JP6917722B2 - 口腔の健康状態の評価方法 - Google Patents
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Description
予防歯科の実践のためには、口腔の健康状態を維持又は改善する必要がある。そのため、口腔の健康状態を診断するシステムの開発が盛んに行われている。ここで、「口腔の健康状態」とは、歯周病や齲蝕等の口腔疾患の有無に、唾液の粘つき、口臭の強さ、舌苔の多寡等の様々な愁訴を加えて判断される、現時点での口腔状態、並びに将来の口腔疾患や口腔愁訴の悪化リスクも加えて、総合的に判断されるものである。
そこで、自宅など専門機関以外でも実施できる、簡便な口腔状態のセルフチェック法の開発が求められている。
また、特許文献2に記載のタンパク質バイオマーカーのための唾液プロテオーム分析は、歯周疾患の状態を診断するものであり、口内環境をセルフチェックするものではない。さらに、唾液中のタンパク質プロファイルをクラスター化する必要があるので、特許文献2に記載の方法も、簡便性を欠く。
さらに、特許文献3には、歯肉溝液に含まれる、全血清型IgA量とエラスターゼ量を測定し、これらの量比から活動性歯周炎を生じるリスクを検出又は評価する方法が記載されている。しかし特許文献3に記載の方法では、歯周炎を生じるリスクを唯一の評価項目としており、口腔内の健康状態を総合的に評価するものではない。
また本発明は、前述の評価方法をセルフチェックできる、口腔の健康状態の評価システム、及び口腔の健康状態の評価用キットの提供を課題とする。
具体的には、まず、唾液に含まれるタンパク質量を定量し、定量した値に対して主成分分析を行い、第1主成分のタンパク質と第2主成分のタンパク質を決定した。そして、被験者から採取した唾液に含まれる第1主成分のタンパク質及び第2主成分のタンパク質、それぞれの成分量を定量し、定量した各成分量を指標とすることで、被験者の口腔の健康状態を評価できることを見出した。そして本発明によれば、被験者の口腔の健康状態が相対的に、唾液量が少なく、口腔愁訴を感じている群、口腔状態が良い群、口内細菌数が多く、口腔疾患リスクが高い群、及び恒常性維持能が低下し、歯や歯肉などの口腔状態が悪化傾向にある群のいずれの群に分類されるのかを総合的に評価できることを見出した。
本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。
定量した各成分量から被験者の口腔の健康状態を評価する方法に関する。
定量手段により定量した各成分量から被験者の健康状態を評価する、解析手段、を備える、口腔の健康状態を評価するシステムに関する。
また本発明の口腔の健康状態の評価システム、及び口腔の健康状態の評価用キットは、口腔の健康状態の評価をセルフチェックできる。
ここで「主成分分析」とは、多変数のデータを解析するための統計学の分野では周知の手法であって、観測値の組を直交変換し、線型な相関を持たない特徴量の組によって表示する、統計学的手法である。
本発明において主成分分析は、常法に従い行うことができる。例えば、主成分分析を行うために、対象被験者の複数のタンパク質の定量値データから、相関係数行列又は分散共分散行列、好ましくは相関係数行列を作成する。この行列の固有値と固有ベクトルを求め、最大、2番目の固有値及び固有ベクトルを、それぞれ第1主成分、第2主成分の固有値と固有ベクトルとする。固有値と固有ベクトルから算出される各タンパク質の因子負荷量の絶対値が大きいものを主成分の代表タンパク質とする。以上の操作は、R(https://www.r-project.org/)、SPSS(IBM)などのソフトウェアにて実行できる。
さらに、第1主成分のタンパク質の成分量と、第2主成分のタンパク質の成分量を指標とすることで、被験者の口腔の健康状態の総合的な評価が可能となる。この指標は、各々の主成分を代表する1種以上のタンパク質によって代用することで簡易計測も可能である。
ここで「口腔の健康状態の分類」とは、被験者の口腔の健康状態を相対的に、「唾液量が少なく、口腔愁訴を感じている群」、「口腔状態が良い群」、「口内細菌数が多く、口腔疾患リスクが高い群」、及び「恒常性維持能が低下し、歯や歯肉などの口腔状態が悪化傾向にある群」のいずれかの群に分類することをいう。ここで、「唾液量が少なく、口腔愁訴を感じている群」、「口内細菌数が多く、口腔疾患リスクが高い群」、及び「恒常性維持能が低下し、歯や歯肉などの口腔状態が悪化傾向にある群」の3群を口腔状態が良くない群とする。
より詳細には、口腔の健康状態とは、歯周病や齲蝕等の口腔疾患の有無に、唾液の粘つき、口臭の強さ、舌苔の多寡等の様々な愁訴を加えて判断される、現時点での口腔状態、並びに将来の口腔疾患や口腔愁訴の悪化リスクも加えて総合的に判断されるものである。具体的には、口腔状態が良好であるか、唾液量が減少しているか、口腔細菌数が増えているか、恒常性が低下しているか等の状態を判断することができる。
唾液量が減少すると、口腔内が粘つき且つ口臭がきつくなるが、これらの愁訴は全身的な疲労やストレスに起因する可能性がある。また、口腔細菌数の増加が認められる場合は、口腔内の菌耐性が低下し、舌苔も多い傾向にあり、炎症反応が亢進している可能性がある。さらに、本明細書において「恒常性の低下」とは、例えば老化により菌耐性やその応答性が低下した状態であり、歯や歯肉などの口腔状態が悪化傾向にある可能性がある。また、以上のいずれにも該当しない場合は、口腔内が健常である可能性がある。
具体的には、下記表1に示すタンパク質が挙げられる。なお、表1に記載のAccession Numberはタンパク質データベースUniprot(http://www.uniprot.org/)における番号を記載している。
具体的には、下記表2に示すタンパク質が挙げられる。なお、表2に記載のAccession Numberはタンパク質データベースUniprot(http://www.uniprot.org/)における番号を記載している。
