KR20150052311A

KR20150052311A - Ｆｔ-ｉｃｒ-ｍｓ/ｍｓ를 이용한 치은염 및 치주염의 바이오마커에 대한 타액 프로테옴의 분석

Info

Publication number: KR20150052311A
Application number: KR1020157009171A
Authority: KR
Inventors: 이언 채플; 앤드류 크리스; 멜리사 그랜트
Original assignee: 코닌클리케 필립스 엔.브이.
Priority date: 2012-09-10
Filing date: 2013-09-10
Publication date: 2015-05-13
Also published as: CN104620110A; US20150219665A1; EP3396383A1; CA2884089A1; JP2015529333A; BR112015004881A2; EP2893353A2; IL237600A0; RU2015113089A; WO2014037924A2; JP6402106B2; WO2014037924A3

Abstract

치주염 질환의 상태를 진단하기 위한 방법은, 치주염의 특정 단계에서 존재비가 변하는 것으로 밝혀진 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 단백질 바이오마커의 세트를 선택함을 포함한다. 단백질 바이오마커의 세트는, 치주염의 상이한 상태들을 구별하기 위해 획득된 치은구액(GCF) 또는 타액 구강 유체 샘플에서의 발현시 동정되고 정량될 수 있다. 변하는 수준의 중증도로의 치주염 구강 질환의 상태, 예를 들면, 치은염, 온건한 치주염, 또는 중증의 치주염을 진단하는 방법은, 치주염의 상이한 단계들을 구별할 수 있는 단백질 바이오마커의 세트를 선택함을 포함할 수 있다.

Description

ＦＴ-ＩＣＲ-ＭＳ/ＭＳ를 이용한 치은염 및 치주염의 바이오마커에 대한 타액 프로테옴의 분석{ANALYSIS OF SALIVA PROTEOME FOR BIOMARKERS OF GINGIVITIS AND PERIODONTITIS USING FT-ICR-MS/MS}

본 출원은, 프로테오믹스(proteomics) 및 생물 정보학(bioinformatics)의 분야에 속한다. 보다 구체적으로, 본 출원은, 단백질 바이오마커의 정량화를 통해 구강 질환, 예를 들면, 치주염의 상태를 다양한 수준의 중증도로 진단하는 것에 관한 것이다.

치은염은, 치육의 연조직 염증에 관여하는 치주 질환의 비-파괴적 형태이다. 치은염은, 전형적으로, 치아에 부착된 세균성 생물막(biofilm) 또는 플라크에 대한 신체적 반응으로서 발생한다. 적절한 치료의 부재시, 치은염은, 치주 질환의 파괴적 형태를 나타내는 치주염으로 진행될 수 있다. 치주염은 보다 온건한 질환으로 시작될 수 있고, 이는 후에 중증의 치주염으로 진행된다. 치주염에는 항상 치은염의 개시가 선행된다.

치주 질환은 성인에서의 치아 상실의 선두적인 원인이다. 따라서, 진단 시험은, 개체가 치주염을 발병하는지의 가능성을 확인하도록 발전되어 왔다. 구강-유체-기반 현장 현시(point-of-case)(POC) 진단학은 의학에서의 각종 진단 시험에 흔히 사용되고, 보다 최근에는 구강 질환의 측정에 적용되고 있다(Tabak, 2007, Ann N Y Acad Sci 1098: 7-14). POC 진단학을 위한 구강 유체의 사용은, 구강암(Li et al., 2004, Clin Cancer Res 10:8442-8450; Zimmerman et al., 2008, Oral Oncol. 44(5):425-9) 또는 HIV 감염(Delaney et al., 2006, Aids 20: 1655-1660)을 검출하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다.

치주 질환은, 현재, 임상 매개변수, 예를 들면, 치주낭 깊이(pocket depth), 탐침시 출혈, 및 방사선 사진을 평가함으로써 진단된다. 이들 매개변수에는 미래의 부착 상실을 예측하는 능력이 결여되어 있고, 과거 질환 활성의 존재에 대한 정보만을 제공한다는 점에서 이들 매개변수는 제한을 갖는다. 또한, 치주 질환 활성에 대해 예측되는 것으로 밝혀진 임상 매개변수는 없었다("Clinical risk indicators for periodontal attachment loss, Journal of Clinical Periodontology 1991: v. 18:117-125"). 현재, 임상 시험(clinical practice)에서의 진단 방법에는 염증, 예를 들면, 비-파괴적 치은염의 개시를 검출하는 능력, 및 미래에 치주염의 파괴적 형태를 발병할 가능성을 동정하는 능력 둘 다가 결여되어 있다.

따라서, 과거 구강 질환 활성의 존재를 인식할 수 있을 뿐만 아니라, 또한, 구강 질환의 초기 단계를 진단 및 평가할 수 있는, 효과적이고, 정확하고, 민감한 구강 유체 진단 방법에 대한 요구가 당해 분야에 존재한다. 치주염의 경우, 구강 유체 진단 방법은, 적어도 건강한 환자와 치은염, 보다 온건한 형태의 치주염, 및/또는 보다 중증인 형태의 치주염을 발병한 환자를 구별할 수 있어야만 한다. 이러한 진단 방법은, 구강 유체 중에 존재하는 특정 단백질 바이오마커의 정량화를 유리하게 포함할 수 있다. 이들 구강 유체는 환자로부터 치은구액(gingival crevice fluid)(GCF) 및/또는 타액으로서 비-침습적으로 획득될 수 있다.

간단한 요약

한 예시적 실시형태에서, 치주염 질환의 상태를 진단하는 방법이 본원에서 입증된다. 상기 방법은, 치은구액(GCF) 샘플 및 타액 샘플 중 하나 이상을 제공하고, 치주염의 특정 상태를 동정하기 위한 단백질 바이오마커의 세트를 선택하고, 선택된 세트의 단백질 바이오마커에서의 발현 수준을 측정하여 치주염 질환의 상태를 진단함을 포함한다.

상기 방법의 한 양상에서, 상기 단백질 바이오마커의 세트는, 치은염 상태와 치주염 상태를 구별하기 위해 선택된다.

상기 방법의 다른 양상에서, 상기 단백질 바이오마커의 세트는, 치주의 건강한 상태와 치주 질환 상태를 구별하기 위해 선택된다.

상기 방법의 또 다른 양상에서, 상기 단백질 바이오마커의 세트는, 온건한 치주염 상태와 중증의 치주염 상태를 구별하기 위해 선택된다.

상기 방법의 몇몇 양상에서, 상기 단백질 바이오마커의 세트는, 헤모글로빈 쇄 알파 및 베타, 탄산 무수화효소 1(International Protein Index 또는 "IPI" #IPI00980674), 및 플라스틴 1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함한다.

상기 방법의 다른 양상에서, 상기 단백질 바이오마커의 세트는, S100-P, 트랜스알돌라제, S100-A8(칼그래뉼린-A), 미오신-9, 헤모글로빈 알파, 및 헤모글로빈 베타로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함한다.

상기 방법의 또 다른 양상에서, 상기 단백질 바이오마커의 세트는, 알파-1-산 당단백질 1 및 2, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9, 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소머라제 A, 및 합토글로빈-관련 단백질(IPI00431645.1)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함한다.

상기 방법의 몇몇의 양상에서, 상기 단백질 바이오마커의 세트는, NADPH 옥시다제 및 알파-N-아세틸갈락토사미니다제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함한다.

상기 방법의 한 양상에서, 상기 단백질 바이오마커의 세트는 알파-N-아세틸갈락토사미니다제를 포함한다.

상기 방법의 다른 양상에서, 상기 단백질 바이오마커의 세트는, 단백질 S100-A11(IPI00013895.1), 단백질 IPI00037070.3, 카탈라제(IPI00465436.4), 콜린 수송체-유사 단백질 2 유도체(IPI00903245.1), 및 티틴 이소형 N2-B(IPI00985334.2)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함한다.

상기 방법의 또 다른 양상에서, 상기 단백질 바이오마커의 세트는 2개 이상의 바이오마커들을 포함한다.

상기 방법의 몇몇의 양상에서, 상기 방법은, 상기 GCF 샘플 및 타액 샘플 둘 다를 제공하고, 상기 GCF 샘플 및 타액 샘플의 프로테옴을 분석함으로써 제1 및 제2 단백질 프로파일들을 생성하고, 제1 및 제2 단백질 프로파일들 사이의 중첩 영역을 측정함을 추가로 포함한다. 상기 단백질 바이오마커의 세트는, 치주염의 상이한 단계들 동안의 중첩 영역 내의 단백질의 존재비(abundance)의 변화를 계산하고, 치주염의 단일 상태 동안 발현된 것 미만 또는 초과인 단백질들을 선택함을 포함하는, 치주염의 특정 상태들을 구별하기 위해 선택된다.

상기 방법의 다른 양상에서, 상기 방법은, 상기 하나 이상의 구강 유체 샘플의 프로테옴을 분석함으로써 단백질 프로파일을 생성하고, 상기 단백질 프로파일을 클러스터링하여 단백질 바이오마커의 세트를 결정함을 추가로 포함한다.

