KR101731764B1 - Odam의 치주질환 바이오마커로서의 용도 - Google Patents

Abstract

본원은 ODAM 검출용 시약을 포함하는 치주질환 진단용 조성물, 키트, 방법을 개시한다. 본원에 따른 마커는 비침습적인 방법으로 간편하게 치주염을 조기에 진단할 수 있어, 치료의 방향과 정도를 예측할 수 있어 치주질환의 효과적 치료는 물론 현재 막대하게 지출되는 치주질환 치료비 감소에도 기여한다.

Description

ODAM의 치주질환 바이오마커로서의 용도 {Use of ODAM as a biomarker for periodontal disease}

본원은 치주 질환 진단용 바이오마커와 관련된 것이다.

치주질환은 치아의 플라크 축적 또는 박테리아 감염으로 인해 잇몸 및 주변 결합조직의 염증반응으로서, 서서히 진행되다가 진행된 상태에서 갑자기 증상이 나타나는 것이 특징으로 그대로 방치하게 되면 여러 치아를 한 번에 잃게 되는 심각한 침묵(silent)의 질병이다.

2012년도 국민구강건강실태조사에 의하면 우리 국민의 충치이환율은 매년 감소하고 있으나, 치주질환은 꾸준히 증가하고 있으며, 2013년도 국민건강보험공단 자료에 의하면 보험급여외래진료 다빈도 질환 순위에서 급성기관지염 다음의 2위로 치은염 및 치주질환이 차지하고 있어, 의료비가 급증하고 있는 추세이다.

하지만 치주질환도 조기 진단 및 치료를 통해 진행을 중지하거나, 이미 손상받은 치아주위 조직도 조직재생치료를 통해 회복할 수 있다.

현재 치주질환의 진단은 환자의 자각증상, 방사선 촬영 후 치주낭 탐침기를 이용하여 치주낭 깊이, 잇몸의 퇴측 정도를 측정하여 치주염 진행 정도를 파악하거나, 세균 감염 정도를 분석하는 것에 의존하고 있다.

하지만 치주질환의 효과적인 치료를 위해서는 조기 진단 및/또는 간편한 검사가 가능한 치주질환 진단 인자에 대한 개발이 필요하나 미비한 실정이다.

미국 공개공보 2008-0027146호는 V-FOS FBJ murine 골육종 바이러스 암유전자 호모로그 B, 메트릭스 메탈로프로티네아제 I 또는 III, 카스파제 10 등을 포함하는 치주질환 진단용 바이오마커를 개시한다.

미국 공개공보 2002-0012944호는 PAI-2 및 T-PA의 치주질환 마커로서의 용도를 개시한다.

하지만 치주질환의 정확한 진단 및 조기 진단을 위해서는 보다 많은 바이오마커의 개발이 필요하다.

본원은 치주낭에서 치주질환의 존재 및/또는 정도를 비침습적인 방법으로 특히 조기에 진단할 수 있는 바이오마커를 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 ODAM 마커 검출 시약을 포함하는 검체의 치주질환 진단용 조성물을 제공한다. 본원에 따른 조성물은 검체 특히 치은열구액에서 ODAM을 검출한다.

본원에 따른 조성물은 치주질환 예를 들면 치은염, 치주염 또는 임플란트 주위염의 진단에 사용될 수 있다.

본원에 따른 조성물에 포함되는 검출 시약은 본원에 따른 마커를 단백질 수준에서 검출할 수 있는 시약으로, 예를 들면 단백질 검출용 시약은 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분광분석, 또는 단백질 마이크로어레이에 사용되는 시약을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 일 구현 예에서, 본원에 따른 마커 단백질 검출용 시약은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 기질, 앱타머, 아비머, 펩티도모방체, 수용체, 리간드 또는 보조인자를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.

다른 양태에서 본원은 또한 ODAM 마커 검출 시약을 포함하는 검체의 치주질환 진단용 키트를 제공한다.

본원에 따른 키트는 ELISA 분석용, 딥스틱 래피드 키트(dip stick rapid kit) 분석용, 마이크로어레이용, 유전자증폭용, 또는 면역분석용으로 사용될 수 있다.

또 다른 양태에서 본원은 치주질환 또는 임플란트 주위염의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대상체 유래의 검체로부터 ODAM을 단백질 수준에서 검출하는 단계 및 상기 단백질의 수준에서의 검출 결과를 치주질환 또는 임플란트 주위염의 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하는, 치주질환 마커 검출방법을 제공한다. 본원에 따른 방법에서, 연관시키는 단계는 상기 결정된 마커의 검출 결과를 비교군에서 결정된 상기 각 마커에 대한 임계값과 비교하는 것이다.

본원에 따른 방법은 검체로서 치은열구액이 사용된다.

본원에 따른 방법의 일 구현 예에서, 본원의 방법은 마이크로어레이, 유전자 증폭, 항원-항체 반응, 또는 질량분석 방식으로 수행되나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본원에 따른 방법의 일 구현 예에서, 상기 연관시키는 단계는 상기 대상체의 비마커 임상정보 예를 들면 대상자의 치주낭의 깊이 측정, 출혈여부 또는 X-ray 검사와 같은 방법에 의해 수득된 결과가 추가로 사용될 수 있다.

