Fluore- 43 98961 soivat yhdisteet voidaan konjugoida myös suoraan vasta-aineeseen ja niitä voidaan käyttää fluoroimmunoanalyyseis-sä ja fluoroimmunometrisissa analyyseissä, joihin on kehitetty useita monimutkaisia detektiomenetelmiä (esim. viivästynyt fluoresenssi, fluoresenssipolarisaatio). Yhdessä fluoresenssimenetelmien kanssa menetelmät, joissa käytetään luminesoivia leimoja (luminoimmunomääritykset ja immunoluminometriset määritykset) ovat herkimpiä tällä hetkellä saatavissa olevia immunokemiallisia menetelmiä.

9. Paikkasepesifiset ja seulontatestit parodontaalisai-rauden aktiivisuuden määrittämiseksi

Kaikkia edellä kuvattuja menetelmiä voidaan periaatteessa käyttää sekä paikkaspesifisiin että seulontamäärityksiin. Kuitenkin näköhavaintoon perustuva agglutinaatio, "lateral flow" ja immunokromatograafiset menetelmät soveltuvat parhaiten nopeaan vastaanotolla suoritettavaan määrittämiseen, mikä on parasta molemmissa tapauksissa.

Seulontatesteissä on tarkoitus todeta, onko kokonais MMP-8 kohonnut potilaan GCF: ssä, syljessä tai suun huuh-, telunesteessä. Jos totaali ja aktiivinen MMP-8 mitataan samanaikaisesti, voidaan arvioida mahdollisen parodontaalisai rauden etenemisen aste.

• · · • · · • · • ·

Sylki on helposti kerättävissä, kun potilaan annetaan .•'Γ ensin huuhdella suunsa huolellisesti ja sitten pureskella paraffiinia. Muitakin syljen eritystä stimuloivia aineita voidaan käyttää. Jos on tarvetta säilyttää näytettä ennen analysointia, voidaan käyttää erityistä syljenkeräyslai- « · · tetta kuten Omni-SALR (Saliva Diagnostic Systems, WA).

♦ · « ’· Vaihtoehtoisesti määritys voidaan suorittaa suun huuhtelu- * näytteestä, joka kerätään antamalla potilaan pureskella ) paraffiinia 30 sekuntia - 1 minuuttia ja sen jälkeen 44 98961 sylkeä suun nestesisältö; sen jälkeen potilaat huuhtele-vat tyhjät suunsa 3 ml: 11a kraanavettä, joka kerätään sitten määritystä varten.

Paikkaspesifistä määritystä varten hammaslääkäri voi ottaa GCF-näytteen laittamalla suodatinpaperiliuskan parodontaalitaskun suulle. Liuskan annetaan absorboida nestettä, edullisesti standardoidun ajan. Sitten liuska pannaan koeputkeen, jossa on sopiva puskuriliuos, johon näytteen proteiinit ekstrahoituvat. Immunokromatografian kyseessä ollen käytetään mittatikkua, jolloin testi tikku kastetaan suoraan putkeen testausta varten. Suodatinlius-kojen ohella voidaan käyttää myös muita absorboivia materiaaleja kuten huokoisia muoveja tai keramiikka sekä orgaanisia että epäorgaanisia silikayhdisteitä, todennäköisesti kiinnitettynä pidikkeeseen sopivaa kuljetusta varten. Neste voidaan kerätä myös lasiseen tai muoviseen kapillaariputkeen. Lopuksi "dip-stick"-tyyppinen määritys-laite voidaan suunnitella niin, että se sisältää absorboivan pään, joka pannaan parodontaalitaskuun ja näyte absorboituu suoraan määrityslaitteeseen.

Paikkaspesifinen testi-tikkumääritys, jolla suljetaan pois sairauden mahdollisuus tietyssä kohdassa tai joka ... ohjaa lääkäriä jatkotutkimuksiin, voi olla kvalitatiivi- • · ‘ nen. Määrityksen raja-arvo (cut-off pitoisuus) valitaan *·'_* niin, että saadaan optimaalinen herkkyys ja spesifisyys.

Parodontaalisairauden aktiivisuusmäärityksen ollessa kyseessä yli noin 1 ug/ml olevat MMP-8: n kokonaispitoi - ..li’ suudet voidaan tulkita positiivisiksi GCF-näytteissä.

