BR112016019588B1 - Método de determinação da ativação da mmp-8 em uma amostra - Google Patents
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Abstract
PRODUTO DE ATIVAÇÃO DE MMP-8, E, MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DA ATIVAÇÃO DA MMP-8 EM UMA AMOSTRA. A presente invenção refere-se a um produto de ativação de MMP-8 novo, como um produto de ativação da parte mediana da MMP-8. A invenção também se refere à detecção de tal produto de ativação de MMP-8 ou de fragmentos de MMP-8 ativados em uma amostra biológica derivada de um indivíduo, e ao uso do mesmo para diagnosticar doenças que se relacionam a níveis elevados ou anormais de MMP-8 ativada.
Description
[001] A presente invenção refere-se, em geral, ao campo de diagnósticos. Em particular, a presente invenção refere-se a um produto de ativação de MMP-8, preferencialmente a um produto de ativação da parte mediana da MMP-8 para detectar a ativação da MMP-8, os produtos de ativação da MMP-8 ou fragmentos da MMP-8 ativados em uma amostra biológica derivada de um indivíduo, e para determinar uma predisposição ou um risco para uma doença ou progressão da doença. A invenção refere-se também ao uso do produto de ativação de MMP-8 para diagnosticar as doenças relacionadas aos níveis anormais ou elevados da MMP-8 ativada.
[002] As doenças periodontais são um grande problema na dentição humana. De fato, mais dentes são perdidos por causa de doença periodontal do que de cárie dentária. Assim, há uma grande necessidade por testes de diagnóstico confiáveis para a doença periodontal; em particular, há uma necessidade de diagnóstico nos estágios iniciais do início da doença, até mesmo no estágio inicial da gengivite, ou seja, o diagnóstico dos estágios iniciais do início da destruição tecidual antes de ocorrer sinais visíveis da destruição.
[003] A doença periodontal compreende um grupo de distúrbios inflamatórios originários de infecções que afetam a gengiva e as estruturas ósseas alveolares do maxilar que sustentam os dentes.
[004] A principal causa das doenças periodontais é a placa bacteriana e o biofilme bacteriano fixado aos dentes. Eles causam inflamação da gengiva, que pode resultar na destruição das estruturas efetivas de apoio do dente e óssea na doença periodontal. Normalmente há um grande acúmulo de bactérias na placa e no biofilme, ambos acima (supragengival) e abaixo (subgengival) da linha da gengiva.
[005] A gengivite (inflamação da gengiva) é distinta da periodontite pelo fato de que, na gengivite, a gengiva é inflamada, mas nenhuma bolsa periodontal profunda (> 4 mm) é detectável; assim, nenhuma destruição irreversível das estruturas de sustentação do dente moles e duras (ósseas) está associada com a gengivite. A periodontite é caracterizada pela gengiva inflamada e destruição das estruturas de sustentação do dente moles e duras (ósseas); no entanto, a periodontite pode ser omitida em gengivas com aparência clinicamente saudável.
[006] Apesar de vasta pesquisa e desenvolvimento de sistemas de diagnóstico aprimorados ter sido realizada nos últimos 20 anos ter refletido um aumento de publicações (por exemplo, pesquisa no PubMed de abril de 2010 a julho de 2013: MMP-8 640 / 891 citações, MMP-8 em Implantologia periodontal 95 / 136 citações) doença periodontal e seu sucessor em implantes periodontais dentários ainda faz com que bilhões de dólares sejam gastos em custos de tratamento odontológico.
[007] Apesar de uma crescente conscientização, grandes esforços em tratamento e, enquanto isso, na disponibilidade de sistemas de ensaio melhorados que são capazes de identificar a doença na consulta, ou por meio de ensaios laboratoriais, a doença está se espalhando/crescendo significativamente (Deutsche Mund Gesundheits Biomotionlab IV, 2006) em países industrializados como, por exemplo, na Alemanha.
[008] “De acordo com a definição de CDC considerando os locais mesiovestibular e distolingual, a prevalência da periodontite foi de 70,9% e 87,4% em ambos os grupos de idade, com um quarto e metade apresentando formas graves, respectivamente.” (B. Holtfreter et al., 2010)
[009] Nos últimos 25 anos, um dramático progresso foi feito em tecnologias de restauração pelo desenvolvimento de implantes dentários que podem substituir os dentes, que foram perdidos por causa da periodontite e outras causas nos anos anteriores.
[0010] No entanto, uma patologia igual ou similar se aplica aos implantes dentários, assim para dentes naturais na periodontite.
[0011] Conforme descrito acima para os dentes naturais, a periodontite é causada principalmente por patógenos no biofilme que aderem à superfície do implante, a e na conexão entre o implante e o limite e à construção prostética acima uma reação hospedeira similar do tecido ao redor do implante dentário é provocada: desencadeada por fragmentos bacterianos (LPS), uma reação inflamatória é induzida que pode sair de controle e, em seu curso, liberará grandes quantidades de proteases, principalmente de MMP-8.
[0012] Semelhantemente aos dentes naturais, uma ativação desequilibrada de MMP-8 pode levar à hiperativação e a concentrações extremamente altas de MMP-8 (aMMP-8) no fluido do sulco peri-implantar (PISF) (Ma J, et al, 2000, Xu L et al, 2008) e podem dentro de um período de tempo individualmente imprevisível, levar a uma perda significativa de osso alveolar (peri-implantite) e em consequência a uma perda do implante.
[0013] Uma vez em um estágio da peri-implantite, há poucas opções para tratar a doença. Equivalente à periodontite no diagnóstico clínico da peri- implantite (Ma J, et al: 2000 e Xu L, et al. 2008) significa a medição do nível de destruição que a doença já causou, por exemplo, por sondagem da perda de ligação ou inspeção de raio x. Outros métodos, como a análise de proteínas, não demonstraram ser suficientemente específicos, ou os parâmetros não são acessíveis por meio de diagnósticos de consultório odontológico ou as amostras biológicas relevantes não são estáveis para serem enviadas para um laboratório especializado para o diagnóstico de rotina.
[0014] Portanto, é ainda de grande interesse para profissionais odontológicos, para profissionais da área médica e até mesmo para o monitoramento no domicílio do paciente, desenvolver sistemas de teste, especialmente de testes no consultório odontológico rápidos que sejam capazes de reconhecer não apenas as proteases ativas (como MMP-8), mas já o processo de ativação. Isso pode possibilitar um julgamento preditivo ou análise de prognóstico aprimorado da situação periodontal individual, que é importante no caso de uma doença periodontal futura ou existente na dentição natural e no caso de implantes para a detecção precoce do risco para os distúrbios peri-implante.
[0015] Ele permitirá que os médicos encaminhem os pacientes de risco aos profissionais odontológicos tão cedo quanto possível e permitirá que os profissionais odontológicos apliquem um tratamento preventivo precoce, e motivará os pacientes para exercer uma melhor higiene oral. A detecção precoce e o subsequente tratamento profilático da doença/distúrbios periodontais - como os sistemas de cuidados de saúde aprenderam antes na profilaxia das cáries - ajuda a economizar bilhões de custos de tratamento e restauração.
[0016] Além disso, está atualmente bem documentado que a periodontite (crônica) interage com várias doenças sistêmicas e é considerada um fator de risco significativo em inúmeras doenças sistêmicas, como diabetes, enfarte do miocárdio (MI), derrame e outras doenças neurológicas e cardiovasculares (DCV), doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), artrite reumatoide (RA), doença de Crohn (MC), sepsia, HIV, borreliose e outras inflamações sistêmicas de baixo grau, síndrome metabólica, obesidade, nefropatias, transplante de tecidos, distúrbios ortopédicos e para a administração precoce (PTD), baixo peso de nascimento e riscos de reprodução, como disfunção erétil, contagem reduzida de espermatozoides e menor mobilidade das células de esperma.
[0017] Por exemplo, as razões de probabilidade aumentam para pacientes com periodontite em comparação com pacientes periodontalmente saudáveis com diabetes (taxa de mortalidade) = 7,7, para PTD = 7,5, e para derrame = 8,5. A periodontite é um fator de risco bem reconhecido para MI, diabetes e derrame. Muitos destes estudos demonstraram a relevância da MMP-8 como um biomarcador local (oral) e sistêmico da doença periodontal.
[0018] Como tal, a capacidade de diagnosticar o início precoce da doença periodontal e de identificar os pacientes em risco de desenvolver ou a progressão de distúrbios periodontais com sistemas de teste prognóstico é crucial não só dentro de campo/área dentária, mas efetivamente para toda a área/campo médico e o sistema de cuidados de saúde. AETNA, um seguro de cuidados de saúde dos EUA, provou que, em relação a todos os custos de saúde, por exemplo, dos diabéticos que passaram por tratamento periodontal em comparação com aqueles sem tratamento periodontal, foi reduzido em 16, indicando a importância e o impacto das doenças orais, e dando motivos para imaginar o que uma melhor detecção precoce de riscos periodontais em combinação com o tratamento profilático pode significar para os pacientes e os custos totais de cuidados de saúde no futuro.
[0019] A MMP-8 sistêmica também desempenha um papel em outras doenças. A função predominante da MMP-8 na renovação da matriz extracelular, na modulação de respostas inflamatórias e em outros processos fisiológicos, no envolvimento da MMP-8 em uma grande variedade de patologias e na função da MMP-8 como uma droga alvo ou marcador de doença em alguns distúrbios inflamatórios e na progressão do câncer está bem documentado. A MMP-8 é descrita como um possível alvo de droga em uma ampla variedade de distúrbios inflamatórios e, em pacientes, os níveis elevados de MMP-8 são frequentemente associados com a progressão da doença inflamatória (Dejonckheere E. et al., 2011).
[0020] Verificou-se que níveis séricos iniciais elevados de MMP-8 prognosticam resultados fatais em infecções sépticas e em doenças cardiovasculares. Além disso, verificou-se que pacientes com meningite bacteriana (BM) têm níveis altos ou elevados de MMP-8 no líquido cerebrospinal (CSF) e também que os níveis de MMP-8 no CSF de crianças com BM são significativamente maiores entre não sobreviventes do que entre sobreviventes.
[0021] Também é conhecido que a inflamação e/ou infecção no líquido amniótico é um fator de risco para o parto prematuro e resultados neonatais adversos. A MMP-8 foi usada como um marcador para a predição e o diagnóstico de infecção/inflamação e também para o desenvolvimento do parto prematuro e complicações neonatais.
[0022] Era um objeto da invenção fornecer um método novo de determinação de risco aumentado, predisposição ou de um processo ativo levando a uma doença ligada à degradação do tecido periodontal ou peri- implante ou inflamação periodontal ou peri-implante.
[0023] Outro objeto da invenção era fornecer um novo método de detecção de ativação de MMP-8 ou de processos de ativação em uma amostra biológica derivada de um indivíduo.
[0024] Outro objeto da invenção era fornecer um método novo de detecção da presença de espécies de MMP-8 em amostras derivadas de diferentes grupos de pacientes.
[0025] Outro objeto da invenção era desenvolver novos métodos para o diagnóstico de doenças relacionadas com a formação; a presença; maior concentração; ou ativação da MMP-8, especialmente de um produto de ativação de MMP-8, como o produto de ativação da parte mediana da MMP- 8.