한 예시적 실시형태에서, 치주염 질환의 상태를 진단하기 위한 키트가 본원에서 입증된다. 상기 키트는, 치은염과 치주염을 구별하기 위해 선택된 단백질 바이오마커의 세트를 포함한다.

상기 키트의 양상에서, 단백질 바이오마커의 세트는, 헤모글로빈 쇄 알파 및 베타, 탄산 무수화효소 1(International Protein Index 또는 "IPI" #00980674), 및 플라스틴-1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함한다.

상기 키트의 다른 양상에서, 상기 키트는 치은염 또는 온건한 치주염을 진단하고, 상기 단백질 바이오마커의 세트는 타액 데이터 클러스터 1B, 1D, 1A4, 및 1A5로부터의 하나 이상의 단백질 바이오마커를 추가로 포함한다.

개시되는 방법들 및 키트들이 가질 수 있는 이들 및 다른 양상들, 특성들 및 이점들은, 수반되는 도면을 참조하여, 방법들 및 키트들의 실시형태들의 하기 설명으로부터 명백해질 것이고 설명될 것이며, 여기서,
도 1은, 한 실시형태에 따른 구강 질환의 상태를 진단하는 방법의 플로우-챠트 도해이고;
도 2는, 환자 타액 샘플에 대한 UV 흡광도(mAU) 대 시간(분)의 그래프이다. UV 트레이스(trace)는, 214nm에서의 UV 흡광도를 기록하는 SCX 시스템의 출력(output)으로서 얻어졌다.
도 3은, 환자 GCF 샘플에 대한 UV 흡광도(mAU) 대 시간(분)의 그래프이다. UV 트레이스는, 214nm에서의 UV 흡광도를 기록하는 SCX 시스템의 출력으로서 얻어졌다.
도 4는, GCF 샘플 데이터에 대해, 단백질 존재비의 변화 대 여섯(6)개의 프로테옴 MS 분석 그룹(표 3에 정의됨)을 나타내는 그룹 평균 클러스터링 그래프이다. 그룹 평균 클러스터링은 여섯(6)개의 상이한 클러스터들의 단백질 바이오마커를 동정하였다. 클러스터 1은 대다수의 단백질(243개 단백질)을 함유하였고, 클러스터 2는 19개의 단백질을 함유하였고, 클러스터 3, 5 및 6은 각각 1개의 단백질만을 함유하였고, 클러스터 4는 5개의 단백질을 함유하였다.
도 5는, GCF 샘플 데이터에 대해, 단백질 존재비의 변화 대 여섯(6)개의 프로테옴 MS 분석 그룹(표 3에 정의됨)을 나타내는 제1 라운드 재-클러스터링 그래프이다. 도 4로부터의 클러스터 1은 4개의 클러스터 그룹으로 재-클러스터링되었고, 여기서, 그룹 A는 대다수의 단백질(233개)을 함유하였고, 그룹 B 및 그룹 C는 각각 2개의 단백질을 함유하였고, 그룹 D는 6개의 단백질을 함유하였다.
도 6은, GCF 샘플 데이터에 대해, 단백질 존재비의 변화(밑(base) 2의 대수 척도에 의해 변환됨) 대 여섯(6)개의 프로테옴 MS 분석 그룹(표 3에 정의됨)을 나타내는 제2 라운드 클러스터링 그래프이다. 도 5로부터의 클러스터 A는 4개의 클러스터 그룹으로 재-클러스터링되었고, 여기서, 가장 큰 클러스터(1A1)는 여전히 171개의 단백질을 함유하였고, 클러스터 1A2는 50개의 단백질을 함유하였고, 1A3은 10개의 단백질을 함유하였고, 1A4는 2개의 단백질을 함유하였다.
도 7은, GCF 샘플 데이터에 대해, 단백질 존재비의 변화(밑 2의 대수 척도에 의해 변환됨) 대 여섯(6)개의 프로테옴 MS 분석 그룹(표 3에 정의됨)을 나타내는 최종 라운드 클러스터링 그래프이다. 도 6으로부터의 클러스터 1A1은 4개의 그룹으로 재-클러스터링되었다. 단백질 존재비의 변화가 1.0 크기(magnitude) 미만이므로, 이 분석으로부터 흥미로운 것으로 밝혀지는 클러스터는 존재하지 않았다.
도 8은, 타액 샘플 데이터에 대해, 단백질 존재비의 변화(밑 2의 대수 척도에 의해 변환됨) 대 여섯(6)개의 프로테옴 MS 분석 그룹(표 3에 정의됨)을 나타내는 그룹 평균 클러스터링 그래프이다. 그룹 평균 클러스터링은 다섯(5)개의 상이한 클러스터들의 단백질 바이오마커를 동정하였다. 가장 큰 클러스터(1)는 297개의 단백질을 함유하였고, 클러스터 2 및 5는 각각 1개의 단백질을 함유하였고, 클러스터 3은 11개의 단백질을 함유하였고, 클러스터 4는 3개의 단백질을 함유하였다. 클러스터 2는, 보다 온건한 조건으로부터 중증의 치주염을 구별하는 것으로 밝혀진다.
도 9는, GCF 샘플 데이터에 대해, 단백질 존재비의 변화(밑 2의 대수 척도에 의해 변환됨) 대 여섯(6)개의 프로테옴 MS 분석 그룹(표 3에 정의됨)을 나타내는 제1 라운드 재-클러스터링 그래프이다. 도 8로부터의 클러스터 1은 4개의 클러스터 그룹으로 재-클러스터링되었고, 이들 중 가장 큰 클러스터는 166개의 단백질을 함유하였다(클러스터 1A). 클러스터 1B 및 1D는 각각 14개 및 1개의 단백질을 함유하였다. 이들 두 그룹은, 치은염/온건한 치주염과 중증의 치주염을 구별할 수 있다.
도 10은, GCF 샘플 데이터에 대해, 단백질 존재비의 변화(밑 2의 대수 척도에 의해 변환됨) 대 여섯(6)개의 프로테옴 MS 분석 그룹(표 3에 정의됨)을 나타내는 제2 라운드 재-클러스터링 그래프이다. 도 9로부터의 클러스터 1A는 5개의 클러스터 그룹으로 재-클러스터링되었고, 가장 큰 클러스터는 150개의 단백질을 함유하였다. 존재비 변화의 결여에 근거하여 여기서 임의의 유의한 클러스터는 밝혀지지 않는다.
도 11은, GCF 샘플 데이터에 대해, 단백질 존재비의 변화(밑 2의 대수 척도에 의해 변환됨) 대 여섯(6)개의 프로테옴 MS 분석 그룹(표 3에 정의됨)을 나타내는 제2 라운드 재-클러스터링 그래프이다. 도 9로부터의 클러스터 1C는 3개의 클러스터 그룹으로 재-클러스터링되었다. 7개의 단백질을 함유한 클러스터 1C2는, 단백질 존재비에 있어서 치료 후의 감소 전의 중증의 치주염까지 거의 직선형의 증가를 나타낸다.
도 12는, GCF 샘플 데이터에 대해, 단백질 존재비의 변화(밑 2의 대수 척도에 의해 변환됨) 대 여섯(6)개의 프로테옴 MS 분석 그룹(표 3에 정의됨)을 나타내는 최종 라운드 재-클러스터링 그래프이다. 도 10으로부터의 클러스터 1A1. 5개의 클러스터는, 중증의 치주염(클러스터 1A1b)에 대한 존재비의 증가를 나타내는 단백질의 그룹을 이용하여 관찰되었지만, 다른 그룹으로는 관찰되지 않았다. 이 클러스터에서 동정된 5개의 단백질이 존재하였다.
도 13은, GCF와 타액 샘플 데이터세트 사이의 중첩을 나타내는 벤 다이어그램이다.
도 14는, GCF 및 타액 샘플 병용 데이터에서, 단백질 S100-P의 로그(2) 변환된 존재비 수준 대 여섯(6)개의 프로테옴 MS 분석 그룹(표 3에 정의됨)을 나타내는 클러스터 그래프이다.
도 15는, GCF 및 타액 샘플 병용 데이터에서, 단백질 S100-A8의 로그(2) 변환된 존재비 수준 대 여섯(6)개의 프로테옴 MS 분석 그룹(표 3에 정의됨)을 나타내는 클러스터 그래프이다.
도 16은, GCF 및 타액 샘플 병용 데이터에서, 미오신-9의 로그(2) 변환된 존재비 수준 대 여섯(6)개의 프로테옴 MS 분석 그룹(표 3에 정의됨)을 나타내는 클러스터 그래프이다.
도 17은, GCF 및 타액 샘플 병용 데이터에서, 트랜스알돌라제의 로그(2) 변환된 존재비 수준 대 여섯(6)개의 프로테옴 MS 분석 그룹(표 3에 정의됨)을 나타내는 클러스터 그래프이다.
도 18은, GCF 및 타액 샘플 병용 데이터에서, 헤모글로빈 베타의 로그(2) 변환된 존재비 수준 대 여섯(6)개의 프로테옴 MS 분석 그룹(표 3에 정의됨)을 나타내는 클러스터 그래프이다.