• · · V! Vastaavasti seulontamäärityksessä syljen/suun huuhtelu- nesteen kokonais MMP-8: n pitoisuus, joka on yli 2 ug/ml, saattaa viitata kohonneeseen etenevän parodontiitin ris-. kiin ja aktiivisen MMP-8: n pitoisuus, joka on yli 4 ·.'·· ug/ml, voi olla osoituksena aktiivisesta sairaudesta •f>J joissakin kohdissa, joka pitäisi määrittää sitten yksit- 45 98961 täin. Testitikkutestissä sekä kokonais- että spesifiset määritykset voidaan yhdistää yhdessä tikussa käyttämällä kahta vasta-aineviivaa, joissa vasta-aineilla on erilaiset spesifisyydet. Tämä määritys (GCF: stä, syljestä ja suun huuhtelunesteestä) on uusi lähes tyrnistäpä ja sitä tullaan käyttämään sellaisten parodontaalikohtien tutkimiseen, jotka näyttävät olevan vaarassa kehittää sekä parodontaalikiinnityksen että alveolaarisen luun kiinnityksen menetyksen, täten eri parodontiittipotilasryh-mien mahdollisen parodontaalisairauden aktiivisuuden tutki miseen.

«1 · • · · • · « · ♦ · · · • « · • « · « « • · t * • « · · • · · • · · • · · «

Claims (18)

46 98961

1. Menetelmä parodontaalisairauden aktiivisuuden ja/tai peri-implantiitin ja/tai mainittujen sairauksien kohonneen riskin diagnosoimiseksi, tunnettu siitä, että detektio suoritetaan immunologisena määrityksenä, joka sisältää seu-raavat vaiheet: a) ientaskunestenäytteen keräys näytteenotto- tai määritysväli-neellä; ja b) mainitun näytteen saattaminen yhteen ainakin yhden monoklo- naalisen vasta-aineen kanssa, joka on näytteenotto- tai määri-tysvälineessä, tai joka voidaan lisätä näytteenotto- tai määri-tysvälineeseen, tai johon näytteenotto- tai määritysväline voidaan lisätä, ja joka tunnistaa aktiivisen nisäkkäiden ja/tai ihmisen matriksimetalloproteinaasi 8:n (MMP-8), jota tuottavat polymorfonukleaariset neutrofiiliset leukosyytit (PMNL).

2. Vaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun aktiivisen MMP-8:n olemassaolo todetaan immunologisella menetelmällä, joka kykenee erottamaan mainitun aktiivisen MMP-8:n ja inaktiivisen proMMP-8:n ja/tai tunnis- ; tamaan niiden kohonneen tason.

·*·*: 3. Vaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, » · .j. että mainittu monoklonaalinen vasta-aine on monoklonaalinen • · « I anti-MMP-8, joka tunnistaa aktiivisen ihmisen MMP-8 :n.

< .. 4. Vaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, • · • « · *... että se sellaisen monoklonaalisen vasta-aineen lisäksi, joka « · · **) tunnistaa aktiivisen nisäkkäiden MMP-8, sisältää toisen vasta-'/ aineen, joka tunnistaa inaktiivisen nisäkkäiden ja/tai ihmisen proMMP-8 :n. * · 98961

5. Vaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ainakin yksi toinen vasta-aine on leimattu ainakin yhdellä detektioleimalla, joka on valittu suoria ja epäsuoria leimoja sisältävästä ryhmästä.

6. Vaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että parodontaalisairauden aktiivisuutta ja/tai peri-implan-tiittia esiseulotaan keräämällä sylki- tai suun huuhtelunäyte.

7. Määritysväline parodontaalisairauden aktiivisuuden ja/ tai peri-implantiitin ja/tai mainittujen sairauksien kohonneen riskin diagnosoimiseksi patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä, tunnettu siitä, että se sisältää ainakin yhden monoklonaalisen vasta-aineen, joista ainakin yksi tunnistaa polymorfonukleaaristen neutrofiilisten leukosyyttien (PMNL) tuottaman aktiivisen nisäkkäiden ja/tai ihmisen mat-riksimetalloproteinaasi 8:n (MMP-8) ja ainakin yhden detek- toitavissa olevan leiman ja valinnaisesti kiinteitä tai nestemäisiä kantajia, joita tarvitaan immunologisen testin suorittamiseen.

8. Vaatimuksen 7 mukainen määritysväline, tunnettu siitä, että väline kykenee erottamaan mainitun aktiivisen MMP-8:n ja sen inaktiivisen esimuodon (proMMP-8) toisistaan ja/tai tunnistamaan kokonais-MMP-8:n kohonneen tason. • · • · · • · • · ..li*