[0026] Um ensaio de combinação também pode ser concebido, no qual o produto de ativação da parte mediana da MMP-8 é detectado individualmente ou em grupos, ou juntamente com as maiores espécies de MMP-8 ativas. O ensaio de combinação é especialmente útil quando o epítopo reconhecido por um anticorpo é um epítopo comum presente em ambas ou em várias moléculas, tanto no produto de ativação como na MMP-8 ativa; e/ou quando o epítopo está multiplamente presente no produto ativação da MMP-8 em comparação com a maior molécula de MMP-8 ativa; e/ou quando vários produtos de ativação da MMP-8 são criados a partir de uma única molécula de MMP-8 durante o processo de ativação, um fenômeno chamado de efeito estérico de multiplicação.
[0027] Aspectos da invenção referem-se a um produto de ativação de MMP-8, como um produto de ativação da parte mediana da MMP-8 com tamanho de 5 a 35 KDa, de preferência de 10 a 30 KDa, mais preferencialmente de 20 a 35 KDa, e adequadamente de cerca de 5KDa, 6KDa, 7 KDa, 8 KDa, 9 KDa, 10 KDa, 11 KDa, 12 KDa, 13 KDa, 14, KDa, 15 KDa, 16 KDa, 17 KDa, 18 KDa, 19 KDa, 20 KDa, 21 KDa, 22 KDa, 23 KDa, 24 KDa, 25KDa, 26 KDa, 27 KDa, 29 KDa, 30 KDa, 31 KDa, 32 KDa, 33 KDa, 34 KDa e/ou 35KDa, ou para detectar tal produto de ativação de MMP-8 em uma amostra.
[0028] Outro aspecto da invenção refere-se a um método para determinar a ativação da MMP-8 em amostras; compreendendo fornecer uma amostra biológica de um indivíduo, detectar a presença de um ou mais produtos de ativação de MMP-8, especialmente produtos de ativação da parte mediana da MMP-8 e, opcionalmente, correlacionar a presença do produto de ativação de MMP-8 ou de produto(s) de ativação da parte mediana da MMP-8 em uma amostra com a presença de partes maiores de MMP-8 ativa na amostra, em que a presença do produto de ativação de MMP-8 ou do produto de ativação da parte mediana da MMP-8 na amostra é indicativo, preditivo e/ou confirmativo da presença de MMP-8 ativa na amostra, e que, por exemplo aumenta a detecção analítica da MMP-8 ativa e o seu poder preditivo em um ensaio. Por exemplo, produtos de ativação da MMP-8 fluidos orais repetidamente ou cronicamente elevados preveem a resposta ao tratamento e indicam os locais e/ou pacientes em risco para a progressão da doença, por exemplo, perda de fixação na periodontite.
[0029] Outro aspecto da invenção refere-se ao diagnóstico adicional da presença de ou uma predisposição para uma doença ou a progressão da doença, compreendendo determinar a presença de um ou mais produtos de ativação da MMP-8, como produtos de ativação da parte mediana da MMP-8 em uma amostra biológica obtida do indivíduo; comparar os resultados de detecção para uma amostra de referência, por meio do que a presença ou a predisposição para a doença deve ser diagnosticada, em que a) a amostra de referência é derivada de um indivíduo ou de um grupo de pacientes conhecido por ter um nível normal de MMP-8, por meio do que resultados semelhantes para a amostra biológica e a amostra de referência são indicativos para o indivíduo não ter ou não ser predisposto ao risco de desenvolver ou progredir a doença, e por meio do que o nível elevado do produto de ativação de MMP-8 ou do produto de ativação da parte mediana da MMP-8 na amostra biológica, em comparação com a amostra de referência, é indicativo para o indivíduo presentemente ter (no momento do teste) a doença ou ser predisposto à doença, ou ser predisposto a ter maior risco de desenvolver ou progredir a doença; ou b) a amostra de referência é derivada de um indivíduo ou de um grupo de pacientes conhecido por ter, presentemente, a doença, ou ser predisposto à doença, por meio do que resultados semelhantes para a amostra biológica e a amostra de referência são indicativos para o indivíduo ter ou ser predisposto à doença, ou ter ou ser predisposto a um risco de desenvolver ou progredir a doença.
[0030] Os aspectos caracterizantes da invenção são apresentados nas reivindicações em anexo.
[0031] Outro objeto da invenção era averiguar a associação das espécies moleculares de MMP-8 representando fragmentos de ativação de MMP-8 com os níveis de imunorreatividade do MMP-8 analisados pelo de ensaio imunofluorimétrico de tempo resolvido (IFMA) e pelo método de imuno-ELISA (IEMA, ELISA) e com níveis de carga inflamatória periodontal diferentes.
[0032] A figura 1A mostra o IFMA da MMP-8 e a figura 1B mostra os níveis de MMP-8 no IEMA nos grupos de estudo 1 a 4 (exemplo 1) de acordo com o status de fumante, quando o número de dentes foi levado em consideração. A tendência de não fumantes nos grupos 1 a 4 é significativa, tanto para IFMA (p = 0,010) como para IEMA (p = 0,028).
[0033] A figura 2A mostra a espécie MMP-8 e suas combinações. Forest blot, representando a razão de probabilidade (95% de nível de confiança, cl) de prevalência das espécies de MMP-8 kDa. Variável dependente: nível de IFMA (ajustado pelo número de dentes) > nível mediano no grupo 4 (forte carga inflamatória periodontal). A associação é significativa. A figura 2B mostra a espécie MMP-8 e suas combinações. Forest blot, representando a razão de probabilidade (95% de cl) de prevalência das espécies de MMP-8 kDa. Variável dependente: tabagismo. A associação é significativa.
[0034] A figura 2C mostra a espécie MMP-8 e suas combinações. Forest blot, representando a razão de probabilidade (95% de cl) de prevalência das espécies de MMP-8 kDa. Variável dependente: tabagismo. A associação é significativa.
[0035] A Figura 3 mostra a análise da curva do receptor das características dos operadores (ROC) para a avaliação da sensibilidade e especificidade de diagnóstico dos níveis de IFMA e IEMA de MMP-8 (figura 3A) e a prevalência das espécies do grupo 4 de MMP-8 de 25 + 35 KDa com forte carga inflamatória periodontal como variável de estado (figura 3B). Para consultar as áreas sob a curva ROC, intervalos de confiança de 95% e valores de p, consulte o exemplo 1.
[0036] A figura 4 mostra uma análise de SDS-PAGE (10%) dos efeitos da APMA organomercurial (Figura 4a) e ativadores do NaOCl (Figura 4B) oxidativos da MMP-8 humana recombinante (Proteaimmun). As quantidades de rhMMP-8 e dos tempos de incubação estão indicadas. Tanto a APMA como o NaOCl induzem a geração de espécies de MMP-8 de baixo peso molecular após a ativação. Observar especialmente a formação dependente do tempo do fragmento de ativação, de 20 a 30 KDa, indicado pela seta. A figura 4 mostra que uma análise de Western immunoblot usando rhMMP-8 ativada de três fontes diferentes (Proteaimmun, Merck e Invent) por APMA e NaOCl, líquidos corporais humanos e soro. Raia 1: rMMP-8 da Proteaimmun; raia 2: igual à raia 1 mais APMA; raia 3: igual à raia 1 mais NaOCl; raia 4: rh MMP-8 da Merck; raia 5: igual à raia 4 mais APMA; raia 6: igual à raia 4 mais NaOCl; raia 7: antígeno de MMP-8 da Invent; raia 8: igual à raia 7 mais APMA; raia 9: igual à raia 7 mais NaOCl; raia 10: fluido de fenda gengival de periodontite humana (GCF); raia 11: fluido sulcular de peri-implantite humana (PISF); raia 12: GCF de dente humano tratado ortodonticamente; raia 13: saliva de periodontite humana; raia 14: enxágue bucal de periodontite humana; raia 15, líquido amniótico humano infectado; raia 16: líquido cefalorraquidiano de meningite humana; raia 17: soro de sepse humano. O fragmento de 20 a 30 KDa prevalente formado após a ativação da MMP-8 está indicado pela seta. Consulte o exemplo 2.
[0037] A Figura 5 mostra uma análise de Western immunoblot das amostras de líquido amniótico humano não infectadas (No. 16) e infectadas (Nos. 12, 13 e 19) com diferentes anticorpos da MMP-8 e diferentes concentrações da MMP-8.
[0038] A Figura 6 mostra uma análise de SDS-PAGE da MMP-8 humana recombinante (Proteaimmun) ativada por APMA com diferentes tempos de incubação. As bandas usadas para o sequenciamento estão indicadas na figura.
[0039] A Figura 7 mostra um SDS-PAGE de várias frações do ativo MMP-8 purificado. As amostras são da esquerda para a direita; marcador de peso molecular PAGERuler, 1) a 4) várias frações de hMMP-8 purificado, marcador de peso molecular Spectra Multicolor.
[0040] A figura 8 mostra um Western Blot de várias alíquotas de aMMP-8 humana purificada marcada com anti-hMMP-8-MoAb 1491-E6-F7. As amostras são da esquerda para a direita; marcador de peso molecular Dual Xtra; 1) a 4) várias frações de hMMP-8 purificada, 5) extrato de placenta antes da purificação.
[0041] SEQ ID NO: 1 Sequência da parte do meio da MMP-8 encontrada no produto de ativação de MMP-8 das bandas 3, 4, 5 e 6 da figura 6, por exemplo, na banda 3 com o tamanho de 25 KDa; SEQ ID NO 2: sequência da parte do meio da MMP-8 encontrada no produto de ativação de MMP-8 das bandas 2, 3, 4, 5 e 8 da figura 6, por exemplo, na banda 4, com o tamanho de 21 KDa.
[0042] Os presentes inventores verificaram que a presença da MMP-8 ativada pode ser detectada em várias amostras biológicas pela detecção de seu produto de ativação de MMP-8 recém-descoberto, como um produto de ativação da parte mediana da MMP-8 com tamanho de 5 a 35 KDa, preferencialmente de cerca de 10 a 30 KDa, e mais preferencialmente, de cerca de 20 a 35 KDa. O fragmentado MMP-8 está presente em várias formas moleculares definidas, com tamanho de 5 KDa, 6 KDa, 7 KDa, 8 KDa, 9 KDa, 10 KDa, 11 KDa, 12 KDa, 13 KDa, 14, KDa, 15 KDa, 16 KDa, 17 KDa, 18 KDa, 19 KDa, 20 KDa, 21 KDa, 22 KDa, 23 KDa, 24 KDa, 25 KDa, 26 KDa, 27 KDa, 29 KDa, 30 KDa, 31 KDa, 32 KDa, 33 KDa, 34 KDa e 35 KDa, e compreendendo uma sequência SEQ ID No: 1 ou SEQ ID No: 2.
[0043] Em um aspecto, as diferentes espécies moleculares dos fragmentos podem ser correlacionadas com o tipo de amostra e uma combinação específica de fragmentos pode ser usada para indicar um determinado estado ou doença presente, ou risco para o desenvolvimento da doença no indivíduo do qual a amostra é derivada.