본원에 따른 ODAM 검출용 시약을 포함하는 치주질환 진단용 조성물, 키트, 방법은 비침습적인 방법으로 간편하게 치주염을 조기에 진단할 수 있어, 치료의 방향과 정도를 예측할 수 있어 치주질환의 효과적 치료는 물론 현재 막대하게 지출되는 치주질환 치료비 감소에도 기여한다.

특히 본원 실시예를 참조하면, 본원에 따른 마커는 접합상피의 손상이 수반된 치은염, 치주염 또는 임플란트주위염의 진단에 보다 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 본원의 일 구현 예에 따른 치아와 치은(잇몸)에서 ODAM과 RhoA의 발현 시기와 위치를 보여주는 면역 염색 결과이다.
도 2는 염증이 있는 치은(잇몸) 세포에서 ODAM의 발현이 감소하고, 치은열구액에서 ODAM 발현이 확인됨을 보여주는 면역염색 결과이다.
도 3a 내지 도 3c는 치주질환 환자에서 치은열구액 채취 깊이에 따른 ODAM 농도와의 관계를 보여주는 그래프로, 탐침 포켓 깊이, 치주낭 (도 3a) (상관계수 t = 0.167*, Sig.(2-tailed)=0.0127), 포켓에서 치아-치주 세포 부착 소실 (Clinical Attachment Level, CAL) (도 3b) (상관계수 = 0.226**, Sig.(2-tailed)=0.0007), 포켓 내 출혈 (Bleeding)(도 3c)로 평가 분류한 후 각 환자로부터 채취한 치은열구액의 ODAM 농도(ng/ml)를 ELISA 방법으로 측정한 결과이다. *: 신뢰도 0.05 (2-tailed); **: 신뢰도 0.01 (2-tailed).
도 4a 내지 4b는 임플란트 시술 후 임플란트 주위의 염증을 나타내는 환자 (peri-implantitis)에서 ODAM의 농도를 측정한 것이다.

본원은 치주염 환자의 치주낭에서 ODAM의 존재를 규명한 결과에 근거한 것이다. 특히 본원에서는 ODAM이 치아 발생 과정의 접합 상피와 외과적 치주 처치 후 치아와 부착하는 구강 상피에서 강하게 발현되나, 치은염에서 발견되는 손상된 조직에서는 ODAM이 발현되지 않는 것을 규명하였다.

따라서 한 양태에서 본원은 ODAM 마커 검출 시약을 포함하는 검체의 치주질환 또는 임플란트 주위염 진단용 조성물에 관한 것이다.

ODAM (ODontogenic Ameloblast-associated protein)은 치아의 법랑모세포와 상아모세포뿐만 아니라 분비샘, 치아암, 자궁경부암 등 몇 종류의 암에서 발현이 관찰되는 단백질이나, 치주염에서의 마커로서 보고된 적은 없다.

본원에 따르면 ODAM의 세포내 발현이 높을수록 세포 부착이 증가하고, 전이 정도가 감소하는 것으로 나타났다. 또한 ODAM은 대식세포 등 액틴 링을 형성함으로서 세포 부착을 유도하는 세포의 액틴 링에서 발현하다가 감염 등 병소가 나타나는 부분에서는 세포 내 발현이 감소하는 것으로 나타났다. 하지만, 염증성 치주질환을 가진 환자의 치은열구액에 ODAM 단백질이 존재하고, 염증의 깊이가 깊을수록 더 많은 양의 ODAM 단백질이 치은열구액에 존재함을 확인하였다.

현재 치주 질환은 진행이 많이 되어 통증이 있거나 치료 시 눈으로 확연히 보일 때 치료가 가능하다. 하지만 치주염은 진행될수록 치주낭이 깊어지고 잇몸이 점점 퇴축되어, 치아에 손상을 줄 뿐만 아니라 치아주위 뼈 조직의 소실을 유발시키기 때문에 초기 치료가 중요하다. 따라서 치주질환 마커를 통해 초기에 치주질환을 확인할 수 있다면 이를 기초로 잇몸의 형태 및 높이, 치아의 건강상태, 주위 뼈 조직의 소실 예방 등 다양한 효과를 기대할 수 있다. 그런 관점에서 치아에 염증이 유발되어 상피와 치아의 접합이 상실되면 ODAM 단백질이 치은열구에 유리되므로 ODAM 단백질을 확인함으로서 정확한 치주염의 초기 진행 상태의 진단이 가능하다. 상피와 치아의 접합이 소실되었다는 것은 아래쪽에 상피를 지지하는 결합조직도 손상되었음을 의미하기 때문에 초기치주염 진행상태이다. 이어서 치주염이 진행되어 뼈를 포함한 조직 파괴가 심해지면 상피가 아래쪽으로 내려가면서 치주낭이 깊어지게 되는데 이때 상피는 비록 치아에 부착을 못하지만 계속 붙으려고 생리적으로 노력하기 때문에 ODAM 단백질을 만들고 이것이 치은열구에 유리되게 되어 결과적으로 치주질환의 진행 정도와 ODAM 단백질의 검출이 상관성을 보이게 된다. 따라서 ODAM은 초기 치주질환을 진단할 수 있는 진단 표지자로서 유용하다.

본원에서 치주병 또는 치주질환이란 잇몸 및 주변 결합조직 및 뼈의 염증반응 및/또는 퇴행을 의미하는 것으로, 예를 들면 치은염, 치주염, 임플란트 주위염을 포함하는 것이나 이로 제한되는 것은 아니다.