被験者の健康状態に影響するタンパク質の成分量を安定させるため、飲食、喫煙、及び口腔清掃を0.5時間以上、好ましくは1時間以上、5時間以下、好ましくは2時間以下、禁止した後、唾液を採取することが好ましい。飲食、喫煙、及び口腔清掃の禁止時間は、0.5時間以上5時間以下が好ましく、1時間以上2時間以下がより好ましい。
唾液を採取する具体的な方法としては、一定時間口腔内に貯留した唾液を容器に採取する方法、専用の唾液採取デバイスを用いる方法が挙げられる。唾液採取デバイスとしては、Salivette(登録商標、Sarstedt, Germany), Salimetrics(登録商標)Oral Swab (USA), Greiner Bio-One, Saliva Collection System (GBO SCS(登録商標)) (Austria)などを用いることができる。
なお、唾液中のタンパク質成分の検出感度に応じて、適当量の唾液を貯留させる時間を適宜設定することができる。また、採取する唾液量についても、タンパク質成分の検出感度に応じて適宜設定することができる。
また、第1主成分とするタンパク質、及び第2主成分とするタンパク質をそれぞれ1種類若しくは2種類、好ましくは1種類、を選択し、選択した特定のタンパク質のみの成分量を定量する場合は、簡便性の観点から、後述の本発明のキットを用いて第1主成分及び第2主成分とするタンパク質成分の成分量を定量することが好ましい。
イオン化されたタンパク質成分は、質量分析装置により、質量電荷比(m/z)毎に分離され、検出される。質量分析装置としては、四重極型(Q)質量分析計、飛行時間型(TOF)質量分析計、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型(FT−ICR)質量分析計、イオントラップ型(IT)質量分析計、磁場型質量分析計など、およびこれらを連結したタンデム型装置(QqQ、QqTOF、QqIT、TOF/TOF、IT/FT−ICR、QIT/TOFなど)が挙げられる。
イオン化方法と質量分析装置の好ましい組み合わせは、ESIとQ又はITとの組み合わせ、MALDIとTOFとの組み合わせである。
従って質量分析により唾液に含まれるタンパク質成分の定量を行う方法として、(1)ペプチド断片化したタンパク質を、LC−MSやCE−MSなどにより分析し、ペプチドのピーク強度やピーク面積により定量する方法、(2)タンパク質をゲル電気泳動により分析し、スポットを切り出してMALDI−TOFMSやLC−MSによりそのタンパク質を同定し、ゲル中あるいは質量分析装置での信号強度により定量する方法、が一般的にとられる。これらの方法は、Paul Denny, et. al., Journal of Proteome Research, 2008, vol. 7, p. 1994-2006などに記載の方法を参考に実施できる。
限外ろ過には、分画分子量が通常3,000〜20,000Da、好ましくは3,000〜5,000Daの限外ろ過膜を用いる。限外ろ過は、Amicon Ultra(Millipore製)、Vivaspin(GEヘルスケア製)などの遠心フィルターデバイスを用いることができる。
沈殿法では、アセトン、エタノール、イソプロパノール、クロロホルム、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコールなどを試料溶液に添加して、タンパク質を沈殿させる。そして、遠心分離を行いタンパク質を沈殿させ、溶液を除去することでタンパク質成分を回収する。
分離及び精製後の試料溶液は、pHを7〜10の範囲、好ましくはpH7.4〜8.0の範囲とすることが好ましい。上記分離及び精製工程での希釈液や再溶解液に、重炭酸アンモニウム水溶液やトリス緩衝液などを用いることで溶液置換し、pHの調整を行うことができる。
タンパク質の還元は、得られたタンパク質と、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、メルカプトエタノール、トリブチルホスフィン、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィンなどとを混合することで行うことができる。タンパク質の還元後に、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、S-methyl methanethiosulfonate(MMTS)などを用いて、タンパク質のアルキル化を行うことができる。
プロテアーゼを用いた反応条件は、用いるプロテアーゼにより適宜設定することができる。例えば、プロテアーゼ:試料タンパク質=1:20〜1:100(重量比)となるようにタンパク質とプロテアーゼとを混合し、反応温度4〜40℃、処理時間1〜24時間でタンパク質を処理する。
好ましく用いられる有機溶媒としては、アセトニトリル、メタノール、イソプロパノールなどが挙げられ、好ましくはアセトニトリルを用いる。溶離液には添加剤として、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸などを0.01〜0.3%、好ましくは0.05〜0.15%含む。
分離カラムは、逆相モードに使用可能なものを用いることができ、ODSカラムが汎用される。
質量分析装置は、イオン化法がESIであり、MS/MS測定が可能なタンデム型やイオントラップ型装置が一般的に用いられる。タンデム型では、QqQ、Q/TOF、IT/FT−ICRなどの構成装置が用いられる。
(1)DDA(data dependent acquisition)測定を行い、検出されるイオンのm/z値とそのMS/MSスペクトルを得る。この測定データをタンパク質配列データベースと照合し、ペプチドをタンパク質に帰属する。目的タンパク質由来のペプチドのm/z値の抽出イオンクロマトグラムを描き、ペプチドのピーク強度又はピーク面積から定量値を得る。あるいは、目的タンパク質由来のペプチドのスペクトルカウントに基づく定量値を得る。
