JP3083325B2 - 歯周病の特異的で鋭敏な診断方法とその診断用試験キット - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の技術分野 本発明は、哺乳類、特にヒトの歯周病の活性の診断方
法とその診断用試験キットに関する。本発明の方法は、
歯周炎、ペリ−インプラント破壊症（peri−implantiti
s）およびHIV（＋）−感染／エイズ病関連歯周病の迅速
なチェアサイド診断（chair−side diagnosis）を行う
方法である。

発明の背景 歯周病はヒトの生歯にとって重要な問題である。実際
に、むし歯より歯周病によって多くの歯が失われてい
る。したがって、歯周病の信頼性が高い診断試験法が強
く要望されている。

歯周病は、歯肉および歯を支持する歯槽（顎）骨を冒
す感染症が原因の一群の炎症障害で構成されている。歯
周病の主な原因は、歯に付着した細菌苔である。この細
菌苔が歯肉の炎症を起こして、実際の歯（actual toot
h）を支持する構造体と骨の破壊をもたらす。歯周病の
場合は、通常、歯肉線の上方（歯肉上）および下方（歯
肉下）の両方の細菌苔に大量の細菌が蓄積されている。
その細菌苔は石灰化して石灰結石を形成する。この石灰
結石と付随する細菌苔は、歯と歯肉の間に“ポケット”
を生成し、このポケットが歯周症の特徴である。

歯肉炎（歯肉の炎症）は、歯肉が炎症を起こしている
が、深い（＞4mm）歯周ポケットが検出されない点が歯
周炎と異なっている。したがって歯を支持する構造体の
回復不能の破壊は歯肉炎には見られない。歯周炎は、炎
症を起こした歯肉と、歯を支持する構造体の破壊とが特
徴であるが、歯周炎は、臨床上健康に見える歯肉の場
合、見落とされるときがある。

歯周病を検出する方法がいくつも開発されている（Ar
mitage,G.C.,C.D.A.Journal,36巻、35〜41頁、1993
年）。しかし、現在利用できる検出法は、歯周病の活性
を診断し、ペリ−インプラント破壊症およびHIV（＋）
−感染症／エイズ関連歯周病を評定する信頼性の高い手
段を提供するのに十分正確で特異的な方法ではない。

特に、以下に考察するように進行中の歯周炎を評定す
る方法を開発する試みがいくつも、なされているが、こ
れらの方法はいずれも、迅速で信頼性が高いチェアサイ
ド試験を生み出すのに十分満足すべきものではないこと
が分かっている。

視覚検査 歯肉が歯周病に冒されると、色が変化し（ピンク色か
ら赤へ）、組織の変化（赤さと腫脹）と出血する傾向の
増大（特定の歯肉と小溝／溝の領域）が検出される。歯
周病が進行した段階では、歯の可動性と浮上がりが増大
することが多い。

しかし、限局性若年型歯周炎（LJP）のような歯周病
のいくつかの形態のものは、性質が不安定でありかつ紛
らわしい臨床過程をとる。したがって、活動中の局所性
歯周炎は視覚検査によって必ずしも検出できるわけでは
ない。その結果、若年型歯周炎の臨床診断に役立つ生化
学的補助手段が、特に若年の患者の場合、敏速で十分な
早期診断を行うのに望ましくかつ有益である。

歯周の状態の臨床評定と歯周病変部の消息子検査（pr
obing）。

現在、歯周病は、歯周ポケットの存在と深さ、歯と骨
の結合の減損、および歯肉の乳頭状出血のような指標を
臨床観察することによって診断されている。しかし、臨
床観察結果は必ずしも信頼性が高い指標ではない。例え
ば、推定される歯周病病原体が入っている深い歯周炎ポ
ケットが、疾患の活性または歯周組織の破壊を必ずしも
示していない。

歯周の結合のレベルは、目盛付き歯周消息子によって
評定し、セメント質とエナメル質の接合部から歯周ポケ
ットの底部までの距離で表すことができる。比較的長い
各歯面（tooth surface）の距離を記録して歯周図に入
れる。4mm未満のポケット深さの値は通常の変動（norma
l variation）の範囲内にあるとして図から除外する。
したがって4mmを超えるポケットは歯周炎ポケットまた
は歯周病変部とみなされる。

歯周消息子検査法は、測定法としていくつもの誤差原
因をもっている。消息子の侵入度は、挿入力、歯周組織
の炎症状態、および消息子先端の直径によって変化す
る。消息子の太さ、歯面の外形および消息子の不適切な
角形成（angulation）から生じる測定誤差は、適正な測
定器を選択しかつ検査手順を注意深く管理することによ
って小さくしたりまたは回避することができる。しかし
ながら、消息子挿入力と歯周組織の炎症の変動が原因の
誤差は回避することが一層困難である。これらの測定誤
差によって、正確さと再現性が制限される。

歯肉炎すなわち歯肉の炎症は、注目すべきことである
が、歯肉は炎症を起こしているが深い（＞4mm）歯周ポ
ケットは検出できないという点で歯周炎とは区別され
る。したがって、消息子検査および／またはＸ線撮影法
で検出される、歯を支持する構造体の回復不能の劣化
（破壊）は、歯肉炎には見られない。歯周炎は、炎症を
起こした歯肉と、派を支持する構造体の破壊が特徴であ
るが“臨床上健康に見える”歯肉にかなり存在してい
る。

結論として、臨床観察の結果は、必ずしも信頼性があ
る指標ではないことは明らかである。その外の問題点
は、進行中の活性歯周病を評定するのは困難であること
である。というのは、症例によっては、深い歯周炎ポケ
ットに、歯周病病原体と考えられるものが宿っていて
も、炎症歯周組織の破壊については必ずしも活性ではな
いからでる。したがって、既存の試験法は炎症歯周組織
の破壊に対しては信頼性がなく、歯周ポケットが活性で
あるか否かを決定する信頼性が高く安価で客観的な手段
がない。

歯周病の活性を明らかにしかつ監視する診断試験法が
ないことは、一般に歯周病を治療するためとる必要があ
る矯正方法が困難なので特に重大な問題になっている。

自動歯周消息子も開発されている。主な利点は、挿入
力が制御されること、再現性があり直接データが入力さ
れることである。主な欠点は、オペレータと患者の接触
感覚が減少することである。

Ｘ線撮影法による評価 連続Ｘ線画像も、歯周病の活性を評価するのに使用さ
れている。歯槽堤における骨密度の喪失が歯周炎が進行
している徴候であることが多い。

歯槽（顎）骨の高さと歯槽堤の外形はＸ線撮影器で検
査できる。Ｘ線撮影器は歯間の歯槽骨の高さと形態の情
報を提供する。しかしながら、歯周病の活性のＸ線撮影
による評定には欠点がある。優れた一組のフィルムがあ
って、経験をつんだ検査員でも、裸眼では、歯槽骨の鉱
物質の30〜50％が失われてしまった後の骨の変化しか検
出できない。カバー構造（骨、組織、歯）によって、頬
側と舌側の歯槽堤の輪郭を適正に確認することが困難に
なることが多い。Ｘ線撮影器による分析は、正しい正確
な診断結果を得るには、ポケットの深さと結合レベルの
データの詳細な評価を組合せて行わねばならない。再診
（recall）時（治療された歯周炎患者の検査）にはＸ線
撮影検査が必要である。

要約すると、歯周消息子とＸ線撮影器は、歯周炎進行
の二つの別個の構成要素を測定している。一方は軟組織
の歯面に対する結合が失われていることを推定し、他方
は骨密度の喪失を測定する。

歯周消息子法に加えて、生物学的（微生物および生化
学による）試験法が、進行中の歯周病巣に関連する情報
を提供するために計画されている。これらの生物学的歯
周炎試験法は、四つの一般的な範疇に分類され、１）推
定病原体に関連する物質、２）宿主由来の酵素、３）組
織破壊生成物、および４）炎症媒体（inflammatory me
diator）の存在を検出するよう設計されている。

推定歯周病病原体の存在についての試験法 どの微生物が進行中の歯周炎に関連しているかを決定
するため多くの研究が行われている（Armitage,G.C.,
“Periodontal diagnostic aids",C.D.A.Journal,36
巻、35〜41頁、1993年）。歯周炎がみられる未治療の患
者には、下記の細菌類（各種の組合せで）が推定病原体
として示唆されている。すなわちスピロヘータ類［例え
ばトレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticol
a）］、ポルフィロモナス・（バクテロイデス）・ジン
ジバリス［Porphyromonas（Bacteroides）gingivali
s］、バクテロイデス・フォーシンサス（Bacteroides
forsythus）、プレボテラ・（バクテロイデス）・イン
ターメディア［Prevotella（Bacteroides）intermedi
a］、カンピロバクター・レククス（Campylobacter re
ctus）［ウォリネラ・レクタ（Wolinella recta）］、
エイケネラ・コローデンス（Eikenella corrodens）、
アクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンス（Acti
nobacillus actinomycetemcomitans）、フソバクテリ
ウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）、キ
ャプノサイトファガ・スプチゲナ（Capnocytophaga sp
utigena）、ペプトストレプトコッカス・ミクロス（Pep
tostreptococcus micros）、ストレプトコッカス・ミ
ティス（Streptococcus mitis）、セレノモナス（Sele
nomonas）属の種の細菌、ユウバクテリウム（Eubacteri
um）属の種の細菌およびヘモフィルス（Haemophilus）
属の種の細菌である。これらの微生物は、培養分析、顕
微鏡検査およびDNAプローブ分析（Armitage,G.C.,C.D.
A.Journal,36巻、35〜41頁、1993年）によって、歯肉下
の細菌苔の試料中に確認されている。

ベンゾイル−アルギニン−ナフチルアミド／ベンゾイ
ル−アルギニン−ｐ−ニトロアニリドの加水分解に基づ
いたBANA/BAPNA−試験法は同じ推定病原体を確認してい
る（Armitage,C.G.,C.D.A.Journal,36巻、35〜41頁、19
93年）。これら微生物のどれが（存在している場合）歯
周炎の進行に関与しているか明確には分かっていないの
で、これら微生物の存在が歯周病の実際の活性を示して
いない。

宿主由来の酵素に基づいた試験 歯周病／歯周炎病巣の進行に伴う組織の破壊は、各種
の宿主および細菌由来のタンパク質分解酵素の独立の作
用と協働作用が原因であろう。歯周炎の病巣が拡張し進
行している間、マトリックスメタロプロティナーゼ類
（MMP）、エラスターゼ、カテプシン類およびトリプシ
ン様プロティナーゼ類を含む各種酵素が、トリガーされ
た宿主の細胞から放出される。またこれらプロティナー
ゼ類は口腔細菌からもある程度誘導される（Uitto,V.J.
ら、Proc.Finn.Dent.Soc.,83巻、119〜130頁、1987
年）。したがって、この種のいくつもの酵素は、歯周病
の進行と活性を監視するための生化学的指標として提案
されている（Armitage,C.G.,C.D.A.Journal,36巻、35〜
41頁、1993年）。

酵素活性を確認し測定することに基づいた試験法が開
発されている。例えば、アスパラギン酸アミノトランス
フェラーゼ（ASAT）は歯周病と関連づけられている。こ
の酵素は、歯肉溝液、すなわち歯肉細胞組織の実際の健
康状態を示すことが分かっている隣接歯肉の炎症滲出液
中に測定されている（Page,R.C.,J.Periodont.Res.,26
巻、230〜242頁、1991年）。しかし、ASATは、各種歯周
組織の損傷細胞のほとんどすべてが放出し、かつ血液中
にもかなりの量で存在している。したがって、歯肉溝液
のASAT試験法は、高い非特異的なバックグランドによっ
て妨害される。