본원에서 임플란트 주위염이란 임플란트 시술 후 주위 뼈조직 소실과 연조직 감염을 포함한 임플란트 주위에 염증 반응이 생기는 것을 나타낸다.

본원에서는 치주낭의 깊이에 따라 ODAM의 농도가 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 본원은 치은염, 치주염 및 임플란트 주위염을 포함하는 치주질환의 진행 상태에 따른 진단이 가능하다. 치주염은 진행된 상태에 따라 초기(Early), 중기(Moderate) 및 말기(Advanced) 치주염으로 나눌 수 있으며, 초기는 탐침 시 출혈, 3 내지 4 mm 치주낭, 국소 퇴축, 부착손실 (3-4 mm), 골 손실 및 클래스 I 치근이개부 병소 중 하나 이상으로 특징된다. 중기는 탐침 시 출혈, 4 내지 6 mm 치주낭, 부착손실 (4-6 mm), 골 손실 (수평 및/또는 수직) 및 클래스 I 또는 II 치근이개부 병소 및 클래스 I 치아 흔들림 또는 크라운 대 루트의 비가 1:1 중 하나 이상으로 특징된다. 말기는 출혈, 6 mm 초과의 치주낭, 부착 손실 (6 mm 초과), 클래스 II 및/또는 III 치근이개부 병소 및 클래스 II 및/또는 III 치아 흔들림, 골 손실 (수평 및/또는 수직), 크라운 대 루트의 비가 2:1 또는 그 이상 중 하나 이상으로 특징된다.

치주염은 또한 성인 치주염 (예를 들면 플라크 관련 치주염), 조기발생 치주염(소아 치주염, 급속 진행형 치주염), 전신 질환과 관련된 치주염, 궤양성 치주염, 임플란트 주위염과 같은 하위 질환으로 구분될 수 있으며 본원에 포함된다.

치은염은 잇몸 조직의 염증, 잇몸 출혈, 위포켓(pseudopockets)과 같은 증상을 나타낸다. 치은염은 플라크 연관 치은염, 만성 치은염, 급성 치은염, 괴사궤양 치은염, 전신 질환 또는 약물 관련성 치은염(예를 들면 호르몬으로 인한 잇몸 염증, 약물로 인한 치은염, 잇몸 홍반 등), 감염성 치은염 등으로 세분화될 수 있으며, 본원에 포함된다.

본원에서 ODAM 단백질은 정상 잇몸에서 발현이 되었으나 염증이 유발된 조직에서는 검출되지 않았으며, 오히려 치은열구액에서 ODAM이 검출되었다. 이는 본 이론으로 한정하는 것은 아니지만, 손상된 세포에 존재하던 ODAM 단백질이 상피가 치아에서 떨어지면서 세포의 손상과 함께 외부로 방출된 것이 한 원인으로 생각된다.

본원에서 용어 진단은 특정 질병 또는 질환에 대하여 검사 대상자의 질환에 대한 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상자의 예후(prognosis)(예컨대, 질환의 단계 또는 진행 상태 판별 또는 치료에 대한 반응성 결정)를 판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.

본원에서 용어 바이오마커 또는 마커(diagnosis marker)란 질환이 발생한 조직 또는 세포를 정상 검체 또는 적절한 치주질환 치료를 받은 후 호전된 조직 또는 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 검체에 비하여 질환이 발생한 대상체 유래 검체에서 증가 양상을 보이는 단백질, 핵산, 또는 그 유도체이다.

본원에서 생물학적 시료 또는 검체란 바이오마커 검출이 가능한 하나 이상의 성분을 포함하는 물질 또는 물질의 혼합물을 일컫는 것으로 생물체, 특히 인간 유래의 세포, 조직, 또는 체액을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 또한, 생물체에서 직접적으로 유래된 것은 물론 인비트로에서 배양된 세포 또는 조직을 포함한다. 본원에 따른 일 구현 예에서는 치주낭의 치은열구액이 사용되었다.

본원에서 검출이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재 또는 부존재의 검출, 존재하는 양에 대한 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.

본원에서 검출 시약이란, ODAM을 단백질 또는 핵산 수준에서 특이적으로 검출할 수 있는 물질이다.

본원에서 단백질 검출용 시약은 예를 들면 웨스턴블랏, ELISA(Enzyme linked immunoabsorbent assay), 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 또는 단백질 마이크로어레이에 사용되는 시약을 포함할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 또한 표지된 비드를 기본으로 하는 시스템, 용액/현탁액 중에서 표지된 항체와의 결합 및 유세포 분석기를 통한 검출, 또는 질량분석기 등을 이용한 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 공지된 것으로 예를 들면 chip-based capillary electrophoresis: Colyer et al. 1997. J Chromatogr A. 781(1-2):271-6; mass spectroscopy: Petricoin et al. 2002. Lancet 359: 572-77; eTag systems: Chan-Hui et al. 2004. Clinical Immunology 111:162-174; microparticle-enhanced nephelometric immunoassay: Montagne et al. 1992. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 30:217-22 등을 참조할 수 있다.