본 출원의 방법 및 키트의 몇몇 실시형태들은, 당해 분야 숙련가들이 개시되어 있는 방법 및 키트를 수행할 수 있도록 하기 위해 첨부된 도면을 참조하여 하기에 보다 상세하게 기술될 것이다. 그러나, 상기 방법 및 키트는, 상이한 형태로 구현될 수 있고, 본원에 제시된 실시형태들에 한정되는 것으로 구성되지 않아야만 한다. 오히려, 이들 실시형태들이 제공되어, 본 개시가 철저하고 완전해질 것이고, 당해 분야 숙련가에게 개시되어 있는 방법 및 키트의 범위를 완전히 전하게 될 것이다. 실시형태들은, 개시되어 있는 방법 또는 키트의 범위를 한정하지 않는다. 실시형태들은, 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정된다. 또한, 수반되는 도면에서 도해된 특정 실시형태의 상세한 설명에서 사용된 용어는, 개시되어 있는 방법 또는 키트에 한정되도록 의도되는 것은 아니다.

본 출원은, 구강 질환, 예를 들면, 치주염의 상태를 진단하는 방법을 상세히 설명한다. 상기 방법은, 바이오마커의 세트의 발현 수준을 측정함을 포함할 수 있다. 단백질 바이오마커의 세트는, 구강 질환의 특정 단계에서 존재비가 변하는 것으로 밝혀진 하나 이상의 단백질 바이오마커를 포함할 수 있다. 따라서, 단백질 바이오마커의 세트는, 구강 질환의 상이한 상태들을 구별하기 위해 발현시 동정되고 정량될 수 있다.

본 출원의 방법은, 변하는 수준의 중증도로의 치주염, 예를 들면, 치은염, 온건한 치주염의 지표로서 작용하는 바이오마커에 대한 역할을 입증한다. 본원에 기술되어 있는 작용은, 상승된 수준의 다중 바이오마커들이 구강 질환, 예를 들면, 치주염의 상태를 정확하고 신속하게 측정하기 위한 도구로서 사용될 수 있음을 입증한다.

본원에서 사용되는 용어 "치주의 건강한 상태"는, 역치 기준 기반이고, 단순히 건강이 모호한 상태는 아니다. 치주의 건강한 상태를 지닌 환자는 1.0의 G.I. 또는 B.O.P.를 갖는 10% 미만의 부위를 나타내고, 2.0 또는 3.0의 G.I.를 갖는 부위는 존재하지 않는다. 추가로, 이들은, 치간 부착 상실을 갖는 부위를 갖지 않고, 3mm 초과의 ppd를 갖는 부위는 존재하지 않는다.

본원에서 사용되는 용어 "치은염 상태"는, 일반적인 치은염을 나타내는 환자에 근거한 역치 기준이고 단순히 모호한 상태는 아니다. 일반적인 치은염은, 2.0 초과의 G.I.를 갖는 30% 초과의 부위를 나타내는 환자에서 나타나고, 치간 부착 상실을 갖는 부위는 존재하지 않고, 4mm 초과의 ppd를 갖는 부위는 존재하지 않는다.

본원에서 사용되는 용어 "온건한 치주염 상태"는 온건 내지 중간 정도의 치주염을 나타내는 환자에 근거한 역치 기준이고 단순히 모호한 상태는 아니다. 온건 내지 중간 정도의 치주염은, 5 내지 7mm의 ppd 및 8개 초과의 치아에서 2 내지 4mm의 치간 CAL을 나타내는 환자에서 나타난다.

본원에서 사용되는 용어 "중증의 치주병적 상태"는 중증의 치주염을 나타내는 환자에 근거한 역치 기준이고 단순히 모호한 상태는 아니다. 중증의 치주염은, 7mm 초과의 ppd 및 12개 초과의 치아에서 5mm 초과의 치간 CAL을 나타내는 환자에서 나타난다.

본원에서 사용되는 용어 "바이오마커"는, 객관적으로 측정되어 정상의 생물학적 프로세스, 병원성 프로세스, 또는 치료학적 개입에 대한 약리학적 반응의 지표로서 평가되는 물질을 의미한다.

본원에는 구강 질환의 선택 상태의 지표인 예후 단백질 바이오마커의 측정에 의해 구강 질환의 상태를 진단하는 방법이 제공된다. 예시적 실시형태에서, 구강 질환은 치주염이고, 단백질 바이오마커는 치은염, 온건한 치주염, 또는 중증의 치주염 중 어느 하나의 지표이다.

변하는 상태의 구강 질환을 지닌 환자로부터 채취한 치은구액(GCF) 및 타액 샘플의 프로테옴 분석을 통해, 별도의 상의 치주염 동안의 존재비가 증가되거나 감소되는 단백질 바이오마커를 동정할 수 있다. 하나 이상의 단백질 바이오마커를 단독으로 또는 병용하여 사용하여 건강한 환자, 치은염을 앓고 있는 환자, 및 온건한 또는 중증의 치주염을 앓고 있는 환자를 구별할 수 있다.

프로테옴 분석은 액체 크로마토그래피 및 질량 분광측정 기술의 병용을 통해 수행될 수 있다. 특히, GCF 및 타액 구강 액체 샘플의 프로테옴은 Fourier Transform - 탠덤 질량 분광측정(FT MS/MS)에 의해 분석할 수 있다. FT MS/MS 프로테옴 접근법은, 건강한 상태와 이환 구강 상태를 구별할 바이오마커의 패널을 시도하고 해명하기 위해서, 치주상 건강한 지원자들, 치은염을 지닌 지원자들, 온건한 치주염 및 중증의 치주염을 지닌 지원자들, 및 무치아 지원자들(무치아 대조군)로부터 수집된 GCF 및 타액 샘플에 적용될 수 있다. 특히, FT MS/MS 접근법은, 치은구액(GCF) 및 자극된 타액의 비-추정적 프로테옴 분석의 사용을 통해, 치주 건강과 질환을, 치은염과 치주염을, 그리고, 온건한 치주염과 중증의 치주염을 구별할 수 있는 신규한 단백질 바이오마커를 발견하기 위해 시작될 수 있다.

본 발명자들은, 놀랍게도 특정 단백질 바이오마커의 소세트의 발현을 측정하여 치은염 또는 온건한 치주염을 동정할 수 있음을 발견하였다. 이들 단백질 바이오마커는, 치은염/치주염의 온건한 질환 상태 동안의 존재비에 있어서 향상된 변화(증가 또는 감소)를 나타내고, 치주염의 중증의 상태 동안에는 거의 변화를 나타내지 않는다. 추가로, 특정 단백질 바이오마커의 소세트의 발현을 측정하여 중증의 치주염을 동절할 수 있다. 이들 단백질 바이오마커는, 치주염의 중증의 상태 동안의 존재비에 있어서 향상된 변화(증가 또는 감소)를 나타내고, 치은염 및 치주염의 온건한 상태 동안에는 거의 변화를 나타내지 않는다. 온건한 치주염 또는 치은염에 비하여 중증의 치은염을 동정하고 구별하기 위한 단백질 바이오마커의 세트.

도 1과 관련하여, 구강 질환의 상태를 진단하는 방법(S100)은 S101에서 시작한다. 예시적 실시형태에 따르면, 상기 구강 질환은 치주염이고, 치주염의 상태로는 치주 건강, 치은염, 온건한 치주염, 및 중증의 치주염이 포함될 수 있다.

S102에서, 하나 이상의 구강 유체 샘플이 제공된다. 한 실시형태에 따르면, 구강 질환은 치주염이고, GCF 및 타액 샘플 중 하나 이상이 제공된다. 샘플은 환자로부터 비-침습적으로 수집될 수 있다.

S104에서, 단백질 프로파일은, GCF 및 타액 샘플 중 하나 이상의 프로테옴을 분석함으로써 생성된다. 다른 실시형태에서, 단백질 프로파일은, LC FT MS/MS를 이용하여 발견된다.

S106에서, 단백질 프로파일은, 단백질 바이오마커의 세트에서 작용하기에 가장 적합한 단백질이 어떤 것인지를 결정하도록 클러스터링된다. 클러스터링은, 주성분 분석, 감마 통계학, 및 미터 다차원 척도법(MMDS)을 포함하는 통계학적 방법의 조합을 이용하여 수행할 수 있다. 한 실시형태에서, 그룹 평균 링크 계층적 클러스터링을 사용하여 단백질 바이오마커의 세트를 결정한다. 다른 실시형태에서, 완전 링크 계층적 클러스터링 방법을 사용하여 단백질 바이오마커의 세트를 결정한다.

S108에서, 단백질 바이오마커의 세트는, 구강 질환의 상이한 상태들을 구별하기 위해 선택된다. 한 실시형태에서, 구강 질환은 치주염이고, 단백질 바이오마커의 세트는, 치은염과 치주염을 구별하기 위해 선택된다. 다른 실시형태에서, 구강 질환은 치주염이고, 단백질 바이오마커의 세트는, 온건한 치주염과 중증의 치주염을 구별하기 위해 선택된다.