[0044] O produto de ativação de MMP-8 ou o produto de ativação da parte mediana da MMP-8, compreendendo pelo menos um fragmento de MMP-8, pode ser detectado na amostra usando qualquer método conhecido na técnica. O ensaio pode ser um imunoensaio qualitativo, semiquantitativo ou quantitativo. Exemplos não limitantes dos métodos de detecção adequados, de acordo com a invenção, incluem Western blotting, IFMA, EIA, ELISA, ensaio de fluxo lateral, ensaio Dip-stick, ensaio de ressonância de plasmônio de superfície, ensaio eletroquímico ou qualquer outro sistema de ensaio de ligação de ligante ou de detecção direta conhecido. Sistemas ou tecnologias de ensaio de detecção direta significam qualquer método que não é baseado na ligação de ligante para análise, ou seja, tecnologias como; cromatografia de exclusão por tamanho [SEC], como cromatografia líquida de alta pressão [HPLC] ou cromatografia de permeação em gel (GPC), como SDS-PAGE; ou métodos de espectroscopia molecular, como espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), espectroscopia UV/VIS, ionização por eletropulverização (ESI), etc.
[0045] A menos que seja especificado de outra forma, os termos, que são usados no relatório descritivo e nas reivindicações, têm os significados comumente usados no campo de diagnósticos. Especificamente, os termos a seguir têm os significados indicados abaixo.
[0046] Produto de ativação de MMP-8 refere-se a um produto compreendendo um ou mais fragmentos da matriz metaloproteinase 8 (MMP- 8) formados naturalmente durante a ativação da MMP-8 in vivo ou in vitro. O produto de ativação de MMP-8 pode ser produzido endogenamente (ou seja, autoativação) ou por meio de agentes de ativação ou ativadores como, mas sem se limitar, a APMA, NaOCl, outros agentes oxidativos e/ou proteases derivadas do hospedeiro e microbianas.
[0047] O produto de ativação da parte mediana da MMP-8 refere-se a um produto compreendendo pelo menos um fragmento da matriz metaloproteinase 8 (MMP-8) que compreende uma ou mais sequências do domínio da região do meio da sequência da MMP-8 total, em que uma ou mais sequências não são substancialmente parte da parte C-terminal ou N- terminal, ou seja, não é totalmente parte do C-terminal ou N-terminal. As sequências podem, por exemplo, se estender dos aminoácidos Asn119 ao Ala132 ou dos aminoácidos lie151 ao Asp165 da proteína completa.
[0048] A MMP-8 ativa refere-se às diferentes formas da colagenase ativada, ao contrário de suas formas pró ou precursoras.
[0049] A ativação da MMP-8 refere-se aos processos biológicos ou bioquímicos da transformação das pré-formas de MMP-8 na MMP-8 ativa/ativada.
[0050] Os presentes inventores verificaram surpreendentemente que, através da detecção de um produto de ativação de MMP-8, como o produto de ativação da parte mediana da MMP-8, ao invés das espécies de alto peso molecular da MMP-8 ativa, a detecção da MMP-8 ativa pode ser aumentada. Sem desejar se ater a qualquer teoria, acredita-se que o produto de ativação de MMP-8 ou o produto de ativação da parte mediana da MMP-8 está em maior concentração absoluta, ou o número de epítopo é maior em uma amostra biológica do que o número de moléculas MMP-8 maiores ativas com tamanho típico de 55 a 95 kDa. Assim, usando o produto de ativação da parte mediana da MMP-8 de baixo peso molecular como biomarcador, é mais fácil obter um valor de prognóstico ou diagnóstico, por exemplo, pela captura de um anticorpo em um imunoensaio.
[0051] Não está completamente claro por que a detecção de fragmentos menores de MMP-8 é mais eficaz para fins de diagnóstico e previsão do que a detecção de espécies de alto peso molecular de MMP-8 ativada. Sem nos comprometer com qualquer modelo explicativo, uma observação preliminar sugere que, uma vez desencadeada por bactérias e apoiada por fatores ambientais, genéticos e adquiridos, uma resposta imunológica do hospedeiro aos patógenos no biofilme de PMN irá conduzir a pró-enzima de 85 kDa da MMP-8 para a seção de ataque bacteriano e ativar a pró-enzima de 85 KDa. A pró-enzima de 85 KDa é, em seguida, convertida em um fragmento de 64 KDa, o qual se liga ao colágeno e bactéria/biofilme e causa a lise do colágeno ao tecido gengival e osso alveolar. Se mais fragmentos de 64 KDa forem gerados do que podem se ligar ao colágeno, a quantidade em excesso de fragmentos de 64 KDa irá se ligar com o TEVIP, que é o regulador natural do sistema MMP.
[0052] Se a quantidade em excesso de 64 KDa ainda se formar, seja endogenamente e/ou pela ação de oxidantes e proteases derivadas do hospedeiro e/ou microbianas, se fragmentam em fragmentos de 40 KDa e fragmentos de 24 KDa por autólise e, provavelmente, também para vários fragmentos de MMP-8 pequenos, por exemplo, de 5 KDa, 9 KDa, 14 KDa, etc.
[0053] Sabe-se que o fragmento de 40 KDa aciona e apoia a ativação adicional da pró-enzima de 85 KDa, porém, com atividade reduzida.
[0054] A situação fisiológica parece ser que, primeiramente, na fase I, a maioria dos fragmentos de 64 KDa está ligada ao colágeno tipo 1 na lesão periodontal e às bactérias no biofilme para a lise do colágeno.
[0055] Posteriormente, na fase II; se quantidades em excesso de fragmentos de 64 KDa estiverem disponíveis, eles podem se ligar aos TEVIPs (TIMP1 e TIMP2) e começar a serem fragmentados até 40 KDa, os quais também se ligarão aos TIMPs. Tanto os fragmentos de 64 KDa como os de 40 KDa formam complexos de uma razão molar de cerca de 1:1 para inibição com TEVIP 1/TIMP2. Assim, pelo fato de se ligar à matriz gengival e ao biofilme, os fragmentos de 64 KDa e de 40 KDa estão provavelmente menos disponíveis na amostra de fluido de fenda gengival (GCF) e no fluido do sulco peri-implantar (PISF) do que no GCF dissolvido na saliva ou enxágue bucal. No entanto, os fragmentos não ligados “livres”, como os fragmentos de 24 KDa, e outros fragmentos de MMP-8 pequenos, tornam-se disponíveis em concentrações elevadas ou altas, indicando e refletindo a fase do processo de ativação precoce da MMP-8.
[0056] Na fase III; se a ativação em curso de fragmento de 85 KDA para fragmento de 64 KDa produz quantidades excessivas de fragmentos de 64 KDa, estes serão autolisados para fragmentos de 40 KDa (que oferecem suporte à ativação e tornam a situação ainda pior) e outros fragmentos, incluindo pequenos produtos de ativação de MMP-8 ou produtos de ativação da parte mediana da MMP-8. Os fragmentos menores, ou seja, provavelmente todos os outros fragmentos de 5 KDa a 35 KDa, se tornarão disponíveis na amostra, indicando, refletindo ou representando uma fase de risco elevado para rápida quebra de tecidos moles e duros.
[0057] Para obter informações de diagnóstico/biomarcador, isto, por sua vez, significa que estes fragmentos menores formados por autólise in vivo aparecem apenas em altas concentrações apenas em situações clínicas quando o equilíbrio natural fragmentos de 64 KDa ligados para não ligados está ou ficou fora de equilíbrio, e as quantidades em excesso de 64 KDa estão disponíveis para autólise ou fragmentação adicional, indicando risco elevado para a formação ou progressão da doença.
[0058] A modalidade 1 da invenção fornece um produto de ativação de MMP-8, preferencialmente um produto de ativação da parte mediana da MMP-8 caracterizado pelo fato de que o produto de ativação de MMP-8 ou o produto de ativação da parte mediana da MMP-8 compreende um fragmento de ativação de MMP-8 e tem um tamanho entre 20 e 35 KDa, de preferência, de cerca de 20 KDa, 25 KDa, 30 KDa ou 35 KDa.
[0059] A modalidade 2 fornece o produto de ativação de MMP-8 ou o produto de ativação da parte mediana da MMP-8 de acordo com a modalidade 1, em que o produto de ativação e o tamanho do produto de ativação corresponde ao produto de ativação obtido pela ativação do MMP-8 nativo com APMA.
[0060] A modalidade 3 fornece o produto de ativação de MMP-8 ou o produto de ativação da parte mediana da MMP-8 de acordo com a modalidade 1, em que o produto de ativação e o tamanho do produto de ativação corresponde ao produto de ativação obtido pela ativação do MMP-8 nativo por remoção proteolítica ou por modificação química com a ativação oxidativa pelo NaOCl ou espécies reativas de oxigênio.
[0061] A modalidade 4 fornece o produto de ativação de MMP-8 ou o produto de ativação da parte mediana da MMP-8 de acordo com uma das modalidades 1 a 3, em que o produto de ativação compreende a sequência SEQ ID NO: 1, sendo um domínio da parte do meio (não C-terminal ou N- terminal) de MMP-8.
[0062] A modalidade 5 fornece o produto de ativação de MMP-8 ou o produto de ativação da parte mediana da MMP-8 de acordo com uma as modalidades 1 a 4, em que o produto de ativação compreende a sequência SEQ ID NO: 2, sendo um domínio da parte do meio (não C-terminal ou N- terminal) de MMP-8.
[0063] Uma modalidade adicional da invenção fornece um método para determinar a ativação da MMP-8 em uma amostra, compreendendo A. fornecer uma amostra biológica oriunda de um indivíduo; B. detectar a presença de um ou mais produtos de ativação da MMP-8 ou dos produtos de ativação da parte mediana da MMP-8, compreendendo um ou mais fragmentos de ativação da MMP-8 e com um tamanho entre 5 e 35 KDa, preferencialmente de 10 a 30 KDa, e mais preferencialmente cerca de 10 KDa, 15 KDa, 20 KDa, 25 KDa, 30 KDa ou 35 KDa na amostra biológica; e C. opcionalmente correlacionar a presença do produto de ativação de MMP-8 ou do produto de ativação da parte mediana da MMP-8 com a presença de MMP-8 ativa na amostra; e/ou D. opcionalmente correlacionar a presença do produto de ativação de MMP-8 ou do produto de ativação da parte mediana da MMP-8 com a presença de outras partes maiores da MMP-8 ativa na amostra; em que a presença de um ou mais produtos de ativação da MMP-8 ou de produtos de ativação da parte mediana da MMP-8 na amostra biológica é indicativo e/ou confirmativo e/ou preditivo para a presença de MMP-8 ativa na amostra, e melhora a detecção analítica da MMP-8 ativa em um ensaio e/ou o seu poder preditivo.
[0064] A presença de um ou mais produto de ativação de MMP-8 ou produtos de ativação da parte mediana da MMP-8 é tipicamente determinada pelo uso de um sistema ligante para a detecção de um produto de ativação da MMP-8 na amostra biológica. Preferencialmente, o sistema ligante compreende um ou mais anticorpos, um par de anticorpos e/ou um fragmento de anticorpo, e em que o ensaio é um imunoensaio quantitativo, semiquantitativo ou qualitativos, como um Western blot, IFMA, EIA, ELISA, ensaio de fluxo lateral, ensaio dip-stick, ensaio de ressonância de plasmônio de superfície, ensaio eletroquímico ou qualquer outro sistema de ensaio de ligação de ligante. Os anticorpos usados de acordo com os diferentes aspectos da invenção podem ser monoclonais e/ou policlonais, opcionalmente, recombinantes.