본원에 따른 일 구현 예에서는 ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), RIA(Radio Immuno Assay) 등과 같은 샌드위치 방식의 면역분석법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 고상의 기질 예를 들면 글라스, 플라스틱(예를 들면 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 나이트로셀룰로스로 제작된 비드, 막, 슬라이드 또는 마이크로타이터플레이트에 결합된 제1 항체에 생물학적 시료를 추가한 후, 직접 또는 간접 검출이 가능한 표지물질 예를 들면 ³H 또는 ¹²⁵I와 같은 방사선물질, 형광물질, 화학발광물질, 햅텐, 바이오틴, 디그옥시제닌 등으로 표지되거나 또는 기질과의 작용을 통해 발색 또는 발광이 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 말레이트 데하이드로게나아제와 같은 효소와 컨쥬게이션된 항체와의 결합을 통해 단백질은 정성 또는 정량적으로 검출할 수 있다.

기타 다른 면역 반응 기반의 방법이 사용될 수 있으며 다른 구현 예에서는 항원-항체 결합을 통해 마커를 간단하게 검출할 수 있는 Ouchterlony 플레이트, 웨스턴블랏, Crossed IE, Rocket IE, Fused Rocket IE, Affinity IE와 같은 면역 전기영동(Immuno Electrophoresis)이 사용될 수 있다.

상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 예를 들면 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있다. 상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석하여 즉, 비교군 검체와의 시그널 대조를 수행함으로써, 질환의 진단 등과 연관시킬 수 있다.

상술한 방법에 사용되는 시약은 예를 들면 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 기질, 앱타머, 아비머, 펩티도모방체, 수용체, 리간드 또는 보조인자를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

일 구현 예에서 검출 시약은 본원에 따른 하나 이상의 마커에 특이적으로 결합하는 항체로, 시료 중 단백질을 정량 및/또는 정성적으로 평가가 가능하다.

다른 일 구현 예에서, 이러한 항체는 기질, 예를 들면 다중웰 플레이트의 웰 또는 유리 슬라이드의 표면 또는 나이트로셀룰로스에 부착되어 제공될 수 있다.

다른 구현 예에서, 검출 시약은 마이크로어레이를 포함하는 어레이 또는 칩의 형태로 제공될 수 있다. 유리 또는 나이트로셀룰로스와 같은 기질의 표면에 검출 시약이 부착될 수 있으며, 어레이 제조 기술은 예를 들면 Schena et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA. 93(20):10614-9; Schena et al., 1995, Science 270(5235):467-70; 및 U.S. Pat. Nos. 5,599,695, 5,556,752 또는 5,631,734를 참조할 수 있다. 어레이에 부착될 수 있는 검출 시약은 예를 들면 한 단백질에 특이적 결합이 가능한 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함한다.

검출 시약은 검출을 위해 직접적 또는 샌드위치 형태로 간접적으로 표지될 수 있다. 직접적 표지 방법의 경우, 어레이 등에 사용되는 시료는 Cy3 또는 Cy5와 같은 형광 표지로 표지된다. 샌드위치의 경우, 표지되지 않은 시료를 먼저 검출 시약이 부착된 어레이와 반응시켜 결합시킨 후, 표적 단백질을 표지된 검출 항체와 결합시켜 검출한다. 샌드위치 방식의 경우, 민감도와 특이성을 높일 수 있어, pg/mL 수준까지 검출이 가능하다. 그 외 방사능물질, 발색물질, 자기성 입자 및 고밀도 전자입자 등이 표지물질로 사용될 수 있다. 형광 광도는 스캐닝 콘포칼 현미경이 사용될 수 있으며, 예를 들면 Affymetrix, Inc. 또는 Agilent Technologies, Inc 등에서 입수할 수 있다.

다른 양태에서 본원은 또한 상술한 조성물 또는 ODAM 검출용 시약을 포함하는, 치주질환 또는 임플란트 주위염 검출용 키트에 관한 것이다.

다양한 검출 시약을 포함할 수 있는 본원의 키트는 분석 양태에 따라 ELISA 분석용, 딥스틱 래피드 키트(dip stick rapid kit) 분석용, 마이크로어레이용, 유전자 증폭용, 또는 면역 분석용 등으로 제공될 수 있으며, 분석 양태에 맞추어 적절한 검출 시약을 선별할 수 있을 것이다.

일 구현 예에서는 ELISA 또는 딥스틱 래피드 키트가 사용되며, 이 경우 본원에 따른 마커를 인식하는 항체가 기질, 예를 들면 다중웰 플레이트의 웰 또는 유리 슬라이드의 표면 또는 나이트로셀룰로스에 부착되어 제공될 수 있다. 딥스틱의 경우, POCT(Point of Care Treatment) 분야에서 널리 이용되는 기술로, 본원에 따른 바이오마커를 인식하는 하나 이상의 항체가 나이트로셀룰로스와 같은 기질에 결합되어 있고, 이를 시료와 접촉시키면 즉, 예를 들어 딥스틱의 말단을 치은열구액 시료와 접촉시키면, 시료가 모세관 현상에 의해 이동하여, 기질 중의 항체와 결합하여 발색하는 방식으로 마커를 검출하는 것이다.

본원의 키트는 추가로 분석에 필요한 하나 이상의 부가 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들면 검출에 필요한 완충액, 시료 준비에 필요한 시약, 시료 채취용 도구 또는 음성 및/또는 양성 대조군을 추가로 포함할 수 있다. 다른 양태에서 본원에 따른 바이오마커의 사용법에 관한 안내서를 추가로 포함할 수 있다.