活性歯周病以外の症状で放出される酵素類が起こす偽
陽性は、提案されている他の酵素（例えばβ−グルクロ
ニダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アリールスルファタ
ーゼおよびいくつかのプロティナーゼ類）の大部分を用
いる場合、重大な問題である。チェアサイド試験法が歯
肉液エラスターゼ（Prognostik,Dentsply Corp社、米
国ペンシルバニヤ州ヨーク）と一般プロティーゼの活性
［Periocheck（登録商標）、Advanced Clinical Tech
nologies Inc.社、米国マサチューセッツ州ウェストウ
ォード］について開発されている。この両者の試験法に
は特異性が欠けている。基質として使用される合成ペプ
チド類とゼラチンは、ヒトおよび細菌のプロティナーゼ
類のほとんどすべてによって分解される。したがって、
酵素活性が、歯周が健康な対照と比べて歯周病の臨床過
程と関連している場合、高いバックグランド活性、偽陽
性および偽陰性の試験結果が認められている。

唾液／口内リンス液、歯肉溝液および歯苔の試料から
歯周病を診断するチェアサイド比色プロテアーゼ検定シ
ステムが提案され開発されている［Periocheck（登録商
標）、Advanced Clinical Technologies Inc.社、米
国マサチューセッツ州ウェストウォード］。

BANA/BAPNA−試験法として知られている試験法は、ベ
ンゾイル−アルギニン−ナフチルアミド／ベンゾイル−
アルギニン−ｐ−ニトロアニリドの加水分解に基づいて
いる。その加水分解によって、嫌気性口腔細菌、例えば
ポルフィロモナス・ジンジバリス、トレポネーマ・デン
ティコラおよびバクテロイデス・フォーシンサスの存在
を示す赤橙色を呈する（Armitage,C.G.,C.D.A.Journal,
36巻、35〜41頁、1993年）。これらの微生物は、合成の
BANA/BAPNA−ペプチドの基質を加水分解することができ
るトリプシン様プロティナーゼ類を放出すると考えられ
ている。しかしこの試験法は、細菌プロティナーゼ類に
対してだけ特異的であるわけではない。宿主細胞由来の
多数のプロティナーゼ類（例えばトリプシン類、トリプ
シン様プロティナーゼ類、マスト細胞トリプターゼ類な
ど）がBANA/BAPNA−ペプチド類に対して同様の特異性を
有している（Ingman,T.ら、Oral Microbiol.Immunol.,
8巻、298〜305頁、1993年）。歯周炎の歯肉溝液中に、
ヒト細胞由来のトリプシン様プロティナーゼ類が存在す
ることが報告されている（Sorsa,T.ら、J.Dent.Res.,71
巻、732頁、1992年）。したがって、この試験法の問題
点は、ヒト細胞由来のプロティナーゼと細菌プロティナ
ーゼを識別しないことである。

要約すると、上記の検定法では、各種の宿主および細
菌由来のプロティナーゼ類が非特異的な合成もしくは天
然の基質、例えばゼラチンの分解に関与しているので偽
陰性および偽陽性の試験結果が起こることが多い。

組織分解生成物の測定 歯周炎の主な特徴の一つは、歯周組織の細胞外マトリ
ックス（すなわちコラーゲン）の破壊である。Ｉ型とII
I型のコラーゲンが歯周組織中に存在する主なコラーゲ
ンの種類である。

歯周炎の患者の歯肉溝液中のヒドロキシプロリンとグ
リコサミングリカン類の濃度が増大していることが分か
っている。歯周炎の歯肉溝液中の特定のＮ末端とＣ末端
を有するコラーゲンテロペプチド類が研究されている。
歯肉溝液中にこれらコラーゲンのＩ型とIII型のプロペ
プチド類が存在してることは歯肉コラーゲンの合成と分
解の両者を反映していると提言されている（Talonpoik
a,J.Ann.Univ.Turku,Serie Ｄ 142、1994年）。しか
し、これらプロペプチドは、歯肉コラーゲンの分解を反
映している代わりに、一般に一層有効なコラーゲンの合
成／代謝を反映し、活性歯周病の進行に関連する実際の
歯周の破壊ではなく歯周の治療を行った後の歯周の治癒
を監視する場合有益であった（Talonpoika,J.ら、J.Cli
n.Periodontol.,21巻、320〜333頁、1994年）。

炎症媒体の測定 歯周組織、特に歯肉炎と歯周炎に明確に関連がある細
胞は、各種の炎症媒体を産生することが知られている。
これら媒体のいくつかは、疾患の活性を評価する際の生
化学的／免疫学的マーカーとして提案されている（Pag
e,R.C.,J.Periodont.Res.,26巻、533〜546頁、1991
年）。病気にかかっている歯肉組織と歯肉溝液中に検出
されるこれら炎症媒体の量は、健康な歯周の歯肉と歯肉
溝液と比べ増大している（Page,R.C.,J.Periodont.Re
s.,26巻、533〜546頁、1991年）。腫瘍壊死因子−α、
インターロイキン−１βおよびプロスタグランジンE2が
研究されている（Page,R.C.,J.Periodont.Res.,26巻、5
33〜546頁、1991年）。これらの媒体は、炎症プロセス
の活性を反映しているので、マーカーとして有望であ
る。しかしこれら媒体はどれも歯周病に対して十分特異
的であると証明されているわけではない。また迅速試験
法も開発されていない。生体外で、これらの炎症媒体
は、常在口腔細胞（歯肉の線維芽細胞と角化細胞）によ
るde−novo MMPの発現を誘発することができることが
知られている（Birkedal−Hansen,H.,J.Periodontol.,6
4巻、474〜484頁、1993年）。生体内で、歯周炎の歯肉
と歯肉溝液中の炎症媒体の量が増大するのは、線維芽細
胞型のMMPの量の増大とは関連がない。これらの種類のM
MPは、PMN−型のMMPとは対照的に、常在の歯肉／口腔線
維芽細胞と上皮細胞によって発現され産生される。好中
球由来のMMPとエラスタービが歯周炎の歯肉と歯肉溝液
中に見出されている（Suomalainen,K.,Thesis,Univ.ヘ
ルシンキ、1993年;Ingman,T.,Thesis,Univ.ヘルシン
キ、フィンランド、1994年）。したがって、炎症媒体
（腫瘍壊死因子−α、インターロイキン１−βおよびプ
ロスタグランジンE2など）のMMP依存性歯周組織破壊に
対する関係は、生体外の試験結果は有望であるにもかか
わらず、（Birkedal−Hansen,H.,J.Periodontal.,64
巻、474〜484頁、1993年）、明らかでない（Sorsa,T.
ら、Ann.NY.Acad.Sci.,732巻、112〜131頁、1994年）。

歯周病のマトリックスメタロプロティナーゼ類（MMP） 歯周結合組織の酵素分解は、病気にかかった歯周組織
に特徴的な各種の変化（alternation）の原因になって
いる。これらの変化としては、コラーゲン（類）の正味
の減少、歯周／歯肉組織の強度の低下と透過性の増大お
よび歯槽骨の損失がある。

コラーゲンの損失はコラーゲン代謝の変化が原因であ
ろう。線維芽細胞による合成の速度は、炎症組織では低
下し、合成されるコラーゲンは、繊維構造体の分子構造
に欠陥がある。このような変化があると、コラーゲン
は、タンパク質分解作用を一層受け易くなる。分子間架
橋を有する高分子コラーゲンフィブリルは、可溶性コラ
ーゲンフィブリルより、タンパク質分解／コラーゲン分
解の作用に対し著しく耐性であることが分かっている。

コラーゲンの分解酵素（コラゲナーゼ類、ゼラチナー
ゼ類およびストロメリシン類すなわちマトリックスメタ
ロプロティナーゼ（MMP）のファミリーのメンバー）
は、歯周病に関連して十分に研究されてきた宿主細胞由
来のプロティナーゼ群である。培養条件で、炎症歯肉の
外植片は、臨床上健康な歯肉由来の外植片より多量のコ
ラゲナーゼを分泌する。いくつもの生体内の徴候が、宿
主細胞由来のマトリックスメタロプロティナーゼ類（MM
P）がヒトの歯周組織の破壊に関与していることを示し
ている（Birkedal−Hansen,H.,J.Periodontal.,64巻、4
74〜484頁、1993年）。その徴候としては、歯周炎患者
の炎症歯肉組織、歯肉溝液および唾液／口内リンス試料
の抽出物中の高いコラゲナーゼ活性（MMP−１とMMP−
８）とゼラチナーゼ類（MMP−２とMMP−９）がある（So
rsa,T.ら、Ann,NY,Acad,Sci.,732巻、112〜131頁、1994
年）。これらプロティナーゼ類の活性は、これらプロテ
ィナーゼ類を歯肉細胞外マトリックスと隣接歯肉に提供
する歯周炎病巣部位における歯周炎症とポケットの深さ
の重症度に対して正の相関関係がある（Sorsa,T.ら、An
n.NY.Acad.Sci.,732巻、112〜131頁、1994年）。さら
に、潜在型ではなくて活性型で見出されるこれらプロテ
ィナーゼ類の相対量は、歯周病の重症度が高いほど増大
するようである（Suomalainen,K.,Thesis,Univ.ヘルシ
ンキ、フィンランド、1993年）。さらに、歯周炎部位に
おけるこれらMMPの活性は、機器による治療（歯石除去
および歯根剥削）の後、低下する（Ingman,T.,Thesis,U
niv.ヘルシンキ、フィンランド、1994年）。さらに、実
験歯肉炎における歯肉溝液中のコラゲナーゼの活性が増
大することが見出されている（Sodek,J.ら、Matrix 12
（Suppl.1）,352〜362頁、1992年）。最後になるが、炎
症ヒト歯肉からは、炎症の程度が低い歯肉より多量のコ
ラゲナーゼが抽出される（Sorsa,T.Thesis,Univ.ヘルシ
ンキ、フィンランド、1989年）。これらの試験結果は、
哺乳類MMPの活性の変化を反映していると考えられる。
というのは、病気にかかった部位に見出されるプロティ
ナーゼは、三重らせんのコラーゲンを分解して、哺乳類
のコラーゲンの開裂に特徴的な3/4〜1/4のフラグメント
を生成するからである（Sorsa,T.,Thesis,Univ.ヘルシ
ンキ、フィンランド、1989年;Sodek,J.ら、Matrix 12
（Suppl.1）,352〜362頁、1992年）。歯肉炎／歯周炎の
場合の、歯肉、歯肉溝液および唾液の中のコラゲナーゼ
類に関する最近の研究では、脊椎動物と細菌のコラゲナ
ーゼによるコラーゲンの開裂パターンの差を利用して、
コラゲナーゼの起源を確認している（Sorsa,T.ら、Ann.
NY.Acad.Sci.,732巻、112〜131頁、1994年）。例えばＩ
型コラーゲンを炎症ヒト歯肉の歯肉抽出物とともにイン
キュベートして反応生成物が分析された。試験結果は一
貫して、細菌のコラゲナーゼではなくてヒトコラゲナー
ゼが特徴とする開裂パターンを示した。したがって、歯
肉溝液試料のコラゲナーゼは、主としてヒトの細胞から
生成し細菌からは生成しないことが証明されたのである
（Sorsa,T.らAnn.NY.Acad.Sci.,732巻、112〜131頁、19
94年）。また最近の研究によって、ヒトの唾液ならびに
ヒトの歯肉上および歯肉下の歯苔試料のコラゲナーゼ
は、ヒトが起源のコラゲナーゼであり、活性型のMMP−
８の機能的および免疫学的特性を有することも報告され
ている（Sorsa,T.ら、J.Clin.Perio.印刷中、1995
年）。したがって、歯周病のコラゲナーゼは主として宿
主由来であることは明らかである。

歯肉組織、歯肉溝液および唾液のコラゲナーゼ類の特
性解析をさらに行った結果、これら酵素の主の起源は、
歯周炎症に存在する多形核中性白血球（PMN）であるこ
とが分かった。このことは、Ｉ〜III型のコラーゲンに
対する基質の特異性の研究、プロコラゲナーゼ・アクチ
ベーターに対する応答および特定の抗MMP抗体を用いる
ウエスタンブロットと免疫化学の分析に基づいている
（Sorsa,T.ら、Ann.NY.Acad.Sci.,732巻、112〜131頁、
1994年）。Tonetti,M.S.らは最近、好中球コラゲナーゼ
（MMP−８）のトランスクリプト（transcript）が炎症
ヒト歯肉組織に見られることを指摘した（Tonetti,M.S.
ら、J.Periodont.Res.,28巻、511〜513頁、1993年）。