[0065] De acordo com outro aspecto da invenção, a presença de um ou mais produtos de ativação de MMP-8 ou produtos de ativação da parte mediana da MMP-8 é determinada usando uma tecnologia de detecção de proteína direta de um produto de ativação da MMP-8 na amostra biológica.
[0066] De acordo com uma modalidade da invenção, o método é usado para diagnosticar uma predisposição ou um risco de uma doença ou progressão de doença, compreendendo I. determinar a presença do produto de ativação de MMP-8 ou do produto de ativação da parte mediana da MMP-8 em uma amostra biológica obtida a partir do indivíduo; II. comparar os resultados obtidos na etapa I com uma amostra de referência, por meio do que uma predisposição ou um risco para a doença ou a progressão da doença é para ser diagnosticada, em que a) a amostra de referência é derivada de um indivíduo ou de um grupo de pacientes conhecido por ter um nível normal de MMP-8, por meio do que resultados semelhantes para a amostra biológica e a amostra de referência são indicativos para o indivíduo no momento não ter ou não ser predisposto à doença, ou não ter ou não ser predisposto a um risco de desenvolver ou progredir a doença, e por meio do que o nível elevado do produto de ativação de MMP-8 ou do produto de ativação da parte mediana da MMP-8 na amostra biológica, em comparação com a amostra de referência, é indicativo para o indivíduo presentemente ter (no momento do teste) a doença ou ser predisposto à doença, ou ser predisposto a ter maior risco de desenvolver ou progredir a doença; ou b) a amostra de referência é derivada de um indivíduo ou de um grupo de pacientes conhecido por ter, presentemente, a doença, ou ser predisposto à doença, por meio do que resultados semelhantes para a amostra biológica e a amostra de referência são indicativos para o indivíduo ter ou ser predisposto à doença, ou ter ou ser predisposto a um risco de desenvolver ou progredir a doença.
[0067] De acordo com as diferentes modalidades da invenção, a amostra é normalmente obtida a partir do fluido de fenda gengival, fluido sulcular peri-implantar, placa bucal, placa dental, enxágue bucal, lavagem bucal, saliva, fluido do canal radicular, exsudato de ferida, PUS, biofilme oral, biópsias de tecido, zaragatoas bucais, sangue de lesões bucais ou, alternativamente, a amostra não é derivada da cavidade oral, mas sim do líquido amniótico, soro, plasma, lavagem vaginal, lavagem nasal, seio nasal, orelha, seio, urina, líquido sinovial, fluido cerebral espinhal, fezes, zaragatoas, lágrimas, lavagem (do pulmão), escarro, biópsias de tecido, exsudato de feridas e/ou suor.
[0068] Nas modalidades preferenciais da invenção, a doença é uma ou mais de inflamação periodontal, perda de tecido periodontal (degradação), gengivite, periodontite, peri-implantite, perda dentária, remissão de implante dentário, perda óssea alveolar, mucosite, alterações da membrana mucosa, inflamações periodontais apicais, inflamação do canal radicular, cáries, rupturas do osso maxilar vertical, movimento ortodôntico do dente, reações inflamatórias alérgicas e/ou bacteremia causada por bactérias orais.
[0069] De acordo com outras modalidades da invenção, a presença de um ou mais produtos de ativação de MMP-8 ou produtos de ativação da parte mediana da MMP-8 é indicativo ou preditivo para doenças periodontais, tais como periodontite ou peri-implantite crônica ou aguda, onde essas doenças orais são adicionalmente indicativas ou intensificadoras de um fator de risco conhecido para doenças ou distúrbios sistêmicos, como diabetes I, diabetes II, DPOC (doença pulmonar obstrutiva crônica), síndrome metabólica, obesidade, doença reumática, doenças artríticas/artrite, osteoporose, doenças ortopédicas, doenças autoimunes, doenças de transplante de tecido, artrite, infecção ou remissão de prótese final, doenças cardiovasculares, como derrame, enfarte do miocárdio, arteriosclerose, riscos relacionados à gravidez, tais como, mas sem se limitar, a parto prematuro, baixo peso ao nascer, riscos reprodutivos, como disfunção erétil, contagem reduzida de espermatozoides e menor mobilidade dos espermatozoides.
[0070] De acordo com outra modalidade da invenção, a doença é a) doenças ginecológicas, como inflamação intra-amniótica, inflamação materna, doenças neonatais, parto prematuro, baixo peso ao nascer e patologias amnióticas; b) doenças cancerosas, como malignidades, por exemplo, câncer de mama e leucemias; c) doenças artríticas/reumáticas, como artrite reumatoide e artrose; d) doenças diabéticas, incluindo todas as formas de diabetes mellitus, doenças nefrológicas, doenças renais e ferimentos diabéticos não cicatrizáveis; e) doenças oculares (por exemplo, do líquido lacrimal) como ceratocone e degeneração marginal pelúcida da córnea; f) doenças otolaringológicas (por exemplo, de orelha ou seio nasal); g) infecções e inflamações como borreliose, sepse, síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS), HIV, infecção causada por H. pylori, inflamação sistêmica, inflamação sistêmica de baixo grau, infecções pulmonares e inflamações como bronquite, bronquiectasia, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), infecções/inflamações pediátricas, infecções neurológicas, inflamações e doenças, como meningite (por exemplo, do líquido cefalorraquidiano) e doença de Crohn; h) doenças cardiovasculares, como doenças vasculares, aterosclerose, como inflamação da placa intra-arterial, embolias e derrame; i) ferimentos (por exemplo, do exsudato do ferimento) como ferimentos críticos, ferimentos crônicos, ferimentos não cicatrizáveis e pele queimada; j) doença do intestino (a partir de testes fecais) k) doenças pós-traumas ou acidentes e/ou l) síndrome metabólica e obesidade.
[0071] As modalidades da invenção também abrangem sistemas e meios legíveis por computador, para fazer com que os sistemas de computador executem um método para determinar se um indivíduo tem uma doença ou distúrbio específica, ou uma predisposição para uma doença ou distúrbio específico (definido acima), com base na determinação de um produto de ativação de MMP-8 ou produto de ativação da parte mediana da MMP-8, ou informações de sequência.
[0072] Especialmente, a invenção refere-se ainda a um sistema para analisar uma amostra biológica, compreendendo: a) um módulo de determinação configurado para receber uma amostra biológica e determinar um produto de ativação de MMP-8 ou produto de ativação da parte mediana da MMP-8, em que o produto de ativação de MMP-8 ou produto de ativação da parte mediana da MMP-8 compreende um fragmento de ativação de MMP-8 e tem um tamanho entre 5 e 35 KD; e/ou b) uma informação de sequência, em que as informações de sequência compreendem a SEQ ID NO: 1 e/ou a SEQ ID NO: 2; c) um dispositivo de armazenamento configurado para armazenar informações de sequência do módulo de determinação; d) um módulo de comparação adaptado para comparar as informações de sequência armazenadas no dispositivo de armazenamento com dados de referência, e para fornecer um resultado de comparação, em que o resultado de comparação é derivado de uma amostra de referência, que é derivada de; um indivíduo ou um grupo de pacientes conhecido por ter, atualmente, um nível normal de MMP-8, por meio do qual resultados semelhantes para a amostra biológica e a amostra de referência são indicativos para o indivíduo ser ou não atualmente predisposto à doença, ou ser ou não predisposto a um risco de desenvolvimento ou progressão da doença; e/ou um indivíduo ou um grupo de pacientes conhecido por ter a doença, ou ser predisposto à doença, por meio do que resultados semelhantes para a amostra biológica e a amostra de referência são indicativos para o indivíduo ter ou ser predisposto à doença, ou ter ou ser predisposto a um risco de desenvolver ou progredir a doença, e e) um módulo de visualização para exibir um conteúdo com base em parte no resultado da comparação para o usuário, em que o conteúdo é um sinal indicativo da presença ou do nível elevado de produto de ativação de MMP-8 ou de produto de ativação da parte mediana da MMP-8 na amostra biológica, em comparação com a amostra de referência, que é um indicativo para o indivíduo ter atualmente uma doença ou ser predisposto a uma doença, ou ser predisposto a ter maior risco de desenvolver ou progredir uma doença.
[0073] De acordo com outra modalidade da invenção, a invenção pode ser adicionalmente utilizada por um meio legível por computador com instruções legíveis por computador gravadas no mesmo para definir os módulos de software, incluindo um módulo de comparação e um módulo de visualização para implementar um método em um computador, o dito método compreendendo: a) comparar com o módulo de comparação os dados armazenados em um dispositivo de armazenamento com dados de referência para fornecer um resultado de comparação, no qual o resultado da comparação, ou seja, a presença ou o nível elevado do produto de ativação de MMP-8 ou do produto de ativação da parte mediana da MMP-8 na amostra biológica, em comparação com a amostra de referência, é indicativo para o indivíduo ter atualmente uma doença, ou de ser predisposto a uma doença, ou ser predisposto a ter maior risco de desenvolver ou progredir uma doença; e b) exibir um conteúdo baseado em parte no resultado da comparação para o usuário, em que o teor é um sinal indicativo de ter uma doença ou de ser predisposto a uma doença, ou de ser predisposto a ter um risco maior risco de desenvolver ou de progredir uma doença.
[0074] Os exemplos a seguir são fornecidos apenas para ilustrar várias modalidades da invenção, e eles não se destinam a limitar a presente invenção sob qualquer aspecto. Uma pessoa versada na técnica notará prontamente que a presente invenção, que é definida pelas reivindicações associadas, está bem adaptada para realizar os objetos e obter as finalidades e vantagens mencionadas acima.
[0075] As concentrações de MMP-8 foram determinadas por um ensaio imunofluorimétrico de tempo resolvido (IFMA). Os anticorpos específicos do fragmento de MMP-8 monoclonal 1491-E6-F7 e 1492-B3-C11 (Medix Biochemica, Kauniainen, Finlândia) foram usados como um anticorpo de captura e um anticorpo marcador, respectivamente. O anticorpo marcador foi marcado usando quelato de európio (Hemmila et al., 1984). O tampão de ensaio continha Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 0,5 M, CaCl2 5 mM, ZnCl2 50 μM, BSA 0,5%, azida de sódio 0,05% e ácido dietilenotriaminopentacético 20 mg/L (DTPA). As amostras foram diluídas em tampão de ensaio e incubadas durante uma hora, seguido por incubação durante uma hora com o anticorpo marcador. A solução de reforço foi adicionada e, depois de 5 min, a fluorescência foi medida usando um fluorímetro de pesquisa Delfia 1234 (Wallac, Turku, Finlândia). A especificidade dos anticorpos monoclonais contra a MMP-8 correspondei à da MMP-8 policlonal.