S110에서, 선택된 세트의 단백질 바이오마커에서의 단백질의 발현 수준을 측정하여 구강 질환의 상태를 진단한다.

당해 방법의 한 양상에 따르면, 구강 질환의 상태를 진단하는 방법은, 하나 이상의 구강 유체 샘플을 제공하고, 하나 이상의 구강 유체 샘플의 프로테옴을 분석함으로써 단백질 프로파일을 생성하고, 단백질 프로파일을 클러스터링하여 단백질 바이오마커의 세트를 결정하고, 구강 질환의 특정 상태들을 구별하기 위해 단백질 바이오마커의 세트를 선택하고, 선택된 세트의 단백질 바이오마커에서의 발현 수준을 측정하여 구강 질환의 상태를 진단함을 포함한다.

당해 방법의 또 다른 양상에 따르면, 치주염 질환의 상태를 진단하는 방법은, 치은구액(GCF) 및 타액 샘플 중 하나 이상을 제공하고, 치주염의 특정 상태를 동정하기 위한 단백질 바이오마커의 세트를 선택하고, 선택된 단백질 바이오마커에서의 발현 수준을 측정하여 구강 질환의 상태를 진단함을 포함한다.

당해 방법의 몇몇 양상에서, 바이오마커의 세트는, 치은구액(GCF) 및 타액의 프로테옴을 분석함으로써 선택된다. 프로테옴 분석은, 변하는 상태의 치주염에서 발현되는 것 미만 또는 초과인 것으로 동정되는 단백질의 Fourier Transform - 탠덤 질량 분광측정(FT MS/MS) 분석을 포함할 수 있다.

당해 방법의 다른 양상은, 바이오마커는 질환 상태의 진단에 유용한 단 하나의 특정 바이오마커 또는 특정 바이오마커들의 조합을 포함할 수 있다. 1개, 2개, 또는 그 이상의 단백질 바이오마커의 발현 수준을 측정하여 구강 질환의 상태를 결정한다. 추가의 양상에서, 3개, 4개, 5개, 또는 그 이상의 바이오마커들을 측정하여 구강 질환의 상태를 결정하는데 사용한다.

당해 방법의 각종 양상에서, 하나 이상의 단백질 바이오마커는, 헤모글로빈 쇄 알파 및 베타, 탄산 무수화효소 1(International Protein Index 또는 "IPI" #IPI00980674), 및 플라스틴 1로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 이 양상에 따른 방법은, 건강한 상태, 치은염 상태, 치주염의 온건한 상태, 및 중증의 상태를 구별하기 위해 사용할 수 있다.

당해 방법의 또 다른 양상에서, 하나 이상의 단백질 바이오마커는, S100-P, 트랜스알돌라제, S100-A8(칼그래뉼린-A), 미오신-9, 헤모글로빈 알파, 및 헤모글로빈 베타로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 이 양상에 따른 방법은, 치주염의 중증의 상태를 동정하고, 온건한 상태, 예를 들면, 온건한 치주염 및 치은염으로부터 치주염의 중증의 상태를 구별하기 위해 사용할 수 있다.

개시되어 있는 방법의 몇몇의 양상에서, 하나 이상의 단백질 바이오마커는, 알파-1-산 당단백질 1 및 2, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9, 펩티딜-프로필 시스-트랜스 이소머라제 A, 및 합토글로빈-관련 단백질(IPI00431645.1)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 이 양상에 따른 방법은, 치주염의 중증의 상태를 동정하고, 온건한 상태, 예를 들면 온건한 치주염 및 치은염으로부터 치주염의 중증의 상태를 구별하기 위해 사용할 수 있다.

당해 방법의 또 다른 양상에서, 단백질 바이오마커 알파-N-아세틸갈락토사미니다제는, 치은염 또는 온건한 치주염 상태를 동정하고, 중증의 치주염 상태로부터 이들을 구별하기 위해 선택된다.

당해 방법의 추가의 양상에서, 하나 이상의 단백질 바이오마커는, 치은염 또는 온건한 치주염을 동정하고, 중증의 치주염 상태로부터 이들을 구별하기 위해 NADPH 옥시다제 및 알파-N-아세틸갈락토사미니다제로부터 선택된다.

몇몇의 양상에 따르면, 구강 질환의 상태를 진단하는 방법은, GCF 및 타액 샘플을 제공하고, GCF 샘플 및 타액 샘플의 프로테옴을 분석함으로써 제1 및 제2 단백질 프로파일을 생성하고, 제1 및 제2 단백질 프로파일 사이의 중첩 영역을 측정함을 추가로 포함한다. 치주염의 특정 상태들을 구별하기 위해 단백질 바이오마커의 세트를 선택하는 것은, 치주염의 상이한 단계들 동안의 중첩 영역 내의 단백질의 존재비의 변화를 계산하고, 치주염의 단일 상태 동안 발현된 것 미만 또는 초과인 단백질들을 선택함을 포함할 수 있다.

또 다른 양상에서, 이전의 실시형태들에 의해 개시되는 구강 질환의 상태를 진단하는 방법은, 진단학적 키트에 의해 수행된다. 진단학적 키트는, 구강 질환의 상태를 동정하기 위한 단백질 바이오마커의 세트를 포함한다. 상기 키트는, 개시되는 방법의 검정을 수행하기 위해 필요한 시약을 포함한다.

본 출원은 각종 실시형태 및 실시예의 관점에서 기술되었지만, 당해 분야 숙련가들에게는 변이 또는 향상이 발생할 것임이 이해된다. 따라서, 특허청구범위에 나타낸 바와 같은 제한들만이, 개시되어 있는 실시형태에 대해 인정되어야만 한다.

실시예

실시예 1

치은구액(GCF) 및 타액의 프로테옴을 분석하여 상이한 구강 질환 상태, 예를 들면, 치은염, 온건한 치주염, 및 중증의 치주염에 대한 바이오마커를 동정하였다. GCF 및 타액 샘플은, 몇몇의 환자의 입으로부터 비-침습적으로 수집하였다. 샘플 내로부터 단백질 바이오마커를 분리하기 위해, 그리고, 단백질 바이오마커를 동정하기 위해, Fourier Transform - 탠덤 질량 분광측정(FT MS/MS)과 커플링된 액체 크로마토그래피 기술을 이용하였다.

건강한 상태와 이환 구강 상태를 구별할 바이오마커의 패널을 시도하고 해명하기 위해서, 치주상 건강한 지원자들, 치은염을 지닌 지원자들, 온건한 치주염 및 중증의 치주염을 지닌 지원자들, 및 무치아 지원자들(무치아 대조군)로부터 수집된 샘플에 FT MS/MS 프로테옴 접근법을 적용하였다. 특히, FT MS/MS 접근법은, 치은구액(GCF) 및 자극된 타액의 비-추정적 프로테옴 분석에 의해,

1. 치주 건강과 질환을 구별할 수 있고,

2. 치은염과 치주염을 구별할 수 있고,

3. 온건한 치주염과 중증의 치주염을 구별할 수 있는 신규한 단백질 바이오마커를 발견하기 위해 시작되었다.

연구 계획

5개의 그룹의 환자 지원자들을 표 1에 정의된 바와 같이 모집하였다. 본 연구는, 임상학적으로 표시될 수 있는 일상적 치료 이외의 계획된 개입 부재 하의 단면 연구로서 수행하였다. 샘플링을 위해 기저선에서 1회의 방문만이 요구되었지만, 그룹 3 및 그룹 4에서의 방문은 일상적 치주 스케일링, 루트 표면 변연절제술(root surface debridement) 및 예방을 필요로 하였고, 따라서, 이들의 치료요법의 완료 3개월 후 재-검사 및 샘플링되었다. 따라서, 종단 분석은 그룹 3 및 그룹 4에 대해 이용가능하였다. 숙련된 연구 치과의에 의해 임상학적 평가를 수행하였다.

샘플 수집

지원자들은, 표준 필터 페이퍼 스트립(Periopapers™) 상에 비-침습적으로 치은(치육) 연(margin)으로부터 수집된 GCF의 6개의 샘플을 제공하도록 요구되었다. 또한, 이들은, 5분 동안 이들의 입 주위에 멸균 구슬(marble)을 롤링함으로써 자극된 타액 샘플을 제공하고, 체적 측정을 위해 눈금이 있는 멸균 유리 수집 바일에 뱉도록 요구되었다.

5개의 명백히 정의된 표현형 그룹들: 건강, 치은염, 온건한 치주염, 중증의 치주염, 및 a-ve 대조군 그룹으로서의 무치아 환자 각각에서 10명의 지원자들로부터 GCF 및 타액을 수집하였다. 따라서, 총 50명의 환자를 모집하였고 샘플링하였다. 이어서, 치주염을 지닌 지원자들(그룹 3 & 4)은, 치주 염증을 제거하고 향상된 건강을 회복하기 위해 비-외과적으로 치료하였다. 또한, 이들 2개의 그룹에서 치료 3개월 후에 GCF 및 타액을 수집하여 종단 데이터를 제공하였다.