ここで、ペプチドの帰属は、得られたMS/MSスペクトルに基づく分子量情報とデータベースのタンパク質を同じ酵素で消化したペプチド断片から予想される分子量情報の一致性を、同定エンジンにより解析することにより実行できる。
タンパク質配列データベースとしては、Uniprot、IPIなどを使用できる。また、同定エンジンとしては、MASCOT、SEQUEST、OMSSA、X!TAMDEMなどを使用できる。
上記の定量解析を実行するソフトウェアとして、DeCyder MS, ProteinLynx Global server, Progenesis LC-MS, Scaffold, SIEVE, MaxQuant, SuperHirn, MSightなどを使用してもよい。
(2)SRM(select reaction monitoring)測定を行う。目的タンパク質由来のペプチドのプリカーサーイオンのm/z及びプロダクトイオンのm/zを設定して測定し、クロマトグラム上でペプチドのピーク強度又はピーク面積から、目的タンパク質成分量の定量値を得る。
ペプチドのプリカーサーイオンとプロダクトイオンのm/z組み合わせをあらかじめ調べておく必要がある。このm/z組み合わせは、SRMAtlas(http://www.srmatlas.org/)などを利用して予測し、合成ペプチド標準品などを分析して確認できる。
本発明において、多数の被験者の各タンパク質の成分量の平均値や中央値を基準値に設定し、定量した各成分量と、基準値とを比較することが好ましい。ここで「多数の被験者」とは、10人以上、好ましくは20人以上、200人以下、好ましくは100人以下、の被験者を指す。あるいは、10人〜200人、好ましくは20人から100人、の被験者である。
また、第1主成分及び第2主成分の成分量の各基準値を二軸の交点とするグラフを作成し、各被験者の定量値をプロットし、象限により被験者を分類し、各群の口腔状態の特徴づけることも好ましい。このように分類することで、被験者の健康状態を視覚化できる。被験者の健康状態の視覚化においては、第1主成分量を横軸、第2主成分量を縦軸とし、各基準値にて二軸が直交するグラフがより好ましい。そして、第1主成分の成分量と第2主成分の成分量のそれぞれを軸として交差するグラフの象限により被験者を4群に分類し、そのうち1群を口腔の健康状態が良い群、その他の3群を口腔の健康状態が良くない群とし、被験者を評価することが好ましい。
本発明のシステムには、第1主成分及び第2主成分について、前述した基準値の情報が格納されており、前記解析手段が、定量した各成分量と基準値とを比較して、健康状態を評価することが好ましい。
前記テストストリップは、標識試薬の種類や、標識試薬へのタンパク質の結合量を適宜選択又は調整し、常法に従い作製することができる。
また、成分量を定量するために、テストストリップの検出ラインの発色、発光若しくは蛍光の有無や発色、発光若しくは蛍光の強度を、目視で観察してもよいし、通常の発色、発光若しくは蛍光の検出装置を用いて検出してもよい。
まず、抗原(タンパク質又はペプチド)に対してエピトープが異なる抗体を2種類用意する。抗体は市販品を購入するか、常法(例えば、竹縄忠臣/編 タンパク質実験ハンドブック,羊土社など参照)にて作製することができる。また、アイティーエム社、ホクドー社、和光純薬工業社、ジーンフロンティア社、ジャパン・バイオシーラム社などに、抗体の作製を外注することも可能である。
このような形態のテストストリップを用いる場合、タンパク質試料と、標識抗体(金コロイド標識抗体、ポリマーラテックス標識抗体、蛍光標識抗体、吸光標識抗体など)とを混合する。そして得られた混合物と、吸収部位と反対側のテストストリップ端とを接触させる。
このような形態のテストストリップの作製には、2種類の抗体を使用する。まず、抗体をメンブレンに塗布し、ブロッキング後に乾燥させることで抗体固相化メンブレンを作製する。他方の抗体は、標識体(金コロイド、ポリマーラテックス、蛍光体、吸光体など)と結合させ、標識抗体を作製する。そして、標識抗体をコンジュゲートパッドへ塗布し乾燥する。
また、本発明のキットに用いるイムノクロマトグラフィー用テストストリップは、用途に応じて適当な幅に裁断してもよい。さらに、必要に応じて専用ケースにセットして用いてもよい。
測定試料、又は測定試料と標識抗体との混合物を試料添加部に滴下する。あるいは、測定試料、又は測定試料と標識抗体との混合物にテストストリップを挿入する。測定試料が毛細管現象により抗体固相化メンブレン上の抗体固定ラインまで展開したときには、測定試料中の抗原と標識抗体とが抗原抗体反応により複合体を形成している。そして、抗体が塗布された抗体固相化メンブレンの抗体固定ライン上において複合体が捕捉され、標識体の発色、発光又は蛍光により検出ラインを確認できる。
希釈倍率は、あらかじめテストストリップの検出ラインの発色、発光又は蛍光強度に濃度応答性がある抗原濃度範囲を調べ、唾液中の抗原濃度がその濃度範囲に含まれる希釈倍率を設定する。希釈溶媒には、蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝液、HEPES緩衝液などを用いることができる。
イムノクロマトリーダは、DiaScan(大塚電子社製)、イムノクロマトリーダC11787、C10066-10(浜松ホトニクス社製)などを使用できる。
本発明のキットを用いる際には、基準値の発色、発光又は蛍光の強度の見本と目視で比較してもよいし、数値化した発色、発光又は蛍光の強度で比較してもよい。目視の場合、発色強度の比較が好ましい。
