KR100251594B1 - 치근막 질환의 진단과 이의 진행위험을 예견하는 방법과 이에 사용되는 테스트 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 치근막 질환의 좌상 테스트를 하기 위한 신속하고 신뢰성 있는 방법에 관계하고 특히, 치근막 질환의 진행 위험을 예견하는 테스트 방법에 관계한다. 진단과 예견은 면역학적 테스트 키트를 사용하여 다핵성 호중구 백혈구세포(PMN)로 부터 유도되는 호중구 겔라티나제 연관된 리포칼린(NGAL)을 측정하여 이루어진다.
Description
[발명의 명칭]
치근막 질환의 진단과 이의 진행위험을 예견하는 방법과 이에 사용되는 테스트 키트
[기술분야]
본 발명은 이식부위 염증과 HIV(+)-연관된 치근막 질환 뿐만 아니라 다양한 형태의 치근막 질환을 신속하고, 신뢰성 있고 특이적이고 고감도의 좌상 테스트를 위한 방법과 테스트 키트를 이용하여 상기 질환의 진행성 위험을 예견하는 방법에 관계하는데 이때, 테스트 키트는 호중구 겔라티나제-연관된 리포칼린(NGAL)을 측정하는 것이다.
[배경 기술]
치근막 질환의 진행을 결정하는 전형적인 방법은 프로브에 의해 주어진 시간동안에 치근막 조직에서 일어나는 손상정도를 평가하는 것이다. 그러나, 치근막 프로브는 측정기술에 따라서 여러 가지 원인으로 인하여 정확도가 떨어지게 된다.
방사선사진은 치아주변의 치조골의 높이와 손상정도를 측정하는데 오래 전부터 사용되어 왔다. 그러나, 뼈에서 사소한 변화를 감지하는 것은 불가능하다. 방사선사진을 통상적인 방법으로 읽을 때 뼈의 파괴 또는 손실정도를 과소평가하기 쉽다.
과거 십년동안에 치근막염의 진단과 이의 진행을 초기에 감기하기 위한 진단보조제를 개발하고 테스트하고 개량하는데 관심이 증가되어 왔다. 치근막 병소의 진행을 테스트하기 위한 임의 진단 테스트 또는 예후 테스트는 질병의 통상적인 암시를 넘어서 어느 정도의 유익한 정보를 제공해야만 한다.
표피연구에서 나온 데이터를 보면 치근막 질환은 여러 가지 인자에 의한 것임을 알 수 있다(Armitage, G.C., CDA Journal 36:35-41, 1993). 이와 같은 데이터에서 치근막 질환은 치근막 질환유발 미생물의 감염에 의해 일어난다. 이와 같은 미생물에는 포르필로모나스 깅지발리스(Pg), 프레보텔라 인터미디어(Pi), 박테리오이드 포르시터스(Bf), 악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스(Aa), 캄필로박터 렉투스, 퓨소박테리움 뉴클리아툼과 스피로체트스 등을 포함한다.
병소의 진행과 상당히 연관이 있는 것으로 보이는 치근막아래 특정 미생물을 확인하는 작업이 정의나 명확한 해석도 없이 상당히 많았다. (Armitage, G.C., CDA Journal 36:35-41, 1993). 효소 테스트, 배양물 분석, 현미경 분석 및 DNA-프로브를 이용하여 표적 미생물을 추적하였다.
치육구액(GCF)는 치근막 주머니로부터 구강 내로 흘러 들어오는 염증성 삼출액이다. 여기에는 숙주세포와 박테리아에 의해 생산된 치근막아래 박테리아, 염증 세포 그리고 다양한 물질을 포함하고 있다. 인접한 치근막 조직에서도 일어나는 몇 가지 염증반응이 수반되는 염증성 삼출액이다(Birkedal-Hansen, H., J. Periodontal. 64:474-484, 1993). 임상에서 GCF는 주머니 구멍에서 필터페이퍼 스트립을 교체함으로써 쉽게 모을 수 있다. 이와 같은 특징은 치근막 질환의 진행을 감지하는데 GCF가 아주 적합한 물질임을 나타내는 것이다. 이들 표식에는 1)조직의 제형성과 분해와 연관된 생성물, 2)염증 매개물질, 3)숙주세포 유도된 효소를 포함한다(Birkedal-Hansen, H., J. Periodontal. 64:474-484, 1993).
치근막 질환의 주요 특징 중에 하나는 연결조직과 뼈를 파괴한다는 것이다. 이들 조직으로부터 상당량의 조직파괴 생성물이 치근막 질환과정동안에 방출된다는 것이다. 교차 연구에서 치근막염이 있는 부위로부터 수집한 GCF에서 콜라겐 분해로부터 나오는 하이드록시프롤린이 많은 양으로 포함되어 있다는 것이다(Talonpoika, I., Changes in the composition of gingival crevicular fluid after periodontal treatment, thesis, Ann. Univ. Turku 142, 1994). 그러나 이와 같은 물질의 존재가 진행성 병소와 밀접한 관계가 있는지를 알아보는 연구는 없었다. 또한 이와 같은 생성물이 실제 치근막 조직 파괴나 또는 재형성과 연관이 있는지도 알려지지 않고 있다.
치은염과 치금막염에 걸린 치근막 조직은 여러 가지 많은 염증 매개물질을 생산한다. 이들 매개물질의 일부는 치근막염에서 볼 수 있는 파괴성 과정에 중요한 역할을 하는 것으로 보이며 이는 진행성 병소에 대한 표식으로써 특정 염증 매개 물질을 이용한 가능성을 검사하게 되었다(Sorsa, T. et al, Arch. Oral. Biol. 35:193S-196S, 1990), (Page, R.C., J.Periodont. Res. 26:230-242, 1991).
그러나 지금까지, GCF에서 염증 매개물질을 평가하는 진행성 치근막염을 진단 또는 예후하는 완전히 개발된 또는 유효한 테스트는 없다. 예비작업에서 치근막염에 걸린 부위에 다음의 두 가지 물질 즉, 프로스타글란딘 E2와 종양괴사인사-α이 연관된 것으로 제안하고 있다(Page, R.C., J. Peiodont. Res. 26:230-242, 1991). 그러나, 이와 같은 모든 염증 매개물질은 신체의 다른부분에 골 흡수와도 밀접한 연관이 있다. 이들은 치근막염에 모두 연관이 있는 것으로 보이나 이들이 임상적인 세팅에서 질병의 진행에 유용한 표식으로 작용할 수 있을 지에 대해서는 추가 연구가 필요하다.
치근막염의 진행과 연관된 것으로 보이는 GCF에서 효소를 테스트하기 위해 여러 가지 연구가 실행되었다. GCF에 있는 숙주-유도된 효소들 중에 가장 주목을 받고 있는 것으로는 아스파타테이트 아미노트란스퍼라제와 콜라게나제(Page, R.C., J. Periodont. Res. 26:230-242, 1991), 겔라티나제(Birkedal-Hansen, H., Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 4:197-250, 1993 ; Sorsa, T., et al., Ann. N.Y Acda. Sci. 732:112-131, 1994) 관련된 중성 프로테아제(Teng, Y.T., et al., J. Periodont. Res. 27:544-552, 1993), β-갈락토시다제(Page, R.C., J. Periodont. Res. 26:230-242, 1991) 그리고 엘라스타제(Ingman, T., et at., Oral. Microbiol. Immunil. 8:298-305, 1993)등이 있다. 이들 효소중 일부는 죽은 또는 죽어 가는 치근막에서 방출되고 일부는 다핵성 호중구(PMN)에서 나오고 다른 일부는 다른 염증 세포(PMNs/단핵세포/대식세포), 감염부위에 상피 및 연결조직 세포로부터 방출된다(Sorsa, T., et al., Arch. Oral Biol. 35:193S-196S, 1990; Birkedal-Hansen, H., et al., Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 4;197-250, 1993; Sorsa, T., et at. Ann. N.Y. Acad. Sci. 732:112-131, 1994).