표 2는, 5개의 표현형 그룹을 나타내는 50명의 환자들로부터 수집된 기저선 및 치료요법 후 시점에서의 평균 임상학적 데이터를 제시한다. 5개의 명백히 정의된 표현형 그룹들: 그룹 I(건강), 그룹 II(치은염), 그룹 III(온건한 치주염), 그룹 IV(중증의 치주염), 그룹 V(음성 대조군 그룹으로서의 무치아 환자) 각각에서 10명의 지원자들로부터 GCF 및 타액 샘플을 수집하였고, 여기서, 표현형 그룹은, 사전에 정의된 임상학적 데이터 역치에 근거하여 정의된다. 치주염을 지닌 지원자들(그룹 3 & 그룹 4)은, 치주 염증을 제거하고 향상된 건강을 회복하기 위해 비-외과적으로 치료하였고, 따라서, "기저선" 및 "검토" 임상학적 데이터 둘 다를 갖는다.

샘플 프로세싱

GFC 샘플

지원자당 6개의 치아의 근심-협측(mesio-buccal) 부위로부터 30초 동안 페리오페이퍼 스트립 상에 GCF 샘플을 종래와 같이 수집하였고, 체적은 Perotron 8000™ 상에서 판독하였다(Chapple et al 1999). 이들을 1.5mL 스크류 탑 동결-튜브(screw top cryo-tube) 내의 100mM 중탄산 암모늄 완충액 400μL에 넣었다. GCF 샘플을 즉시 -80℃로 동결시켰다. 분석하기 전에, GCF를 빙상에서 해동하였다. 튜브를 30초 동안 와류시켰고, 용액을 깨끗한 스탭탑 에펜도르프 튜브에 제거하였다. 200μL의 중탄산 암모늄(100mM)을 스트립에 첨가하였다. 이들을 30초 동안 재-와류시켰고, 13,000RPM으로 5분 동안 재-원심분리하였다. 용액을 제거하였고, 상기에 첨가하였다. 그룹 내의 각각의 샘플로부터 150μL를 합하여 그룹당 단일 "풀링된" 샘플을 제공하였다. 개별 환자 샘플은, 일단 바람직한 바이오마커 패널이 설명되면 환자-특이적 수준에서 연구-후 재-평가를 가능하게 하기 위해 다시 보관하였다. 따라서, 6 x 1.5mL의 "집단" 샘플은, 표 3에 나타낸 MS에 의한 프로테옴 분석을 위해 이용가능하였다.

타액 샘플

타액 생산물을, 멸균 구슬을 이용하여 자극하였고, 15mL Falcon 튜브에 5분 동안 수집하였다. 튜브를 -80℃에서 동결시켰다. 분석 전에, 타액을 4℃에서 해동시켰다. 해동시키기 전에, 정제된 타액을 이동시키기 위한 추가의 falcon 튜브를 칭량하였다. 일단 해동되면, 타액을 1.5mL 스냅탑 에펜도르프 튜브에 분획하였고, 13,000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청을 미리-칭량된 튜브에 이동시켰다. 또한, 잔사 펠렛을 잠재적 미래 분석을 위해 보유하였다. 타액의 중량 및 체적 둘 다를 기록하였다. 그룹당 10.5μL의 각각의 타액 샘플을, GCF 샘플과 동일한 방식으로 합하였다. 그러나, GCF와는 달리, 무치아 환자 그룹(그룹 5)으로부터의 타액은 이용가능하였고, 따라서, 총 7 x 105μL의 "집단" 타액 샘플을 얻었다. GCF에 관해서, 개별 환자 샘플은, 미래 "환자-수준" 분석을 가능하게 하기 위해 다시 보관하였다. 풀링된 타액 샘플을 13,000RPM에서 5분 동안 원심분리하였고, 100μL를 보유하였다. 이는, 잔사를 최종 샘플에 이동시키지 않음을 확실히 하기 위해서였다. 중탄산 암모늄(100μL, 200mM)을 각각의 샘플에 첨가하였다.

LC FT MS/MS에 의한 샘플 분석

디티오트리에톨을 GCF 및 타액 샘플 둘 다에 첨가하였고(20μL, 50mM), 60℃에서 45분 동안 진탕하면서 항온배양하여 임의의 디설파이드 결합을 감소시켰다. 상기 샘플들은, 요오도아세트아미드(100μL, 22mM)를 첨가하고 암소의 실온에서 25분 동안 항온배양하기 전에 실온에 돌려 보내었다. 요오도아세트아미드는 시스테인 잔기 상의 유리 티올 그룹을 알킬화한다. 디티오트레이톨(2.8μL, 50mM)을 첨가하여 임의의 잔존하는 요오도아세트아미드를 켄칭시켰다. 1㎍의 Lys-C(리신 잔기의 C 말단에서 단백질을 개열시킴)를 각각의 샘플에 첨가하였고(1:100 효소:단백질), 37℃에서 4시간 동안 진탕하면서 항온배양하였다. 2㎍의 트립신(리신 및 아르기닌 잔기의 C 말단에서 단백질을 개열시킴)을 첨가하였고, 소화는 37℃에서 밤새 계속되었다.

샘플은, 탈염(iTRAQ 표지화에 요구됨)시키기 전에 진공 원심분리 건조시켰다. 샘플을 산성화시켰고(200μL, 0.5% TFA), Macrotrap(Michrom)을 이용하여 탈염을 수행하였다. 트랩을 아세토니트릴(3x 50%, 200μL)로 적시고, 이어서, 트리플루오로아세트산(3x 0.1%, 200μL)으로 세척하였다. 이어서, 샘플을 트랩을 통해 부하하였고, 용출물은 다시 트랩을 통과시켰다. 트랩을 트리플루오로아세트산(3x 0.1%, 200μL)으로 다시 세척하였고, 마지막으로, 펩타이드를 아세토니트릴(70%, 100μL)을 이용하여 용출시켰다. 샘플을 진공 원심분리 건조시켰다.

건조 샘플은, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이 iTRAQ 8-plex 표지로 표지화하였다. 표지화는, 모든 샘플이 후속적으로 함께 혼합되어 한 세트의 조건 하에 삼중으로 수행되게 한다. 후속적으로, 개별 그룹 샘플은 iTRAQ 표지로부터 동정되었다.

샘플은, GCF 및 타액 각각에 대해 모든 개별 샘플을 함께 혼합하기 전에 실온에서 2시간 동안 표지와 함께 항온배양하였다. 합한 샘플들(1개의 풀링된 타액 및 1개의 풀링된 GCF)을 진공 원심분리 건조시켰다. 샘플은 SCX 시스템(10mM KH₂PO₄, pH 3, 20% MeCN)에 대한 이동상 A의 100 중에 재-현탁시켰다. 상기 이동상 A 및 이동상 B(10mM KH₂PO₄, 500mM KCl, pH 3, 20% MeCN)를 이용하는 강한 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 펩타이드를 분리하였다. 농도 구배는 90분 동안 수행하였다. 15개의 분획을 수집하였다. 분획 15 및 분획 12를 합하였고, 분획 13 및 분획 14를 합하여 13개의 분획을 제공하였다.

도 2 및 도 3을 참조하여, 214nm에서 기록된 UV를 이용하여 얻어진 SCX UV 트레이스는 타액 샘플 및 GCF 샘플 각각에 대해 나타낸다. 이어서, 타액 및 GCF 샘플은, 상기와 같은 Macrotrap LC 컬럼으로 탈염시키고, 진공 원심분리시키고, 0.1% 포름산 200μL 중에 재-현탁시켰다. 20μL의 샘플을 2개의 집팁(ziptip)을 이용하여 탈염시키고, 20μL 중에 용출시켰다.

분획 분석

각각의 분획을 LC-MS/MS에 의해 삼중으로 분석하였다. 펩타이드를, 이동상 A(0.1% 포름산) 중의 150mm Acclaim PepMap100 C18 컬럼 상에 부하하였다. 펩타이드는, 350nl/분의 유속으로 3.2% 내지 44%의 이동상 B(아세토니트릴 + 0.1% 포름산)로부터의 선형 농도구배에 걸쳐 분리되었다. 이어서, 컬럼은, 3.2% 이동상 B로 재-평형화시키기 전에 90% 이동상 B로 세척하였다. 컬럼 오븐을 35℃로 가열시켰다. LC 시스템은, 1.7kV의 스프레이 전압으로 펩타이드를 융합시키는 Advion Triversa Nanomate(Advion, Ithaca, NY)에 커플링되었다. 펩타이드는 LTQ-Orbitrap Velos ETD(Thermo Fischer Scientific, Bremen, Germany)에 직접 융합되었다. 질량 분광측정기는 완전 FT-MS 스캔(m/z 380-1600)을 수행하였고, 후속적 충돌은 3개의 가장 풍부한 이온의 해리(CID) MS/MS 스캔을 유도하였고, 이어서, 동일한 3개의 이온의 보다 높은 에너지의 충돌성 해리(HCD)를 유도하였다. CID 스펙트럼을 이용하여 펩타이드를 동정하였고, HCD 스펙트럼을 이용하여 이들을 정량하였다.