<2>被験者の口腔から採取した唾液に含まれるタンパク質のうち、唾液に含まれるタンパク質成分の主成分分析により決定した、第1主成分及び第2主成分について、それぞれの成分量を定量する、定量手段と、定量手段により定量した各成分量から被験者の健康状態を評価する解析手段、を備える、口腔の健康状態を評価するシステム。
<3>被験者の口腔から採取した唾液に含まれるタンパク質のうち、唾液に含まれるタンパク質成分の主成分分析により決定した、第1主成分及び第2主成分について、それぞれの成分量を定量するためのイムノクロマトグラフィー用テストストリップを有する、口腔の健康状態の評価用キット。
<5>前記2軸が交差する点が、第1主成分の成分量及び第2主成分の成分量それぞれの基準値である、前記<4>項記載の方法、システム又はキット。
<6>被験者の口腔の健康状態を相対的に、唾液量が少なく、口腔愁訴を感じている群、口腔状態が良い群、口内細菌数が多く、口腔疾患リスクが高い群、及び恒常性維持能が低下し、口腔状態が悪化傾向にある群のいずれの群に分類されるかを評価する、前記<1>〜<5>のいずれか1項記載の方法、システム又はキット。
<7>前記第1主成分が、シスタチンSN、プロラクチン誘導性タンパク質、トランスコバラミン1、免疫グロブリンA、酵素原顆粒タンパク質16ホモログB、ムチン7、シスタチンD、リゾチームC、グルタチオンS-トランスフェラーゼP、レグ1タンパク質ホモログ、BPI fold-containing family B member 2、ヒスタチン1、血清アルブミン、α-アミラーゼ、及びシスタチンSAからなる群より選ばれる少なくとも1種のタンパク質、好ましくは、シスタチンSN、プロラクチン誘導性タンパク質、免疫グロブリンA、ムチン7、シスタチンD、リゾチームC、ヒスタチン1、及びシスタチンSAからなる群より選ばれる少なくとも1種のタンパク質、より好ましくはシスタチンSN、である、前記<1>〜<6>のいずれか1項に記載の方法、システム又はキット。
<8>前記第2主成分が、S100A8タンパク質、熱ショックタンパク質70kDa、亜鉛-α2-糖タンパク質、ビタミンD結合タンパク質、多量体免疫グロブリン受容体、リポカリン1、チオレドキシン、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ラクトペロキシダーゼ、及びマトリックスメタロプロテアーゼ9からなる群より選ばれる少なくとも1種のタンパク質、好ましくは、S100A8タンパク質、熱ショックタンパク質70kDa、亜鉛-α2-糖タンパク質、ビタミンD結合タンパク質、リポカリン-1、チオレドキシン、及び好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンからなる群より選ばれる少なくとも1種のタンパク質、より好ましくはS100A8タンパク質、である、前記<1>〜<7>のいずれか1項に記載の方法、システム又はキット。
<10>各タンパク質の成分量の平均値又は中央値を基準値に設定し、定量した各成分量と基準値とを比較し、比較結果から健康状態を評価する、前記<1>〜<9>のいずれか1項に記載の方法、システム又はキット。
<11>第1主成分及び第2主成分の成分量の各基準値を二軸の交点とするグラフを作成し、各被験者の定量値をプロットし、象限により被験者を分類し、各群の口腔状態の特徴づける、前記<10>項に記載の方法、システム又はキット。
<12>口腔の健康状態として、現時点での口腔状態、並びに将来の口腔疾患及び口腔愁訴の悪化リスクを総合的に判断する、前記<1>〜<11>のいずれか1項に記載の方法、システム又はキット。
<13>質量分析装置を用いてタンパク質成分量を定量する、前記<1>、<2>及び<4>〜<12>のいずれか1項に記載の方法又はシステム。
(1−1)被験者
全身疾患及び重度の歯肉炎又は歯周炎等の歯科疾患を有さない健常者男性50名(30代男性3名、40代男性31名、50代男性16名)を被験者とした。
当日起床時から調査開始までの飲食、喫煙、口腔清掃を、約1〜4時間禁止した。
被験者の頭部をやや前傾した姿勢で、座位にて口腔内に貯留した唾液を遠沈管(容量:25mL、ポリプロピレン製、Cat.No.2362-025、IWAKI社製)に吐き出し、10分間で貯留した唾液の重量を計測した。そして、10分間に貯留した唾液量から、1分間あたりの唾液分泌量を算出し、これを唾液流量(g/min)とした。
採取した全唾液は、一部は未処理のまま細菌数の測定に用いた。それ以外は、3,000rpm、4℃で15分間遠心分離後、上清を-80℃で凍結保存した。
未処理の唾液100μL中に含まれる細菌数を、細菌カウンタ(Panasonic Co.)を用いて測定した。
また、唾液上清中に含まれる総タンパク質量を、Advanced Protein Assay(Cytoskeleton Inc.)を用いて測定した。ウシ血清アルブミン(BSA)を水で25〜300μg/mLに希釈した溶液で検量線を作成した。測定方法はキットに付属のプロトコルに従った。
齲蝕の状態(DMFT指数(=被検者全員におけるDMF歯(decayed teeth、missing teeth、及びhilled teeth)の合計/被検者数))、歯周組織の状態(歯肉炎指数(GI指数)、歯周ポケット深さ(PD)、プロービング出血指数(BOP指数))、口腔清掃度(OHI)、及び舌苔の付着状態(WTCI)を歯科衛生士により評価した。
各指標の評価方法の詳細を下記に示す。
齲蝕に罹患している未処置歯をD歯(decayed teeth)、齲蝕が原因で抜去された歯をM歯(missing teeth)、齲蝕に罹患したが処置が終了している歯をF歯(hilled teeth)とし、WHOの口腔診査法(1971)に基づき、DMF歯の合計の平均値を算出した。
全歯の表裏3箇所ずつの歯肉の腫れ及び出血の程度を目視で判定した。そして、下記評価基準により各部位のスコアを算出し、全部位の平均値を算出した。
−評価基準−
0:炎症なし。
1:軽度の炎症で出血が見られない。