다른 양태에서 본원은 치주질환 또는 임플란트 주위염의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대상체 유래의 검체로부터 ODAM을 핵산 또는 단백질 수준에서 검출하는 단계 및 상기 핵산 또는 단백질의 수준에서의 검출 결과를 치주질환 또는 임플란트 주위염의 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하여 치주질환 또는 임플란트 주위염 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법은 추가로 본원에 따른 마커에 대한 핵산 또는 단백질 수준 검출 결과를 정상 대조군 시료의 해당 마커에 상응하는 결과와 비교하여, 대상체 시료의 핵산 또는 단백질 수준에 변화가 있을 경우, 이를 치주질환 또는 임플란트 주위염의 진단 또는 예후와 연관시킨다.

본원에 따른 방법에서 연관시키는 단계는 상기와 같이 결정된 마커의 검출 결과를 비교군에서 결정된 상기 각 마커에 대한 임계값과 비교하는 것이다. 비교군은 치주염이 발생하지 않은 정상 대상체 또는 적절한 치료를 받아 치료가 된 대상체 유래의 시료를 포함한다.

예를 들면, 비교군에서 바이오마커의 정상범위 임계값(cutoff)을 결정하여, 질환이 의심되는 환자의 해당 마커의 값이 임계값보다 약 50% 이상 증가한 경우 치주질환 또는 임플란트 치주염 환자로 진단할 수 있다. 특히 해당 생체 표지자의 양이 임계값보다 약 2배 이상 증가한 중증도 치주질환 환자의 조기 감별진단이 가능하다. 하지만 수치는 이에 한정되는 것이 아니다.

또한 치주질환 환자 또는 임플란트 주위염 환자에서 치료 후 해당 바이오마커가 정상 범위 내로 회복되는지를 확인하여 치료 성과에 대한 판정 및 추적 관찰이 가능하다. 이러한 본원에 따른 바이오마커를 이용한 질환의 진단은 단독 또는 공지된 방법과 함께 사용될 수 있다.

본 방법에 사용되는 생물학적 시료, 바이오마커 검출 방법 및 이에 사용되는 시약은 앞서 설명한 바와 같다. 본원의 방법은 포유류 특히 인간을 대상으로 한다. 인간 대상체는 치주질환 또는 임플란트 주위염이 발병했을 것으로 의심되는 사람, 의심되지 않는 사람으로 치주질환 또는 임플란트 진단여부가 필요한 사람을 포함한다.

본원에 따른 방법은 치주질환 또는 임플란트 주위염 진단에 사용되는 비마커 임상 정보와 함께 사용될 수 있으며 예를 들면, 치주낭 깊이, 출혈여부 및/또는 X-ray 검사를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시 예를 제시한다. 그러나 하기의 실시 예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

실시 예

실험재료 및 방법

시약 및 항체 : 본 발명에서 피브로넥틴 fibronectin, laminin은 sigma에서, collagen은 Roche에서 구입하였다. ODAM 항체는 (아미노산 잔기 102-114와 241-251) 펩타이드를 합성하여 토끼에서 제작하였다. RhoA, ROCK, p-myosin, p-paxillin, paxillin, E-cadherin 항체는 cell signaling에서, active RhoA (GTP-RhoA) 항체는 Biosource에서, ARHGEF5, integrin av, integrin b6, cytokeratin, HA, E-cadherin 항체는 Santa Cruz Biotechnology에서, Flag 항체는 Sigma-Aldrich에서, F-actin 항체는 Invitrogen에서 구입하였다.

조직 시료 준비 및 면역화학조직 분석 : 동물을 사용하는 모든 실험은 서울국립대학교의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)가 승인한 프로토콜(SNU-111013-2)에 따랐다. 출생 후 16일(P16), 20일(P20), 26일(P26)의 랫 치아와 출생 후 10일(P10)의 쥐 치아를 10% EDTA(pH 7.4)에서 탈회하고, 파라핀에 포매하여, 면역조직화학분석을 진행하였다. 염증성 치주질환을 가진 환자의 치아는 임플란트를 위해 발치한 환자의 치아로서 조선대학교 치과대학으로부터 제공받았다. 1차 항원으로는 래빗 항-ODAM, RhoA, active RhoA, F-actin, 바이오틴화된 염소 항-래빗 IgG(1:200, Vector Labs)를 사용하여 ABC 킷트(Vector Labs, Burlingame, CA)로 ODAM, RhoA, active RhoA를, F-actin을 사용하여 actin을 발현하였다.