9. Vaatimuksen 7 mukainen määritysväline, tunnettu • · · : siitä, että ainakin yksi monoklonaalisista vasta-aineista, joka tunnistaa mainitun aktiivisen nisäkkäiden tai ihmisen ·*♦., MMP-8 :n, on monoklonaalinen vasta-aine, joka saadaan seuraavat vaiheet sisältävällä menetelmällä: • · · ^ a) inaktiivisen nisäkkäiden ja/tai ihmisen MMP-3:n aktivointi '··’ menetelmillä, joita ovat autoaktivaatio tai aktivointi akti-voivilla aineilla; 98961 b) hiirien immunisointi aktivoidun nisäkkäiden ja/ tai ihmisen MMP-8:n eri isomuotojen seoksella, joka saadaan kohdassa a) kuvatulla tavalla aktivoiduista inaktiivisen nisäkkäiden ja/tai ihmisen MMP-8:n raaka- tai puhdistetuista preparaateista; c) hybridomasolulinjojen tuotto tavanomaisilla hybridomatek-niikoilla; ja d) sellaisia monoklonaalisia vasta-aineita tuottavien hybridomasolulinjojen seulonta, jotka tunnistavat mainitun aktiivisen nisäkkäiden ja/tai ihmisen MMP-8:n riittävän herkästi ja minimaalisella ristireaktiolla inaktiivisen proMMP-8:n ja muiden rakenteeltaan samankaltaisten entsyymien kanssa; tai mikä tahansa monoklonaalinen vasta-aine, jolla on olennaisesti mainitut määritellyt ominaisuudet, jotka seulotaan, ja joka monoklonaalinen vasta-aine on saatavissa olennaisesti mainitun-kaltaisella menetelmällä tai jollain muilla perinteisillä menetelmillä, joita käytetään monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseen.

10. Vaatimusten 7-9 mukainen määritysväline, tunnet-t u siitä, että se sellaisen monoklonaalisen vasta-aineen lisäksi, joka tunnistaa mainitun aktiivisen nisäkkäiden ja/tai ihmisen MMP-8:n, sisältää ainakin yhden toisen monoklonaalisen • · : vasta-aineen, joka ristireagoi mainitun inaktiivisen nisäk- *:· käiden ja/tai ihmisen proMMP-8:n kanssa ja joka on saatavissa • · · · käyttämällä tavanomaisia hybridomatekniikoita tai vaatimuksen 2 vaiheita. • « f · • M

11. Vaatimuksen 7 mukainen määritysväline, tunnettu • · · siitä, että väline on rakennettu immunologiseksi menetelmäksi, « » · joka on valittu ryhmästä, joka sisältää immunokromatografiset menetelmät, immunometriset menetelmät, radioimmunoanalyysit, I) 98961 entsyymi-immunoanalyysit, fluoroimmunoanalyysit, luminesenssi-immunoanalyysit, immunoagglutinaation, hemagglutinaation, agglutinaation inhibition, turbidimetriset immunoanalyysit ja nefelometriset immunoanalyysit, ja detektioleimat ja vaihtoehtoiset kantajat on valittu käytetyn menetelmän mukaan.

12. Vaatimuksen 11 mukainen määritysväline, tunnettu siitä, että väline on konstruoitu immunologiseksi menetelmäksi, joka perustuu "lateral flow"-periaatteeseen.

13. Vaatimuksen 11 mukainen määritysväline, tunnettu siitä, että väline on rakennettu immunologiseksi menetelmäksi, joka perustuu "flow through"-periaatteeseen.

14. Vaatimuksen 7 mukainen määritysväline, tunnettu siitä, että se sellaisen monoklonaalisen vasta-aineen lisäksi, joka tunnistaa mainitun aktiivisen nisäkkäiden ja/tai ihmisen MMP-8:n, sisältää ainakin yhden toisen vasta-aineen, joka voi olla polyklonaalinen vasta-aine, joka ei erota aktiivista MMP-8:a ja inaktiivista proMMP-8:a.

15. Vaatimuksen 7 mukainen määritysväline, tunnettu siitä, että kokonaisMMP-8:n kohonnut taso on ainakin 1 ug/ml paikkaspesifisessä näytteessä ja ainakin 2 ug/ml sylkinäyttees- . sä. r » »

16. Vaatimuksen 7 mukainen määritysväline, tunnettu « siitä, että parodontaalisairauden aktiivisuuden ja/tai peri- • i t * implantiitin olemassaolo todetaan paikkaspesifisellä menetel- ti mällä, jossa näyte kerätään kiinteällä, absorboivalla näytteen- * « ! ottovälineellä, jota voidaan käyttää testausvälineenä. • · » * % m

:*·*; 17. Vaatimuksen 7 mukainen määritysväline, tunnettu siitä, että detektioleima valitaan ryhmästä, joka sisältää suoria ja epäsuoria leimoja. t s 98961

18. Monoklonaalisen vasta-aineen käyttö parodontaalisairauden aktiivisuuden ja/tai peri-implantiitin paikkaspesifiseen immunologiseen määrittämiseen, tunnettu siitä, että mainittu moncklonaalinen vasta-aine tunnistaa aktiivisen ihmisen MMP-8:n.