데이터 분석

데이터는, Proteome Discoverer(V1.2, Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 분석하였다. 데이터는 기술적 반복으로서 분석되었다. Mascot 및 SEQUEST 알고리듬을 이용하여, 사용된 동일한 설정으로 데이터를 연구하였다. 데이터베이스는, Socransky에 의해 기술되어 있는 구강 세균이 보충된 IPI 사람 데이터베이스였다. 이러한 데이터베이스는, 오류 발견률(false discovery rate)을 제공하기 위한 리버스 버젼(reverse version)과 연관되었다. 하기 설정으로 데이터를 연구하였다: 세미트립십은, 최대 2개의 손실된 개열을 갖는 효소로서 선택되었고, 전구체 이온에 대한 5ppm의 질량 정밀도가 선택되었으며, 단편 이온 질량 내성은 0.5Da로 설정되었다. 시스테인의 카복시아미도메틸화 및 N-말단 및 리신 잔기에의 iTRAQ 첨가는 통계학적 변형으로서 설정되었다. 세린, 트레오닌 및 티로신의 인산화는, 메티오닌의 산화 및 티로신에의 iTRAQ 첨가와 같이 가변성 변형으로서 설정되었다.

기술적 복제물들의 각각으로부터의 연구 결과를 조합하였고, 2개 이상의 펩타이드로 동정된 단백질은, 동정된 것으로 분류되었다. 고유한 펩타이드만이 단백질 정량화에 사용되었고, 단백질 그룹핑이 사용되었다(고유한 펩타이드를 함유한 단백질만이 사용되었다).

GCF 분석 예비 결과 - 발견된 단백질

모든 GCF 샘플의 분석으로부터, 270개의 단백질은 2개의 펩타이드로 동정되었다. 이는 264개의 사람 단백질 및 6개의 세균 단백질을 포함하였다. 동정된 단백질들은 부록, 보충 표 1에 상대적 정량 값과 함께 나타낸다. 모든 단백질들은, 건강한 대조군 그룹(표지 113-건강)에 대한 비를 나타낸다. 이러한 데이터는, 후속적으로, 수집된 GCF 체적에 대해 정규화되고, 또한, 로그(밑 2) 변환되어 양성 및 음성 존재비 값을 제공하였다.

질환 상태들 중 임의의 상태에서 단독으로 동정된 단백질은 존재하지 않았다. 대다수의 단백질은, 건강한 상태, 치은염, 및 질환 사이의 존재비에 있어서 감소를 나타냈다(건강한 상태에 비하여 치은염에서 229개의 단백질, 온건한 치주염에서는 195개의 단백질, 그리고, 중증의 치주염에서는 174개의 단백질의 존재비가 보다 낮았다). 그룹들에 걸친 존재비의 상기 감소는 GCF 체적의 증가로 인한 것일 수 있고, 따라서, 조직은 염증이 심해지고, 표 2에 입증되는 바와 같다. 대안으로, GCF의 "비-정규화된" 분석을 수행하여 이러한 과제를 해결할 수 있고, 이는 문헌[Lamster et al 1986, Chapple et al 1994 & 1999]에 인정되어 있다.

발견된 단백질들에 대해 수행된 GCF 클러스터링 분석

발견된 단백질들은 PolySANP 3 소프트웨어를 이용하여 클러스터링하였다. PolySNAP 3은, 각각의 1차원 단백질 프로파일을 다른 모든 것들과 비교하고, Pearson 매개변수 및 Spearman 비매개변수 상관 계수의 가중 평균을 사용하여 유사성 스코어를 생성한다. 주성분 분석, 감마 통계학, 및 미터 다차원 척도법(MMDS)을 포함하는 통계학적 방법의 조합을 이용하여 프로파일들을 클러스터링하였다. 이어서, 데이터를 계통수(dendrogram), PCA 플롯, 및 MMDS 플롯으로 가시화하였다. 이러한 분석에서, 그룹 평균 링크 계층적 클러스터링 및 완전 링크 계층적 클러스터링 방법을 사용하여 데이터를 그룹핑하였다. 모든 경우에서, 사용된 클러스터의 수는 PolySANP3에 의해 자동으로 설정되었다.

그룹 평균 클러스터링으로부터, 3 라운드의 클러스터링을 수행하였다. 최대수의 단백질을 갖는 그룹은 각각의 시점에서 재-클러스터링되었다.

클러스터링의 제1 라운드

도 4를 참조하여, 분석의 제1 라운드는 6개의 클러스터를 제공하였다. 클러스터 1은 대다수의 단백질(243개의 단백질)을 함유하였고, 클러스터 2는 19개의 단백질을 함유하였고, 클러스터 3, 5, 및 6은 각각 1개의 단백질만을 함유하였고, 클러스터 4는 5개의 단백질을 함유하였다.

계속해서 도 4를 참조하여, 클러스터 4는, 질환 동안 존재비가 감소되지만 쇠퇴-후 기저선으로 회귀하지 않는 단백질의 세트를 포함하므로 흥미로울 수 있다. 클러스터 2로서 동정된 19개의 단백질은, 치주염에서의 수준과 같이 기저선으로 회귀하기 전에 치은염으로의 존재비의 증가를 나타낸다. 이는, 혈액을 함유하는 GCF 샘플 중 하나로 인한 것일 수 있지만, 출혈은 치은염 및 치주염의 중요한 임상학적 징후이고, 혈액-관련 단백질은 건강한 상태와 질환 사이에서 매우 구별성일 수 있다. 헤모글로빈 알파 및 베타를 포함하는, 이 그룹에서 동정된 몇몇의 혈액 관련 단백질들이 존재한다. 이는, 혈액의 존재의 가능성에도 불구하고 치은염 및 치주염 및 건강한 상태를 구별할 수 있는 그룹으로서 흥미로울 수 있다. 클러스터 3 및 5는, 예를 들면, 건강한 상태/치은염으로부터 치료되지 않은 치주염을 구별하는 것으로 밝혀진다.

흥미로운 클러스터인 클러스터 3, 4, 및 5에서 동정된 단백질들은 부록, 보충 표 2에 나타낸다.

클러스터링의 제2 라운드

도 5를 참조하여, 도 4의 클러스터 1로부터의 243개의 단백질은 재-클러스터링되었고, 이는 총 4개의 그룹을 제공하였다. 그룹 1A는 대다수의 단백질(233)을 함유하였고, 그룹 1B 및 1C는 각각 2개의 단백질을 함유하였고, 그룹 1D는 6개의 단백질을 함유하였다. 그룹 1D는, 치주염으로 증가하기 전에 건강한 상태와 치은염 사이에 거의 변화를 나타내지 않는다. 온건한 치주염과 치료된 온건한 치주염 사이의 상대적 존재비의 감소(fall) 및 치료된 중증의 치주염에서의 기저선으로의 회귀가 존재한다. 그룹 1C에서 동정된 2개의 단백질은, 치료된 샘플에서 기저선으로 회귀하기 전에 치은염에 대한 감소 및 2개의 구강 그룹에 대한 보다 큰 감소로 질환으로 이어지는 것으로 밝혀진다. 이러한 단백질은, 치료가 성공적이었는지 또는 성공적이지 않았는지의 여부의 결과 측정값으로서 분석되는 것으로 예상될 수 있다.

목적하는 클러스터, 클러스터 1C 및 클러스터 1D에서 동정된 단백질들은 부록, 보충 표 3에 나타낸다.

클러스터링의 제3 라운드

도 6을 참조하여, 도 5의 클러스터 1A로부터의 233개의 단백질은 다시 재-클러스터링되어 4개의 클러스터를 얻었지만, 존재비의 변화는 이제 로그 스케일에 대해 2 미만이다(4배 증가/감소). 최대 클러스터(1A1)는 여전히 171개의 단백질을 함유하였고, 클러스터 1A2는 50개의 단백질을 함유하였고, 1A3은 10개를 함유하였고, 1A4는 2개의 단백질을 함유하였다. 또한, 이 분석에서 잠재적으로 흥미로운 그룹이 존재하는 것으로 밝혀진다.

흥미로운 각각의 클러스터, 1A3 및 1A4에서 동정된 단백질들은 부록, 보충 표 4에 나타낸다.

클러스터링의 최종 라운드

도 7을 참조하여, 클러스터링의 최종 라운드는 도 6의 클러스터 1A1로부터의 171개 단백질로 수행하였다. 이는 도 6에 나타낸 바와 같이 4개의 그룹을 얻었다. 이 분석으로부터 흥미로운 것으로 밝혀진 클러스터는 존재하지 않는다.

다중 라운드의 클러스터링 분석은, 치주염의 상이한 질환 상태를 구별할 수 있는, GCF 중의 단백질의 몇몇의 그룹들이 존재함을 시사한다.