[0076] As formas moleculares da MMP-8 foram detectadas por um kit de Western blotting modificado por ECL, de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante (GE Healthcare, Amersham, Reino Unido). A MMP-8 humana recombinante indicada e o líquido corporal/secreção indicada, e as amostras de soro, foram misturadas com tampão de Laemmli sem quaisquer reagentes redutores, e foram aquecidas durante 5 min, seguido pela separação de proteínas com géis com 11% de (SDS)-poliacrilamida de dodecilsulfato de sódio. Após a eletroforese, as proteínas foram eletrotransferidas nas membranas de nitrocelulose (Protran, Whatman GmbH, Dassel, Alemanha). A ligação não específica foi bloqueada com leite em pó 5% (Valio Ltd., Helsinki, Finlândia) em tampão TBST (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, contendo NaCl 22 mM e Triton-X 0,05%) durante 1 h. Em seguida, as membranas foram incubadas com o anticorpo primário 1491-E6-F7 (Medix Biochemica, Kauniainen, Finlândia) de um dia para o outro, seguido por anticorpo secundário ligado à peroxidase de rábano silvestre (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) durante 1 h. As membranas foram lavadas 4 vezes durante 15 min em TBST entre cada etapa. As proteínas foram visualizadas utilizando o sistema amplificado de quimioluminescência (ECL) (GE Healthcare).
[0077] As intensidades das diferentes formas de peso molecular da MMP-8 foram verificadas e analisadas usando o escâner de densitometria de imagem GS-700 (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) e o programa Quantity One da Bio-Rad por correção dos valores basais.
[0078] A identificação da proteína e a análise dos dados de proteoma foram realizados de acordo com o método descrito por Turunen et al. (2012).
[0079] As bandas de gel removidas que corresponderam à imunomarcação de MDmAb foram lavadas e desidratadas com acetonitrila (ACN). As proteínas foram reduzidas com ditiotreitol 20 mM e incubadas a 56°C durante 30 min antes da alquilação com iodoacetamida 55 mM - hidrogenocarbonato de amônio 0,1 M (NH4HCO3) no escuro em temperatura ambiente, durante 15 minutos. Após lavar com NH4HCO3 0,1 M e desidratar com ACN, os pedaços de gel foram reidratados com tripsina modificada de grau de sequenciamento de 10 a 15 μL (Promega, EUA) em NH4HCO3 0,1 M, a uma concentração final de 0,01 μg/μL de tripsina e incubados para digestão de um dia para o outro a 37°C. Os peptídeos trípticos foram eluídos dos pedaços de gel incubando, sucessivamente, em NH4HCO3 25 mM e, depois, duas vezes em ácido fórmico 5%, cada um durante 15 minutos em temperatura ambiente. Os peptídeos do digesto tríptico resultantes foram dessalinizados usando colinas de fase reversa Zip Tip μC-18 (Millipore, EUA) e eluídos diretamente com ACN 50%-ácido trifluoracético 0,1% (TFA) na placa alvo MALDI. Uma solução de matriz saturada de ácido α-ciano-4- hidroxicinâmico (CHCA) (Sigma, EUA) com ACN 33% - TFA 0,1% adicionado foi analisada por MALDI-TOF com Autoflex III (Bruker Daltonics, Bremen Alemanha) equipado com um laser SmartBeam™ (355 nm), operado nos modos positivo e reflexivo. Tipicamente, os espectros de massa foram obtidos pelo acúmulo dos espectros de 2000 disparos de laser e até 10000, para os espectros de MS/MS. A calibração externa foi realizada para atribuições moleculares usando um padrão de calibração de peptídeo (Bruker Daltonik GmbH, Leipzig, Alemanha). As massas de peptídeo autolítico de tripsina foram usadas para verificar ou corrigir a calibração. Esses peptídeos autolíticos e aqueles derivados com queratina, quando presentes, foram removidos antes do envio da pesquisa. As identificações das proteínas foram realizadas combinando os arquivos (PMF e alguns espectros do tipo Lift (MSMS) originários da mesma mancha) e foram buscados contra o banco de dados SwissProt. Outras bactérias foram selecionadas no campo da taxonomia (mais de 42100 sequências) usando Mascot da Matrix Science (Matrix Science Ltd, Reino Unido). Os softwares FlexAnalysis™ v 3.0 e Biotools™ v 3.1 (Bruker Daltonics) foram usados para atribuir massas isotópicas moleculares aos picos nos espectros de MS e como interface de motor de busca entre a transferência de dados da lisa de massas e os bancos de dados no servidor Mascot, respectivamente. Os parâmetros a seguir foram definidos para as buscas: tolerância de precursor de 0,1 Da e tolerância de fragmento de 0,5 ou 1 Da MS/MS para pesquisas de MS e MS/MS combinadas, modificações fixas e variáveis foram consideradas (cisteína carbamidometilada e metionina oxidada, respectivamente), com uma clivagem de tripsina perdida sendo permitida. As identificações das proteínas foram adicionalmente avaliadas comparando as massas moleculares calculadas e observadas, bem como a qualidade dos espectros de massa MS/MS e suas sequências de aminoácidos correspondentes aos peptídeos identificados.
[0080] 192 pacientes de clínicas odontológicas de saúde pública selecionados aleatoriamente participaram deste estudo transversal. O protocolo de estudo foi apresentado em detalhes por Leppilahti JM et al. (2011). Concisamente, o exame oral compreendeu as medições das profundidades da sondagem dos bolsos (PPD) por uma sonda Florida e da hemorragia na sondagem (BOP) feita por dois dentistas gerais calibrados. As características basais foram gravadas por questionários e amostras de enxágue oral foram coletadas de todos os pacientes. Todos os pacientes forneceram um consentimento informado, e o protocolo de estudo foi aceito pelos comitês de ética do Instituto de Odontologia da Universidade de Helsinki e pelo Hospital Central da Universidade de Helsinki.
[0081] Os pacientes do estudo foram classificados em quatro grupos com base em seu nível de carga inflamatória periodontal, combinando o Índice de carga inflamatória periodontal (Lindy O et al. 2008) e o BOP (Leppilahti JM et al. 2011). Os grupos de pacientes formados foram 1) 31 indivíduos periodontalmente saudáveis sem bolsos periodontais aprofundados (> 4 mm) e BOP < 10 (Grupo 1), 2) 17 pacientes com BOP > 10%, mas sem bolsos periodontais aprofundados em relação a ter carga inflamatória periodontal leve (Grupo 2), 3) 97 pacientes com PIBI x BOP < 100 (nível e carga inflamatória periodontal moderada; Grupo 3) e 4) 47 pacientes com PIBI x BOP > 100 (forte nível de inflamação periodontal; Grupo 4).
[0082] Por meio de uma pipeta de plástico descartável, 1 ml de água da torneira foi colocado na boca do paciente e, depois de 1 min de enxágue, o enxágue foi coletado em um tubo. A amostra foi imediatamente congelada para análises posteriores (Leppilahti JM et al. 2011).
[0083] Após o descongelamento, amostras de enxágue bucal foram analisadas quanto aos níveis de MMP-8 por um ensaio de imunofluorescência de tempo resolvido, (IFMA) conforme descrito por Hanemaaijer R et al. (1997). Em suma, os anticorpos específicos do fragmento de MMP-8 monoclonal 1491-E6-F7 e 1492-B3-C11 foram usados como um anticorpo de captura e um anticorpo marcador, respectivamente. O anticorpo marcador foi marcado usando quelato de európio (Hemmila et al. 1984, Europium as a label in time-resolved immunofluorometric assays. Anal Biochem 137: 335343). O tampão de ensaio continha Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), NaCl 0,5 M, CaCl2 5 mM, ZnCb 50 μM, albumina de soro bovino 0,5%, azida de sódio 0,05% e DTPA 20 mg/litro. As amostras foram diluídas em tampão de ensaio e incubadas durante uma hora, seguido por incubação durante uma hora com o anticorpo marcador. A solução de reforço foi adicionada e, depois de 5 min, a fluorescência foi medida usando um fluorímetro de pesquisa Delfia 1234 (Wallac, Turku, Finlândia).
[0084] Os níveis de MMP-8 das amostras de enxágue oral também foram analisados pelo método IEMA descrito acima. Além disso, as amostras foram analisadas usando Western immunoblotting, conforme descrito acima, utilizando o anticorpo marcador (1492-B3-C11) do método IFMA para a identificação de diferentes formas moleculares (21, 25, 35, 45, 55 e 60 a 70 KDa) de MMP-8 por análise de varredura de imagem.
[0085] A prevalência de diferentes formas moleculares da MMP-8 e de proporções da MMP-8 total foram analisadas a partir de imagens digitalizada e calculada para todos os pacientes. Os níveis de MMP-8 IFMA e IEMA, a quantidade absoluta de cada forma molecular de MMP-8 e suas proporções, bem como combinações, foram comparados pelos testes não paramétricos (teste de Mann-Whitney para comparações pareadas, teste de Kruskall-Walllis para vários grupos e teste de Joncheere-Terpstra para tendências em alternativas ordenadas) entre diferentes grupos de estudo e entre fumantes e não fumantes. A prevalência/expressão de diferentes espécies de KDa de MMP-8 em diferentes grupos de estudo foram analisadas pelo teste Chi-quadrado.
[0086] As seguintes regressões logísticas foram realizadas como sendo não ajustadas e multiajustadas: 1) associação dos níveis de IFMA e IEMA com prevalência de diferentes espécies de KDa de MMP-8 (variáveis dependentes); na análise de regressão logística multiajustada do número de dentes, BOP e números de bolsos de 4 a 5 mm e > 6 mm, como variável contínua e de fumantes, como variável dicotômica (Sim/Não), 2) Associação de prevalência, proporção e unidades absolutas de digitalização das espécies de KDa de MMP-8 e suas combinações com níveis elevados de IFMA e IEMA (> IFMA ou IEMA mediano, considerando o n do nível de dentes do grupo 4 com forte carga inflamatória periodontal); no modelo multiajustado BOP e números dos bolsos de 4 a 5 mm e > de 6 mm como variáveis contínuas, e fumantes como variável dicotômica (Sim/Não), 3) Associação das espécies de KDa de MMP-8 com forte nível de carga inflamatória periodontal (Grupo 4); no modelo multiajustado BOP e números de bolsos 4 a 5 mm e > de 6 mm como variáveis contínuas e fumantes como variáveis dicotômicas (Sim/não), 4) Associação de espécies de KDa de MMP-8 com fumantes; no modelo multiajustado n de dentes, BOP, n de 4 a 5 mm e bolsos com > de 6 mm, como variáveis contínuas.
[0087] Um modelo para o reconhecimento de pacientes com forte carga inflamatória periodontal foi feito por meio da análise de regressão logística passo a passo. Os níveis de IFMA e IEMA (com n de dentes considerados), BOP e status de tabagismo (Sim/não), juntamente com a prevalência, quantidades absolutas e proporções de espécies de 21, 25 e 35 KDa da MMP-8, uma a uma, em como combinações, foram testados.
[0088] A análise do receptor das características dos operadores (ROC) foi realizada para avaliar a sensibilidade e a especificidade do diagnóstico dos níveis de IFMA e IEMA de MMP-8, e a prevalência das espécies de 25 + 35 KDa nos grupos de estudo.
[0089] Valores de P < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. As análises estatísticas foram feitas pelo SPSS Statistics da IBM, versão 20.