これらプロティナーゼ類は、歯肉溝液（GCF）と唾液
のコラゲナーゼまたはゼラチナーゼの活性の合計として
測定されると、炎症歯肉組織のコラゲナーゼとゼラチナ
ーゼの活性に対して正の相関関係があるので、歯周組織
の破壊と歯周病の活性を反映していることが見出されて
いる（Kinane,Curr.Op.Dent.,2巻、25〜32頁、1992
年）。歯周を治療すると、歯肉溝液と唾液／口内リンス
のPMN MMP−活性が低下する（Sorsa,T.Thesis,Univ.ヘ
ルシンキ、1989年;Suomalainen,K.,Thesis,Univ.ヘルシ
ンキ、フィンランド、1993年；およびIngman,T.,Thesi
s,Univ.ヘルシンキ、フィンランド、1994年）。Sorsa,
T.らは、PMN細胞由来の好中球コラゲナーゼ（MMP−８）
が、コラゲナーゼ/MMP−群の主要メンバーであり、特に
歯周病に見られる組織破壊の進行に関与していることを
確認できた（Sorsa,T.ら、J.Periodont.Res.,23巻、386
〜393頁、1988年;Sorsa,T.ら、Arch.Oral.Biol.,35巻、
193〜196頁、1990年;Golub,L.M.ら、J.Clin,Periodon
t.,22巻、100〜109頁、1995年;Sorsa,T.ら、Ann.NY.Aca
d.Sciences,732巻、112〜131頁、1994年;Ingman,T.ら、
J.Periodontol.,64巻、82〜88頁、1993年）。またHIV
（＋）感染症／エイズ病に関連する歯周炎（Robinson,
P.G.ら、J.Periodont.,65巻、236〜243頁、1994年;Holm
strup,P.ら、J.Clin.Periodontol.,21巻、270〜280頁、
1994年）も活性（MMP−８）の増大と関連している（Sal
o,T.ら、Ann.NY.Acad.Sci.,732巻、476〜478頁、1994
年）。またペリ−インプラント破壊症に関連する炎症プ
ロセスは、ペリ−インプラント破壊症の歯肉溝液中のコ
ラゲナーゼ類（MMP−８）の活性の増大と関連があるこ
とが分かっている（Ingman,T.ら、J.Clin.Periodonto
l.,21巻、301〜307頁、1994年;Teronen,O.ら、J.Dent.R
es.,74巻、495頁、1995年）。

歯周炎患者由来の歯肉溝液と唾液のコラゲナーゼ類
（PMN MMP−８）は、歯周炎症によって、非活性で潜在
型のプロフォーム（proform）から触媒的に活性の形態
に変換されることが見出されている（Sorsa,T.ら、J.Pe
riodont.Res.,23巻、386〜393頁、1988年;Uitto,V.ら、
J.Periodont.Res.,25巻、135〜142頁、1990年）。歯肉
炎の場合の歯肉溝液と唾液のプロ−MMPの活性化は、他
のヒト/PMN−プロティナーゼ類（カテプシンＧ）、細
菌、（ピー・ジンジバリスおよびティー・デンティコ
ラ）のプロティナーゼ類、およびPMNが生成する反応性
酸素の種（例えば次亜塩素酸:HOCl）の独立のおよび／
または協力作用によって起こると考えられる（Sorsa,T.
ら、N.Engl.J.Med.,321巻、327〜328頁、1989年;Sorsa,
T.ら、Infection and Immuntiy,60巻、4491〜4495
頁、1992年;Sorsa,T.ら、Somin.Arth.Rheum.,22巻、44
〜53頁、1992年）。

コラゲナーゼの活性は、コラーゲンの分解として、分
光光度法（227nm）で測定することができる（Lindy,S.
ら、Eur.J.Biochem.,158巻、１〜４頁、1986年）。合成
ペプチドの分解も分光光度法または蛍光光度法で監視で
きる（Bergmeyer,U.H.編集“Methods in Enzymatic
Analysis",Verlag Chemie社、ドイツ、バインハイム19
85年239〜248頁に記載のTschesche,H.らの報告）。

これらの方法によって、個々のコラゲナーゼを区別す
ることは可能なので、特定のインヒビターとアクティベ
ーターによってこの区別は達成することができる（Sors
a,T.ら、Thesis Univ.ヘルシンキ、フィンランド、198
9年）。

しかし、一般に、上記の方法は、ヒト好中球（MMP−
８）と線維芽細胞型（MMP−１）のコラゲナーゼの活性
を識別することができない。Sorsa,T.らが確認したよう
に、ヒト好中球コラゲナーゼ（MMP−８）（Sorsa,T.
ら、J.Periodont.Res.,23巻、386〜393頁、1988年;Sors
a,T.ら、Arch.Oral.Biol.,365巻、193S〜196S、1990
年）は、歯周病において歯肉／歯周組織および歯槽骨組
織の破壊を開始する際の主要MMPである。他の起源（単
球／マクロファージ類、上皮細胞類および歯肉線維芽細
胞）由来のコラゲナーゼ類は、この場合、あまり重要な
役割をはたしていないようである（Sorsa,T.Thesis.Uni
v.ヘルシンキ、フィンランド、1989年;Sorsa,T.ら、An
n.NY.Acad.Sci.,732巻、112〜131頁、1994年;Golub,L.
M.ら、J.Clin.Periodont.,22巻、100〜109頁、1994
年）。

したがって、歯周炎の歯肉溝液のMMP−８に対して特
異的な方法は、歯周炎における組織破壊事象のコースを
検討するのに最適であろう。

コラゲナーゼ類はウエスタンブロット法で同定するこ
とができる。SDS−PAGEに次いでニトロセルロースへの
転移を行った後、標識化ポリクローナル抗体で蛍光免疫
学的ステイニングを行って特定の酵素を同定することが
できる。

本発明の発明者らは、歯周炎がみられる患者と健康な
対照由来の歯肉溝液と唾液の中の全MMP−８を定量する
ため、ELISA法（酵素結合イムノソルベント検定法）
で、潜在状態および活性のMMP−８に対するポリクロー
ナルウサギ抗血清を使用した。

しかしこの方法は、労力と時間がかかりすぎて日常的
な実験室の試験では利用できない。さらに、迅速なチェ
アサイド試験は電気泳動法によって実施できそうにな
い。

歯肉溝液は、炎症ヒト歯肉から歯周ポケットを通じて
唾液へ流入する炎症滲出液である。それは、隣接する炎
症歯肉で起こっている無数の炎症反応を反映している。
臨床業務において、歯肉溝液は、細長い濾紙を、歯周ポ
ケットの開口部に入れることによって容易に収集され
る。したがって、歯肉溝液は、歯周炎の進行に対する有
力なマーカーの興味深い原料である。

歯周病活性の生化学的マーカーの研究は、歯肉溝液
（GCF）または唾液／口内リンスの試料に集中してい
る。病気の炎症ヒト歯肉組織の分解プロセスは、隣接歯
肉溝液に反映される。歯肉溝液分析法の利点は、冒され
ていない部位と冒されている部位に関する部位特異性で
ある。欠点は試料容積が小さいことと試料収集が技術的
に難しいことである。一方、唾液／口内リンスの試料の
場合、炎症媒体類／酵素類の濃度は希釈されることが多
いので部位特異性を反映しない。

上記のように、歯周病の活性を評価する多数の方法が
開発されている。しかしこれらの方法はいずれも十分満
足すべきものではない。視覚検査では、歯周炎のすべて
のタイプと段階を検出することができない。臨床観察の
結果には十分な信頼性がない。なぜならば、深いポケッ
トでさえ、炎症が必ずしも活性ではないからである。Ｘ
線撮影による評価を行うには、詳細な臨床観察結果と視
覚観察結果を組合わさねばならない。病原微生物が存在
していても、実際の歯周病の活性を十分に反映している
わけではない。分解生成物に基づいた診断も満足すべき
ものではない。なんとなれば、分解生成物が存在してい
ることは、コラーゲンの迅速な代謝または合成を示し、
必ずしもコラーゲンの分解を示すものではないからであ
る。炎症媒体が研究されているが、満足すべき迅速かつ
特異的な試験法は設計されていない。いくつもの宿主由
来酵素に基づいた試験法が開発されているが、細菌が放
出する酵素類によって起こる偽陽性のため特異的でな
い。

MMPについて許容可能な方法は入手できなかった。コ
ラゲナーゼを測定する生化学的方法は多数あるが、いず
れの方法も、試験キットで成功するための前提条件であ
る信頼性が高い迅速なチェアサイド試験法を設計するの
には十分でないことが証明された。使用されたポリクロ
ーナル抗体は十分に特異的ではない。上記のウエスタン
ブロット法、ELISA法などのような免疫学的方法は高価
な機器と設備が必要である。これらの方法は、冗長でか
つ実施することが困難である。したがって、これらの方
法では、信頼性が高く、簡単な迅速チェアサイド試験法
は得られない。技術の現状はMcCulloch,C.A.G.,J.Clin.
Periodontol.,21巻、497〜506頁、1994年で考察されて
いる。

簡単で実用的な信頼性の高い方式で歯周病の活性を検
出する生化学的マーカー試験法は、感度と特異性が必要
である。感度は、試験の結果が陽性の場合、疾患が存在
している確率である。特異性は、試験結果が陰性の場
合、疾患が存在しない確率でる。歯周炎が進行している
場合、最適の試験法は、進行中の歯周炎部位をすべて偽
陰性の試験結果を示すことなく検出し（最適感度）、か
つ進行していない部位を偽陽性の試験結果を示すことな
く検出する（最適特異性）。

上記のように、MMP−８は、歯周炎の際に起こる結合
組織の破壊に直接関連している。MMP−８は、歯肉溝液
に含有され、歯肉ポケットを通じて口腔に拡散されるの
で、歯肉溝液試料中のMMP−８の活性の大きさを評定す
ることによって部位特異的歯周病活性を測定することが
可能である。

プロMMP−８は、歯周炎症に関連する炎症プロセス中
に活性型に変換される。したがって、歯周炎部位から収
集した歯肉溝液試料における潜在型から活性型プロMMP
−８への変換を測定することは、進行性歯周病の活性の
特異的でかつ鋭敏な生化学的指標として役立つはずであ
る。健康な歯周と歯周炎の歯周の歯周溝液試料由来のポ
リクローナル抗MMP−８で行ったウエスタンブロット試
験のデータは、MMP−８が存在していることは歯周炎が
存在していることを示し偽陽性と偽陰性の試験結果が最
も少ないことを示唆している。しかしながら、ポリクロ
ーナル抗MMP−８は、活性のMMP−８と非活性のプロMMP
−８を識別することができない。したがって、特異的な
モノクローナル抗体を利用して歯肉溝液中の活性化され
たMMP−８を同定する試験法は、歯周病の活性を選別
し、かつ部位特異的サンプリング時の試料サイズが小さ
いという問題と口内リンスサンプリング時の希釈される
問題を克服するのに最適であろう。

唾液または歯肉溝液のコラーゲン分解酵素活性を測定
する方法がいくつも報告されている。活性は、コラーゲ
ンの分解によって起こる吸光度の増大を観察することに
よって分光光度法で測定することができる。基質として
の合成ペプチドの分解は色または蛍光を生成するシステ
ムに接続して、分光光度法または対応して蛍光分光法に
よって追跡することができる。全MMP−８を定量測定す
るELISA法には、潜在型と活性型のMMP−８の両者と反応
性のポリクローナルウサギ抗血清が使用されている。

しかし、これらの方法は、本発明の発明者の知見によ
ると、歯周病の歯肉組織の破壊の主原因であるMMP−８
の活性と、他の起源由来のコラゲナーゼ類の活性を区別
しない。これらの方法は、各種の酵素の活性が含まれて
いるため、歯周炎に対して特異的ではないので、歯周炎
とは無関係の理由により、例えば非病原性であるがコラ
ゲナーゼを産生する細菌が存在しているため増大した値
を示すことが多い。