세포배양 분화 : 5%의 CO₂ 포함하는 습윤된 공기 37℃ 조건에서 배양된 2 종류 세포가 실험에 사용되었다. 생쥐 법랑모세포주는 아멜로블래스트-리니지 셀(ALC, provided by Dr. T. Sugiyama, Akita Medical School, 일본)를 이용하였고, ALC는 5% 열 불활성화된 소의 혈청(FBS)이 첨가된 MEM 배지에 상피성장인자(epithelial growth factor)(EGF, 50 ng/ml, R&D systems, Minneapolis, MN, 미국)를 첨가하여 콜라젠이 코팅된 접시에 배양하였다. HAT7 (애피컬 버드 세포, apical bud cells)은 Dr. Harada H (Department of Oral Anatomy II, Iwate Medical College School of Dentistry, Morioka, Japan)에게서 제공받았고, 10% 열 불활성화된 소의 혈청(FBS)이 첨가된 DMEM/F12 배지에서 배양하였다. ALC와 HAT7 세포는 실험 목적에 따라 fibronectin, laminin, collage이 코팅된 배양 플레이트에서 배양하였다. RAW264.7 (파골세포)는 10% 열 불활성화된 소의 혈청(FBS)이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 골수 유래 대식세포는 10% 열 불활성화된 소의 혈청(FBS)이 첨가된 a-MEM 배지에서 배양하였다.

세포가 80-90% 컨플루언스에 이르렀을 때, 50 ㎍/ml 아스코르브산(ascorbic acid), 10 mM 베타-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate)를 포함한 분화배지를 이용하여 2주간 분화시켰다.

웨스턴 분석 : 총세포 추출물을 제조하기 위하여, 상기 세포를 PBS로 세 번 세척하여 1.5 ml 튜브 내에 스크랩한 후 4℃에서 2분간 12,000rpm에서 원심분리하여 펠렛으로 하였다. 상층액을 제거한 후 상기 펠렛을 용해 버퍼(50 mM Tris-Cl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 2 mM EDTA, pH 7.4)에 재현탁시켜 얼음에서 15분간 배양하였다. 세포 잔해는 원심분리로 제거하였다. 10% 소디움 오데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)로 30 마이크로그램 단백질을 분리하여 니트로셀룰로오스 멤브레인에 트랜스퍼하였다. 0.1% Tween 20 (PBS-T)를 함유하는 PBS내의 5% 탈지 분유로 1시간 동안 멤브레인을 블락하고, 4℃에서 PBS-T (1:1000)에 희석된 1차 항체와 함께 밤새 배양하였다. 세척후, 과산화효소(horseradish peroxidase)가 컨쥬게이트(1:5000)된 항-마우스(sc-2031), 항-래빗(sc-2004), 또는 항-염소(sc-2768) IgG 2차 항원(전부 Santa Cruze Biotechnology 에서 구입)와 함께 상기 멤브레인을 1시간 동안 배양하였다. 라벨된 단백질 밴드는 증강된 화학 발광 시스템(GE Healthcare, UK)을 사용하여 탐지하였고, 상기 벤드는 상기 디벨롭프된 자기방사 필름의 농도 분석으로 측정하였다.

유전자 발현 프로파일링 : 유전자 프로 파일링은 유전적 치은섬유종증, Integrin b6 유전자 결손 쥐, 구강 병원균 감염 반응에 치은(잇몸) 상피 세포를 이용한 mRNA 마이크로 어레이 데이터 베이스를 이용하여 분석하였다. 마이크로 어레이 데이터는 NCBI의 GEO 데이터베이스 (accession number GSE4250, GSE2255, GSE9723)에서 다운로드 받아 분석하였다.

환자 샘플 채취 : 인간을 이용한 모든 실험은 고려대학교(IRB No. ED13162)와 서울대학교 분당병원 (IRB No.B-1410-271-003)의 IRBHS(Institutional Review Board for Human Subjects)가 승인한 프로토콜에 따랐다. 4명의 건강한 환자와 10명의 치주질환 환자의 치주 조사는 염증의 유무에 따른 ODAM의 발현 정도를 평가하였으며, 4명의 치주질환 환자의 치주 조사는 한 환자당 10개 이상의 치아, 치아 당 4군데 부위에서 시료를 채취하여 총 222개 부위에서 치주낭 정도 평가, 플라크 정도 평가, 탐침 포켓 깊이, 포켓에서 치아-치주 세포 부착 소실, 포켓내 출혈을 평가로 이루어졌다. 치주환자의 치은 연상 치태를 핸드 큐렛으로 제거하고 압축된 공기로 10초 정도 건조 시킨 후 흡수지스트립(absorbing paper strips, Oraflow, USA)을 사용하여 치아의 다양한 위치와 다양한 깊이의 탐침 포켓에서 치은열구액 샘플을 채취하였다. 흡수지스트립은 100 μl PBS가 담긴 튜브에 담아 ELISA 분석을 위해 -70℃에 보관하였다.

ELISA : 치은열구액 샘플 내의 ODAM의 농도는 ODAM ELISA kit(CUSABIO company)을 사용자의 방법대로 사용하여 측정하였다.

상기 실험에서 통계 처리는 스튜던트 t-테스트를 사용하여 수행하였다. 모든 통계 분석은 SPSS software ver. 19.0를 사용하여 수행하였다.

실시예 1 법랑모세포 및 접합상피 (Junctional Epithelium, JE ) 발생 중 ODAM, ARHGEF5 및 RhoA 발현 분석 및 마커 규명

면역화학염색을 이용하여 치아 발생 중 잇몸의 법랑모세포-치아 경계에서 ODAM의 발현 정도를 분석하였다. 결과는 도 1에 있다. 그 결과 ODAM 발현은 생후 16일째 래트의 제1 어금니의 OE(oral epithelium)의 기저 세포에 국한되었다. ODAM은 reducing 구강 상피세포의 핵상 부분에서 관찰되었으며, 경계 부분에서는 표지가 확산되어 분포하였다. 생후 20일 래트의 제1 어금니에서는 에나멜 기관 및 접합상피 사이에 위치한 세포에서 ODAM에 대한 면역염색이 강하게 나타났다. 또한, ODAM은 치아의 경계에서 발현되는 것으로 나타났다. 세 개의 어금니가 모두 나고 잇몸(JE)이 잘 발생된 생후 26일째 래트의 경우, 접합상피(JE) 세포에서 발현이 되었다.