예전에는 글루타민 옥살로트란스퍼라제라고 불리던 아스파르테이트 아미노트란스퍼라제(AST)는 죽은 그리고 죽어 가는 숙주세포에 의해 방출된다. 의약에서 심근경색후에 심근에서 또는 간질환동안에 간에서 볼 수 있는 세포 죽음에 대한 유용한 표식이다. 사실, 신체의 모든 조직의 죽은 세포로부터 방출된다. 진행의 기준으로 임상적인 접착 손실이 이용되는 진행성 치근막에 걸린 환자로 몇 가지 종재 연구 결과로부터 CGF AST 손실은 부위 기준으로 질병 진행의 표식으로 작용할 수 있다(Page, R.C., J. Periodont. Res. 26:230-242, 1991), GCF에서 효소에 대한 신속한 좌상 테스트를 개발하였다. 효소 활성에 기초하여 AST는 치은염과 비진행성 치근막염이 있는 부위에서 다소 상승된 것을 볼 수 있다. 따라서, 이는 이의 GCF 수준이 파괴되는 염증 부위와 파괴되지 않은 염증 부위를 구별하는데 유용한 것인지를 밝히는 것이 남아 있다(Page, R.C., J. Periodont. Res. 26:230-242, 1991). 따라서, AST검사의 이용으로는 치근막염을 명확하게 진단할 수 없다. 또한, 효소 검사는 GCF가 오염된 혈액으로부터 AST가 유도될 가능성이 있기 때문에 정확하지 않다.
다핵성 호중구 백혈구세포(PMNs)는 치은염 또는 치근막염이 있는 부위로부터 GCF에서 발견될 수 있는 주요 염증이다. 이들은 치근주머니를 콜로니화시키는 박테리아에 대해 제 1 방어 기작이다. 박테리아의 도전을 받을 때, PMNs는 광범위한 라이소조말 효소, 부입상 효소, 염증 매개 물질 및 단백질 분해효소를 방출한다. 치근막염의 진행에 대한 표식으로써 이들 효소의 일부가 작용할 수 있다는 생각의 배경은 간단하다. 즉, 치근막염이 진행될 때, 잇몸 아래 박테리아는 국소 숙주 방어기작(PMNs 포함)을 압도하고 죽은 호중구로부터 방출되는 라이소자임 효소, 프로테아제/염증 매개물질은 GCF로 상당량이 방출된다. 라이소자임 효소(예로써, 중성 프로테아제)의 신속한 좌상 테스트가 개발되었다(PeriocheckTM). 이는 진행된 치근막염이 있는 부위에서 상승되는 것을 볼 수 있다(Teng, Y.T., at el., J. Period. Res. 27:544-552, 1993). 그러나, PeriocheckTM는 PMN 프로테아제에 특이성이 부족하고 미생물 프로테아제는 이를 함유하는 기질에 들어갔을 때 쉽게 부서진다. 진행의 위험이 높은 부위를 확인하는 테스트는 없다.
한가지 종재 연구에서 본 예비 작업에서 다른 라이소조말 효소, β-글루코로니다제의 GCF 수준이 1년동안 임상적인 부착 손실이 증가된 환자에서 상승된 것을 볼 수 있다(Armitage, G.C., CDA Journal 36:35-41, 1993, Page, R.C., J. Periodont. Res, 26:230-242, 1991). 이들 효소의 낮은 수준은 비진행성 질환이 있는 환자에서 볼 수 있다. 그러나, GCF에서 β-글루코로니다제의 신속한 좌상 테스트가 개발되지 않았고 또한 β-글루코로니다제를 위한 신속한 좌상 GCF 테스트가 치근막염의 진행에서 부위별로 감지할 수 있는 유용한 방법으로 개발될 수 있을지를 확인하는 작업도 남아 있다.
엘라스타제는 PMNs에의해 GCF내로 방출되는 주요 중성 세린 프로테나제중에 하나이다. 그러나, 다른 세포도 상기 효소를 생산하는 것으로 공지되어 있다(McCullough, C.A.G., J. Clin. Periodontol. 21:497-506, 1994). GCF에서 효소의 신속한 좌상 테스트는 효소활성에 기초하여 개발되었고 특히, 임상적인 세팅에서 부분적으로 테스트된다(McCullough, C.A.G. , J. Clin. Periodontol. 21:497-506, 1994). GCF 엘라스타제 수준이 높은 부위는 효소의 수준이 낮은 부위보다 6개월 이내에 추가 뼈 손상을 받게된다(McCul1ough, C.A.G., J. Clin, Periodontol. 21:497-506, 1994).
효소 GCF-기초한 테스트가 확실한 것으로 보이지만 완전하게 충분하게 테스트되고 유효화시키기 전에 좀더 많은 작업을 해야 한다.
테스트는 PMN-단백질 특히 엘라스타제 결핍 특이성에 기초하여 개발되었다;엘라스타제는 사람과 박테리아 단백질 분해효소/프로테아제/프로테이나제에 의해 효과적으로 분해되기 때문에 특이성이 부족한 합성 프로타제 기질(SAAVNA-펩티드)에 의해 검사되었다. 따라서, 비록 테스트 샘플에 엘라스타제가 없더라도 효소 테스트에서 양성 결과를 수득할 수 있다(Sorsa, T., et al., J. Periodont, Res. 22:375-380, 1987; Ingman, T., et al., Oral Microbiol. Immunol. 8:298-305, 1993). 이와 같은 테스트는 치근막염 질환의 진행에 대한 진단에 결정적이라고는 할 수 없다.
핀란드 특허 출원 FI 943939에서는 활성 사람 매트릭스 메탈로프로테나제-8(MMP-8)-호중구 콜라게나제의 결정에 기초한 뼈의 파괴나 손실과 연관된 활성 친근막염의 신속하고, 신뢰성 있는 신규한 방법과 좌상 테스트용 진단 키트에 대해 상술하고 있다. 상시 특허 출원 FI 943939에서는 또한 치근막 질환 활성을 진단하는 다른 통상적인 방법에 대해서도 광범위하게 상술하고 있다.
원래, 좌상 테스트로 활성 질환의 신뢰성 있는 진단을 하는 것이 중요하다. 치근막염을 예방하기 위해서는 치과의사가 자기 사무실에서 실행할 수 있는 좌상 테스트에 의해 질병의 진행에 대한 신뢰성 있는 예후를 하는 것이 중요하다.
Kjeldsen L., et al. (J. Biol. Chem. 268:10425-10432, 1993)는 사람 말초 혈액 PMNs로부터 신규한 호중구 겔라티나제-연관된 리포칼린(NGAL)의 정제, 특징화 및 1치 구조에 대해 최근 상술하였다. NGAL은 사람 PMN 92kD 겔라티나제 즉, 매트릭스 메탈로프로테나제-9(MMF-9)와 연관된 25kD 단백질이다. 활성 PMNs는 2차 PMNs(특이적인) 입자로부터 대부분 25kD NGAL로 분해된다(Kjeldsen, L., et al., J. Biol. Chem 268:10425-10432, 1993). PMNs이외에 NGAL은 PMN 3차 또는 C-타입 입자로부터 분해된 92kD MMP-9와 공유결합 120kD 복합체를 만들 수 있다(Kjeldsen, L., et al., J. Biol. Chem. 268:10425-10432, 1993). 이는 NGAL/MMP-9-복합체 형성은 NMP-9 120kD 형을 설명하는데 이는 PMNs와 이의 겔라티나제(MMP-9)의 독특한 성질이다(Sorsa, T., et al., Arch. Oral Biol. 35:193S0197S, 1990; Kjeldsen, L., et al., J. Biol. Chem. 268:10425-10432, 1993). 또한, NGAL은 단량체 25kD와 이량체 46kD형으로 존재하는데 이는 PMN 활성에 의해 역시 식작용할 수 있다(Kjeldsen, L., et al., J. Biol Chem. 268:10425-10432, 1993). NGAL은 겔라티나제에서 조직활성이 없으며 NGAL의 기능은 완전히 명확하게 밝혀지지 않고 있다.
PMNs는 메탈로매트릭스 단백질(MMPs)의 주요 소스이고(Sorsa, T., et al., J. Periodont. Res. 23:380-393, 1988, Sorsa, T., et at., Ann. N.Y. Acad. Sci. 732:112-131, 1994; Golub, L.M. et al., J. Clin. Perio. 22:100-109, 1995) 인자들은 NGAL와 같은 것과 연관이 있고 결과적으로는 치근막염에서 특정 120kD 복합체 NGAL/MMP-9와 연관이 있다. HIV(+)-환자의 치근막 질환 부위로부터 GCF는 활성 PMN 유도된 MMPs를 증가된 양으로 포함하는 것으로 나타났으나(Salo, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 732:476-478, 1994), 이는 아마도 이들 PMN 유도된 단백질이 NGAL 또한 포함하는 것으로는 보이지 않는다. PMN 유도된 단백질에 기초한 치근막염의 진행을 나타내는 신뢰성 있는 좌상 테스트가 개발되지는 않았다.