MMP−８（先に述べたコラゲナーゼ／間質コラゲナー
ゼ）は、ヒトの多形核好中球（PMN）によってプロコラ
ゲナーゼ（プロMMP−８）として産生される。MMP−８は
PMNからプロMMP−８として精製される。プロMMP−８は
高度にグリコシル化されている安定なポリペプチドであ
り分子量は約85000である。このプロ酵素は生体外で、
各種のプロティナーゼ類（例えばトリプシン、キモトリ
プシンおよびカテプシンＧ、しかしプラスミンは含まれ
ない）または有機水銀化合物類のような薬剤によって活
性化することができる。生体内での活性化の機構はほと
んど分かっていないが、活性化は、PMNがつくり出す反
応性の酸素代謝物と炎症部位においてトリガーされたPM
Nがつくり出す酸化剤（ヒドロキシルラジカルと次亜塩
素酸）によって起こるようである。活性化はプロ酵素分
子の開裂によって行われる。この開裂によって活性コラ
ゲナーゼが創製される。分子量は、活性化のモードによ
って、60000〜70000の範囲内で変化する（Knuper,V.
ら、Eur.J.Biochem.189巻、295〜300頁、1990年）。プ
ロコラゲナーゼのＮ末端プロペプチドが除去されると、
その酵素の活性部位が生成して露出する。プロMMP−８
の自己活性化も分子分解（molecular splitting）なし
で起こることがある（Saari,H.ら、Biochem.Biophys.Re
s.Commun.171巻、979〜987頁、1990年）。

発明の要約 上記のように、各種の宿主細胞由来の炎症媒体が、歯
肉炎、歯周炎、ペリ−インプラント破壊症およびHIV
（＋）−感染／エイズ関連歯周病の歯周組織によって産
生される。これらの宿主細胞由来炎症媒体のいくつかが
歯周炎において組織破壊を行う主流になっているであろ
うという状況に鑑みて本発明の発明者らは、これら炎症
媒体の一種以上が進行中の病巣の生化学的マーカーとし
て有用であるという可能性を検査した。

本発明の発明者らは、哺乳類のMMP−８の活性型を認
識してその活性型とプロ酵素型を区別するモノクローナ
ル抗体が、歯周炎を診断するのに用いる信頼性が高い鋭
敏な方法と試験キットを製作する手段を提供することを
見出したのである。活性MMP−８の各種の分子型のすべ
てが共有しているのは酵素的に活性の部位であるから、
活性MMP−８を検出するのに用いるのを目的とする抗体
はこの部位を認識するよう開発される。これらの抗体
は、その分子の外の部分の大きさにかかわりなく、同様
に上記活性部位に結合しなければならない。

したがって本発明は、哺乳類の活性マトリックスメタ
ロプロティナーゼ−８を認識するモノクローナル抗体に
基づいた、歯周病活性の信頼性が高く、再現性があり、
高感度で特異的な診断法を提供するものである。

また本発明は、チェアサイドで利用することができ、
そして特異性、感度および信頼性に加えて迅速かつ容易
に実施できる方法を提供するものである。これらのチェ
アサイド法は、精巧な機器や設備を必要としない。サン
プリングによって外傷は生じない。本発明の方法は、部
位特異的サンプリングと前もって簡単に行う選別に有用
である。

また本発明は、口内リンスサンプリングに関連する希
釈の問題と部位特異的試料のサイズが小さい問題を克服
する方法を提供するものである。

また本発明は、ペリ−インプラント破壊症を早期に高
い信頼性で診断する手段、ならびに歯肉炎およびHIV
（＋）−感染症／エイズ病に関連する歯周病の経過と進
行を診断し監視する手段を提供するものである。

本発明の方法は、試験キットを組立てることによって
実施することができる。本発明の方法は、チェアサイド
診断用に組立てられた試験キットによって実施すること
ができる。

本発明の試験キットには、PMNが産生する哺乳類の活
性MMP−８を認識する少なくとも１種のモノクローナル
抗体が入っている。

本発明の試験キットには任意に、哺乳類の非活性MMP
−８と活性MMP−８を認識するが両者を区別しない他の
モノクローナル抗体が入っており、任意の試験キットを
製造するのに使用できる。

また本発明の試験キットには、免疫学的試験を実施す
るのに用いる直接または間接の標識ならびに任意の固体
または液体の担体が入っている。

本発明は、歯周病の活性を診断する試験キットに関す
る。本発明の試験キットには、多形核好中球（PMN）が
産生する、哺乳類の特にヒトの活性マトリックスメタロ
プロティナーゼ８（MMP−８）を認識する少なくとも１
種のモノクローナル抗体が入っている。

また本発明の試験キットには、免疫額的試験を実施す
るのに必要である検出可能な直接または間接の標識なら
びに任意の固体または液体の担体が入っている。

公知の免疫学的検定法のいずれも適用することができ
る。好ましい実施態様において、側方流動原理に基づい
た免疫クロマトグラフィー法および流動通過原理に基づ
いた免疫化学的な特に免疫分析法（immunometric meth
od）が用いられる。

活性型および非活性型のMMP−８を認識する抗体はモ
ノクローナル抗体である。しかし、本発明には、モノク
ローナル抗体に加えて、使用できる必要な特性を有する
ポリクローナル抗体も含まれている。抗体は任意の哺乳
類の起源から誘導することができる。抗体は、任意の哺
乳類の起源由来のMMP−８を認識すると解される。

哺乳類の活性MMP−８を認識するモノクローナル抗体
は、哺乳類および／またはヒトの非活性のMMP−８が活
性化されて、異なるイソ型の活性化MMP−８の混合物で
免疫化が実施される方法で得ることができるモノクロー
ナル抗体である。細胞系は、通常のハイブリドーマ法で
製造され、次いで本発明の試験キットと方法に必要な異
なるタイプのモノクローナル抗体を産生する細胞が選別
される。

また本発明は、歯周病の活性の診断方法に関する。そ
の方法は、免疫学的検定法として実施され、その検定法
は、試料を収集し次に試料を哺乳類の活性MMP−８だけ
を認識する１種もしくは複数種のモノクローナル抗体と
接触させ、そして同時にまたは上記ステップの後、試料
を、哺乳類の非活性プロMMP−８を認識するモノクロー
ナルまたはポリクローナルでもよい追加の１種または複
数の抗体と接触させるステップを含んでなる方法であ
る。これらの抗体は適当な方法で試験キットに組み入れ
ることができ、そしてその試験は、試験結果を容易に解
釈することができる検出法を用いて実施される。

試料は、特定の部位または病巣に関連する歯肉溝液か
ら部位特異的方式で収集することが好ましい。

本発明の別の実施態様で、歯周炎になる危険は、唾液
試料または口内リンスの試料を試験することによって前
もって選別される。陽性の場合は引続いて部位特異的方
法を行い、試料の収集は、免疫学的試験の帯状物として
作動するかまたは作動しない固体の吸収性サンプリング
器具で実施する。

発明の詳細な説明 以下の説明では、免疫学と免疫病理学、臨床科学、薬
科学および歯科学と歯科病理学の技術分野の熟練者にと
って公知の各種の方法を参照する。参照するかような公
知方法が記載されている刊行物などの資料は、完全に記
載されているようにその全体を本明細書に援用するもの
である。

免疫検定法の一般原理および試験室と臨床の用具とし
ての抗体の生成と使用は、例えば“Antibodies,A Labo
ratory Manual"（Harlow,E.およびLane,D.編集、Cold
Spring Harbor Laboratory、米国ニューヨーク州コ
ールドスプリングハーバー、1988年）に記載されてい
る。

薬科学の一般原理は、例えば“Remington's Pharmac
eutical Sciences"（第18版、Gennaro,A.R.編集、Mack
Publishing社、米国ペンシルベニア州イーストン、19
90年）に記載されている。

定義 本明細書で用いる技術用語と科学用語はすべて、特に
ことわりないかぎり、本発明が属する技術分野の熟練者
が通常理解しているのと同じ意味を有している。以下の
説明には、免疫学と歯科学で用いられる多くの用語が広
範囲に使用されている。本明細書と特許請求の範囲を、
これら用語に与えられる作用域を含めて明確かつ一貫し
て理解するために下記の定義を提供する。

“抗原”は、組成物、生物または物質であって、それ
らに対して特異的な抗体産生応答を誘発することができ
るものを意味する。

“チェアサイド試験法”は、患者が医科医院にいる間
に、歯科治療室内にいるのと同様に医科医院の職員が実
施することができる試験法または手順を意味する。

“歯周病”は、一般に軟組織の炎症と歯槽骨支持体の
損失の両者を含む、歯の支持構造体すなわち歯周組織の
疾患を意味する。この疾患には、ペリ−インプラント破
壊症とHIV（＋）−感染／エイズ病関連の歯周病が含ま
れている。

“歯肉炎”は、歯肉または口の結合粘膜軟組織が炎症
の状態にある症状を意味する。

“メタロプロティナーゼ”は、ヒト多形核白血球（PM
N）コラゲーナーゼ:MMP−８およびヒト線維芽細胞コラ
ゲナーゼ:MMP−１を含むコラゲナーゼ類のファミリーを
意味する。MMP−８は、歯肉と歯周の疾患の開始に関連
する主なメタロプロティナーゼである。メタロプロティ
ナーゼ類は、細菌の細胞または哺乳類の細胞によって合
成される。メタロプロティナーゼ類は、最初、非活性の
すなわち“プロ酵素”の形態で合成され、次に開裂され
て酵素の活性部位を創製するかまたは露出するときに酵
素として活性になる。活性部位の生成は、プロ酵素の生
体内または生体外での化学的開裂または酵素的開裂によ
って行うことができる。生体内で、酵素は活性部位を生
成することができ、起源は細菌または内因性のすなわち
哺乳類でもよい。プロ酵素は“プロ型（proform）”と
も呼称されている。“イソ型”は同じタンパク質の異な
る型を意味する。例えば、メタロプロティナーゼMMP−
８のような活性コラゲナーゼは、上記のように、プロ酵
素が開裂して活性部位が露出した活性酵素を生成するこ
とによって生成される。異なる酵素反応を含む異なる反
応によって活性酵素を創製することができる。これらの
多様な反応によってプロ酵素が別の方式で開裂され、イ
ソ型と呼ばれる異なる分子種を生成する。本発明では、
プロ酵素を認識する抗体は、活性型と非活性型の酵素に
共通の酵素の一部を認識する抗体が好ましい。

“ペリ−インプラント破壊症（peri−implantiti
s）”は歯槽骨堤に外科手術で移植された安定な移植片
によって起こる軟組織および骨組織の炎症の状態を意味
する。

“部位特異的サンプリング”は、遠位歯周ポケット由
来の溝内液だけ試験を行うため、遠位歯周病巣の試料だ
けをサンプリングする方法または手順を意味する。

“直接標識”は、検定試験で抗体または抗原を検出可
能にする標識を意味し、検出可能な標識が、主な免疫反
応に関与している抗体または抗原に直接結合されてい
る。

“間接標識”は、検定試験で抗体または抗原を検出可
能にする標識を意味し、検出可能な標識が、主な免疫反
応に関与している抗原または抗体に間接的に結合されて
いる。

“固体の担体”は、抗体が結合されている固体媒体ま
たは固体相を意味する。例えば、抗体のようなタンパク
質はラテックスのビーズ、コロイド金属、ポリ塩化ビニ
ル（PVC）およびポリスチレンに結合される。スタフィ
ロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）の
プロテインＡはニトロセルロース膜に結合され、これら
のタンパク質は個体の担体に結合される。

“液体担体”は、抗体または抗体接合複合体のような
組成物（液体によって拡散する）を移動させることがで
きる液体媒体または液体相を意味する。

“免疫検定法”は、ある物質を検出および／または測
定できる方法または手順であって、特異的な活性試薬
に、前記物質を特異的に捕捉できる少なくとも１種の抗
体が含まれている方法または手順を意味する。免疫検定
法の基本的なタイプとしては、抗原捕捉検定法、抗体捕
捉検定法および以下に定義する抗体サンドイッチ検定法
がある。