또한 ODAM, ARHGEF5, 및 RhoA 발현은 잇몸(JE) 및 발생 중인 어금니 배아 (germ)에서 면역염색으로 분석하였다. 생후 20일 래트의 경우, 접합상피(JE)에서 ODAM이 강하게 발현되었으며, ARHGEF5 및 RhoA도 동일 부위에서 관찰되었다 (도 1B). 생후 10일 래트의 경우, ODAM은 법랑모세포, 에나멜 매트릭스 및 법랑모세포-치아 경계에서 발현되었다. 특히 흥미로운 것은, ODAM의 발현은 법랑모세포 및 법랑모세포-치아 경계에서 활성화된 RhoA (GTP-RhoA)의 발현과 일치하는 것으로 나타났으나, ARHGEF5는 단지 법랑모세포-치아 경계에서만 발현되었다 (도 1C). 또한 F-액틴은 ODAM 및 RhoA와 비교하여 p10 마우스의 동일한 부위에서 강하게 발현되는 것으로 나타났다 (도 1D).

나아가 HAT7 및 ALC 세포에서 웨스턴블랏으로 분석한 결과 법랑모세포 분화 동안 ODAM, ARHGEF5, RhoA가 선택적이며 시간 의존적으로 발현이 유도된 것으로 나타났다. ODAM의 발현은 배양기간 동안 점진적으로 증가하였으며 (도 1E), 마찬가지로 ARHGEF5 및 RhoA도 계속적으로 발현되었다 (도 1E). 이러한 결과는 ODAM, ARHGEF5, 및 RhoA이 법랑모세포의 분화 및 성숙과 접합상피(JE)의 형성에 기능적으로 연관되어 있음을 나타낸다. 특히 ODAM은 치아 발생 과정의 접합 상피와 외과적 치주 처치 후 치아와 부착하는 구강 상피에서 강하게 발현되는 것으로 나타났으며, 이를 근거로 치주염의 마커 후보로 선별하였다.

실시예 2 손상된 접합상피(JE)에서 발현되는 ODDAM의 세포 내 위치 및 발현 분석 결과

염증에 의해 손상된 접합상피(JE)에서 ODAM 및 RhoA의 존재 여부 및 분포를 조사하였다. 이를 위해 마우스 및 인간의 손상된 조직을 이용하여 상기 실험재료 및 방법에 기재된 바와 같이 면역조직염색을 수행하였다. 그 결과 ODAM은 정상 접합상피(JE)에서는 발현이 되었으나 DDS 또는 PG로 염증이 유발된 마우스의 접합상피(JE)에서는 검출되지 않았다. 결과는 도 2에 기재되어 있다. 도 2는 염증이 있는 접합상피(JE) 세포에서 ODAM의 발현이 감소하고, 치은열구액에서 ODAM의 발현이 확인되는 것을 나타낸다. 마우스 실험시에 염증 유발 약물이 경구 투여되기 때문에 혀 부위의 접합상피(JE)는 심하게 손상되었으나, 입술 부위의 접합상피(JE)는 손상이 적어 정상에 가까운 소견을 보였으며, 이 부위에서는 ODAM이 발현되었다 (도 2A). 이는 정상 접합상피(JE)에서는 ODAM이 세포 내에 발현된다는 것을 나타낸다. 치주질환이 발생하면 접합상피(JE)은 많은 염증 침윤물로 둘러쌓인 상피골 (epithelial ridges) 및 궤양 병변을 나타내는 침습 포켓 (invasive pocket)으로 변한다. 이러한 침습 포켓에서 ODAM의 발현을 관찰하기 위하여, 치아 주변에 깊은 치주 포켓을 갖은 환자로부터 임플랜트를 위해 발치한 치아를 분석한 결과, 도 2B에 기재된 바와 같이 염증에 의해 손상된 인간의 접합상피(JE)에서 ODAM 및 RhoA는 검출되지 않았다.

또한 염증이 발생한 접합상피(JE)에서의 ODAM 발현을 추가로 확인하기 위하여, NCBI GEO 마이크로어레이 데이터 세트를 이용하여 Porphyromonas gingivalis (PG)에 감염되어 병변이 발생한 접합상피(JE) 세포에서의 발현을 분석한 결과, 도 2C에 나타난 바와 같이 ODAM의 발현이 억제된 것으로 나타났다. 유전성 치은섬유종증(Hereditary gingival fibromatosis, HGF)은 접합상피(JE)가 벌어지는 유전성 질환이며, 치주질환이 발생하는 경우에는 치아지지 부위가 심각하게 손상된다. HGF 환자 유래의 접합상피(JE) 조직을 사용하여 분석한 GEO 데이터의 ODAM 발현을 분석한 결과, 정상 환자와 비교하여, HGF 환자에서 ODAM 발현이 감소된 것으로 나타났다 (도 2D). 그러나 접합상피(JE)에 염증이 있는 환자의 치은열구액에서 ODAM의 발현을 분석한 결과, 발현이 증가하는 것으로 나타났다 (도 2E). 이러한 결과는 건강한 접합상피(JE)에서 ODAM이 발현되다가, 치주질환이 발행하면 접합상피(JE)에서는 ODAM의 발현이 감소하는 반면 치은열구액에서는 ODAM의 발현이 증가함으로 치주 질환의 마커로서 용이하게 사용될 수 있음을 나타낸다.