[0090] A Tabela 1 mostra as características dos quatro grupos de estudo com base na carga inflamatória periodontal. Nos grupos 1 e 2, havia apenas 4 (12,9%) e 3 (17,6%) fumantes, todos eles fumando < 10 cigarros/dia. Nos grupos 3 e 4, o tabagismo era mais usual [20 (20,6%) e 23 (48,9%) respectivamente], e 10 pacientes (50%) nos grupos 3 e 17 (73,9%) no grupo 4 fumavam > 10 cigarros/dia. O número de pacientes do sexo masculino aumentou com o aumento da carga inflamatória periodontal (p = 0,011). Tabela 1. Características dos grupos de estudo (Grupos 1 a 4)
* Teste qui-quadrado ** teste de ANOVA § teste de Kruskall-Wallis Prevalência, quantidades absolutas e proporções das espécies de kDa da MMP-8
[0091] A porcentagem da prevalência e dos níveis medianos (IQR) das quantidades absolutas (unidades de varredura) e proporções das diferentes espécies de KDa da MMP-8 são apresentadas para todos os grupos de estudo na tabela 3. A prevalência e as quantidades absolutas dessas formas moleculares da MMP-8, que mostraram diferenças significativas entre todos os grupos de estudo, ou seja, das espécies de 25 e 35 KDa, são adicionalmente apresentadas na tabela 2, calculadas separadamente para fumantes e não fumantes.
[0092] No grupo 4, tanto a prevalência como a quantidade absoluta das espécies de 25, 35 e 25 + 35 KDa foram significativamente maiores entre os fumantes. A prevalência das espécies de 25 KDa diferiu significativamente entre todos os grupos (p = 0,025) e as prevalências de 25 + 35 KDa entre os fumantes (p = 0,011) e não fumantes (p = 0,046) foram maiores no grupo 4. Entre os não fumantes, a quantidade total das espécies de 35 kDa diferiu significativamente entre todos os grupos de estudo. Quando as diferenças foram analisadas entre os grupos 1 a 3 combinados e o grupo 4, no grupo 4, a prevalência de fumantes das espécies de 25, 35 e 25 + 35 KDa foi significativamente maior (respectivamente, valores de p de 0,011, 0,038 e 0,005). Tabela 2. Prevalência e quantidades absolutas de espécies de 25 e 35 KDa de MMP-8 para fumantes e não fumantes nos grupos de estudo 1 a 4. Valores de P para a prevalência por qui-quadrado de Pearson; para quantidades absolutas pelo teste de Kruskal-Wallis (vários grupos independentes) e pelo teste de Mann-Whitney (dois grupos independentes) Tabela 3. Prevalência, unidades absolutas de digitalização e proporções das formas moleculares de KDa de MMP-8 nos grupos 1 a 4. As figuras, referindo-se às diferenças significativas através dos grupos 1 a 4, estão em negrito [para prevalência das espécies de 35 kDa (p = 0,031), 25 kDa (p = 0,006) e 25 + 35 KDa (p = 0,002) (teste Chi-quadrado); para a quantidade absoluta das espécies de 35 KDa (p = 0,042) (teste de Ruskall-Wallis)]. Tabela 4. Níveis da mediana de MMP-8 (IQR) analisados por IFMA e IEMA para todos os grupos de estudo e quando o número de dentes e status de tabagismo são levados em consideração. NF não fumante, F fumante. *Teste de Kruskall-Wallis através dos grupos 1 a 4 **Teste de Mann-Whitney entre os grupos combinados 1 a 3 vs. Grupo 4 §Teste de Joncheere-Terpstra através dos grupos 1 a 4
[0093] A correlação entre os resultados das análises de IFMA e IEMA foi muito bom (coeficiente de correlação de Pearson igual a 0,954, significante ao nível de p < 0,01). Coeficiente de correlação de Pearson entre as análises de IFMA atual e anterior (Leppilahti et al. 2011) foi 0,627 significativa no nível de p < 0,01.
[0094] A tabela 4 apresenta os níveis de MMP-8 analisados por IFMA e IEMA para todos os grupos de estudo, e quando o número de dentes e status de tabagismo foram levados em consideração. Houve uma tendência significativa através dos grupos 1 a 4 para aumentar os níveis de MMP-8 por IFMA quando foi testado para alternativas ordenadas (p = 0,035), e para IEMA, uma tendência alcançando a significância (p = 0,058). Quando o número de dentes foi considerado, a tendência tanto para o IFMA como para o IEMA foi significativa (p = 0,016 e p = 0,025, respectivamente) através dos grupos 1 a 4. Quando os níveis do grupo 4 foram comparados com os níveis dos grupos 1 a 3, todas as comparações forneceram resultados significativos com valores de p iguais a 0,035, 0,033, 0,013 e 0,011. Os níveis entre os grupos 1 a 3 foram semelhantes (valores de p de 0,643, 0,822, 0,647 e 0,816, respectivamente).
[0095] Quando o tabagismo foi levado em consideração, a tendência se tornou mais forte para não fumantes: IFMA, p = 0,020 e, para IEMA, p = 0,038, e quando também o número de dentes foi considerado para IFMA, p = 0,010 e, para IEMA, p = 0,028 (tabela 4, figura 1). Não foi encontrada nenhuma tendência significativa para fumantes. Quando os níveis de fumantes e não fumantes do grupo 4, considerando o n de dentes, foram comparados com os níveis dos fumantes e não fumantes dos grupos 1 a 3, os níveis de IFMA e de IEMA dos pacientes do grupo 4 foram significativamente maiores do que os dos outros grupos de estudo (valores de p, respectivamente, de 0,009 e 0,013). No entanto, quando os indivíduos do estudo nos grupos 3 e 4 foram divididos em não fumantes, os pacientes fumando < 10 cigarros/dia ou > 10 cigarros/dia, embora nenhuma significância estatística tenha ido encontrada, a distribuição em fumantes de > de 10/dia foi maior do que em pacientes fumantes de < de 10/dia, e semelhante aos não fumantes, especialmente no grupo 4 (figura 1).
[0096] Os níveis de IFMA e IEMA em relação às diferentes espécies de kDa de MMP-8 estavam em níveis significativamente mais altos nos pacientes positivos para as espécies de 21 KDa de MMP-8 (valores de p respectivos de 0,011 e 0,003; para não fumantes, 0,005 e 0,002; para os fumantes, a diferença não foi significativa). No entanto, o tabagismo não teve nenhum efeito significativo na prevalência das espécies de 21 KDa.
[0097] Na análise de regressão logística multiajustada , os níveis de IFMA e IEMA associados com a prevalência dos fragmentos de 21 kDa (para IFMA, OR = 1, 95% de IC de 1 a 1,001, p = 0,008; para IEMA OR = 1, 95% de IC de 1 a 1,001, p = 0,004) e fragmentos combinados de 21 com 25 kDa (para IFMA OR = 1, 95% de IC de 1 a 1,001, p = 0,002; para IEMA OR = 1, 95% de IC de 1 a 1,001, p = 0,001) e juntamente com as espécies de fragmentos de 25 e 35 KDa (21 a 35 KDa) (para o IFMA OR = 1, 95% de IC de 1 a 1,001, p = 0,002; para IEMA OR = 1, 95% de IC de 1 a 1,001, p = 0,001), mas não com a prevalência de espécies de 25 e 35 KDa individualmente. Da mesma forma, a combinação de espécies de 21 + 45 KDa associadas com os níveis de IFMA e IEMA na análise de regressão logística não ajustada (para tanto OR = 1, com 95% de IC, de 1 a 1.001, p = 0,028). Das outras covariáveis nas análises de regressão logística multiajustadas, o tabagismo foi associado significativamente com as espécies de fragmentos de 25, 35, 25 + 35, e 21 + 35 KDa, e BOP com as espécies de fragmentos de 45, 21 + 45, 21 - 45, 25 + 45 e 35 + 45 KDa, tanto quando o IFMA como o IEMA eram covariantes.
[0098] Além disso, a associação de prevalência, a proporção de unidades absolutas de digitalização e totais das espécies de fragmentos de KDa de MMP-8 e suas combinações com níveis elevados de IFMA (> que o nível mediano do grupo 4, considerando o n de dentes), foram analisadas. Quantidades absolutas (valores de p para a análise de regressão multiajustada entre parênteses) de 21 KDa (p = 0,011), 25 KDa (p = 0,050), 21 + 25 KDa (p = 0,011), 21 + 35 KDa (p = 0,006), 21 + K5 kDa (p = 0,012), 21 a 35 KDa (p = 0,009) e 21 a 45 KDa (p = 0,010) e a quantidade total de MMP-8 (p = 0,010) associada com os altos níveis de IFMA (Figura 2A) em ambas as análises de regressão não ajustado e multiajustada.
[0099] Testes semelhantes foram feitos para os altos níveis de IEMA; as quantidades totais de análise de regressão multiajustada de 21 KDa (p = 0,013), 25 KDa (p = 0,044), 21 + 25 KDa (p = 0,011), 21 + 35 KDa (p = 0,006), 21 + 45 KDa (p = 0,014), 21 - 35 KDa (p = 0,007) e 21 - 45 KDa (p = 0,008), e MMP-8 total (p = 0,007) foram significativas.
[00100] A prevalência das espécies de 25 e 35 KDa foram análises para indivíduos positivos e negativos para as espécies de 21 KDa. Quando todos os indivíduos do estudo foram analisados juntos, a prevalência de fragmentos de 35 KDa foram significativamente maiores em pacientes positivos para os fragmentos de 21 KDa (89,6%) do que em pacientes negativos (56,5%) (p < 0,001). Foram encontradas diferenças significativas para as espécies de 25 KDa no grupo 3, com 88,3%/44,3% quando as espécies de 21 KDa eram positivas/negativas (p < 0,001); no grupo 4, os respectivos valores para as espécies de 35 KDa foram 94,7/71,4% (p = 0,046) e para as espécies de 25 KDa, foram 100%/71,4% (p = 0,011) quando as espécies de 21 KDa eram positivas/negativas.
[00101] Nas análises não ajustadas, a prevalência das espécies de 25 KDa (OR 2,566, 95% de IC, de 1,114 a 5,909, p = 0,027), 25 + 35 KDa (OR 2,586, 95% de IC, de 1,221 a 5.477, p = 0,013) e de 21 - 45 KDa (OR 3,10, 95% de IC, de 1,121 a 8,568, p = 0,029) foi significativamente associada com a forte carga inflamatória periodontal (Grupo 4). No entanto, a associação não foi significativa em análises multiajustadas (combinação das espécies de 25 + 35 KDa alcançando significância, p = 0,053).
[00102] Ambos os níveis de IFMA e IEMA associados ao Grupo 4 apresentaram forte carga inflamatória periodontal nas análises não ajustadas; para o IFMA OR 1, 95% de IC, de 1,0 a 1,001, p = 0,029 e para IEMA OR 1, 95% de IC, de 1,0 a 1,001, p = 0,046.
[00103] Em vez disso, as covariáveis % de BOP e tabagismo foram fortemente associadas com o Grupo 4, com grande carga inflamatória periodontal com valores de p < 0,001% para % de BOP e < 0,001 a 0,002 para o tabagismo em todas as análises.