비록 치근막 질환의 진행을 진단하는 만족스러운 방법을 제공하기 위한 다양한 작업이 실행되었으나 이중 충분히 개발된 해결책을 제시하는 것은 없었다. 따라서 현재까지, 임상의는 국소 프로브 측정과 방사능 사진에 의해 치근막염과 치은염을 평가하는 예전의 통상적인 방법에 의존할 수밖에 없었다. 또한, 지금까지 개발된 테스트 중에 어느 정도에서건 치근막 질환의 위험을 암시하는 것은 없었다. 이는 입안에서 상승된 효소활성을 평가하는 것이고 상승된 활성은 상당히 다른 원인 즉, 인후염, Sjogren 증후군에 의한 것이다. 환언하면 상기 상술한 효소활성은 상승된 효소 활성이 치근막 질환의 실제 원인이라는 것을 분명히 나타내지는 못했다. 상승된 양은 물론 세균에 의해서 일 수도 있다.
상기 지적한 바와 같이, 성숙된 질환은 육안으로도 임상의가 구분할 수 있다. 본 기술에서 필요한 것은 육안으로 식별할 수 있기 전에 치근막 질환의 진행위험을 평가할 수 있는 신속하고 감도 있고 정확한 방법을 구하고자 하는 것이다.
치과의사들간에는 진단된 치근막 질환이 어느 정도 진행되었는지, 치근막 질환의 치료효과를 모니터하고 평가할 수 있는 감도 있고, 특이적이고, 신속한 테스트가 필요한 것 또한 사실이다.
본원 발명자들은 특이적인 면역화학적 수단에 의해 활성화된 PMNs의 존재를 모니터 함으로써 초기단계에서 질병의 진행정도를 나타내고 치근막질환의 위험을 경고할 수 있는 검사 방법을 제공함으로써 본 기술 분야에 숙원을 이루어지게 하였다. MMP-9, 엘라스타제 그리고 골수 퍼옥시다제와 같은 공지의 PMNs 표식 단백질의 일부는 특이성이 부족한데 그 이유는 이들은 박테리아에 의해서도 생산될 수 있고(엘라스타제), 다른 세포(단세포/대식세포)와 상피세포도 골수 퍼옥시다제와 MMP-9를 생산할 수 있기 때문이다. 본 발명에 따르면, 진단을 하고 치근막 질환의 진행 위험의 적절한 예후를 알기 위해 환자의 GCF로부터 신규한 특이적인 PMN 표식 단백질 즉, NGAL의 좌상 감지와 결정을 위한 신속한 면역학적 테스트를 제공하는 것이다. 환자에서 취한 GCF시료 또는 환자의 타액 HE는 구강 세척액을 면역학적 좌상 키트의 도움으로 상기 NGAL을 측정할 수 있다. 본 발명에 따르면, 상기 NGAL은 치근과 이식 주변부의 건강을 조절하고 HIV(+)-감염 연관된 치근염을 포함하는 다양한 치근막 질환 형태의 처리와 모니터를 위한 생화학적 부차 표식으로 작용하는데 그 이유는 이것이 염증의 초기 단계를 암시하고 때로는 NGAL이 MMP-9와 복합체를 형성한다는 사실에 의해 활성 질병과 이의 특이성이 혼돈되지 않기 때문이다.
따라서, 본 발명의 목적은 여러 가지 치근막 질환을 신속하고 신뢰성 있게 진단 및 예후하고 특이적인 면역화학적 방법을 이용하여 특정 PMN 표식, NGAL의 결정에 기초하여 상기 질환의 위험을 예후하는 방법을 제공한다. 본 발명은 질병 초기 단계에서 진단 및 예후를 하는 상기 방법에 이용되는 테스트 키트를 제공한다.
[발명의 요약]
본 발명은 NGAL를 인지하는 단클론 항체의 도움을 받아 감지할 수 있는 특이적인 PMN 표식 단백질인 NGAL을 이용하여 치육구액(GCF)에 있는 활성화된 PMNs의 존재를 감지함으로써 치근막 질환의 위험을 특별하게 모니터 하는 진단 방법에 관계한다.
본 발명은 특히, 치근막 질환을 감지하고 위험을 예고하는 좌상 테스트 키트에 관계한다. 본 발명에 따른 좌상 테스트는 특이적으로 NGAL을 인지하는 적어도 하나의 단클론 항체로 구성된다.
단클론 항체에 추가하여, 특이적인 테스트 키트를 구성하는데 있어 NGAL에 대해 발생되는 선택적으로 다클론 항체를 인지하는 표식도 이용될 수 있다.
본 발명에 따르는 테스트 키트에는 선택된 면역학적 테스트를 실행하는데 필요한 선택적으로 감지할 수 있는 직간접 라벨과 선택적인 고체 또는 액체 담체를 포함할 수 있다. 좌상 테스트 키트는 PMN의 표식 단백질인 NGAL을 용이하고 신뢰성 있는 방식으로 감지할 수 있도록 만들어 졌다.
본 발명은 HIV-감염/AIDS-연관된 치근막염과 이식부위 염증 뿐만 아니라 여러 가지 형태의 치근막 질환을 진단, 예측 및 평가하고 특히, 상기 질병의 진행의 위험을 평가하는 방법에 연관된다. 감지 방법은 면역학적 검사로 실행할 수 있다.
본 발명의 구체예에 따르면, 치근막 질환과 이식 주위 염증의 위험은 타액 샘플 또는 구강 세척액 샘플의 좌상 테스트를 이용하여 실행할 수 있다.
양성인 경우에는 부위-특이적인 방법을 추가로 실시하는데 이때, 샘플의 모집은 딱딱한 흡수 샘플장치로 실행하는데 본 발명의 구체예는 이와 같은 면역학적 검사로 이루어진다.
NGAL은 초기 염증단계의 위험을 알리고 NGAL이 때로 MMP-9와 복합체를 형성하는 사실로 인해 활성 질병과 이의 특이성이 혼란되지 않기 때문에 본 목적에 특히 유용하게 이용된다.
본 발명의 특징은 명세서 다음에 첨부된 특허청구범위에 상술되어 있다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 NGAL을 포함하는 사람 치조골 점막의 냉동된 부분의 조직학적(a) 그리고 면역화학적(b-f) 착색을 나타내는 것이다. (a-c)와 (e)에서 상피 표면은 (E)으로 나타내고 연결 조직은 (CT)로 나타낸다. (a-c)에서 막대는 150㎛이고, (d)와 (f)에서는 50㎛이다. 맥관 주위 염증 세포는 이들 연결조직에서 화살표로 나타내었다. MMP-9(c,d)와 NGAL(e,f)에 대한 분명한 면역착색이 호중구 입상세포와 연합하여 볼 수 있다. 확대하여 보았을 때(d,f), 맥관내에 있는 PMNs는 세포질 면역활성이 있고 혈액밖에 있을 경우에는 착색반응은 부근 연결 조직에까지 이어진다. 연결조직을 통하여 NGAL(e)의 약한 반응성을 볼 수 있고 기저막 부근(화살표머리부분)(f)와 몇몇 섬유아세포(화살표머리부분)에서도 볼 수 있다.
[발명의 상세한 설명]
[정의]
본 발명에서 ″NGAL″은 NGAL/MMP-9 복합체 뿐만 아니라 단량체와 이량체 NGAL을 포함하는 여러 가지 형태의 호중구 겔라티나제 연관된 리포칼린을 의미한다.
″치근막 질환″은 HIV(+)-감염/AIDS-질병 연관된 치근막 질환 뿐만 아니라 치근막 질환과 이식 주변 염증을 의미한다.
″진단″은 테스트 키트에 의해 이루어지는 검사 또는 결정에 기초한 치과의의 진료에 의해 이루어진 진단 또는 평가를 의미한다.
″예후″는 치근막와 이식주변염증의 감시와 처리 뿐만 아니라 여러 가지 형의 치근막 질환과 이식 주변염증의 모니터와 치료를 포함하는 질병-질병의 패턴-을 예후하기 위한 치과의의 진료에 의해 이루어지는 평가 또는 측정을 의미한다. 건강한 사람에게서는 예후를 만들 수 없다.
″좌상 테스트″란 치과병원에서 치과의사의 자리에서 테스트 키트로 치과의가 진단할 수 있는 진단과 예후를 의미한다.
″샘플링 장치″란 보통 필터 페이퍼 스트립을 의미하는데 테스트 장치 자체가 샘플링 장치로 이용될 수 있는 것 뿐만 아니라 다른 고형 흡수 스틱을 의미한다. 타액 샘플이나 구강 세척액 샘플에서는 특별한 샘플링 장치가 필요하지 않다.