2:中程度の炎症が見られる。
3:重度の炎症が見られる。
全歯の表裏の歯肉溝に歯周ポケットプローブを挿入し、先端が歯肉溝底に達した際のプローブの挿入深さを目視で判定し、全部位の平均値を算出した。
全歯の表裏のPDの測定後に歯周プローブを抜き出し、歯肉溝から一時的に出血があるかどうかを目視で判定した。下記評価基準により歯肉出血指数を算出し、全部位の平均値を算出した。
−評価基準−
0:出血がない。
1:点状の出血が見られる。
2:線上の出血が見られる。
全顎を6群に分割して観察し、下記評価基準により各群の歯垢指数(DI)と歯石指数(CI)を算出し、これらの指数の最高値の和(DI+CI)を口腔清掃度(OHI)として算出した。
−歯垢指数(DI指数)評価基準−
0:歯垢の付着なし。
1:歯垢が1/3未満で付着している。
2:歯垢が1/3〜2/3以内で付着している。
3:歯垢が2/3以上で付着している。
−歯石指数(CI指数)評価基準−
0:歯石の付着なし。
1:縁上歯石が1/3未満で付着している。
2:縁上歯石が1/3〜2/3以内で、点状で沈着している。
3:縁上歯石が2/3以上で、板状で沈着している。
舌を6分割して観察し、下記評価基準により、各部位の舌苔の付着状態を算出し、それらの和をWTCI指数として算出した。
−評価基準−
0:舌苔の被覆なし。
1:舌苔が薄く被覆している。
2:舌苔が厚く被覆している。
Visual analogue scale(VAS)による、口腔内のねばつき、疲労感、口臭、及びストレスに関する愁訴アンケートを実施した。
各項目の評価方法の詳細を下記に示す。
左端を「全く口中がネバついていない」、右端を「非常に口中がネバついている」とした100mmのスケールを用いて、調査を行った時点での口腔内のねばつきの感覚に最も当てはまる箇所に縦線を記入した。そして、スケールの左端から、記入した縦線までの距離(mm)を測定し、口腔内のねばつきの指標とした。
左端を「全く疲労がない」、右端を「非常に疲労がある」とした100mmのスケールを用いて、調査を行った時点での疲労感の感覚に最も当てはまる箇所に縦線を記入した。そして、スケールの左端から、記入した縦線までの距離(mm)を測定し、疲労感の指標とした。
左端を「全く口臭ない」、右端を「非常に口臭がある」とした100mmのスケールを用いて、調査を行った時点での口臭の感覚に最も当てはまる箇所に縦線を記入した。そして、スケールの左端から、記入した縦線までの距離(mm)を測定し、口臭の指標とした。
左端を「全くストレスがない」、右端を「非常にストレスがある」とした100mmのスケールを用いて、調査を行った時点でのストレスの感覚に最も当てはまる箇所に縦線を記入した。そして、スケールの左端から、記入した縦線までの距離(mm)を測定し、ストレスの指標とした。
(2−1)試薬、器具
唾液に含まれるタンパク質の解析に、下記の試薬、器具を用いた。
Tris-HCl(pH8.0):遺伝子工学実験用、ニッポンジーン
ウシ血清アルブミン(BSA):SIGMA-ALDRICH
トリプシン:Trypsin Gold、プロメガ
DL-ジチオトレイトール(DTT):分子生物学用、SIGMA-ALDRICH
ヨードアセトアミド:プロテオミクス用、和光純薬工業
トリフルオロ酢酸(TFA):試薬特級、和光純薬工業
0.1%ギ酸含有アセトニトリル:Optima LC/MS、Fisher Scientific
0.1%ギ酸水溶液:Optima LC/MS、Fisher Scientific
水:MilliQ水
限外ろ過フィルター:Amicon Ultra、3K device、0.5mL、Millipore
凍結保存した唾液サンプルを融解後撹拌し、遠心分離した(10,000rpm、10分)。限外ろ過フィルターに、上清300μLと、0.1mol/L Tris-HCl 200μLを入れ、遠心分離した(14,000×g、30分、4℃)。さらに0.1mol/L Tris-HCl 400μLを入れ、遠心分離した(14,000×g、30分、4℃)。前工程を2回繰り返し、フィルターを逆さにして遠心分離し(1,000×g、2分、4℃)、溶液を回収した。
算出したタンパク質濃度をもとに、各サンプルについてタンパク質75μgを1.5mLチューブに入れ、0.1mol/L Tris-HClを加えて、液量を90μLに調整した。ここにReduction solution(0.1mol/L DTT、0.1mol/L Tris-HCl)5μLを加え、56℃で45分放置した。次にアルキル化溶液(0.6mol/L ヨードアセトアミド、0.1mol/L Tris-HCl)5μLを加えて遮光し、37℃で30分放置した。次にトリプシン:タンパク質=1:20(質量比)となるようにトリプシン溶液を加えて、37℃で18時間放置した。反応停止のため、10%TFAを終濃度0.3%となるように加えて撹拌した。
トリプシン消化後の溶液をLC-UVにて測定し、前処理後の各サンプルのペプチド濃度を定量した。BSAをトリプシン消化した溶液を0.1%ギ酸2%アセトニトリル水溶液で0.125〜2μg/μLに希釈した溶液で検量線を作成した。
全サンプルを0.2μg/μLになるように0.1%ギ酸2%アセトニトリル水溶液を用いて希釈し、LC-MSによりタンパク質解析を行った。なお、タンパク質の同定は、Mascot 2.3(Matrix Science)を用いて行った。
測定条件の詳細は、下記に示すとおりである。
(2−4−1)LC-UV
LC:nanoAcquity UPLC(Waters)
UV検出器:Acquity TUV(Waters)
セル容量:10nL
分析カラム:nanoAcquity UPLC BEH130 C18、粒子径1.7μm、内径100μm×長さ100mm(Waters)
トラップカラム:SymmetryC18TrapColumn 180μm I.D.、20mm、5μm