[00104] A prevalência de espécies de MMP-8 de 35 e 25 + 35 KDa foi significativamente associada tanto na análise de regressão logística ajustada como não ajustada, com os respectivos valores de p de 0,033 e 0,008 no modelo multiajustado. As espécies de 45 KDa não foram significativas na análise não ajustada, mas no modelo ajustado, apareceram como protetoras (p = 0,033) (Figura 3B).
[00105] Da mesma forma, a proporção de fragmentos de 35 KDa (p < 0,001), bem como as proporções das combinações das espécies de 25 + 35 (p < 0,001), 25 - 45 (0,003), 35 + 45 (0,010), 21 - 45 (p = 0,012) e 21 + 35 (p = 0,002) associadas com o tabagismo (Figura 3C) (respectivos valores de p do modelo multiajustado entre parênteses, após cada espécie de MMP-8 mencionada). A quantidade absoluta de qualquer espécie de MMP-8 não se associou significativamente com o tabagismo. O número de bolsos de 4 a 5 mm se associou significativamente com o tabagismo em todas as análises de regressão multiajustadas.
[00106] Em todos os indivíduos do estudo, a prevalência das espécies de 45 KDa foi maior para os pacientes com BOP > 25% do que com o BOP < 25% (p = 0,003, Qui-quadrado). A diferença também foi estatisticamente significativa para a quantidade absoluta do tipo 45 KDa (p = 0,002) e em não fumantes (p = 0,001). No entanto, o sangramento na prevalência da sondagem > 25% no grupo 1 foi 0, nos grupos de 2 e 3, 9,1% para ambos, e no grupo 4, 81,8%. Assim, a maioria dos BOP > 25% dos casos pertenceu principalmente ao grupo 4. No grupo 4, a quantidade absoluta, a prevalência e a proporção de espécies de 45 KDa foi significativamente maior (valor de p 0,009, 0,022 e 0,037, respectivamente) no BOP > 25% do que o BOP < 25% dos pacientes. Não foi encontrada nenhuma diferença significativa entre os fumantes do grupo 4 e os não fumantes.
[00107] Na análise de regressão logística não ajustada, a prevalência da MMP-8 tipo 45 KDa foi associada com % de BOP > 25% com OR 3,66, IC de 95%, de 1,523 a 8,797, p = 0,004. Na análise de regressão logística multiajustada, a prevalência do tipo 45 KDa foi associada com BOB > 25% com OR 3,36, IC de 95%, de 1,309 a 8,634, p = 0,012. As outras covariáveis não foram significativas. Nenhuma outra forma molecular de MMP-8 se associou com BOP > 25%.
[00108] Pela análise de regressão logística passo a passo forward, um modelo para o reconhecimento de pacientes com forte carga inflamatória periodontal (Grupo 4) das amostras de enxágue oral foi realizado. Juntamente com IFMA e IEMA (com n de dentes considerados), BOP e prevalência do status de tabagismo (Sim/Não), as quantidades absolutas e as proporções das espécies de 21, 25 e 35 KDa da MMP-8, foram, individualmente e em combinação, testadas. O melhor modelo foi a combinação da % de BOP, do status de tabagismo juntamente com a prevalência das espécies de 25 + 35 KDa, com os respectivos valores de p < 0,001, 0,006 e 0,044.
[00109] A análise do receptor das características dos operadores (ROC) foi realizada para avaliar a sensibilidade e a especificidade do diagnóstico dos níveis de IFMA e IEMA de MMP-8, e a prevalência das espécies de 25 + 35 KDa nos grupos de estudo. A distinção foi significativa para o IFMA, IEMA e as espécies de 25 + 35 KDa para o grupo 4, como variável de estado (Figura 4). Para IFMA no grupo 4, a área sob a curva ROC foi igual a 0,602, com 95% de intervalo de confiança (IC), de 0,507 a 0,698 e valor de p 0,035; para IEMA, a área sob a curva ROC foi 0,604, com 95% de IC, de 0,510 a 0,697 e valor de p 0,033; para as espécies de 25 + 35 KDa, a área sob a curva ROC foi 0,604, com 95% de IC, de 0,514 a 0,693 e valor de p 0,033; para a % de BOP, a área sob a curva ROC foi 0,880, com 95% de IC, de 0,832 a 0,928 e valor de p 0,025. A análise ROC revelou que os produtos de ativação de MMP-8, de 25 + 35 KDa, juntamente com a análise de IFMA e IEMA, identificou os pacientes com periodontite diferenciando-se claramente das espécies de MMP-8, de 55 a 70 KDa, que não fizeram isso.
[00110] Uma análise de SDS-PAGE (10%) foi realizada de acordo com Kiili M et al. (2002).
[00111] As quantidades de rhMMP-8 e dos tempos de incubação estão indicadas na figura 4. A figura 4a mostra os efeitos de APMA organomercúrio e a figura 4B mostra os efeitos dos ativadores de NaOCl oxidativos na MMP-8 recombinante humana (Proteaimmun). Tanto a APMA como o NaOCl induzem a geração de espécies de MMP-8 de baixo peso molecular após a ativação. A formação dependente do tempo do fragmento de ativação de 20 a 30 KDa está indicada por uma seta.
[00112] A análise de Western immunoblot foi realizada usando o método de Western immunoblotting descrito acima. A figura 4C mostra a análise de Western immunoblot usando o anticorpo anti-MMP-8 1491-E6-F7- monclonal de rhMMP-8 ativado (antígeno MMP-8 de Proteaimmun, Merck e Invent) por APMA e NaOCl e diferentes fluidos corporais humanos, bem como soro.
[00113] Amostras de fluido de fenda gengival de periodontite humana (GCF); fluido sulcular de peri-implantite humana (PISF); GCF de dente ortodonticamente tratado humano; saliva de periodontite humana; enxágue bucal de periodontite humana; amostras infectadas de líquido amniótico humano; líquido cefalorraquidiano de meningite humano e soro de sepse humano foram usados nas raias 10 a 17, como indicado abaixo. Raia 1: rMMP-8 da Proteaimmun; Raia 2: como a raia 1 mais APMA; Raia 3: como a raia 1 mais NaOCl; Raia 4: rh MMP-8 da Merck; Raia 5: como a raia 4 mais APMA; Raia 6: como a raia 4 mais NaOCl; Raia 7: Antígeno MMP-8 da Invent; Raia 8: como a raia 7 mais APMA; Raia 9: como a raia 7 mais NaOCl; Raia 10: fluido de fenda gengival de periodontite humana (GCF); Raia 11: fluido sulcular de peri-implantite humana (PISF); Raia 12: GCF de dente ortodonticamente tratado humano; Raia 13: saliva de periodontite humana; Raia 14: enxágue bucal de periodontite humana; Raia 15: líquido amniótico humano infectado; Raia 16: líquido cefalorraquidiano de meningite humano; Raia 17: soro de sepse humano.
[00114] O fragmento de 20 a 30 KDa prevalente formado após a ativação da MMP-8 está indicado pela seta.
[00115] Uma análise de Western immunoblot foi realizada usando o método de Western immunoblotting descrito acima usando amostras de líquido amniótico não infectadas (#16) e infectadas (#12, #13 e #19). As diferentes amostras e as diferentes concentrações de MMP-8 avaliadas com IFMA utilizadas para a análise são mostradas abaixo para cada raia. Os géis utilizados foram de 11%. Os testes foram realizados usando três diferentes anticorpos, os anticorpos específicos de MMP-8 monoclonais 1491-E6-F7 (7) e 1492-B3-C11 (4) (Medix Biochemica, Kauniainen, Finlândia) e um anticorpo policlonal (3) (Lauhio A et al., 1994). Em outro aspecto, as raias são iguais para todos os anticorpos utilizados, mas não há nada amostras na raia 8 e 10 para o anti-MMP-8 policlonal. Os resultados são mostrados na figura 5. Os níveis de fragmentos MMP-8, de 25 KDa + 35 KDa, foram correlacionados com os níveis de MMP-8 avaliados com IFMA. Raia 1. Padrão. Raia 2. #16, 210 μg/L de MMP-8 (14 μL x 15 μg/l .)/poco Raia 3. #12, 210 μg/L de MMP-8 Raia 4. #12, 2000 μg/L de MMP-8 Raia 5. #12, 40000 μg/L de MMP-8 Raia 6. #12, 76160 μg/L de MMP-8 (14 μL x 5440 μg/lj/poco Raia 7. #13, 210 μg/L de MMP-8 Raia 8. #13, 2000 μg/L de MMP-8 Raia 9. #13, 40000 μg/L de MMP-8 Raia 10. #13, 186088 μg/L de MMP-8 (14 μL x 13292 μg/lj/poco Raia 11. #19, 210 μg/L de MMP-8 Raia 12. #19, 2000 μg/L de MMP-8 Raia 13. #19, 40000 μg/L de MMP-8 Raia 14. #19, 127666 μg/L de MMP-8 (14 μL x 9119 μg/L)/poco
[00116] Uma análise de SDS-PAGE (10%) foi realizada de acordo com Kiili M et al. (2002).
[00117] A MMP-8 humana recombinante (Proteaimmun) foi ativada por APMA, e as quantidades de rhMMP-8 e dos tempos de incubação estão indicadas abaixo. As bandas usadas para o sequenciamento são mostradas na figura 6. Raia 1. 1,5 μL de peso molecular padrão (Bio-Rad) Raia 2. 2 μL de peso molecular padrão (Bio-Rad) Raia 3. 1 μL de MMP-8 (0,15 μg/μL) + 3 μL de tampão TNC (Tris- HCl 50 mM, pH 7,8: NaCl 0,2 M: CaCl2 0,75 mM) Raia 4. Vazia Raia 5. 1 μL de MMP-8 (0,15 μg/μL) + 4 μL de APMA 2 mM + 3 μL de tampão TNC, tempo de incubação de 2 h (37°C) Raia 6. Vazia Raia 7. 1 μL de MMP-8 (0,15 μg/μL) + 4 μL de APMA 2 mM + 3 μL de tampão TNC, tempo de incubação de 5,5 h (37°C)
[00118] O sequenciamento foi realizado de acordo com o método de sequenciamento descrito acima. As bandas de gel de 1 a 8 da figura 6 foram sequenciadas. O tamanho das bandas eram; Banda 2 = 32 KDa Banda 3 = 25 KDa Banda 4 = 21 KDa Banda 5 = 25 KDa Banda 6 = 21 KDa Banda 7 = 12 KDa Banda 8 = 5 KDa
[00119] As bandas 3, 4, 5 e 8 compreenderam a SEQ ID NO: 1 e as bandas 2, 3, 4, 5 e 6 compreenderam a SEQ ID NO: 2. A banda 7 identificou outros fragmentos de MMP-8. Nenhum fragmento de MMP-8 foi identificado na banda 1. Os produtos de ativação de MMP-8 das bandas 3, 4 e 5 compreenderam tanto a SEQ ID NO: 1 como a SEQ ID NO: 2. Os aminoácidos 119 a 132 da SEQ ID NO: 1 e os aminoácidos 151 a 165 da SEQ ID NO: 2 foram derivados do domínio da região do meio da sequência de MMP-8 total.
[00120] Uma análise de SDS PAGE e uma análise de Western Blot foram realizadas em aMMP-8 humana purificada extraída a partir da placenta humana com os anticorpos monoclonais usados nos exemplos 2 e 3 para mostrar os fragmentos.