[발명의 상세한 설명]
본 원 발명자들은 면역조직학적 그리고 조직학적 평가에서 염증이 있는 사람 치은에서 MMP-9와 NGAL의 소스는 PMNs라는 것을 밝혔다. 이들은 또한 성인 치근막염(AP)에서 더 많은 PMN-유도된 MMP-9와 NGAL 면역활성을 볼 수 있고-국소화된 청소년 치근막염(LJP) 잇몸 조직 샘플에서는 더 많은 PMN-연관된 치근막염이 있다는 것을 알았다. 이와 같은 발견에 기초하여 발명자들은 질병의 초기단계에서 염증을 가지는 잇몸으로부터 치근막 질환의 신뢰성 있고 신속한 진단 및 예후를 위한 본 발명의 테스트 키트를 개발하게 되었다.
또한 본원 발명자들은 시험관에서 구강/잇몸 케라틴세포가 MMP-9와 NGAL를 생산한다는 것을 알았다 그러나, 생체내 단세포/대식세포 또는 잇몸/구강 또는 소구 상피세포에선, MNP-9/NGAL 양성 시그날을 감지할 수 없었다. 이는 NGAL와 MMP-9의 유일한 소스가 GCF에서 PMNs라는 것을 말한다. 이들 두 가지 단백질은 생체내에서 생산되고 특히 치근막 질환 부위의 PMNs에서 특별히 유도되고, 상피세포 또는 케라틴세포와 같은 다른 세포에서는 유도되지 않는다는 것을 의미한다. 이를 기초로 하여 치근막 질환의 진행 위험을 특이적으로 예후하는 특이적인 PMN 표식 단백질로써 NGAL을 이용하는 신뢰성 있는 테스트 키트를 만들었다.
또한, 기록된 발견에 따르면(제1도와 실시예 1의 결과) PMNs가 염증을 가진 잇몸 연결조직에 있는 혈액의 관강에 있으면 MMP-9와 NGAL는 PMN 세포질에 있고, PMNs가 잇몸 연결 조직내로 삼출하면, MMP-9와 NGAL는 PMNs의 주변에 지속적으로 볼 수 있다. 이는 PMNs가 치근/잇몸 염증동안에 자극을 받으며 자극된 삼출된 PMNs는 잇몸 연결 조직에서 골수 퍼옥시다제와 엘라스타제와 같은 다른 인자들 뿐만 아니라 MMP-8, MMP-9, 엘라스타제와 NGAL와 같은 이의 단백질 인자로 결국 분해된다. 잇몸에 MMP-9와 NGAL의 존재는 MMP-9 또는 NGAL의 면역활성이 이가 나지 않은 염증이 없는 치수 연결 조직에서 감지되지 않았기 때문에 잇몸/치근 염증과 연관이 있는 것으로 보인다.
결론적으로, 본 면역화학적 그리고 기능적 데이터에서 PMNs는 특히 AP에 있는 것들(NGAL)과 연관된 MMPs와 인자의 관련 소스로 간주된다. 이들의 역할은 LJP와 같은 다른 형의 치근막 질환보다는 중요성이 덜한 것으로 보인다. 또한, HIV(+) 환자의 치근막 질환으로부터 구한 GCF는 MMP-8, MMP-9와 같은 활성 PMN유도된 분자가 증가된 양으로 포함된 것을 볼 수 있다(Salo, T., et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 732:476-478, 1994).
본원 발명자들에 의해 실시된 연구는 결국 치육구액(GCF)으로부터 좌상 테스트 키트를 이용하여 면역학적으로 측정하였을 때 상이한 형태의 PMN-유도된 NGAL은 치근막 건강을 제어할 뿐만 아니라 치근막 질환의 치료와 과정을 부위 특이적으로 모니터하기 위한 정확하고 신뢰할 수 있는 생화학적 보조제 표식으로 작용한다는 것을 나타내고 있다.
따라서, 본 발명에 따른 치근막 질환의 신속하고, 감도 있고 선택적인 진단을 위한 좌상 테스트 키트를 만들 수 있다. 키트에는 하나 또는 그 이상의 NGAL을 인지하는 항체를 포함할 수 있으나 적절하게는 항체에 부착될 수 있는 적어도 하나의 감지 가능한 라벨과 함께 또는 테스트 키트에 별도로 첨가될 수 있는 상이한 형태의 NGAL를 인지할 수 있는 적어도 단클론 항체를 포함할 수 있다. 뿐만 아니라 선택적인 고형 또는 액상 담체에 부착될 수도 있다.
진단 및 예후를 하는 방법은 근본적으로 샘플을 수집하고, 이때 샘플은 적절하게는 혈액이 없어야 하고, 샘플은 적어도 하나의 단클론 항체 또는 다클론 항체와 접촉시키고, 이때 특이적으로 NGAL을 인지해야 한다. 상기 항체는 적절한 방식으로 테스트 키트내에 결합한다. 상기 항체에 NGAL의 결합이 감지되고 진단을 하는데 이용된다.
적절한 단클론 항체는 자유형 또는 MMP-9에 복합된 형태로 NGAL을 인지할 수 있다. 환언하면, 단클론 항체는 적절하게는 에피토프에 관계해야 하고 이때 이는 MMP-9와 복합체를 형성하는데에는 관여하지 않아야 한다. 세포주는 통상적인 하이브리도마 기술과 본 발명에 따른 테스트 키트와 방법에서 요구하는 적절한 형태의 단클론항체를 생산할 수 있는 세포주를 스크린 한다.
NGAL을 인지하는 다클론 항체는 겔라티나제 또는 MMP-9에 대한 겔라티나제 항체의 친화력 정제에 의해 수득할 수 있다(Kjeldsen, L., f Biol. Chem. 268:10425-10432, 1993).
NGAL을 인지하는 단클론항체는 통상적인 방법에 의해 수득할 수 있고 이는 다음과 같은 단계로 구성된다. 우선, 마우스를 NGAL로 면역처리하고, 이때, NGAL은 원액 또는 고도로 정제된 제형일 수도 있다. NGAL 항체 생산에 대해 테스트하고 여러 가지 형태의 단클론 항체에 대해 스크린된 마우스의 비장세포를 이용하여 통산적인 하이브리도마 기술에 의해 하이브리도마 세포주가 생산된다. 가장 바람직한 단클론항체는 NGAL을 인지하는 것이고 이들은 감응성이 있으며 치근막 질환이 있는 환자의 치육구액에 있는 다른 단백질 또는 호소와의 교차 반응을 최소로 하는 것이다.
적절한 그리고 선택된 면역학적 방법에 맞도록 여러 가지 형태의 테스트 키트가 만들어질 수 있다. 방법은 면역크로마토그래피 방법, 면역측정 방법, 방사능 면역검사법, 방사능면역측정법, 효소면역검사법, 형광면역검사법, 발광면역검사법, 면역응집법, 혈구응집법, 응집저해법, 탁도측정 면역검사법, 비탁 면역검사법에서 적절하게 측정될 수 있다. 감지 가능한 라벨과 선택적인 담체는 적절한 방법에 따라 선택될 수 있다.
공지된 면역학적 검사의 대부분이 테스트에 적용될 수 있다. 이와 같은 검사는 본 기술분야에 숙지의 기술을 가진 자에게는 공지된 것이고 따라서, 여기에서 상술하지는 않는다. 가장 적절하고 신속한 검사 방식은 관통 원리에 기초한 면역학적 방법 뿐만 아니라 측면 흐름 원리가 연관된 면역크로마토그래프 방법이다. 이용할 수 있는 방법은 EP 291 194 Bl, EP 212 599 Bl 및 WO 94/00765에 상술되어 있고 이는 여기에 참고문헌으로 첨부되어 있다. 전술한 방법과 같이 응용할 수 있는 다른 공지의 방법이 다수 있다.
치근막 질환을 진단하고 질병의 진행 위험을 알리는 방법은 다음의 단계를 포함하는 면역학적인 검사로써 실행한다. 우선, 치육구액(GCF)를 샘플링 장치로 모으고 이때, 이는 통상적으로 필터 페이퍼 스트립을 이용하고 이로부터 샘플은 테스트 장치로 추출할 수 있다. 선택적으로 샘플링 장치는 테스트 장치로도 이용할 수 있다. 간단한 고형 장치는 부위 특이적인 샘플을 수득하는데 이용될 수 있다. 샘플링후에 샘플은 적어도 하나의 단클론 항체와 접촉시키고 이때, 단클론 항체는 이미 샘플링 또는 테스트 장치에 부착되어 있거나 또는 테스트 장치에 첨가될 수 있다. 또는, 샘플링 장치는 테스트 장치에 포함되거나 또는 부착시킬 수 있고 또는 샘플링 장치로부터 추출된 샘플은 NGAL을 인지할 수 있는 단클론 항체을 포함하는 테스트 장치 내로 들어갈 수 있다.