試料ローディング溶液:0.1% ギ酸水溶液/0.1% ギ酸含有アセトニトリル溶液=98/2(体積比)(試料注入後、5μL/minで3分間洗浄)
溶離液A:0.1% ギ酸水溶液
溶離液B:0.1% ギ酸含有80%アセトニトリル水溶液
グラジエント条件:
溶離液B:5-50% for 30min
溶離液B:95% for 15min
溶離液B:5% for 15min
流速:0.4μL/min
注入量:3μL
カラム温度:35℃
検出:UV 214nm(ペプチド結合の吸収)
<LC条件>
液体クロマトグラフ:Ultimate 3000 RSLCnano System(Dionex)
トラップカラム:Acclaim PepMap 100 Nano Trap C18、nanoViper、粒子径3μm、内径75μm×長さ20mm(Thermo)
試料ローディング液:0.1%TFA溶液(試料注入後5μL/minで5分間洗浄)
分析カラム:nanoAcquity UPLC BEH130 C18、粒子径1.7μm、内径100μm×長さ100mm(Waters)
溶離液A:0.1%ギ酸水溶液
溶離液B:0.1%ギ酸含有80%アセトニトリル水溶液
グラジェント条件:溶離液B 2%(Initial to 5min)→溶離液B 50%(125min)→溶離液B 95%(126min)→溶離液B 95%(150min)
流速:0.4μL/min
カラム温度:40℃
試料注入量:5μL(タンパク質として1μg)
分析時間:150min
<MS条件>
質量分析計:TripleTOF 5600+(AB SCIEX)
イオン化法:ナノエレクトロスプレーイオン化(nanoESI)法
極性:Positive
スプレー電圧:2300V
ネブライザーガス:20psi
カーテンガス:20psi
Interface Heater温度:150℃
Declustering Potential(DP):80V
スキャン範囲:m/z 350-1250
スキャン時間:250msec
MS/MS測定:衝突誘導解離(CID)法によるData Dependent Scan
測定モード:High Sensitivity モード
MS/MSスキャン範囲:m/z100-2000
Collision Energy(CE):37V
Collision Energy Spread(CES):15V
Accumulation Time:100msec
Experiment with charge state:2 to 5(which exceeds 150 cps)
Mass Tolerance:50mDa
Maximum number of candidate ions to monitor per cycle:20
Exclude former target ions:15sec
検索エンジン:Mascot サーチエンジンver2.3(Matrix Science)
データベース:Swiss-Prot 2012/04
Enzyme:Trypsin
Static modification:Carbamidomethyl(C)
Variable modification:Oxidation(M)
Maximum missed cleavage:1
Precursor Mass tolerance:±20ppm
Fragment Mass tolerance:±20mmu
半数以上の被験者で同定され、口腔での機能や疾患による変動が報告されている、下記表3に示すタンパク質34種を解析対象とし、各タンパク質由来ペプチドのピーク面積値を算出した。
下記に示す統計解析は、R 3.2.3(http://www.r-project.org)を用いた。
前記(2−5)項で得た、34種のタンパク質の相対定量値(n=50)により、50行×34列のデータ行列を作成した。なお、欠損値は各列の最小値の1/10値を当てはめて補完した。
このデータ行列をRのprcomp関数に適用して主成分分析を行った。
前記(2−6)項で得られた第1主成分軸と第2主成分軸に、被験者50人の主成分スコアをプロットし、象限で4群に分類した。
各群の口内環境の差を検証するため、唾液の性状(唾液流量、唾液中の細菌数、唾液中のタンパク質濃度)、歯科臨床指標、及び愁訴アンケートの結果について、Student's t検定(唾液の性状)又はMann-Whitney U検定(歯科臨床指標、愁訴アンケート)にて群間比較を行った。
(3−1)主成分分析による唾液タンパク質タイプによる被験者分類
第1主成分(以下、「PC1」ともいう。寄与率:27%)と第2主成分(以下、「PC2」ともいう。寄与率:18%)に対するタンパク質の因子負荷量を、図1に示す。なお、各タンパク質の表記は、Accession Numberを用いて行った。また、因子負荷量は主成分と変数との相関係数と捉えられるので、絶対値が1に近いほど主成分に寄与するタンパク質であると言える。
さらに、PC1への寄与が大きいタンパク質(PC1への因子負荷量の絶対値が0.5以上かつPC2への因子負荷量の絶対値が0.5未満)を表4に示す。また、PC2への寄与が大きいタンパク質(PC1への因子負荷量の絶対値が0.5未満、かつPC2への因子負荷量の絶対値が0.5以上)を表5に示す。
一方、図1及び表5に示すように、PC2に寄与するのは、S100A8タンパク質、熱ショックタンパク質70kDa、亜鉛-α2-糖タンパク質、ビタミンD結合タンパク質、多量体免疫グロブリン受容体、リポカリン1、チオレドキシン、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ラクトペロキシダーゼ、及びマトリックスメタロプロテアーゼ9であった。
また、PC1値とPC2値がいずれも負の値を示す群を「A群」、PC1値が負の値を示しPC2値が正の値を示す群を「B群」、PC1値が正の値を示しPC2値が負の値を示す群を「C群」、PC1値とPC2値がいずれも正の値を示す群を「D群」、と分類した。そして、各群に含まれる被験者の人数と、平均年齢を表6に示す。