타액 분석 예비 결과 - 발견된 단백질

모든 타액 샘플을 GCF 샘플과 유사하게 분석하였다. 307개의 사람 단백질 및 7개의 세균 단백질을 포함하는 314개의 단백질을 2개 이상의 펩타이드로 동정되었다. 1개의 샘플 그룹(무치아)에서만 1개의 단백질이 동정되었다. 동정된 단백질은 부록, 보충 표 5에서 상대적 정량 값과 함께 나타낸다.

발견된 단백질들에 대해 수행된 타액 클러스터링 분석

클러스터링의 제1 라운드

클러스터링 분석에 관해서, 무치아 샘플은 포함되지 않았다. 클러스터링 분석은 PolySNAP3을 이용하여 수행하였다. 도 8을 참조하여, 클러스터링의 제1 라운드는 5개의 클러스터를 얻었다. 최대 클러스터는 (1) 297개 단백질을 함유하였고, 한편, 클러스터 2 및 5는 각각 1개의 단백질을 함유하였다. 클러스터 3은 11개의 단백질을 함유하였고, 클러스터 4는 3개의 단백질을 함유하였다. GCF 데이터세트에 관해서, 질환으로 하향 조절되고 치료 후 기저선으로 회귀하지 않는 단백질의 그룹이 존재한다. 클러스터 2는 온건한 상태로부터 중증의 치주염을 구별하는 것으로 밝혀진다.

흥미로운 클러스터인 클러스터 2에서 동정된 단백질은 부록, 보충 표 6에 나타낸다.

클러스터링의 제2 라운드

도 9를 참조하여, 도 8로부터의 클러스터 1을 재-클러스터링하여 추가의 4개의 그룹을 얻었다. 최대 그룹은 166개의 단백질을 함유하였다(클러스터 1A). 클러스터 1B 및 1D는 각각 14개 및 1개의 단백질을 함유하였다. 이들 2개의 그룹은 치은염/온건한 치주염을 및 중증의 치주염을 구별할 수 있다. 그러나, 상기 경우 둘 다에서, 치료 후 온건한 치주염 및 중증의 치주염 둘 다에 대한 단백질 존재비의 증가가 발생하지만, 중증의 치주염에 관한 신호는 건강한 수준에 가깝다. 클러스터 1C는 116개의 단백질을 함유하였다. 이 그룹에서, 중증의 치주염에 대한 큰 증가 전에 온건한 치주염에 대한 증가에 이어지는 건강한 상태와 치은염 사이의 변화는 거의 나타나지 않는다. 이들 값은, 치료된 샘플에서 감소되지만, 여전히 치은염 그룹보다 더 높은 수준으로 존재한다.

흥미로운 클러스터인 클러스터 1B 및 클러스터 1D 각각에서 동정된 단백질은 부록, 보충 표 7에 나타낸다.

클러스터링의 제3 라운드

도 10을 참조하여, 도 9로부터의 클러스터 1A를 재-클러스터링하였다. 클러스터 1A는 5개의 그룹을 제공하였고, 최대 클러스터(1A1)는 150개의 단백질을 함유하였다. 여기서 임의의 유의한 클러스터가 존재하는 것으로 밝혀지지 않는다. 클러스터 1A4는 3개의 단백질을 제공하였고, 클러스터 1A5는 1개의 단백질을 제공하였다. 클러스터 1A4 및 1A5에서의 단백질 바이오마커는 모두 건강한 상태와 치은염 사이의 단백질 존재비의 증가 또는 감소를 나타내고, 이는 온건한 치주염에서 보다 크지만 중증의 치주염에서는 보다 적다.

클러스터 1A4 및 1A5에서 동정된 단백질은 부록, 보충 표 8에 나타낸다.

도 11을 참조하여, 도 9로부터의 클러스터 1C를 재-클러스터링하였고, 3개의 클러스터를 얻었다. 클러스터 1C2는, 치료 후 감소 전에 중증의 치주염까지 단백질 존재비에서 거의 직선형의 증가를 나타내는 7개의 단백질을 함유하였다. 이 그룹은 더 추가로 클러스터링되지 않았다. 클러스터 1C2에서 동정된 단백질은 부록, 보충 표 9에 나타낸다.

클러스터링의 최종 라운드

도 12를 참조하여, 도 10으로부터의 클러스터 1A1을 재-클러스터링하였다. 5개의 클러스터는, 중증의 치주염에 대해 존재비의 증가를 나타내는 단백질의 그룹(클러스터 1A1b)으로 관찰되었지만, 다른 그룹들은 그렇지 않았다. 이 클러스터에서 5개의 단백질이 동정되었다. 클러스터 1A1b에서 동정된 단백질은 부록, 보충 표 10에 나타낸다.

GCF 및 타액 데이터세트의 비교

두 데이터 세트에서 관찰된 단백질들을 비교하여 타액 및 GCF 샘플 둘 다에서 발견된 단백질 바이오마커를 동정하였다. 도 13을 참조하여, GCF 및 타액 둘 다에서 도 13의 벤 다이어그램의 중첩 영역으로 나타내어지는 95개 단백질을 동정하였다. 이는 GCF 데이터세트에 대해 동정된 단백질의 총 수의 대략 1/3이다.

상기 중첩 영역에서 관찰되는 단백질들은 부록, 보충 표 11에 나타낸다. 보충 표 11에서의 단백질에 관한 관련 존재비 데이터를 수집하였고, 후속적으로, 관찰된 단백질 존재비에 대한 로그(2) 비를 나타내도록 변환하였다. 추가로, GCF에 관한 2개의 값을 측정하였고, 하나는, 수집된 체적에 대해 정규화하였고, 다른 하나는 그렇지 않았다.

GCF가 타액의 구성성분인 것으로 추정되는 경우, 그리고, 타액이 동일한 GCF 체적에 대해 정규화되지 않는 경우, 3개의 값을 비교하기 위한 용도일 수 있다. 이들 3개의 값의 분석은, 이들 단백질 중 몇몇이 매우 유사한 프로파일을 가짐을 나타낸다. 존재비 값에 있어서 큰 증가 또는 감소를 갖는 이들 단백질 바이오마커들 중 몇몇은 도 14 내지 도 17에 나타낸다.

도 14는 단백질 S100-P에 대한 3개의 트레이스를 나타낸다. S100-P는 세포 사이클 진행 및 분화의 조절에 관련되어 있다. 이는, GCF 및 타액 둘 다에서 관찰되었고, 구강 편평 세포 암종에 대한 잠재적 바이오마커로서 제안되었다. 도 14에 나타낸 바와 같이, iTRAQ 측정된 S100-P 단백질의 존재비는, 온건한 치주염과 중증의 치주염 사이에 큰 증가가 존재함을 나타낸다. 따라서, S100-P는, 온건한 치주염과 중증의 치주염을 구별하는데 유용한 단백질 바이오마커로서 작용할 수 있다.

도 15는 단백질 S100-A8에 대한 3개의 트레이스를 나타내고, 또한, 이는 칼그래뉼린-A로서도 공지되어 있다. 이는 세균에 대한 항균 활성을 갖는다. 이는 염증에서 프로-염증성 매개인자이고, IL8의 방출을 상향-조절한다. 만성 치주염을 지닌 환자의 혈장에서 높은 수준의 S100-A8이 검출되었다. 도 15에 나타낸 바와 같이, iTRAQ 측정된 S100-A8 단백질은, 온건한 치주염과 중증의 치주염 사이에 큰 증가가 존재함을 나타낸다. 따라서, S100-A8은, 온건한 치주염과 중증의 치주염을 구별하는데 유용한 단백질 바이오마커로서 작용할 수 있다.

도 16은 단백질 미오신-9에 대한 3개의 트레이스를 나타낸다. 도 16에 나타낸 바와 같이, iTRAQ 측정된 미오신-9 단백질의 존재비는, 온건한 치주염과 중증의 치주염 사이에 큰 증가가 존재함을 나타낸다. 따라서, 미오신-9는, 온건한 치주염과 중증의 치주염을 구별하는데 유용한 단백질 바이오마커로서 작용할 수 있다.

도 17은 단백질 트랜스알돌라제에 대한 3개의 트레이스를 나타낸다. 도 17에 나타낸 바와 같이, iTRAQ 측정된 트랜스알돌라제 단백질의 존재비는, 온건한 치주염과 중증의 치주염 사이에 큰 증가가 존재함을 나타낸다. 따라서, 트랜스알돌라제는, 온건한 치주염과 중증의 치주염을 구별하는데 유용한 단백질 바이오마커로서 작용할 수 있다.

도 18은 단백질 헤모글로빈 베타에 대한 3개의 트레이스를 나타낸다. 도 18에 나타낸 바와 같이, iTRAQ 측정된 헤모글로빈 베타 단백질의 존재비는, 온건한 치주염과 중증의 치주염 사이에 큰 증가가 존재함을 나타낸다. 또한, 트레이스들은 모든 구강 질환 상태의 범위에 걸쳐 증가하고 감소한다. 따라서, 헤모글로빈 베타(또는 알파)는, 온건한 치주염과 중증의 치주염 및/또는 다른 구강 질환 상태를 구별하는데 유용한 단백질 바이오마커로서 작용할 수 있다.