가장 적절한 방법은 치근막 질환의 위험은 부위-특이적인 방법에 의해 감지되는데 이는 샘플을 샘플링과 테스트 장치가 복합된 고형 장치로 수득할 수 있다.
본 발명의 한 구체예를 따르면, 치근막 질환의 위험은 타액 HE는 구강 세척액의 도움으로 수득된 샘플에서 NGAL의 수준이 증가된 것으로 예비 스크린할 수 있다. 치근막 질환의 예비 스크린은 다음의 단계로 구성된 면역학적 방법으로 실행할 수 있다. 타액 또는 구강 세척액을 포함하는 샘플은 임의 방법으로 수득할 수 있고 샘플은 상이한 형태의 NGAL을 인지할 수 있는 적어도 하나의 항체와 접촉시킨다.
상기 NGAL의 증가된 수준은 면역학적 방법에 의해 감지될 수 있다. Kjeldsen, L., et al은 European Journal Haematology 49:180-192에서 MMP-9에 대한 ELISA-테스트에 대해 상술하고 있다. 발명자들은 NGAL의 상승된 수준은 Kjeldsen, L.에 의해 상술된 ELISA-테스트에 상응하는 ELISA-테스트에 의해 결정될 수 있다. 건강한 사람의 GCF의 부위 특이적인 샘플에서의 NGAL의 수준은 거의 0에 가까운 반면, NGAL의 수준은 50-100ng/㎖인 것은 GCF에서 무언가가 일어나고 있다는 것을 나타낸다. 치근막 질환이 있는 환자는 그의 NGAL-샘플에서 상당히 높은 NGAL을 가지는 것을 볼 수 있다. GCF의 부위-직접적인 샘플에서 50-100ng/㎖ 수준은 치근막 질환의 진행 위험이 있다는 것을 나타낸다. 타액 샘플에서는 상응하는 수준이 결코 0이 아니다. 타액에서의 NGAL의 수준은 몇 가지 치아에서 GCF의 총합이 된다. 건강한 사람의 NGAL의 기본 수준은 타액 샘플과 같은 50-100ng/㎖ 수준이 된다. 150ng/㎖ 수준은 치근막 질환의 진행 위험을 나타내고 반면에 치근막 질환이 있는 사람은 전술한 ELISA-테스트에 의하면 400-500ng/㎖와 같이 높은 NGAL 수준을 가지는 것이 명백하다.
따라서, 각각 GCF와 타액에서 약 50과 150ng/㎖은 NGAL의 수준이 증가됨을 나타내는 것을 볼 수 있다. 절대 값은 항체 농도, 친화력, 샘플링 방법 등과 같은 다양한 인자에 따라 다양해진다. 그러나, 가장 중요한 인자는 건강한 샘플과 염증이 있는 샘플간의 비율이 수득한 절대치와는 동일하게 독립적이라는 것이다.
본 발명의 테스트 키트을 개발하고 이 방법을 개발하는데 이용된 방법과 물질은 다음의 실시예에서 더욱 상세히 설명한다.
[실시예]
[실시예 1]
치근막 질환이 있는 환자의 염증이 있는 사람 치육구액(GCF)과 건강한 자와 비교하여 NGAL의 증가된 양을 설명.
[환자]
본 연구에 참가한 환자들은 치근막 치료를 위해 헬싱키 대학의 치근막학부에 온 환자들이다. 성인 치근막(AP)군(n=10)에는 6명의 여성(나이는 32-47세)과 4명의 남성(나이 35-42세)를 포함한다. 국소화된 청소년 치근막 질환(LJP)군(n=11)에는 8명의 여성(나이 18-21세)와 3명의 남성(나이 17-21세)를 포함한다. 전체적인 건강 집단 대조군(n=10)은 6명의 여성과 4명의 남성 치과대 학생(나이 20-25세)으로 구성된다. AP의 임상학적인 기준은 주머니 깊이, 방사능 손실, 가시적인 플락인덱스와 전술한 것과 같이 프로브후에 출혈 등에 의해 판단할 수 있다.
[치육구액과 타액 샘플 수득]
GCF와 타액 샘플을 수득하기 전에 환자는 그의 구강을 수돗물로 양치하고 30초간 파라핀을 씹는다. 필터 페이퍼 스트립으로 GCF 샘플을 취하기전에 잇몸 위에 있는 모든 플라그를 제거하는데(Periopaper GCF strips; IDE Interstate, Amituvile, N.Y., U.S.A.) 이때, 이는 약한 저항성 느낌이 있을 때까지 AP와 LJP 환자 뿐만 아니라 치근이 건강한 대조군의 잇몸 틈새 구멍으로 삽입하게 된다. 스트립을 제거하고 중성 생리학적인 염 완충액으로 씻어낸다. 전체 타액을 수거하고 MGAL-결정에 사용한다.
[잇몸 조직 견본]
7명의 AP 환자로부터 잇몸 가장자리의 다양한 면에서 잇몸 조직 견본 상하 영구치에서 얻었고, 스케일링과 뿌리를 평편하게하는 것으로 구성된 성공정도가 약한 통상적인 치근막 치료 후에 깊은(＞5mm) 잇몸 주머니를 제거하기 위해 소구 상피 조직을 일반적인 잇몸 피판 외과술와 치육절개술을 실행한다. 유사하게, 6명의 LJP 환자로부터 잇몸 조직 견본을 면역조직 분석을 위해 구하였다. 비교를 위해, 근거 있는 임상적인 이유로 젊은 성인으로부터 염증이 없는, 완전히 발달된 이가 나지 않는 제 3 대구치의 경구/치조직을 외과적으로 제거하여 하기에서 상술하는 것과 같이 과육 조직을 분석하였다. 이가 나지 않은 제 3 대구치와 연관하여, 아래 있는 정상적인 치조골 점막으로부터 조직 견본을 이들 환자들로부터 구하였다.
[면역조직학적 착색으로부터 조직 견본의 준비]
치과술후에 바로, 연조직 견본을 Tissue-TEK II O.C.T. 첨가 배지가 깔고 액화 질소로 냉동된 코르크 한 조작에 둔다. 6㎛ 두께의 부분을 크리톰으로 절단하여 흡착을 개선하기 위해 3-아미노프로필트리에톡시실란(Sigma, ST. Louis. M.0., U.S.A.)-피복된 슬라이드에 모으고 사용할 때까지 20℃에 저장한다. 뽑은 이는 바로 액화 질소에 담그고, 점성 수용성 Na-카르복시메틸셀룰로오즈(Fluka, Buchs, Switzerland)를 깔고, 약 15㎛ 두께로 횡으로 절단한다. 조직의 분열을 막기 위해 부분은 접착성 테이프로 모으고, -20℃에서 공기 건조시키고, 30분간 99% 찬 메탄올에 고정시키고, 대기 건조시킨다. 보존하는 동안에(-20℃)조직의 건조를 피하기 위해 부분은 투명한 필름을 붙여 놓는다.
[면역조직학적 착색]
냉동된 점막, 잇몸 및 치아 견본을 면역 착색하기 위해서, Vectastain ABC rabbit Elite 키트를 이용하였다(Vector Laboratories, Burlingame, C.A., U.S.A.). 내생 과산화효소의 활성을 막기 위해 10-20분간 메탄올에 0.5% H2O2로 선 처리하고 인산완충염(PBS)(3×10분)으로 세척하였다. 과정의 추가 단계에서 항체의 비-특이적 흡착을 저해하기 위해 부분은 37℃에서 30분간 20mg 소혈청 알부민×BSA×/㎖ PBS를 포함하는 PBS에 1:5로 희석된 정상적인 염소 혈청으로 처리한다. 항체는 0.2㎍/㎖ 희석 농도의 것을 이용한다. PBS로 3회 세척 후에 부분은 37℃에서 30분간 1㎎ BSA/㎖ PBS를 포함하는 PBS에 1:250로 희석된 바이오티닐화된 염소 항-토끼 IgG로 처리하였다. 부분은 다시 세척하고 37℃에서 30분간 PBS로 희석된 시약 A와 B의 1:1 혼합물로 배양하고, ABC-착색으로 착색하고 그리고 Glycergel(Dakopatts, Glostrup, Denmark)에 얹는다. 임의 반응 세포/조직의 특징을 결정하기 위해 일부 부분은 헤마토실린으로 반착색을 한다. 좀더 상세한 조직 검사를 위해서는 각 시료의 부분(면역착색할 필요는 없다)은 헤마토실린과 에오신으로 착색한다.