前記(3−1)で分類したA群〜D群間で、唾液の性状(唾液流量、唾液中の細菌数、唾液中のタンパク質濃度)、歯科臨床指標、愁訴アンケートの結果について群間比較を行った。その結果をそれぞれ図3〜5に示す。
歯科臨床指標に関して、図4に示すように、D群はGI値、BOP値、OHI値がB群やA群よりも高く、歯や歯肉の状態の悪化傾向が認められた。また、舌苔指数については、C群が他群よりも高かった。
愁訴アンケートに関して、図5に示すように、A群では他群との比較で、ネバつきが多く、口臭が強かった。また、全身的な疲労感やストレスは、A群とD群が高かった。
前記A〜D群の口腔状態の比較から、各群の特徴をまとめた。
A群は、唾液流量が少なく、唾液中のタンパク質濃度が高い群である。
A群は、相対的に歯や歯肉の状態は悪くはない。しかし、口腔内のネバつきや口臭などの口腔愁訴が高く、全身的な疲労感やストレスも高い。
B群は相対的に唾液中の細菌数が少なく、唾液流量が多く、歯や歯肉の状態が良好であることから、口腔状態が良好であった。
C群は、他群よりも唾液中の細菌数が顕著に多く、舌苔も多い。口内細菌は、齲蝕や歯周病などの代表的な口腔疾患の原因となるため、唾液中の細菌数が多いC群は、口腔疾病リスクが高い。
D群は、C群に次いで細菌数が多い傾向にあり、歯や歯肉の状態が悪化傾向にある。本来このような口腔状態では、生体の恒常性維持能が働き、抗菌性や抗炎症性タンパク質の発現量が多いと予想される。しかしD群はいずれのタンパク質濃度も低いことから、口腔内の恒常性維持能が低下していると考えられる。
第1主成分タンパク質としてシスタチンSN(後述の図6及び7において、「Cys-SN」と表記する。)を、第2主成分タンパク質としてS100A8タンパク質をそれぞれ検出できるイムノクロマトグラフィー用テストストリップ(ハーフストリップ)を作製し、被験者の唾液の分析を行った。
ホクドー社に依頼し、下記の抗体を用いたイムノクロマトグラフィー用テストストリップ(ハーフストリップ)を作製した。
<シスタチンSN>
抗体1−1(金コロイド標識):Human Cystatin SN Antibody AF1285(R&D)
抗体1−2(ストリップ固定):Cystatin SN Antibody 11568-R111(Sino Biological Inc.)
緩衝液:PBS-T(0.1% BSA、0.1% Tween20含有)
<S100A8タンパク質>
抗体2−1(金コロイド標識):Anti-MRP8+MRP14[No.19] antibody Ab50138(Abcam)
抗体2−2(ストリップ固定):Anti-MRP8+MRP14[No.134] antibody Ab50143(Abcam)
緩衝液:0.1M HEPES pH7.5(0.1% BSA、0.1% Tween20含有)
前記抗体1−1及び2−1をそれぞれ濃度50μg/mLで金コロイド(粒径:40nm、GOLD COLLOID 40nm、Product code. GC40, BBI Solution)に作用させ、金コロイド標識抗体を作製した。
前記抗体1−2及び2−2の濃度をそれぞれ1mg/mLに調整し、メンブレン(素材:ニトロセルロース、商品名:Hi-Flow Plus HFC12004、Cat. No. HF12004XSS、MILLIPORE社製、サイズを25mm×305mmに裁断して使用)に筆塗布した。乾燥後にBSAを含む溶液でブロッキングし再度乾燥した。抗体固定メンブレンをバッキングシート(商品名:バッキングシート9107, 34042/9107、NIPPN社製、サイズ:60mm×300m)に貼り付け、貼り付けた抗体固定メンブレンの上部に吸収パッド(素材:セルロース、商品名:CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS, Cat. NO. CFSP203000、MILLIPORE社製、サイズ:20mm×300mm)を貼り付けた後に裁断し、3層構造のテストストリップを作製した。
被験者15名から安静時の唾液を採取し、遠心分離(10,000rpm、5分、4℃)後の上清を緩衝液で5,000倍希釈し、測定試料を調製した。
前述の各タンパク質検出用金コロイド標識抗体3.5μLを96穴マイクロプレートのウェルに入れ、ここに各測定溶液40μLを添加した。ここに吸収パッド端を上にしてテストストリップ(幅2.5mm×長さ60mm)を挿入し、溶液を展開した。
得られた基準値を2軸の交点として被験者の検出ラインの濃さをプロットし、各象限により被験者を分類した。その結果を図6に示す。さらに、A〜D群のタンパク質検出後のテストストリップの写真を図7(A)〜(D)に示す。ここで、図7(A)はA群の被験者の結果を示し、図7(B)はB群の被験者の結果を示し、図7(C)はC群の被験者の結果を示し、図7(D)はD群の被験者の結果を示す。
Claims (18)
- 被験者の口腔から採取した唾液に含まれるタンパク質のうち、唾液に含まれるタンパク質成分の主成分分析により決定した、第1主成分及び第2主成分について、それぞれの成分量を定量し、
定量した各成分量から、口腔疾患の有無、及び愁訴を含めた、被験者の口腔の健康状態を評価する方法。 - 前記第1主成分の成分量と、第2主成分の成分量のそれぞれを軸として交差するグラフの象限により被験者を4群に分類し、そのうち1群を口腔の健康状態が良い群、その他の3群を口腔の健康状態が良くない群とする、請求項1記載の方法。
- 前記2軸が交差する点が、第1主成分の成分量及び第2主成分の成分量それぞれの基準値である、請求項2記載の方法。