“二抗体サンドイッチ検定法”は、試料中の抗体もし
くは抗原を検出しその量を定量することができる免疫検
定法を意味する。この検定法は、抗原の異なる二つの非
オーバーラップ（非競合）エピトープに結合できる２種
の異なる抗体を使用する必要がある。

“側方流動法（Lateral Flow Technique）”は、免
疫クロマトグラフィーの原理を用いる免疫検定法を意味
する。この試験法では液体型の試料または試験溶液が試
験帯状体にそって移動するのが一般的であるが、これは
試験溶液を試験器具の膜を通過して流動させる“流動通
過法（Flow−Through Technique）”とは対照的であ
る。

“流動通過法”は、サンドイッチ法に基づいたものが
多い免疫検定法である。抗原を含有する試料または試験
溶液をスポットとして塗布して、器具の膜を通じて拡散
させる。

“RIA"すなわち“放射線免疫検定法”は、検出可能な
標識が、抗原に結合された放射性同位元素の形態の放射
能標識である免疫検定法を意味する。

“IRMA"すなわち“イムノラジオメトリックアッセイ
（immunoradiometric assay）”は，検出可能な標識が
抗体に結合された放射能同位元素の形態の放射能標識で
ある免疫検定法を意味する。

“酵素免疫検定法”は、活性試薬として酵素を使用す
る免疫検定法を意味する。例えば、酵素を一次または二
次の抗体に結合させてもよい。その酵素は色素源の基質
と反応する。

“蛍光免疫検定法”は、検出可能な標識として蛍光物
質を使用する免疫検定法を意味する。

“発光免疫検定法”は、検出可能な標識として発光物
質を使用する免疫検定法を意味する。

“免疫凝集反応検定法（immunoagglutination assa
y）”は、免疫特異的反応を検出する手段として、多価
抗原による粒子の凝集反応を利用する免疫検定法を意味
する。例えば精製抗体を赤血球または着色ビーズに結合
させ次に前記抗体に対し反応性の多価抗原を添加する
と、免疫特異的抗体／抗原反応によって前記粒子の凝集
（aggregation）または凝集反応（agglutination）が起
こる。

“比濁分析免疫検定法（turbidimetric immunoassa
y）”は、免疫特異的反応を検出する手段として多価抗
原による粒子の濁度の測定を利用する、免疫検定法を意
味する。例えば、多価抗原によりそして微小粒子を用い
ることにより任意にさらに強制される抗体複合粒子の凝
集によって、さもなければ透明な溶液に測定可能な濁り
を生成させることができる。

“ネフェロ分析免疫検定法（nephelometric immunoa
ssay）”は、比濁分析免疫検定法の一変形を意味する。

本発明は、歯周病の進行を診断し評定する生化学的手
段と方法、特に免疫学的手段と方法に関する。その方法
と手段は哺乳類、特にヒトに適用される。それらの手段
と方法は信頼性の高いチェアサイド試験法を提供する。
また本発明の方法と試験キットは、ペリ−インプラント
破壊症およびHIV（Ｈ）感染／エイズ病関連歯周病の評
定に利用することができる。

本発明は、抗体を用いて本発明の方法を実施して歯周
病を診断する手段を提供する試験キットに関する。本発
明の試験キットには、いくつもの抗体が入っているが、
哺乳類の好ましくはヒトの活性MMP−８を認識する少な
くとも１種のモノクローナル抗体と少なくとも１種の標
識が入っていなければならない。その標識は入っている
抗体に結合させることができる。本発明の試験キット
は、活性MMP−８と非活性のプロMMP−８を区別する手段
も提供することができる。上記哺乳類のMMP−８とプロM
MP−８には任意の与えられた哺乳類のMMP−８とプロMMP
−８が含まれていると解すべきである。しかしながらヒ
トは最も好ましい種であると認識すべきである。勿論、
家畜およびその外の動物も含まれる。

本発明の抗体は好ましくはモノクローナル抗体であ
り、特に活性MMP−８を認識する抗体である。しかしな
がら、本明細書に記載されているような必要な特徴を有
する抗体が含まれている。

哺乳類の活性MMP−８を認識するモノクローナル抗体
は、以下のステップを含んでなる方法で得ることができ
る。粗製製剤または高度に精製された製剤中の哺乳類非
活性プロMMP−８を活性化する。活性化は自己活性化で
起こすことができる。活性化は生体外で、限定はしない
が、トリプシン、キモトリプシンまたはカテプシンＧの
ような酵素によって活性化することが好ましい。有機水
銀化合物のような化学薬剤および／またはNaOClのよう
な酸化剤も使用できる。これらの物質は別個にまたは組
み合わせて使用できる。同じ試料に対して異なる活性化
法を用いてもよい。

活性化を行った後、各種イソ型の哺乳類活性MMP−８
の混合物でマウスを免疫化する。ハイブリドーマ細胞系
を通常のハイブリドーマ法で製造し、次いで異なるタイ
プのモノクローナル抗体を得るために選別を行う。最も
望ましいモノクローナル抗体は哺乳類活性MMP−８だけ
を認識する抗体である。このような抗体は鋭敏であり
（十分なアフィニティーを有している）そして非活性の
プロMMP−８および他の類縁構造を有する酵素（十分な
特異性を有している）との交差反応性は最小である。

特に上記の方法またはモノクローナル抗体の通常の製
造方法で得ることができるほぼ同じ特性を有するモノク
ローナル抗体は本発明の範囲内に含まれる。例えばPCT
特許願公開第WO 90/14443号と同第WO 92/18619号に記
載のファージディスプレイ法（phage display metho
d）も使用できる。

本発明の試験キットには、哺乳類活性MMP−８を認識
するモノクローナル抗体に加えて、哺乳類非活性プロMM
R−８と交差反応を行う少なくとも１種の第二の抗体を
入れておいてもよい。これら抗体類は、ポリクローナル
またはモノクローナルの抗体でもよいが、モノクローナ
ル抗体が好ましい。モノクローナル抗体の場合、通常の
ハイブリドーマ法を用いるかまたは先に述べたのとほと
んど同じ方法であるが他の選別法を用いることによって
得ることができる。

選択された免疫学的方法に適合させて各種の試験キッ
トを製造することができる。担体の材料と付属品を所望
の方法に対応して試験キットに入れる。その方法は、免
疫クロマトグラフィー法類（immunochromatographic m
ethod）、免疫分析法類（immunometric method）、放
射線免疫検定法類、放射線免疫分析検定法類（radioimm
unometric assay）、酵素免疫検定法類、蛍光免疫検定
法類、ルミネッセンス免疫検定法類、免疫凝集反応法
類、赤血球凝集法類、凝集反応阻害法類および比濁分析
免疫検定法類の中から選択することが好ましい。検出可
能な標識と任意の担体は適当な方法で選択される。

チェアサイドで使用するのに最も好ましい本発明の試
験キットは、側方流動原理に基づいた免疫クロマトグラ
フィー法または流動通過原理に基づいた免疫分析法にし
たがって製造される。

哺乳類の活性MMP−８を認識する抗体に加えて、試験
キットには、哺乳類の非活性プロMMP−８を認識する任
意の第二の抗体が入っていてもよい。またこの第二の抗
体は、直接または間接の標識からなる群から選択される
少なくとも１種の検出可能な標識で標識化することが好
ましい。この第二抗体はモノクローナルでもポリクロー
ナルでもよい。第二抗体はプロMMP−８と活性MMP−８を
区別する必要はない。換言すれば、本発明の試験キット
には、哺乳類の活性MMP−８を認識するモノクローナル
抗体に加えて少なくとも１種の第二抗体が入っていても
よい。

歯周病の活性の診断方法は特に、下記のステップを含
む免疫学的検定法として実施する。歯肉溝液試料をサン
プリング器具で収集する。簡単な固体の器具を用いて部
位特異的試料を収集することができる。本発明の任意の
実施態様で、サンプリング器具は、試験器具としても使
用される。そのとき試料は、サンプリング器具または試
験器具に予め付着させてあるかまたはサンプリングと試
験の兼用器具に添加してもよい少なくとも１種のモノク
ローナル抗体と接触させる。あるいは、そのサンプリン
グ器具を、モノクローナル抗体が入っている試験器具に
入れてもよい。

MMP−８の検出は、活性MMP−８と非活性プロMMP−８
を区別できる免疫学的方法によって実施する方が好まし
い。

好ましい方法で、歯周病の活性は、試験器具として作
動しうる固体の吸収性サンプリング器具で試料を収集す
る部位特異的方法によって検出される。

一実施態様で、歯周病の活性の危険は、唾液の試料ま
たは口内リンスの資料中のMMP−８の濃度が増大してい
るのを知るため試験することによって事前に選別するこ
とができる。

歯周病の活性の事前選別は、以下のステップを用いて
免疫学的検定法として実施できる。歯肉溝液を含有する
試料を集め、次にその試料を、MMP−８を認識する少な
くとも１種の抗体と接触させる。MMP−８の増大した濃
度は免疫学的方法で検出される。

本発明にはチェアサイド診断用の一組の試験キットも
含まれている。各試験キットには、哺乳類の活性MMP−
８を認識する少なくとも１種のモノクローナル抗体が入
っている。その一組の試験キットは、一つ以上の事前選
別用試験キットと一つ以上の口内リンス入りバイアルび
んおよびモノクローナル抗体に加えて一つ以上のサンプ
リング器具が入っている一つ以上の部位特異的試験キッ
トが入っている包装組合せ物として提供することができ
る。これらの事前選別用および部位特異的な試験キット
は、例えば学校クラスの全児童の事前選別と、MMP−８
の濃度が増大している児童の部位特異的確認試験を行う
ことができる各種の数の組み合わせで提供することがで
きる。

本発明の試験キットと方法を開発するのに用いた方法
と材料を以下にさらに詳細に考察する。

唾液と歯肉溝液中のコラーゲン分解酵素は各種の公知
の方法で評定することができる。本発明の発明者らは、
成人の歯周炎患者と歯周が健康な個体由来の唾液と歯肉
溝液中の潜在プロMMP−８と活性MMP−８の量を、ELISA
法、SDS−PAGE法およびウエスタンブロット法で推定で
きた。

異なるコラゲナーゼ類もウエスタンブロット法で同定
された。すなわち、酵素の製剤をSDS−PAGE法に付した
後、得られたバンドをニトロセルロースに移し、次いで
試験されるMMP−８、MMP−１などの酵素に対する標識化
ポリクローナル抗体で蛍光免疫学的に染色することによ
って特性を解析した。

このような方法によれば、コラゲナーゼ/MMPの実際の
細胞起源と活性化度について一層特異的な結果が得られ
るが、これらの方法は、非常に労力を要しかつ時間がか
かりすぎるので日常的な実験室の試験には使用できな
い。その上に、迅速なチェアサイド試験はいかなる種類
の電気泳動法をもってしても実施できない。

発明者のTimo Sorsa博士は、彼の研究結果を組み合
わせて、成人の歯周炎患者と歯周が健康な個体由来の唾
液と歯肉溝液中の潜在MMP−８と活性MMP−８の量を推定
することができた。成人の歯周炎患者と歯周が健康な対
照由来の唾液と歯肉溝液の、ELISA検定法の場合の濃度
のデータを、SDS−PAGE/機能検定法とウエスタンブロッ
ト法のデータとともに解明した。

最初の予備試験で、MMP−８の濃度が、歯肉溝液を直
接部位特異的にサンプリングした場合に少なくとも１μ
g/mlであれば、歯周病活性またはペリ−インプラント破
壊症の危険があることが分かった。唾液試料の場合、約
２μg/mlのMMP−８の濃度は上記危険を示す（下記表１
参照）。

鋭敏で信頼性が高くかつ特異的な抗体でその後に実施
したELISA試験で（Lauhio,A.ら、Antimikrobial.Agents
Chemother.,38巻、400〜402頁;Lauhio,A.ら、Clin.Ex
p.Immunol.,98巻、21〜28頁、1994年）、直接部位特異
的試料中の全MMP−８の濃度が100ng/mlを超える場合、
歯周病の危険があるということが見出された（表２）。
唾液試料の場合、対応する危険がある濃度は200ng/mlで
ある。活発に進行中の歯周炎の場合、活性MMP−８の対
応する危険がある濃度は、部位特異的試料の場合約1000
ng/mlであり、唾液試料の場合約200ng/mlである。