[ELISA-측정]
AP CGF와 타액에서 NGAL에 대한 ELISA-측정은 Kjeldsen, L., et al., European Journal of Haematology 49:180-1992, 1992에 상술된 것과 같이 실행한다.
AP 환자에서는 잇몸이 건강한 대조군 GCF(10-50n9/㎖)에 비하여 치근염 농도로부터 GCF샘플에서 NGAL의 양이 증가되었음(200-300㎍g/㎖)을 알 수 있다. 또한 타액 NGAL-양(＞250ng/㎖)은 AP-환자에서 증가되었음을 볼 수 있고, 샘플은 잇몸이 건강한 대조군 타액 샘플과 연관이 있는 것으로 보인다(50-100ng/㎖).
[결과]
면역조직학적 그리고 ELISA의 데이터를 보면 치근염 잇몸에서 NGAL의 주요 소스는 PMNs이고 PMN NGAL의 증가된 양은 타액 뿐만 아니라 인접한 치근염 GCF에서도 볼 수 있다. 제1도에서는 사람 치조골 점막 냉동 부분의 조직학적(a) 그리고 면역화학적(b-f) 착색을 나타낸다. 상피 표면은 (X)으로 나타내고 (a-c)와 (e)에서 연결 조직은 (CT)로 나타낸다. 막대는 (a-c)와 (e)에서는 150㎛이고, (d)와 (f)에서는 50㎛이다.
헤마토실린과 에오신 착색으로 연결조직아래 있는 파라케라틴화된 중층 인상피 세포에서 분사된 맥관 주변 염증 세포(화살표)를 볼 수 있다.
정상적인 토끼 이뮤노글로블린으로 처리한 대조군 부분에서는 조직의 어느 부분에서도 착색이 나타나지 않는다. 호중구 입상 세포((c-f)에서 작은 화살표는 맥관내 호중구(PMNs)를 가리키고, 큰 화살표는 삼출된 PMNs를 가리킨다)와 연관하여 MMP-9(c,d)와 NGAL(e,f)에 대한 분명한 면역 착색을 볼 수 있다. 확대상태(d, f)에서 볼 수 있는 것과 같이, PMNs는 맥관내에 위치하는 PMNs는 세포질성 면역활성이 증가되고, 삼출된 경우에는 착색 반응은 거의 연결 조직으로 연장되는 것을 볼 수 있다. 연결 조직과 기저막 부분(화살표머리)과 몇몇 섬유아세포(화살표머리)(f)에서 NGAL(s)의 감지 가능한 반응성이 없었다.
국소화된 청소년 치근막염 뿐만 아니라 성인에서 NGAL의 반응성은 주로 PMNs로 구성된 염증세포의 일부와 분명하게 연합되나 또한 연결 조직에서도 약한 착생이 나타난다. 이와 같은 결과로 볼 때, 발명자들은 하기 실시예에서 상술된 것과 같이 단클론 항체를 이용하여 면역크로마토그래프 방법에 기초하여 신속하고 신뢰성 있는 특이적인 좌상 테스트 키트를 개발하였다.
[실시예 2]
[NGAL에 대한 단클론 항체]
NGAL은 Kjeldsen, L., et al., J. Biol Che,. 268:10425-10432, 1993에 상술된 것과 같이 정제하였다. 본 발명을 위한 단클론 항체는 Kohler와 Milsten(Nature 256:495, 1975)의 원 기술에 따라 근본적으로 개발하였다. 그러나, 본 발명자들은 Stenman, et at., J. Immunol Meth. 46:337, 1981)에서 공개된 기술을 특이적으로 사용한다.
[실시예 3]
[면역화, 융합 및 클로닝]
BALB/c 마우스를 NGAL 샘플로 면역화시키고 복막으로 부스트시킨다. 처음 부스트후에 항체 역가(테스트 방법은 하기 실시예 4를 참조)를 가지는 마우스는 염에서 상기 항원 50-100㎍으로 정맥 내로 부스트시킨다. 최종 부스트후에 3-4일 경에 비장세포를 제거하고 비장세포는 폴리에틸렌 글리콜(PEG, boehringer Mannheim Cat. no. 1243268)에서 골수 세포와 융합시킨다. 융합 후에 세포는 7.5% 말 혈청이 포함된 RPMI 1640에서 마이크로플레이트에서 배양하였다. 하루가 지난 뒤, 선택선 HAT 배지(RPMI에서 하이포산틴, 아미노프테린 및 티미딘의 2% 혼합물, Gibco 50×HAT, Cat. No.043-01060H)를 배양물에 첨가한다.
배양 2주후에, 배양물은 HT 배지(아미노프테린이 없는 HAT배지, Gibco 50×HT, Cat. No.043-01065H)로 옮기고 최종 2주후에는 RPMI-1640+7.5% akf 혈청배지로 옮긴다.(하기 방법 참조) 그 다음 선택된 하이브리도마 배양물을 클론한다. 또한 추가 특징화를 위해 항체를 점막 복수 중에서 생산한다.
[실시예 4]
[스크리닝과 적정]
NGAL에 대한 항체 생산을 감지하기 위해, 방사능 검사 방법을 이용하였다.
고도로 정제된 NGAL은 클로라민 T 방법(Greenwood, F.C., et al., Biochem. J. 89:114, 1963)으로 방사능 처리하였고 스크리닝 검사에서 라벨로 이용할 수 있다. 검사에서 미량 적정 플레이트로부터 상층액 50㎕를 0.33% BSA를 포함하는 인산-EDTA-NaCl 완충액, pH 7.4에서125I-라벨된 항원(약 10000cpm)로 배양하였다. 12시간 배양 후에, 결합된 라벨은 인산 완충액에서 소 감마글로블린 100㎕와 인산 완충액에 20% PEG 6000 1㎖을 참가하여 침전시킨다. 침전물에서 방사능 활성을 측정한다. 샘플은 침전된 활성이 배경(배양 상층액 대신에 성장 배지)보다 상당히 큰 경우에 항체 생산에 대해 양성인 것으로 간주하는데 예로써, 결합된 활성은 대조군으로 이용된 다클론 준비물의 최대 결합의 50% 이상이 된다.
적정할 때, 역가는 상당 초과량의 항체에 의해 결합된 특정 라벨의 최대 양의 50% 결합되는 희석액으로 정의된다. 항체를 인지하는 다클론 NGAL은 대조군 항체로 이용된다.
[실시예 5]
[테스트 방법과 특징화]
스크리닝에 의해 양성으로 나타나는 하이브리도마 배양물은 NGAL와 MMP-9 복합된 NGAL을 감지하기 위한 이들의 감응성 및 가장 중요한 교차 반응(예, MMP-9)에 대해 테스트한다. 라벨이 방사능 활성화된 NGAL의 동일한 제제에 RIA방법이 사용되고 한편 스크리닝 테스트에 이용될 수도 있다. 테스트될 표준 또는 교차 반응물의 50㎕ 또는 라벨 100㎕과 항체 용액 50㎕(모두 0.33% BSA를 포함하는 인산 -EDTA-NaCl 완충액, pH 7.4에 있음)을 12 시간 배양한다. 결합된 방사능활성의 분리는 스크리닝 방법과 유사하게 실행한다. 각 항체는 최대 결합의 약 50%정도 결합할 수 있도록 희석한다. 표준은 농도 범위가 1-1000ng/㎖에서 NGAL로 부터 준비한다.
본 발명의 배경에서 언급한 것과 같이 다른 치근막 질환과 연관된 단백질과 효소와의 교차반응에 혼란 없이 그리고 최상의 감응도를 가지는 하이브리도마는 클론을 위해 선택된다. 신규한 단클론의 특이성은 추가 특징화시킨다.
면역측정 방법을 위해서는 동일한 항원분자에 동시에 결합할 수 있는 항체를 한 쌍 준비한다. 따라서, 항체는 분자의 상이한 에피토프를 인지해야 하고 이와 같은 에피토프는 친화성을 상실하게 하는 공간적인 방해 없이 결합이 충분히 일어날 수 있도록 떨어져 있어야 한다. 또한 단클론 항체의 선택도 중요한데 NGAL에 대한 항체의 결합은 MMP-9와 복합체 형성에 의해 방해받지 않는다.
이와 같은 한쌍의 항체를 선택하기 위해, 추천 단클론은 우수한 동시 결합을 발견하기 위해 테스트해야 한다.
[실시예 6]
[치근막 질환의 진행 위험을 예측하기 위한 진단 테스트 방법]
상기 과정에 따라 개발되어 온 NGAL에 특이적인 단클론 항체를 치근막 질환 활성의 평가에 유용한 다양한 테스트 방법을 고안하는데 이용한다. 또는 하기에서 상술하는 것과 같은 정량 및 정성 테스트에 이용한다.