- 被験者の口腔の健康状態を相対的に、唾液量が少なく、口腔愁訴を感じている群、口腔状態が良い群、口内細菌数が多く、口腔疾患リスクが高い群、及び恒常性維持能が低下し、口腔状態が悪化傾向にある群のいずれの群に分類されるかを評価する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1主成分が、シスタチンSN、プロラクチン誘導性タンパク質、トランスコバラミン1、免疫グロブリンA、酵素原顆粒タンパク質16ホモログB、ムチン7、シスタチンD、リゾチームC、グルタチオンS-トランスフェラーゼP、レグ1タンパク質ホモログ、BPI fold-containing family B member 2、ヒスタチン1、血清アルブミン、α-アミラーゼ、及びシスタチンSAからなる群より選ばれる少なくとも1種のタンパク質である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2主成分が、S100A8タンパク質、熱ショックタンパク質70kDa、亜鉛-α2-糖タンパク質、ビタミンD結合タンパク質、多量体免疫グロブリン受容体、リポカリン1、チオレドキシン、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ラクトペロキシダーゼ、及びマトリックスメタロプロテアーゼ9からなる群より選ばれる少なくとも1種のタンパク質である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 被験者の口腔から採取した唾液に含まれるタンパク質のうち、唾液に含まれるタンパク質成分の主成分分析により決定した、第1主成分及び第2主成分について、それぞれの成分量を定量する、定量手段と、
定量手段により定量した各成分量から、口腔疾患の有無、及び愁訴を含めた、被験者の口腔の健康状態を評価する、解析手段、
を備える、口腔の健康状態を評価するシステム。 - 前記第1主成分の成分量と、第2主成分の成分量のそれぞれを軸として交差するグラフの象限により被験者を4群に分類し、そのうち1群を口腔の健康状態が良い群、その他の3群を口腔の健康状態が良くない群とする、請求項7記載のシステム。
- 前記2軸が交差する点が、第1主成分の成分量及び第2主成分の成分量それぞれの基準値である、請求項8記載のシステム。
- 被験者の口腔の健康状態を相対的に、唾液量が少なく、口腔愁訴を感じている群、口腔状態が良い群、口内細菌数が多く、口腔疾患リスクが高い群、及び恒常性維持能が低下し、口腔状態が悪化傾向にある群のいずれの群に分類されるかを評価する、請求項7〜9のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記第1主成分が、シスタチンSN、プロラクチン誘導性タンパク質、トランスコバラミン1、免疫グロブリンA、酵素原顆粒タンパク質16ホモログB、ムチン7、シスタチンD、リゾチームC、グルタチオンS-トランスフェラーゼP、レグ1タンパク質ホモログ、BPI fold-containing family B member 2、ヒスタチン1、血清アルブミン、α-アミラーゼ、及びシスタチンSAからなる群より選ばれる少なくとも1種のタンパク質である、請求項7〜10のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記第2主成分が、S100A8タンパク質、熱ショックタンパク質70kDa、亜鉛-α2-糖タンパク質、ビタミンD結合タンパク質、多量体免疫グロブリン受容体、リポカリン1、チオレドキシン、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ラクトペロキシダーゼ、及びマトリックスメタロプロテアーゼ9からなる群より選ばれる少なくとも1種のタンパク質である、請求項7〜11のいずれか1項に記載のシステム。
- 被験者の口腔から採取した唾液に含まれるタンパク質のうち、唾液に含まれるタンパク質成分の主成分分析により決定した、第1主成分及び第2主成分について、それぞれの成分量を定量するためのイムノクロマトグラフィー用テストストリップを有する、口腔疾患の有無及び愁訴を含めた口腔の健康状態の評価用キット。
- 前記第1主成分の成分量と、第2主成分の成分量のそれぞれを軸として交差するグラフの象限により被験者を4群に分類し、そのうち1群を口腔の健康状態が良い群、その他の3群を口腔の健康状態が良くない群とする、請求項13記載のキット。
- 前記2軸が交差する点が、第1主成分の成分量及び第2主成分の成分量それぞれの基準値である、請求項14記載のキット。
- 被験者の口腔の健康状態を相対的に、唾液量が少なく、口腔愁訴を感じている群、口腔状態が良い群、口内細菌数が多く、口腔疾患リスクが高い群、及び恒常性維持能が低下し、口腔状態が悪化傾向にある群のいずれの群に分類されるかを評価するために用いる、請求項13〜15のいずれか1項に記載のキット。
- 前記第1主成分が、シスタチンSN、プロラクチン誘導性タンパク質、トランスコバラミン1、免疫グロブリンA、酵素原顆粒タンパク質16ホモログB、ムチン7、シスタチンD、リゾチームC、グルタチオンS-トランスフェラーゼP、レグ1タンパク質ホモログ、BPI fold-containing family B member 2、ヒスタチン1、血清アルブミン、α-アミラーゼ、及びシスタチンSAからなる群より選ばれる少なくとも1種のタンパク質である、請求項13〜16のいずれか1項に記載のキット。
- 前記第2主成分が、S100A8タンパク質、熱ショックタンパク質70kDa、亜鉛-α2-糖タンパク質、ビタミンD結合タンパク質、多量体免疫グロブリン受容体、リポカリン1、チオレドキシン、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ラクトペロキシダーゼ、及びマトリックスメタロプロテアーゼ9からなる群より選ばれる少なくとも1種のタンパク質である、請求項13〜17のいずれか1項に記載のキット。
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