上記予備試験において（表１）、成人歯周炎患者由来
の歯肉溝液は、全MMP−８を約1.1〜3.6μg/ml含有し活
性MMP−８を1.0〜1.5μg/ml含有していると推定され
た。同じ予備試験で、健康な被検者の歯肉溝液は、全MM
P−８を0.2〜0.8μg/ml含有し活性MMP−８は0.05μg/ml
未満であった。

下記表２は、ELISA試験法で得た唾液のMMP−８の値を
示す。これらの試験結果は、MMP−８が歯周病の活性の
進行を診断して評定するのに最適のマーカーであること
を示している。しかし、得られるELISA法の実測値は、
抗体の特異性、サンプリング法およびサンプリング時間
の変化によって変わるようである。しかし、信頼性があ
る閾値を、これらの試験結果から得ることができる。こ
れらの閾値によって信頼性がある試験キットと呼ぶこと
ができる。

異なる数値の試験結果が得られたのは、異なるセット
の抗体を使用したことと試験条件のその外の変動を反映
している。しかし、活性MMP−８の場合、罹病者と健康
者の間の比率がほぼ同じままであることに注目すること
が大切である。これらの知見は、潜在MMP−８と活性MMP
−８を区別するモノクローナル抗体を用いる免疫クロマ
トグラフィー試験法は、歯周病の活性を診断するのに最
適に選択できることを示している。

表１に示した試料物質由来の抗ヒトMMP−８と抗ヒトM
MP−１の両者を使用するウエスタンブロット分析試験を
行ったところ、MMP−８が70〜75kDの非活性型すなわち
潜在型と65kDの活性型とで存在しMMP−１は検出されな
かった。MMP−１は特異的ELISAレコーディング（specif
ic ELISA recording）でも検出されなかった。

本発明の発明者らの上記知見（表２）は、歯周炎患者
由来の歯肉溝液には、機能で評定したMMP−８の量が増
大しているが免疫反応性の線維芽細胞タイプのMMP−１
はほとんど存在しないことを示すHaerianらの最近の試
験結果（J.Dent.Res.,73巻、208頁、1993年）と一致し
ている。コラゲナーゼの活性の起源は、MMP−８である
ことがウエスタンブロット法で確認され（Sorsa,T.ら、
Ann.NY.Acad.Sci.,732巻、112〜131頁、1994年）、MMP
−１は歯周が健康な対照から得た歯周溝液中には検出さ
れなかった（表１）。

また、MMP−８がペリ−インプラント破壊症で中心的
な役割を演じており（Teronen,O.ら、J.Dent.Res.,74
巻、495頁、1995年）、その上に、最近、HIV（＋）／エ
イズ患者の歯周炎部位／ポケットから収集された歯肉溝
液中に検出された活性MMP−８量が増大していること（S
alo,T.ら、Ann.N.Y.Acad.Sci.,1732巻、470〜478頁、19
94年）も見出されている。これは、歯科インプラントの
まわりの結合組織の炎症の一種であり（Ingman,T.ら,J.
Clin.Periodontal.,21巻、301〜307頁、1994年;Terone
n,O.ら、J.Dent.Res.,74巻、495頁、1995年）、そしてH
IV（＋）感染とエイズに関連する歯周病（Robinson,P.
G.ら、J.Periodontal.、65巻、236〜242頁、1994年;Hol
mstrup,P.ら、J.Clin.Period.,21巻、270〜280頁,1994
年）が最近報告されている。

成人歯周炎患者と健康な対照の対応する試料の歯肉溝
液中にMMP−１は検出されなかった。

ペリ−インプラント破壊症における結合組織巨大分子
の分解は、ヒトのマトリックスメタロプロティナーゼ
類、特に好中球（PMN）由来のマトリックスメタロプロ
ティナーゼによって仲介されることが見出されている
（Sorsa,T.ら,Ann.Ny.Acad.Sei.,732巻、112〜131頁、1
994年;Teronen,O.ら、J.Dent.Res.,74巻、495頁、1995
年）。したがって、本発明の試験キットと方法によって
ペリ−インプラント破壊症を評定することができる。

活性MMP−８に対するモノクローナル抗体 露出した酵素的に活性な部位は、異なる分子型のすべ
ての活性MMP−８に共通しているので、本発明は前記活
性部位を認識できる免疫化学試験法に基づいている。本
発明の試験法に要求される特異性は、前記活性部位を特
異的に標的とするモノクローナル抗体を用いることによ
って達成される。これらのモノクローナル抗体は、MMP
−８分子の他の部分の大きさに関係なくその活性部位の
エピトープに結合することができる。

本発明のモノクローナル抗体は、Ｋ hlerとMilstein
の最初の方法（Nature,256巻、495頁、1975年）によっ
て育成する。本発明の発明者らは、Stenman U.らが報告
したその特定の実用性を利用した（J.Immunol.Meth.,46
巻、337頁、1981年）。

抗体の育成 活性MMP−８の分子立体配置は個体ごとに異なってい
る。生体内で、プロ酵素：プロMMP−８の活性化は、異
なる宿主細胞内因子のみならず推定歯周病原体由来の特
定の細菌プロテアーゼによって起こる。また個体に見ら
れる細菌の種と細菌プロテアーゼも患者ごとに変化す
る。生体外での実験活性化法によって、患者の組織中に
は非常にまれに存在しているかまたは全く存在していな
い活性MMP−８のイソ型を産生させることができる。

このイソ型分子立体配置への変化は、本発明に用いる
モノクローナル抗体を育成する手順において考慮する。
マウスを１種の活性イソ型だけで免疫化し、同じイソ型
を選別に使用すると、そのイソ型に対してのみ反応性の
抗体が生成する。この一抗体だけを使用すると、他のイ
ソ型をもっている患者には偽陰性が起こる。したがって
本発明では全活性イソ型を認識できる抗体を使用する。

本発明において、免疫化法は、例えば活性部位とし
て、共通のエピトープと反応性の抗体を選別できるよう
に、免疫原として各種の分子イソ型の活性MMP−８を用
いる。しかし難い問題点はハイブリドーマとクローンを
試験するシステムである。ハイブリドーマは患者に広く
存在する１種類のイソ型で選別される。成育させたクロ
ーンはさらに各種の活性MMP−８に対して試験した後、
広範囲にわたって反応性の抗体を最終的に選択する。

免疫化に使用する抗原 理想的な抗体は、MMP−８の活性部位を、その活性酵
素の可能なすべての分子立体配置（イソ型）の場合に十
分に等しく認識する。免疫化を行う場合、最初、MMP−
８の粗製剤を使用するが、最後のブースターでは、高度
に精製した活性MMP−８の製剤の混合物を用いることに
よって異なる活性分子型の存在を保証する。MMP−８
は、例えば、３種の異なる方法によって生体外で活性化
される。これによって、最適な種類の活性部位特異的抗
体を産生するハイブリドーマが得られる。分子の他の部
分を認識しないハイブリドーマを選択することができ
る。

プロ酵素のプロMMP−８は軟膜内のヒトPMN白血球から
部分的に精製される（Sorsa,T.,Scand.J.Rheumatol,16
巻、167〜175頁、1987年;Knuper,V.ら,Eur.J.Bioche
m.,189巻、295〜300頁、1990年）。最終のブースターに
ついては、抗原はさらに精製され、そして例えば１）自
己活性化、２）酸化剤による処理および３）ヒトと細菌
のプロティナーゼによる酵素分解（ヒトのカテプシンＧ
の場合:Saari,H.ら、Biochem.Biophys.Res.Commun.,171
巻、979〜987頁、1990年；ティー・デンティコラのキモ
トリプシン様プロテアーゼの場合:Sorsa,T.ら,Infectio
n and Immunity,60巻、4491〜4495頁、1992年）によ
って活性化されたイソ型の混合物（例えば1:1:1のモル
比）として使用される。あるいは別個のマウスを１種の
イソ型で追加抗原刺激を行ってもよい。

MMP−８製剤の自己活性化は、報告されているのと同
様にして行われる（Sorsa,T.,Thesis,Univ.ヘルシン
キ、フィンランド、1989年）。酸化剤による活性化の場
合は、NaOClを酸化剤として利用し、活性化は報告され
ているのとほぼ同様にして行われる（Saari,H.ら、Bioc
hem.Biophys.Res.Commun.,171巻、979〜987頁、1990
年）。ヒト好中球とティー・デンティコラから得られる
プロティナーゼで活性化を行う場合は、Sorsa,T.らの方
法（Infection and Immunity.60巻、4491〜4495頁、1
992年）を使用する。

免疫化、融合、クローン化、およびクローンの移植 粗製活性MMP−８を50〜100μg/ml含有する溶液300〜5
00μｌを腹腔内に注射することによってBALB/cマウスの
免疫化とブースト（追加免疫刺激）を行う。これは、２
〜４週間の間隔をおいてフロイント不完全アジュバント
で注射することによって行う。そのマウスが第一ブース
トの後に抗体価をもっている場合、上記抗原混合物50〜
100μｇを含有する食塩水を腹腔内に注射してブースト
を行う。最後のブーストを行ってから３〜４日後に脾臓
を取り出す。１〜２×10⁸の脾臓細胞を、対数増殖期のP
3×63−Ag8.653骨髄腫細胞（Syngeneic）2.5〜5.0×10⁷
と、ポリエチレングリコール（PEG、Boehringer Mannh
eim Cat.No.1243268）中で融合させる。融合後、細胞
を、15％のウマ血清を含有するダルベッコの改質イーグ
ル培地（DME）または7.5％のウマ血清を含有するRPMP−
1640の入ったＵ型底のミクロ平板内で、２×10⁶細胞/ml
の密度で平板培養を行う。各ウェルに培地が0.1mlずつ
入っている。１日後、その培地に、HAT選択培地（DMEM
中ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンの混
合物:Gibco50×HAT Cat.No.043−01060H）0.1mlを添加
する。この後、培地の1/2ずつを１日おきに取り出して
新しいHAT培地で取り替える。

２週間培養した後、細胞をHT培地（アミノプテリンな
しの２％HAT:Gibco50×HT、Cat.No.043−01065H）に移
し、その培地は２週間にわたって１週間に３回変える。
２週間後、培地をDME＋15％ウマ血清またはRPTM−1640
＋7.5％ウマ血清と取り替える。はげしく増殖する抗体
産生培養物を選別し、報告されているのと同様にして特
性決定を行う。選択したハイブリドーマの培養物を、平
底微量滴定プレート内でヒト線維芽細胞の支持細胞層上
で、希釈を限定することによってクローン化する。抗体
産生クローンを96ウェルの平板で再クローン化を行う。
得られたサブクローンを試験管内で増殖させ次にFalcon
の組織培養フラスコ内で増殖させる。

ハイブリッドクローンを移植する場合、抗体産生細胞
（１×10⁶/動物）を、プリスタン（2,6,10,14−テトラ
メチルペンタデカン、Aldrich社）で初回抗原刺激を行
ったBALB/cレシピエントに腹腔内注射を行う。腹水が３
〜４週間以内に発生する。その腹水を取り出し、その腹
水中の抗体を試験する。

選別と滴定 培養物の上澄み液を、ハイブリッド形成またはクロー
ン化を行ってから１週間間隔で抗体の産生について選別
する。抗体の滴定は１週間毎に実施する。また抗体の滴
定を、免疫化マウス由来の腹水中の抗血清で実施する。

前記MMP−８の活性部位に対する抗体の産生を検出す
るのに、放射線免疫検定法（RIA）を使用する。放射性
同位元素のヨウ素でヨウ素化し、活性化された、高純度
のMMP−８を使用する。活性化には、ヒトPMNカテプシン
−ＧによるMMP−８の分解反応を利用できる。PMNカテプ
シン−Ｇは、内因性のタンパク質分解プロ酵素のプロMM
P−８のアクティベーターとして作用する（Suomalai−n
en,K.,Thesis,Univ.ヘルシンキ、フィンランド、1993
年）。