본 발명에 따른 테스트에 이용될 수 있는 최신 원리는 관통 흐름 면역 측정 기술에서 두 개 항체의 이용이다(US 4,366,241). 여기에서, 테스트는 니트로셀룰로오즈 또는 나일론과 같은 것으로 만들어진 막에 의해 덮여진 흡수 물질 패드가 있는 장치에서 가장 잘 실행된다. 이와 같은 막에서 한 종류의 항체가 결합할 수 있는 부위가 있다. 액체 샘플을 막에 피펫팅하고 샘플에 있는 가능한 NGAL은 항체에 결합하게 되고 나머지 샘플은 막을 통과하여 흐르게 된다. 그 다음 라벨된 시약을 첨가한다. 이와 같은 라벨은 제 2 항체(제 1 항체가 인지하지 못하는 에피토프를 인지할 수 있는 단클론 또는 다클론 항NGAL)와 양고추냉이효소와 같은 효소와 공액될 수 있다. 이와 같은 경우에, 막에 임의 NGAL이 결합된 경우, 공액물도 거기에 결합될 것이고 과량의 공액물을 세척해 내고 눈으로 볼 수 있는 색깔을 만드는 침전기질을 라벨 효소에 첨가하여 눈으로 볼 수 있다. 기질은 또한 눈으로 볼 수 없는 것일 수도 있다(예로써, 형광 또는 발광). 적절한 장치에 의해 색깔, 형광 또는 발광의 강도를 측정한 다음, 농도 계산기를 사용하는 경우에 테스트 결과를 정량적으로 얻을 수 있다. 라벨된 시약은 제 2 항체가 피복된 발색(또는 다른 종류의 시그날 생성) 입자(예로써 라덱스로 만든) 현탁액일 수 있다. 여기에서 막의 포어 크기는 막에 면역 화학적으로 결합하지 않는 입자는 포어를 통하여 빠져 나갈 수 있도록 조정한다. 세척단계 후에, 결합된 입자는 눈으로 볼 수 있는 경우에는 직접적으로 또는 시그날 측정에 의해 간접적으로 감지할 수 있다.
치근막 질환 테스트를 고안하기 위해서는 면역크로마토그래티 원리가 유익하게 이용될 수 있다. 이와 같은 기술은 흔히 측면 흐름 기술이라 칭하는데 EP 291194에 상세하게 기술되어 있다(공동 케이스 내에 기본적으로 흡수 물질 패드와 막으로 구성된 테스트 장치를 이용하는 구체예를 포함하고 있다). 또한, WO 94/15215(방 모양의 틈으로 구성된 딥스틱에 흡수 패드와 막으로 구성된 테스트 장치를 이용하는 구체예를 포함한다)에도 상술하고 있다. 두 가지 상이한 항체를 이용하는 면역 측정에서 제 1 항체는 입자가 색을 가지는 경우 눈으로 알아볼 수 있는 라벨로 작용할 수 있는 입자에 피복 한다. 단, 이들이 형광 또는 발광 시그날을 만드는 경우에는 적절한 기구를 이용하여 감지할 수 있다. 입자는 라텍스, 콜로이드성 금속(금, 세렌)으로 만들 수 있다. 이와 같은 라벨 입자들을 테스트 장치에 부착하여 장치의 흡수부분이 액체 샘플과 접촉할 때 샘플이 흡수되고 입자들은 액체 흐름과 함께 이동하고 동시에 라벨된 항체는 샘플에 NGAL이 있는 경우에 항원 NGAL에 결합하게 된다. 액체는 또한 장치에 있는 막에 추가 결합될 수 있다. 막에서 제 2 항체(제 1 항체가 인지하지 못하는 에피토프를 인지하는 단클론 또는 다클론 항NGAL)가 유사 부위에 부착하게 된다. 액체가 이 지역을 통과하여 이동하는 라벨을 가지는 경우에 항원에 결합된 이와 같은 라벨된 입자들도 이 지역에 부착될 것이다. 따라서, 샘플에 항원이 있는 경우에는 이와 같은 지역은 감지될 수 있다.
이와 같은 기술은 단지 하나의 항체만을 이용하는 기술에 기초한다. 예로써, 샘플에 있는 가능한 항체와 경쟁하는 항원 피복된 라벨 입자를 이용하는 것으로 실행할 수 있다. NGAL에 특이적인 단클론 항체는 막에 이 부위에 부착된다. 샘플 항원은 이 지역의 항체 결합 부위를 점령하고 따라서 감지 가능한 지역은 나타나지 않는다.
공지의 표준 또는 미지의 샘플을 이용하는 경우에 막에 결합된 라벨에 의해 생산되는 시그날을 측정함으로써 면역크로마토그래피를 정량화할 수 있다. 테스트 장치에서 이 지역의 항체 량을 증가시키면서 몇 가지 항체 지역을 이용하는 경우에 가시적인 반-정량화를 할 수 있다.
전술한 현대적인 기술은 짧은 시간(수분 내에) 동안에 신속한 좌상 테스트의 개발에 유용하다. 눈으로 직접 볼 수 있는 라벨을 가지는 테스트 버전은 실험실에서 미숙련자도 실행할 수 있고 쉽게 해석할 수 있는 테스트를 제공한다.
정량 테스트 결과를 요구하는 경우 예로써 , 탁도 측정 또는 비탁도 측정 방법이 사용되는 경우에 적합한 기술이 다수 있다. 방사능 동위원소 라벨을 이용하는 전통적인 면역화학적 방법으로 이용할 수 있다(경쟁 검사에서 하나의 항체가 연관된 방사능면역검사와 한 쌍의 항체가 연관된 면역방사능측정). 등위원소 라벨인 대신에 다양한 다른 라벨된 화합물은 관련 방법에 유용하다. 양고추냉이 과산화효소 또는 알칼리 포스포타제와 같은 효소를 면역검사 또는 면역효소측정검사에서 라벨로써 작용할 수 있도록 항체에 공액시킬 수 있고 이때 라벨은 발색계, 형광측정 또는 화학적 발광 기질에 의해 감지될 수 있다. 또는 형광 화합물은 항체에 직접 공액될 수 있고 형광-면역 검사 또는 형광면역측정 검사에 이용될 수 있다. 그러나, 이와 같은 방법은 자동화된 기구 또는 숙련자의 기술을 요하기 때문에 신속한 좌상 테스트를 위한 것은 아니다.
[실시예 7]
[치근막 질환의 위험을 결정하기 위한 부위 특이적 및 스크리닝 테스트]
전술한 모든 테스트 방법은 원칙적으로 부위-특이적 및 스크리닝에서 이용될 수 있는 것이다. 그러나, 관통 흐름 및 면역크로마토그래피 방법은 두 가지 경우에 모두 적합한 신속한 좌상 테스트에 가장 적절하다. 스크리닝 테스트에서 환자의 타액 HE는 구강 세척액에 총 NGAL의 양이 증가되었는 지를 찾아내는 것이 목적이다.
타액은 환자의 구강을 완전하게 양치한 후 파라핀을 씹게 하면 쉽게 모을 수 있다. 또는 다른 타액 분비 자극제를 이용할 수도 있다. 분석하기 전에 견본을 저장할 필요가 있는 경우에는 Omni-SALR(Salive Diagnostic Systems, WA)와 같은 특수 타액 수집 장치를 이용할 수 있다. 또는 테스트는 30초 내지 1분 동안 환자에게 파라핀을 씹게 하고 구강 액을 뱉아 내게 하여 수집된 구강 세척 액으로 실행할 수 있다; 그 다음 환자는 테스트를 위해 받아 둔 3㎖ 수돗물로 구강을 양치한다.
부위 특이적인 테스트에서, 치과의사는 잇몸 주머니 구멍에 필터 페이퍼 스트립을 둠으로써 GCF의 견본을 모을 수 있다. 스트립은 정해진 시간동안에 액체를 흡수하게 둔다. 그 다음 스트립은 샘플 단백질을 추출하게되는 적절한 완충 용액이 있는 시험관으로 옮긴다. 면역크로마토그래피 딥스틱이 사용되는 경우에 딥스틱을 직접 테스트용 튜브에 넣는다. 필터 스트립이외에 다공성 플라스틱 또는 세라믹과 같은 다른 흡수 물질 뿐만 아니라 유기 또는 무기 실리카 화합물을 이용할 수 있는데 이는 편리한 이동을 위해 홀더에 부착되어 있다. 액체는 유리 또는 플라스틱 모세 튜브에 모은다. 마지막으로, 딥스틱형태의 테스트 장치는 잇몸 주머니에 있는 흡수 단부를 포함하고 샘플이 테스트 장치에 직접 흡수될 수 있도록 만든다.