[00121] O anti-hMMP-8-Ab (anti-hMMP8 de camundongo MoAB 1491-E6-F7 (Medix Biochemica)) se ligou à NHS-sepharose (sepharose NHS-ativada 4 de fluxo rápido (Fast Flow) (GE Healthcare)) para as colunas de cromatografia por afinidade (coluna de sefarose de 30 mL (Bio Rad)). A concentração da matéria-prima da placenta (extrato de MMP-8-placenta humana (in.vent.Diagnostica)) foi realizada por concentradores centrífugos (Vivaspin® Turbo 15 e Vivaspin® 2 (Sartorius)). A cromatografia de afinidade foi realizada usando 10 mL de extrato de placenta bruta concentrado por análise (eletroforese em gel “Mini Protean 3 cell” e instrumento de blotting “Mini Trans-Blot cell” (Bio Rad)). A eluição ácida foi realizada por tampão de ácido cítrico, pH 2,2. Frações de 5 mL foram coletadas. As frações foram agrupadas e concentradas em concentradores centrífugos. A composição tampão foi ajustada (minidialisador MD 1000 (Scienova)), para obter a aMMP-8 humana purificada. SDS-PAGE (kit de marcação Pierce Silver (Thermo Scientific)) e Western Blot (membrana de PVDF Immun-Blot 0,2 μm, de 7 x 8,4 cm (Bio Rad) usando padrões de proteína Precision Plus Protein Dual Xtra (BioRad)) foram realizados. Para SDS-PAGE e WB SDS- Gels com 12% de gel de separação e 4% de gel de coleta foram utilizados.
[00122] Os resultados são mostrados na Figura 7, de SDS-PAGE, e na figura 8, de Western Blot.
[00123] O gel marcado com prata de SDS-Page exibe bandas comparáveis em todas as amostras, predominantemente, mostrando fragmentos de 10 a 15 KDa e de 20 a 35 KDa, juntamente com os fragmentos até então conhecidos acima de 35 KDa. As bandas de Western Blot circuladas eram relativamente fracas, no entanto, elas podiam ser vistas no blot original. As bandas de 75 e 25 KDa marcadas com “*” do marcador de peso molecular são vermelhas e claramente visíveis no blot original. A imunomarcação amplifica as espécies de 10 a 15 KDa e também marca os fragmentos de 20 a 35 KDa nas amostras de maior concentração.
[00124] Os resultados se correlacionam e confirmam os resultados mostrados nos exemplos 2 e 3. REFERÊNCIAS Dejonckheere E. et al., Matrix metalloproteinase-8 has a central role in inflammatory disorders and cancer progression, Cytokine & Growth Factor Reviews 22: 73-81, 2011. Hanemaaijer et al., Matrix Metalloproteniase-8 is expressed in rheumatoid synovial fibroblasts and endothelial cells. Regulation by tumor necrosis factor-a and doxycycline, J. Biol Chem. 278: 40967-40972, 1997. Hemmila et al., Europium as a label in time-resolved immunofluorometric assays. Anal Biochem 137: 335-343, 1984. Holtfreter B. et al., Prevalence of periodontal disease and treatment demands based on a German dental survey (DMS IV), Journal of Clinical Periodontology Volume 37, 3° edição, páginas 211 a 219, Março de 2010. Kiili M et al., Collagenase-2 (MMP-8) and collagenase-3 (MMP-13) in adult perodontitis: molecular forms and levels in ginival crevicular fluid and immunolocalisation in gingival tissue, J. Clin. Periodontal, 29: 224-232, 2002. Lauhio A et al., In vivo inhibition of human neutrophil collagenase (MMP-8) activity during long-term combination therapy of doxycycline and nonsteroidal antiinflammatory drugs (NSAID) in acute reactive arthritis, Clin. Exp. Immunol., 98: 21-28, 1994. Leppilahti JM et al., Oral rinse MMP-8 point-of-care immune test identifies patients with strong periodontal inflammatory burden, Oral Dis. 17: 115-122, 2011. Lindy O et al., Statin use is associated with fewer periodontal lesioins: A retrospective study, BMC Oral Health 15; 8: 16, 2008. Ma J, et al., Collagenases in different categories of peri-implant vertical bone loss. J Dent Res; 79: 1870-1873, 2000. Turunen et al., Recognition of Porphyromonas gingivalis Gingipain Epitopes by Natural IgM Binding to Malondialaldehyde Modified Low-Density Lipoprotein. PluS ONE 7(4): e34910. Doi: 10.1371/journal.pone.0034910, 2012. Xu L et al., Characteristics of collagenase-2 from gingival crevicular fluid and peri-implant sulcular fluid in periodontitis and peri-implantitis patients. Acta Odont Scand; 66: 219-224, 2008.
Claims (12)
1. Método de determinação da ativação da MMP-8 (matriz metaloproteinase 8) em uma amostra, o método sendo caracterizado pelo fato de compreender a) fornecer uma amostra biológica previamente obtida oriunda de um indivíduo; b) detectar a presença de um ou mais produtos de ativação da MMP-8 na amostra biológica compreendendo um ou mais fragmentos de ativação da MMP-8 do domínio da região do meio da sequência da MMP-8 total e com um tamanho entre 10 e 35 KDa, em que o um ou mais produtos de ativação compreende as sequências SEQ ID NO:1 e/ou SEQ ID NO:2; c) opcionalmente correlacionar a presença do produto de ativação de MMP-8 ou a presença da MMP-8 ativa na amostra; e/ou d) opcionalmente correlacionar a presença do produto de ativação de MMP-8 com a presença de outras partes maiores da MMP-8 ativa na amostra; em que a presença do produto de ativação de MMP-8 na amostra biológica é indicativa, confirmativa e/ou preditiva para a presença da MMP-8 ativa na amostra.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o tamanho dos fragmentos ser entre 10 e 30 KDa.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o tamanho dos fragmentos ser 10 KDa, 15 KDa, 20 KDa, 25 KDa, 30 KDa ou 35 KDa.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra é da cavidade oral, fluido de fenda gengival, fluido sulcular peri-implantar, placa bucal, placa dental, enxágue bucal, lavagem bucal, saliva, fluido do canal radicular, exsudato de ferida, PUS, biofilme oral, biópsias de tecido, zaragatoas bucais e sangue das lesões orais.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra é de líquido amniótico, soro, plasma, lavagem vaginal, lavagem nasal, seio nasal, orelha, seio, urina, líquido sinovial, líquido cefalorraquidiano, fezes, zaragatoas, lágrimas, lavagem (pulmão), biópsias de tecido e/ou suor.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a presença do produto de ativação de MMP- 8 é determinada pelo uso de um sistema ligante para a detecção dos fragmentos de MMP-8 na amostra biológica, em que o sistema de ligante compreende um ou mais anticorpos, um par de anticorpos e/ou um fragmento de anticorpo.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o sistema ligante é um imunoensaio quantitativo, semiquantitativo ou qualitativos, escolhido do grupo consistindo em Western blotting, ensaio imunofluorimétrico de tempo resolvido (IFMA), ensaio imunoenzimático (EIA), ensaio imunoenzimométrico IEMA, ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), ensaio de fluxo lateral, ensaio de ressonância de plasmônio de superfície e ensaio eletroquímico.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a presença do produto de ativação de MMP- 8 é determinada pelo uso de uma tecnologia de detecção de proteína direta para detectar na amostra biológica um ou mais fragmentos de ativação de MMP-8 do domínio da região do meio da sequência de MMP-8 total.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda comparar os resultados obtidos na etapa b) com uma amostra de referência, por meio do que uma predisposição ou um risco para uma doença relacionada a níveis elevados de MMP-8 ativado ou a progressão da doença é para ser diagnosticado, em que a) a amostra de referência é derivada de um indivíduo ou de um grupo de pacientes conhecido por ter um nível normal de MMP-8, por meio do que resultados semelhantes para a amostra biológica e a amostra de referência são indicativos para o indivíduo não ter ou não ser predisposto à doença, ou não ter ou não ser predisposto a um risco de desenvolver ou progredir a doença, e por meio do que o nível elevado do produto de ativação de MMP-8 na amostra biológica, em comparação com a amostra de referência, é indicativo para o indivíduo ter a doença ou ser predisposto à doença, ou ser predisposto a ter maior risco de desenvolver ou progredir a doença; ou b) a amostra de referência é derivada de um indivíduo ou de um grupo de pacientes conhecido por ter a doença ou ser predisposto à doença, por meio do que resultados semelhantes para a amostra biológica e a amostra de referência são indicativos para o indivíduo ter ou ser predisposto à doença, ou ter ou ser predisposto a um risco de desenvolver ou progredir a doença.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a doença é inflamação periodontal, perda de tecido periodontal (degradação), gengivite, periodontite, peri-implantite, mucosite peri-implante, perda dentária, remissão de implante dentário, perda óssea alveolar, mucosite, alterações da membrana mucosa, inflamações periodontais apicais, inflamação do canal radicular, cáries, rupturas do osso maxilar vertical, movimento ortodôntico do dente, reações inflamatórias alérgicas e/ou bacteremia causada por bactérias orais.
11. Método de acordo com as reivindicações 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que a presença do produto de ativação de MMP-8 é indicativa ou preditiva para doenças periodontais, tais como periodontite ou peri-implantite crônica ou aguda, e essas doenças orais são indicativas, intensificadoras ou um fator de risco conhecido para doenças ou distúrbios sistêmicos, como diabetes I, diabetes II, DPOC (doença pulmonar obstrutiva crônica), doenças reumáticas, doenças artríticas/artrite, osteoporose, doenças ortopédicas, doenças autoimunes, doenças de transplante de tecido, artrite, infecção ou doenças cardiovasculares prostéticas finais, como derrame, enfarte do miocárdio, arteriosclerose, riscos relacionados à gravidez, tais como parto prematuro, baixo peso ao nascer, riscos reprodutivos, como disfunção erétil, contagem reduzida de espermatozoides e menor mobilidade dos espermatozoides.
12. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a doença é uma doença ginecológica, como uma inflamação intra-amniótica, inflamação materna, doenças neonatais, parto prematuro, baixo peso ao nascer, patologias amnióticas; uma doença cancerosa, como malignidades, câncer de mama e leucemias; uma doença reumática/artrítica, como artrite reumatoide e artrose; uma doença diabética, incluindo todas as formas de diabetes mellitus, uma doença nefrológica, uma doença renal, um ferimento diabético não cicatrizante; uma doença ocular, como ceratocone, degeneração marginal pelúcida da córnea; doenças otolaringológicas (por exemplo ou seio nasal); uma infecção ou inflamação, como borreliose, sepse, síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS), HIV, infecção causada por H. pylori, inflamação sistêmica, inflamação sistêmica de baixo grau, infecções pulmonares e inflamações como bronquite, bronquiectasia, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), infecções/inflamações pediátricas; infecções neurológicas, inflamações e doenças como meningite, doença de Crohn; uma doença cardiovascular, tais como doenças vasculares, aterosclerose, como inflamação da placa intra-arterial, embolismos e derrame; um ferimento, como ferimentos críticos, ferimentos não cicatrizáveis e pele queimada; doenças intestinais (a partir de testes fecais); uma doença após traumas ou acidentes; e/ou síndrome metabólica e obesidade.
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