プロMMP−８は、PMNカテプシン−Ｇによってタンパク
質分解作用で、プロMMP−８のＮ末端におけるPhe₇₉〜Me
t₈₀ペプチドがスプリットして活性化される。その結
果、85kDの非活性プロMMP−８が64kDの活性型MMP−８に
変換する。プロMMP−８のＮ末端における対応するスプ
リットは、ティー・デンティコラのキモトリプシン様プ
ロティナーゼによるプロMMP−８の活性化に関連してい
ることは、本発明の発明者らが見出したのである。カテ
プシン−Ｇで活性化されたMMP−８をクロラミンＴ法に
よって放射性同位元素のヨウ素でヨウ素化して（Greenw
ood,F.C.ら、Biochem.J.,89巻、114頁、1963年）、選別
検定法の標識として使用する。その検定では、上澄み液
50μｌを、0.33％のBSAを含有するリン酸−EDTA−NaCl
緩衝液pH7.4内で抗原の¹²⁵I標識（約10000cpm）150μｌ
とともにインキュベートする。一夜インキュベートした
後、結合した標識を、ウシγ−グロブリン（IgG）を含
有するリン酸緩衝液100μｌおよび20％PEG6000含有リン
酸緩衝液1mlを添加することによって沈殿させる。遠心
分離を行った後、上澄み液を吸引して沈殿の放射能を計
数する。沈殿した放射能がバックグランド（培養上澄み
液の代わりに増殖培地）より著しく大きい場合、すなわ
ち結合放射能が対照として使用したポリクローナル製剤
の最大結合量の50％を超える場合、その試料は抗体の産
生について陽性であるとみなされる。

滴定する場合、力価は、大過剰の抗体によって特異的
に捕捉される最大量の標識の50％を捕捉する希釈度と定
義する。非活性のプロ酵素と活性MMP−８の両者を認識
するポリクローナル抗MMP−８を対照抗体として使用す
る。

試験法と特性解析 陽性のハイブリドーマ培養物をさらに、活性MMP−８
を検出する該培養物の感度すなわち活性MMP−８との反
応性、および該培養物の、プロ酵素との交差反応性につ
いて試験する。RIA法を利用する。標識は、選別検定法
において先に述べたのと同じ、放射能ヨウ素化カテプシ
ン−Ｇで活性化されたMMP−８の製剤である。標識100μ
ｌ、試験される標準または交差反応物50μｌおよび抗体
溶液50μｌ（これらはすべて0.33％BSA含有リン酸−EDT
A−NaCl緩衝液pH7.4に含有されている）を一夜インキュ
ベートする。結合した放射能を前記選別法と同様に分離
する。各抗体を希釈して、その最大捕捉容量の約50％を
捕捉するようにする。標準は、10〜1000μg/の範囲の
濃度の、カテプシン−Ｇで活性化されたMMP−８で製造
する。

最高の感度を有しかつプロMMP−８と交差反応を行わ
ないハイブリドーマを選択してクローン化させる。さら
に、この新しいモノクローンの特異性を確認する。これ
らのクローンが分泌する抗体を、免疫化に用いた３種の
MMP−８のイソ型との結合についてRIAで評定する。診断
試験に使用するため、すべてのイソ型と反応するクロー
ンを選択する。すべてのイソ型に対して共通のエピトー
プは酵素の活性部位である。またこれらクローンは、歯
肉溝液試料中に存在しているMMP−８に構造上および免
疫学的に類縁の酵素〔例えばPMN−ゼラチナーゼ（MMP−
９）、線維芽細胞型コラゲナーゼ（MMP−１）およびス
トロメリシン−１（MMP−３）〕に対するそれらクロー
ンの交差反応について試験する。0.01％を超える交差反
応を起こすクローン（標識の50％の置換を起こす標準濃
度に対する交差反応物の濃度の百分率と定義する）は選
択しない。選択されたクローンが産生する免疫グロブリ
ンのイソ型はキット法（Mouse Typer,BioRad社、米国
カリフォルニア州）で測定される。これら抗体は、プロ
テインＡ（Pharmacia社、スエーデン）を用いてアフィ
ニティークロマトグラフィーによって精製し、それら抗
体の等電点は、標準の方法を用い等電点電気泳動法（Ph
ast System,Pharmacia社、スエーデン）によって記録
される。

PMNプロコラゲナーゼ（プロMMP−８）に対するモノクロ
ーナル抗体 いくつもの免疫検定法、特に免疫分析法は２種の異な
る抗体すなわち同時に同じ抗原分子に結合できる抗体対
を必要とする。したがって、それら抗体はその抗原分子
の異なるエピトープを認識しなければならないからそれ
らエピトープはアフィニティーを損失させる立体障害な
しで結合が起こるよう十分に距離をおいて位置していな
ければならない。活性MMP−８において、その活性部位
は２種の抗体を受け入れるほど十分に大きくはない。し
かし、抗体のうち一方だけが特異的であれば同時に結合
するのに十分である。他方の抗体は、活性型と非活性型
のすべてに共通のMMP−８分子の部分に位置するエピト
ープを認識する。第二の抗体を選択するため、プロ酵素
と強い交差反応性を示すハイブリドーマを選択してクロ
ーン化する。これらのクローンの中で、活性型と非活性
型の両者に対して最も広い特異性を有するクローンを最
終的に選択する。全コラゲナーゼ酵素（活性MMP−８と
非活性プロMMP−８を同時に）を測定する試験におい
て、選択される２種のモノクローナル抗体は、一方が活
性酵素に対して特異的であり、一方は活性酵素とプロ酵
素に共通の酵素の部分と反応することができる。

歯周病の活性を確認する診断試験法 上記方法にしたがって生成させた、ヒトおよび／また
は哺乳類の活性MMP−８に対して特異的なモノクローナ
ル抗体は、歯周病の活性を評価するのに有用な各種の試
験法を設計するのに使用される。定量法と定性法を以下
に説明する。

抗原の存在を免疫学的に検出する標準の方法は、抗原
の結合によって起こる、抗体でコートされた粒子の視覚
で観察される凝集反応である。このような粒子としては
ラテックスの粒子がある。そのラテックス粒子の一部は
MMP−８の活性部位に特異的なモノクローナル抗体でコ
ートされ、そして一部は該活性部位以外のエピトープに
特異的な抗体でコートされている。活性MMP−８が存在
すると、上記２種の粒子は抗原のブリッジングによって
網目構造で結合されて凝集反応が起こる。いわゆる赤血
球凝集試験を行う場合、粒子として赤血球を用いること
ができる。逆に凝集反応を阻害する原理を使用すること
もできる。

一層最近の方法は、流動通過免疫分析法（米国特許第
4366241号）の２種の抗体を使用する。この試験法は、
吸収性材料製のパッドを例えばニトロセルロースまたは
ナイロンの膜でカガーしてある器具で実施することが最
もよい。その膜の上に、１種の抗体（例えばMMP−８の
活性部位を認識する抗体）を結合させる部分がある。液
体の試料を膜の上にピペットで落とし、その試料中に存
在する活性MMP−８を該抗体に結合させる。試料の残り
の部分は膜を流動通過する。次に標識化試薬を添加す
る。この標識は、第二抗体（第一抗体とは異なるエピト
ープを認識するモノクローナルもしくはポリクローナル
抗MMP−８）と西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵
素との複合体でもよい。膜上で結合したMMP−８がある
と、該複合体はそれに結合し、次いで過剰の複合体を洗
い落として沈殿基質を標識化酵素に加えることによって
視覚化することができる。沈殿した基質は目視可能な色
を生成することができる。また基質は、例えば蛍光もし
くは化学発光のシグナルのような眼に見えないシグナル
を発する基質でもよい。色、蛍光または化学発光は適当
な計器で記録することができ、そしてこれらの場合、濃
度の校正を利用すれば試験結果で定量することができ
る。また標識化試薬は、第二の抗体でコートされている
着色した（そうでなければシグナルを発する）粒子（例
えばラテックスで製造されている）の懸濁液でもよい。
この場合、その膜の細孔の大きさは、その膜に免疫化学
的に捕捉されていない粒子は細孔を通過するよう調節さ
れている。洗浄ステップの後、捕捉された粒子は、目視
可能な場合は直接検出することができ、またはシグナル
を測定することによって間接的に検出することができ
る。

本明細書に述べているような歯周病活性の試験は、免
疫クロマトグラフィーの原理に基づいていてもよい。こ
の方法は、側方流動法と呼ばれることが多いが、ヨーロ
ッパ特許第291194号に詳細に記載されている。なおこの
特許は本明細書に援用するものである。PCT特許願公開
第WO 92/15215号には、チャンバー様ギャップで作られ
ているディップスティック中の膜と吸収性パッドで特に
構成されている試験器具が記載されている。異なる２種
の抗体を利用する免疫分析法の変形では、第一抗体（す
なわちMMP−８の活性部位を認識する抗体）は、眼で検
出できる標識（目視可能な色）または適切な計器で検出
できる標識（蛍光もしくは化学発光のシグナルを発す
る）として作動する粒子にコートされる。これら粒子
は、例えば、ラテックス、コロイド金属（金、セレン）
または分散染料で製造することができる。これらの標識
粒子は、試験器具に結合され、試験器具の吸収性の部分
を液体試料と接触させて試料が吸収されると、該粒子は
液体試料の流れで移動し同時に、試料中に抗原（活性MM
P−８）が存在すると標識抗体が該抗原を捕捉するよう
になっている。その液体はさらに、該器具の膜の中に吸
収される。その膜には、第二抗体（第一抗体以外のエピ
トープを認識するモノクローナルまたはポリクローナル
抗体MMP−８）が区域様部分（zone−like area）に結合
されている。該標識を運ぶ該液体の流れが上記区域を通
過して移動すると、抗原を捕捉したこれら標識粒子はそ
の区域に結合する。したがって、試料中に抗原が存在す
るとその区域は検出することができる。またこの免疫検
定法は、１種の抗体だけを使用することに基づいていて
もよい。これは、試料中に存在している可能性がある抗
原と競合する抗原でコートされた標識粒子を用いて実施
することができる。MMP−８の活性部位に特異的なモノ
クローナル抗体を膜の区域に結合させる。試料の抗原は
該区域の抗体結合部位をふさぐので、全く検出できない
区域が出現する。他の変形では、抗原類似体でコートさ
れた標識化粒子は、該吸収性部分に結合された抗体にゆ
るく結合される。試料の抗原は、結合している抗体の該
類似体を置換するので標識粒子は捕捉試薬を含有する区
域に移動することができる。

免疫クロマトグラフィーも、公知の標準または未知の
試料が流動しているとき、膜に結合されている標識が発
するシグナルを測定することによって定量を行うことが
できる。区域内の抗体の量を増大させたいくつもの抗体
区域を試験器具に用いれば視覚による半定量を行うこと
が可能である。

上記の免疫検定法は、短い実施時間（わずか数紛間の
ことが多い）の迅速なチェアサイド試験法を開発するの
に有用である。さらに最近の方法（側方流動法と流動通
過法）は、実験室の試験に未熟な職員が非常に高い信頼
性でもって実施しかつ説明できる試験法を提供する。ま
たこれらの方法には、凝集反応法に伴ういくつもの重大
な欠点、例えばリウマチ因子を含有する試料による偽陽
性、および特に濁った試料の解釈の難しさがない。