개별 부위에서 질병의 가능성을 배제하거나 임상의가 추가 연구할 수 있도록 하기 위한 부위-특이적 딥스틱은 정량적인 것이다. 적정 감응성과 특이성을 얻기 위해 테스트에서 임계치(삭제하는 농도)를 선택한다. 치근막 질환의 테스트 경우에, NGAL 농도-ELISA-테스트로 결정되는-는 약 50ng/㎖으로써 이는 GCF 샘플에서 양성으로 해석된다. 상응하게 타액/구강 세척액의 스크리닝 테스트에서 ELISA-테스트에 의해 결정된 NGAL의 농도가 약 150ng/㎖ 이상인 경우에는 치근막 질환의 위험이 있다는 것으로 간주된다. 이와 같은 테스트(타액 또는 구강 세척액 샘플로부터) 환자에게서 치근막 질환의 위험 증가를 감지하는 새로운 방법을 제공하여, 학생과 같은 단체를 스크리닝하여 치근막 질환의 발생을 알 수 있는 잇몸 부위를 감지하고 또는 발병 가능 위험이 증가된 집단(예로써, AIDS 환자), 또는 치근막 질환을 보통 사람들에 비해 진단하기가 좀더 난이한 사람들 예로써, 흡연자들에 이용될 수 있다.
[실시예 8]
[NGAL에 대한 좌상 테스트 키트를 제작]
NGAL에 대한 단클론 항체를 좁은 니트로셀룰로오즈 스트립(스트립 1. 50×300mm)에 피복한다. 테스트에서 보통 이상의 NGAL량이 양성 시그날을 발생시킬 수 있도록 항체의 농도를 충분히 낮게 조정한다. 색을 가진 라텍스 입자들은 또 가른 NGAL 항체로 피복한다. 피복된 라텍스 입자들은 흡수성 폴리에틸렌 물질의 스트립 중간(스트립 2. 약 50×300mm)에서 건조시킨다. 입자의 직경은 두 개의 스트립 물질에 있는 구멍을 자유롭게 유동할 수 있도록 충분히 작게 한다. 두 개 스트립은 플라스틱 지지판(약 50×1000mm)에 부착하여 스트립 2의 단부가 액체에 잠길 때 스트립 2로부터 스트립 1로 샘플액이 모세혈관 흐름을 할 수 있도록 접촉시킨다. 과량의 액체를 흡수시키기 위해, 필터 페이퍼 패드는 스트립 2에 반대쪽 스트립 1에 접촉하도록 부착한다. 만들어진 딥스틱은 다음의 지시에 따라 신속한 NGAL의 테스트를 실행하는데 이용될 수 있다.
[면역크로마토그래프 NGAL 테스트의 실행]
1. 딥스틱(스트립 2의 단부)의 한 단부를 샘플액에 담그고 액체 전면이 스트립 1에 닿을 때까지 유지시킨 후 샘플로부터 빼낸다.
2. 5분간 배양한 후 샘플은 스트립에서 이주하고 라텍스 입자들은 딥스틱의 또 다른 단부로 항체 피복된 지역을 지나서 액체와 이동된다.
3. 스트립 1을 관찰한다. 색을 가진 부위가 형성되면 결과는 양성이다.
[실시예 9]
[단클론 항체를 이용하여 치근막질환의 위험을 감지하기 위한 좌상 테스트 키트의 이용]
5명의 환자군을 NGAL-좌상 테스트를 이용하여 치과의사의 사무실에서 치근막 질환에 대해 스크리닝하였다. 치근막염에 대한 잇몸 프로브/또는 다른 측정을 하기 전에 GCF 샘플을 수집하기 위한 필터 페이퍼 스트립(Periopaper GCF 스트립)을 치근막염이 있는 것으로 보이는 치아 구멍(n=5)에 위치시킨다. 30초 후에 샘플 스트립을 제거하고 인산완충액(1㎖)이 있는 테스트 튜브 내로 첨가한다. 스트립에 있는 GCF는 완충액으로 추출한다. 추출액은 실시예 8에서 지시한 바와 같이 NGAL 딥스틱으로 테스트한다. 스틱중 4개에 발색 부위가 나타나는데 이는 GCF추출물에 NGAL(자유 또는 MMP-9와 복합체)가 있다는 것을 나타낸다. 방사선 평가 뿐만 아니라 잇몸 프로브에 의해 잇몸 병소의 존재를 확인하고 양성인 경우 즉, 환자가 NGAL의 수준이 증가됨을 나타내면 적절한 치료를 할 수 있다. 치료의 효과는 특정 기간 주의 깊게 주시한다.
Claims (17)
- 치근막 질환이 있는 지를 감지하는 방법에 있어서, 감지 방법은 다음의 단계로 구성된 면역학적 검사로 실행하는데; 가) 샘플장치를 사용하여 근본적으로 혈액이 없는 치육구액(GCF)을 수득하거나 또는 타액 샘플 또는 구강 세척액을 샘플로 수득하고; 나) 호중구 겔라티나제 연관된 리포칼린(NGAL)을 인지할 수 있는 항체와 샘플을 접촉시키고; 그리고 다) 상기 NGAL이 존재하는 지를 감지하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 감지 방법.
- 제1항에 있어서, 부위-특이적인 감지 방법은 고형 흡수성 샘플형 장치로 샘플을 수득하여 실행하고, 감지 테스트는 샘플링 장치에서 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, PMN세포에서 NGAL의 상승된 수준은 혈액이 없는 CGF 샘플에서 NGAL의 농도가 건강한 사람에 있는 GCF 샘플에서 보다 높은 지를 감지하여 결정하는 것을 특징으로 하는 감지 방법.
- 제1항에 있어서, NGAL의 농도는 면역학적 방법에 의해 정량적, 반-정량적 또는 정성적으로 결정되는 것을 특징으로 하는 감지 방법.
- 제1항에 따른 방법을 이용하여 치근막 질환을 진단 및 치근막 질환의 위험을 예견할 수 있는 용도로 이용되는 테스트 키트에 있어서, 호중구 겔라티나제 연합된 리포칼린(NGAL)을 특이적으로 인지하는 적어도 하나의 항체로 구성된 것을 특징으르 하는 테스트 키트.
- 제5항에 있어서, 항체는 단클론항체인 것을 특징으로 하는 테스트 키트.
- 제5항에 있어서, 키트는 측면 흐름 원리를 기초로하는 면역크로마토그래프 방법으로 만들어지는 것을 특징으로 하는 테스트 키트.
- 제5항에 있어서, 키트는 관통 흐름 원리를 기초로 하는 면역크로마토그래프 방법으로 만들어지는 것을 특징으로 하는 테스트 키트.
- 제6항에 있어서, NGAL을 인지하는 단클론항체에 추가하여 적어도 하나의 제 2 항체로 구성되는데 이때, 제 2 항체는 NGAL을 인지하는 또 다른 단클론항체인 것을 특징으로 하는 테스트 키트.
- 제6항에 있어서, NGAL을 인지하는 단클론항체에 추가하여 적어도 하나의 제 2 항체로 구성되는데 이때, 제 2 항체는 NGAL을 인지하는 다클론항체인 것을 특징으로 하는 테스트 키트.
- 제5항에 있어서, 감지 가능한 라벨로 구성된 것을 특징으로 하는 테스트 키트.
- 제5항에 있어서, NGAL 또는 라벨을 인지하는 항체는 GCF에 있는 NGAL의 농도가 건강한 사람에서 취한 샘플에서의 농도보다 높은 경우에만 양성 시그날을 발생하도록 된 것을 특징으로 하는 테스트 키트.
- 제5항에 있어서, 라벨은 NGAL을 인지하는 또 다른 항체와 결합된 시그날을 만드는 물질인 것을 특징으로 하는 테스트 키트.
- 제5항에 있어서, NGAL을 인지하는 항체는 고형상 또는 불용성 입자에 결합되거나 또는 항체 용액으로 구성된 것을 특징으로 하는 테스트 키트.
- 제5항에 있어서, 하나의 라벨 지역은 NGAL을 인지하는 항체로 피복된 발색입자로 구성되고 또 다른 테스트 지역은 NGAL을 인지하는 또 다른 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 테스트 키트.
- 제15항에 있어서, 항체는 샘플링과 테스트 장치가 복합된 장치에 있는 것을 특징으로 하는 테스트 키트.
- 제5항에 있어서, 항체는 샘플링과 테스트 장치가 복합된 장치에 있는 것을 특징으로 하는 테스트 키트.
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