실시예 3 치주 환자에서 치은열구액 채취 깊이에 따른 ODAM의 농도

치주질환에서 치아와 접합상피(JE) 사이가 벌어지면서 골이 형성되며, 치주질환이 진행됨에 따라 골이 깊어진다. 따라서 치은열구액의 채취 깊이가 깊어질수록 치주질환이 더 진행된 것을 나타낸다. 실험방법에서 기재된 바와 같이, 치주질환 환자를 평가한 후, 치주낭에서 치은열구액의 채취 깊이에 따라 ODAM의 농도를 측정하였다.

결과는 도 3a와 3c에 기재되어 있다. 도 3은 치주질환 환자에서 치은열구액 채취 깊이에 따른 ODAM 농도와의 관계를 보여주는 그래프로, 탐침 포켓 깊이, 치주낭 (도 3a), 포켓에서 치아-치주 세포 부착 소실 (Clinical Attachment Level, CAL) (도 3b), 포켓 내 출혈 (Bleeding)(도 3c) 정도를 평가 분류 한 후 각 환자로부터 채취한 치은열구액의 ODAM 농도(ng/ml)를 ELISA 방법으로 측정한 결과를 포켓 깊이에 따라 그래프로 작성한 것이다. 탐침 포켓 깊이는 정상과 비교한 포켓의 깊이로 측정하였다. ODAM과 탐침 깊이, 즉 치주낭과의 상관계수는 0.167, Sig.(2-tailed)=0.0127 (신뢰도 0.05)이고, CAL과 ODAM과 상관계수 0.226, Sig.(2-tailed)=0.0007 (신뢰도 0.01)이며, 이는 거의 100%에 가까운 신뢰도이다. 따라서 본원에 따라 ODAM은 초기 치주질환은 물론, 진행단계에 따라 또는 진행된 치주질환의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

실시예 4 임플란트 주위염 (Peri-implantitis) 환자에서의 ODAM의 농도

임플란트 시술 후에 임플란트 주위에 염증이 발생한 부위와 발생하지 않은 부위에서 치은열구액을 채취하여 실험방법에 기재된 바와 같이 ODAM의 농도를 측정한 결과, 도 4a에 기재된 바와 같이 염증을 나타내지 않은 임플란트 부위와 비교하여 염증이 발생한 부위에서 ODAM의 농도가 증가한 것으로 나타났다.

또한 임플란트 시술을 받지 않은 정상 치주조직 대조군과 임플란트 주위염 환자의 ODAM 농도를 측정한 결과는 도 4b와 같다. 정상 치주조직과 비교하여, 임플란트 주위염 환자에서 ODAM의 농도가 월등히 증가한 것으로 나타났다.

상기 실시예의 결과는 치은염 및 치주염을 포함하는 전체 치주질환에서 접합상피의 손상없이 치주인대 (periodental ligament), 시멘트질 (cementum), 치조골 (alveolar bone) 등의 치주조직만 파괴된 경우, 즉 상피 손상이 없는 치주질환보다는, 접합상피가 손상 또는 파괴된 치주질환의 진단에 보다 효과적으로 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.

이상으로 본원의 예시적인 실시 예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리 범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리 범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (12)

1. 접합상피가 손상된 치은염의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
   대상체 유래의 구강 체액으로부터 ODAM의 단백질 양을 검출하는 단계; 및
   상기 구강 체액에서 상기 ODAM의 단백질 양이 정상 대조군 시료와 비교하여 증가한 경우, 상기 구강 체액이 유래한 대상체를 접합상피가 손상된 치은염과 연관시키는 단계를 포함하는, 치은염 진단용 마커 검출 방법.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 구강 체액은 타액 또는 치은열구액인, 치은염 진단용 마커 검출 방법.
   
6. 삭제
7. 제 1 항에 있어서,
   상기 방법은 마이크로어레이, 항원-항체 반응, 또는 질량분석 방식으로 수행되는 것인, 치은염 진단용 마커 검출 방법.
   
8. 제 1 항, 제 5 항 또는 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 연관시키는 단계는 상기 대상체의 비마커 임상정보를 추가로 사용하는 것인, 치은염 진단용 마커 검출 방법.
   
9. 제 8 항에 있어서,
   상기 비마커 임상정보는 상기 대상자의 치주낭의 깊이 측정, 출혈여부 또는 X-ray 검사 중 하나 이상인, 치은염 진단용 마커 검출 방법.
   
10. 구강 체액 검체로부터 ODAM 단백질 검출용 시약을 포함하는, 접합상피가 손상된 치은염 진단용 조성물.
    
11. 삭제
12. 제 10 항에 있어서, 상기 구강 체액은 타액 또는 치은열구액인, 접합상피가 손상된 치은염 진단용 조성물.
    

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