결과의 논의

GCF 및 타액 데이터세트에 대해 The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery(DAVID)를 이용한 유전자 존재 분석은, 타액 데이터세트에서 가장 유의하게 풍부한 생물학적 프로세스는 방어 반응이었고, GCF 데이터세트에서는 세포골격 조직화였음을 나타낸다. 상위 20개의 프로세스들은 부록, 보충 표 12에 나타낸다. 방어 반응, 자극에 대한 반응, 및 해당을 포함하는 20개 중 7개는 GCF 및 타액 둘 다에서 풍부하다.

GCF 및 타액의 분석은 GCF에서 270개의 단백질을 그리고 타액에서 314개의 단백질을 동정하였고, 이들 단백질 중 95개는 둘 다에서 동정되었다. 1개의 단백질(무치아 타액에서 단독으로 동정된 것)을 제외한 모든 단백질을, 상이한 질환 및 쇠퇴기에 걸쳐 정량하였다. GCF 및 타액 둘 다에서 동정된 단백질들 중에, 건강한 상태, 치은염, 온건한 치주염 및 중증의 치주염, 및 질환의 쇠퇴를 구별하기 위해 잠재적으로 사용될 수 있는, (GCF 및 타액 데이터세트 둘 다에서) 질환으로의 증가를 나타내는 몇몇의 단백질들이 존재한다.

예시적 실시형태에 따르면, 구강 질환의 상태를 진단하는 방법은, 헤모글로빈 쇄 알파 및 베타, 탄산 무수화효소 1(IPI00980674), 및 플라스틴-1로 이루어진 그룹으로부터의 하나 이상의 단백질 바이오마커를 선택함을 포함한다. 당해 방법은, 건강한 상태, 치은염 상태, 및 온건한 및/또는 중증의 치주염 상태 중 하나 이상의 상태를 진단함을 추가로 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 단백질 바이오마커는, 타액 데이터 클러스터 1C2에서의 단백질 바이오마커들(보충 표 9): 단백질 #IPI00016347.5, 단백질 #IPI00377122.4, 헤모글로빈 서브유닛 알파(IPI00410714.5), 헤모글로빈 서브유닛 델타(IPI00473011.3), 헤모글로빈 서브유닛 베타(IPI00654755.3), 단백질 # IPI00980674.1, 및 단백질 수탁 번호 #O83773으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

또한, GCF 및 타액 데이터세트 둘 다에서 존재비의 증가를 나타냄에 의한 몇몇의 치주염에 대한 잠재적 지표인 몇몇의 단백질 바이오마커들이 존재한다. 예시적 실시형태에서, 중증의 치주염을 진단하는 방법은, S100-P, 트랜스알돌라제, S100-A8(칼그래뉼린-A), 미오신-9, 헤모글로빈 알파, 및 헤모글로빈 베타로 이루어진 그룹으로부터의 하나 이상의 단백질 바이오마커를 선택함을 포함한다. 다른 양상에서, 중증의 치주염을 진단하는 방법은, 타액 데이터 클러스터 1A1b에서의 단백질 바이오마커들(보충 표 10): 단백질 S100-A11(IPI00013895.1), 단백질 IPI00037070.3, 카탈라제(IPI00465436.4), 콜린 수송체-유사 단백질 2 유도체(IPI00903245.1), 및 티틴 이소형 N2-B(IPI00985334.2)로 이루어진 그룹으로부터의 하나 이상의 단백질 바이오마커를 선택함을 포함한다.

또 다른 양상에서, 중증의 치주염을 진단하는 방법은, S100-A8(칼그래뉼린-A), 미오신-9, 헤모글로빈 알파, 및 헤모글로빈 베타, 알파-1-산 당단백질 1 및 2, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9, 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소머라제 A 및 헵토글로빈-관련 단백질(IPI00431645.1)로 이루어진 그룹으로부터의 하나 이상의 단백질 바이오마커를 선택함을 포함한다.

다른 예시적 실시형태에 따르면, 치은염 또는 온건한 치주염을 진단하는 방법은, 타액 데이터 클러스터 1B, 1D(보충 표 7)에서의 및/또는 타액 데이터 클러스터 1A4, 1A5(보충 표 8)에서의 단백질 바이오마커들로 이루어진 그룹으로부터의 하나 이상의 단백질 바이오마커를 선택함을 포함한다. 이들 단백질 바이오마커들은 모두 건강한 상태와 치은염 사이에 단백질 존재비의 증가 또는 감소를 나타내고, 이는, 온건한 치주염에서 보다 크지만, 중증의 치주염에서는 보다 적다. 치은염 및 온건한 치주염을 중증의 치주염과 구분하기 위해 이들을 사용하는 것이 가능할 수 있다.

다른 양상에 따르면, 치은염 또는 온건한 치주염을 진단하는 방법은, NADPH 옥시다제 활성인자-1 및 알파-N-아세틸갈락토사미니다제로부터의 하나 이상의 단백질 바이오마커를 선택함을 포함한다. NADPH 옥시다제 활성인자-1은 반응성 산소 종의 생산에 관련되어 있다. 알파-N-아세틸갈락토사미니다제는, 중증의 치주염과 비교하여 치은염 및 온건한 치주염에 대한 최고의 비 중 몇몇을 갖는다. 이러한 단백질은 당지질의 분해(breakdown)에 관련되어 있다. 다른 양상에서, 치은염 또는 온건한 치주염을 진단하는 방법은, 알파 알파-N-아세틸갈락토사미니다제 바이오마커를 선택함을 포함한다.

부록

Claims

치은구액(GCF) 샘플 및 타액 샘플 중 하나 이상을 제공하고;
치주염의 특정 상태를 동정하기 위한 단백질 바이오마커의 세트를 선택하고;
선택된 세트의 단백질 바이오마커에서의 발현 수준을 측정하여 치주염 질환의 상태를 진단함을 포함하는, 치주염 질환의 상태를 진단하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단백질 바이오마커의 세트가, 치은염 상태와 치주염 상태를 구별하기 위해 선택되는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 단백질 바이오마커의 세트가, 치주의 건강한 상태와 치주 질환 상태를 구별하기 위해 선택되는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 단백질 바이오마커의 세트가, 온건한 치주염 상태와 중증의 치주염 상태를 구별하기 위해 선택되는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 바이오마커의 세트가, 헤모글로빈 쇄 알파 및 베타, 탄산 무수화효소 1(International Protein Index 또는 "IPI" #IPI00980674), 및 플라스틴 1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 바이오마커의 세트가, S100-P, 트랜스알돌라제, S100-A8(칼그래뉼린-A), 미오신-9, 헤모글로빈 알파, 및 헤모글로빈 베타로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 바이오마커의 세트는, 알파-1-산 당단백질 1 및 2, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9, 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소머라제 A, 및 합토글로빈-관련 단백질(IPI00431645.1)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 바이오마커의 세트가, NADPH 옥시다제 및 알파-N-아세틸갈락토사미니다제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 바이오마커의 세트가 알파-N-아세틸갈락토사미니다제를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 바이오마커의 세트가, 단백질 S100-A11(IPI00013895.1), 단백질 IPI00037070.3, 카탈라제(IPI00465436.4), 콜린 수송체-유사 단백질 2 유도체(IPI00903245.1), 및 티틴 이소형 N2-B(IPI00985334.2)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는, 방법.
제5항 내지 제8항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 바이오마커의 세트가 2개 이상의 바이오마커들을 포함하는, 방법.
치은염과 치주염을 구별하기 위해 선택된 단백질 바이오마커의 세트를 포함하는, 치주염 질환의 상태를 진단하기 위한 키트.
제12항에 있어서, 상기 단백질 바이오마커의 세트가, 헤모글로빈 쇄 알파 및 베타, 탄산 무수화효소 1(International Protein Index 또는 "IPI" #00980674), 및 플라스틴-1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는, 키트.
제12항에 있어서, 상기 키트가, 치은염 또는 온건한 치주염을 진단하고, 상기 단백질 바이오마커의 세트가 타액 데이터 클러스터 1B, 1D, 1A4, 및 1A5로부터의 하나 이상의 단백질 바이오마커를 추가로 포함하는, 키트.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 GCF 샘플 및 타액 샘플 둘 다를 제공하고;
상기 GCF 샘플 및 타액 샘플의 프로테옴을 분석함으로써 제1 및 제2 단백질 프로파일들을 생성하고;
제1 및 제2 단백질 프로파일들 사이의 중첩 영역을 측정함을 추가로 포함하고;
여기서, 치주염의 특정 상태들을 구별하기 위해 상기 단백질 바이오마커의 세트를 선택하는 것은, 치주염의 상이한 단계들 동안의 중첩 영역 내의 단백질의 존재비(abundance)의 변화를 계산하고, 치주염의 단일 상태 동안 발현된 것 미만 또는 초과인 단백질들을 선택함을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 구강 유체 샘플의 프로테옴을 분석함으로써 단백질 프로파일을 생성하고;
상기 단백질 프로파일을 클러스터링하여 단백질 바이오마커의 세트를 결정함을 추가로 포함하는, 방법.