しかし、他の諸免疫学的方法は、歯周病の活性を評定
する試験法に採用することができる。これらの方法は通
常、研究室で実施される。というのは、特定の自動化が
可能な機器および／または熟練職員が必要だからであ
る。定量試験の試験結果が必要な場合、以下の方法も適
している。比濁分析法とネフェロ分析法を用いることが
できる。これらの方法は通常ポリクローナル抗体を利用
するが、モノクローナル抗体に対する特異性が要求され
るこのような検定法では、使用される試薬は２種の抗体
でコートされた適切な大きさのラテックス粒子の混合物
で構成されている。放射性同位元素の標識を用いる古典
的な免疫化学法も利用できる（競合検定法の構成で１種
の抗体を使用する放射線免疫検定法および抗体の対を使
用する免疫放射分析法）。同位体標識の代わりに、各種
の他の標識化合物が関連免疫検定法に有用である。西洋
ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ
のような酵素は、抗体に接合させて、比色分析法、蛍光
分析法または化学発光分析法の基質の助力で検出され
る、酵素免疫検定法または免疫酵素分析検定法における
標識として作動させることができる。また蛍光化合物
は、抗体に直接接合させて、いくつもの高性能の検出法
が開発されている定量蛍光免疫検定法または定量蛍光免
疫分析検定法に使用することができる〔例えば遅延蛍
光、蛍光偏極（fluorescence polarization）〕。蛍光
法とともに、ルミネセンスを発する標識を用いる方法
〔ルミネセンス免疫検定法または免疫ルミノメトリー検
定法（immunoluminometric assay）〕は現在利用でき
る最も感度の高い免疫化学法である。

歯周病の活性を確認する部位特異的試験法と選別試験法 上記の試験法はすべて、原則として部位特異的試験と
選別試験の両者に用いることができる。しかし視覚化凝
集反応法、流動通過法および免疫クロマトグラフィー法
が迅速なチェアサイド試験に最もよく適している。これ
らの方法は、部位特異試験と選別試験の両者に任意に用
いられる。

選別試験の目的は、患者の歯肉溝液、唾液および口内
リンスの試料中に存在する全MMP−８が増大しているか
どうかを見つけることである。全MMP−８と活性MMP−８
を同時に測定すると、起こっている可能性がある歯周病
の進行段階を推定することができる。

唾液は、まず患者に口を十分にすすがせた後パラフィ
ンをかませることによって容易に収集することができ
る。他の唾液分泌刺激剤も使用できる。分析を行う前に
試験試料を保管する必要がある場合は、特別の唾液収集
器具、例えばOmni−SAL（登録商標）（Saliva Diagnos
tic Systems、米国ワシントン州）を使用してもよい。
あるいは、患者にパラフィンを30秒〜１分間かませ続い
て口腔液を吐き出させ、その後、患者の空になった口を
3mlの水道水ですすがせてその水を試験用に収集した口
内リンス試料で試験を実施することができる。

部位特異的ディップスティック試験の場合、歯科医
は、細長い濾紙を歯周ポケットの開口に置くことによっ
て歯肉溝液の試料を収集することができる。細長い濾紙
には、標準化された時間、液体を吸収させることが好ま
しい。次に、その細長い濾紙を適当な緩衝液が入ってい
る試験管に移して試料のタンパク質類を抽出させる。免
疫クロマトグラフィーのディップスティック方式を使用
する場合は、ディップスティックを試験管内に直接浸積
して試験する。細長い濾紙の外に、多孔質のプラスチッ
クもしくはセラミックおよび有機もしくは無機のシリカ
化合物のような他の吸収材料も利用することができ、こ
れらはたいてい、簡便に動かすためホルダーに取付けら
れている。該液体はガラスまたはプラスチック製のキャ
ピラリー管でも収集することができる。最後になるが、
ディップスティック型試験器具は、歯周ポケット中に配
置される吸収末端を備え、試料が試験器具中に直接吸収
されるよう設計することができる。

歯周病が個々の部位に存在している可能性を打ち消す
かまたは臨床家にさらに試験させるための部位特異的デ
ィップスティック試験法は定性試験でもよい。その試験
法の閾値（カットオフ濃度）を、最適の感度と特異性を
与えるように選択する。歯周病活性試験の場合、歯肉溝
液試料中の全MMP−８の濃度が約100ng/mlを超えたとき
は陽性とみなすことができる。対応して、唾液／口内リ
ンスの選別試験では、全MMP−８の濃度が200ng/mlを超
えると、歯周炎が進行する危険が増大していることを示
唆し、そして1000ng/mlを超える活性MMP−８の濃度はい
くつかの部位に活性疾患がある徴候なのでこれらの部位
は個々に試験しなければならない。ディップスティック
試験では、異なる特異性を有する２種の抗体の線を一本
のスティックに塗布して、全体試験と特定の試験を一本
のスティックに組み込むことができる。この試験法（歯
肉溝液、唾液、口内リンスの試料に対する試験）は新し
い方法であり、歯周結合の損失と歯槽骨の損失の両者に
したがって異なる歯周炎とペリ−インプラント破壊症の
患者のグループに起こる可能性がある歯周病活性が起こ
る危険を示す歯周部位を検出するのに使用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ルンドクヴィスト， レイラ クリステ ィーナ フィンランド， エフアイエヌ−02130 エスポー， ヴェンメルセーレンティ エ ２ エー ６ (56)参考文献 吉田英樹「ヒト好中球コラゲナーゼの 精製、単クローン抗体の作成および歯肉 溝滲出液中の好中球への応用」口腔病学 会雑誌、第60巻、第１号（1993）、Ｐ 121−130 ＳＯＲＳＡ，ｔ．ｅｔ ａｌ”Ｅｆｆ ｅｃｔｓ ｏｆ Ｔｅｒａｃｙｃｌｉｎ ｅｓ ｏｎ Ｎｅｕｔｏｒｏｐｈｉｌ, Ｇｉｎｇｉｖａｌ，ａｎｄ Ｓａｌｉｖ ａｒｙ Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｓ”, Ａｎｎａｌｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃ １ａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｓ，Ｖｏｌ．732，（1994），ｐ112− 131 Ｂｉｒｋｅｄａｌ−Ｈａｎｓｅｎ, Ｈ．，Ｊ．ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ．, Ｖｏｌ．64，（1993），ｐ474−484 ＳＯＲＳＡ，Ｔ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｐ ｅｒｉｏｄｏｎｔ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ. 23，（1988），ｐ386−393 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/573 G01N 33/577 C12N 15/02 C12P 21/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (24)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】哺乳類の活性マトリックスメタロプロティ
   ナーゼ−８（MMP−８）を特異的に認識する少なくとも
   １種のモノクローナル抗体および少なくとも１種の検出
   可能な標識を含んでなる、歯周病の活性、ペリ−インプ
   ラント破壊症またはHIV（＋）−感染／エイズ病関連歯
   周病の診断用試験キット。
2. 【請求項２】MMP−８を認識する少なくとも１種のモノ
   クローナル抗体が、下記ステップすなわち （ａ）哺乳類のマトリックスメタロプロティナーゼ−８
   のプロ酵素を活性化し； （ｂ）ステップ（ａ）で得た活性マトリックスメタロプ
   ロティナーゼ−８の異なるイソ型の混合物でマウスを免
   疫化し； （ｃ）ステップ（ｂ）で免疫化されたマウスを用いてハ
   イブリドーマ細胞系を製造し；次いで （ｄ）哺乳類の活性マトリックスメタロプロティナーゼ
   −８を特異的に認識するモノクローナル抗体を得るた
   め、ステップ（ｃ）で製造したハイブリドーマ細胞系を
   選別する； ステップを含んでなる方法で得ることができるモノクロ
   ーナル抗体である請求の範囲１記載の試験キット。
3. 【請求項３】さらに、前記哺乳類のマトリックスメタロ
   プロティナーゼ−８のプロ酵素と交差反応を行う第二抗
   体を含んでなる請求の範囲１記載の試験キット。
4. 【請求項４】第二抗体がモノクローナル抗体である請求
   の範囲３記載の試験キット。
5. 【請求項５】第二抗体がポリクローナル抗体である請求
   の範囲３記載の試験キット。
6. 【請求項６】前記哺乳類のマトリックスメタロプロティ
   ナーゼ−８がヒトのマトリックスメタロプロティナーゼ
   −８である請求の範囲１記載の試験キット。
7. 【請求項７】キットが、免疫クロマトグラフィー法類、
   免疫分析法類、放射線免疫検定法類、放射線免疫分析検
   定法類、酵素免疫検定法類、蛍光免疫検定法類、ルミネ
   ッセンス免疫検定法類、免疫凝集反応法、赤血球凝集反
   応法、凝集反応阻害法、比濁分析免疫検定法類およびネ
   フェロ分析免疫検定法類からなる群から選択される免疫
   学的方法用に構成され、そして検出可能な標識と任意の
   担体が、使用される方法に応じて選択される請求の範囲
   １記載の試験キット。
8. 【請求項８】キットが、側方流動の原理に基づいた免疫
   クロマトグラフィー法用に構成されている請求の範囲７
   記載の試験キット。
9. 【請求項９】キットが、流動通過の原理に基づいた免疫
   学的方法用に構成されている請求の範囲７記載の試験キ
   ット。
10. 【請求項１０】さらに、ポリクローナル抗体とモノクロ
    ーナル抗体からなる群から選択される第二抗体を含んで
    なり、そのポリクローナル抗体とモノクローナル抗体が
    哺乳類の活性マトリックスメタロプロティナーゼ−８と
    哺乳類の非活性マトリックスメタロプロティナーゼ−８
    プロ酵素の両者を認識する請求の範囲３記載の試験キッ
    ト。
11. 【請求項１１】前記第二抗体が、活性マトリックスメタ
    ロプロティナーゼ−８と非活性マトリックスメタロプロ
    ティナーゼ−８プロ酵素を区別しない請求の範囲10記載
    の試験キット。
12. 【請求項１２】さらに、固体吸収体のサンプリング器具
    で試料を収集することによる、部位特異的検出用の手段
    を含んでなる請求の範囲１記載の試験キット。
13. 【請求項１３】診断試験をサンプリング器具で実施する
    請求の範囲12記載の試験キット。
14. 【請求項１４】前記検出可能な標識が、直接標識および
    間接標識からなる群から選択される請求の範囲１記載の
    試験キット。
15. 【請求項１５】任意の固体または液体の担体を含んでな
    る請求の範囲１記載の試験キット。
16. 【請求項１６】下記ステップすなわち （ａ）歯肉溝液試料を試料収集器具で収集し； （ｂ）前記試料を、哺乳類の活性マトリックスメタロプ
    ロティナーゼ−８を特異的に認識する少なくとも１種の
    モノクローナル抗体と接触させ；次いで （ｃ）前記哺乳類の活性マトリックスメタロプロティナ
    ーゼ−８の存在を検出する； ステップを含んでなる検出法を免疫学的検定法として実
    施する、歯周病活性、ペリ−インプラント破壊症または
    HIV（＋）感染／エイズ病関連歯周病の診断方法。
17. 【請求項１７】さらに、哺乳類のマトリックスメタロプ
    ロティナーゼ−８のプロ酵素を認識する第二抗体を含ん
    でなる請求の範囲16記載の方法。
18. 【請求項１８】第二抗体がモノクローナル抗体である請
    求の範囲17記載の方法。
19. 【請求項１９】第二抗体がポリクローナル抗体である請
    求の範囲17記載の方法。
20. 【請求項２０】第二抗体が、直接標識または間接標識か
    らなる群から選択される標識で標識化される請求の範囲
    17記載の方法。
21. 【請求項２１】前記哺乳類のマトリックスメタロプロテ
    ィナーゼ−８がヒトのマトリックスメタロプロティナー
    ゼ−８である請求の範囲16記載の方法。
22. 【請求項２２】試料を、部位特異的歯肉溝液、唾液およ
    び口内リンスの試料からなる群から選択する請求の範囲
    16記載の方法。
23. 【請求項２３】歯周病活性の進行を評定する請求の範囲
    16記載の方法。
24. 【請求項２４】下記ステップすなわち （ａ）歯肉溝液を含有する試料を収集し； （ｂ）前記試料を、哺乳類のマトリックスメタロプロテ
    ィナーゼ−８を認識する少なくとも１種の抗体と接触さ
    せ；次いで （ｃ）マトリックスメタロプロティナーゼ−８の増大し
    た濃度を認識できる免疫学的方法によって前記哺乳類の
    マトリックスメタロプロティナーゼ−８の存在を検出す
    る； ステップを含んでなる検出法を免疫学的検定法として実
    施する、歯周病活性、ペリ−インプラント破壊症または
    HIV（＋）感染／エイズ病関連歯周病の危険を事前に選
    別する請求の範囲16記載の方法。