JP2015529333A - Ｆｔ−ｉｃｒ−ｍｓ／ｍｓを使用した、歯肉炎および歯周炎のバイオマーカーのための唾液プロテオームの分析 - Google Patents

Abstract

歯周疾患の状態を診断するための方法には、歯周炎の特定の段階で存在量を変化させることが示された、１種または２種以上のタンパク質バイオマーカーを含む、１セットのタンパク質バイオマーカーを選択することを含む。歯周炎の異なる状態を区別するために、前記セットのタンパク質バイオマーカーを、得られた歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）または唾液口腔液サンプル中の発現において、同定して定量し得る。例えば、歯肉炎、軽度の歯周炎および重度の歯周炎などの重症度の種々のレベルでの歯周口腔疾患の状態を診断する方法には、歯周炎の異なる段階を区別することができる１セットのタンパク質バイオマーカーを選択することが含まれてもよい。

Description

本願は、プロテオミクスおよびバイオインフォマティクスの分野に関連する。より具体的には、本願は、タンパク質バイオマーカーの定量によりさまざまなレベルの重症度の、例えば、歯周炎などの口腔疾患の状態を診断することに関する。

歯肉炎は、歯茎の軟部組織炎症を伴う、歯周疾患の非破壊形態（non−destructive form）である。歯肉炎は、典型的には、歯に付着した、細菌性バイオフィルムまたは歯垢の身体的応答（bodily response）として起こる。適切な処置が欠如する場合には、歯肉炎は、歯周炎へ進行し得、これは、歯周疾患の破壊形態（destructive form）を代表する。歯周炎は、より軽度の前記疾患（a milder of the disease）から開始し得るが、これは後に、重度の歯周炎へ進行する。歯周炎は、常に歯肉炎の発現が先行する。
歯周疾患は、成人が歯を失う主な原因である。したがって、個体が歯周炎を発現したか否かの確率を同定するための診断試験が開発されてきた。口腔液に基づくポイントオブケース（oral−fluid−based point−of−case）（ＰＯＣ）診断が、医学の種々の診断試験に広く使用され、より最近では、口腔疾患の決定に適合されている（Tabak，2007，Ann N Y Acad Sci1098：7−14)。ＰＯＣ診断のための口腔液の使用は、口腔がん（Li et al．，2004，Clin Cancer Res 10：8442−8450；Zimmerman et al．，2008，Oral Oncol．44（5）：425−9）またはＨＩＶ感染（Delaney et al．，2006，Aids 20：1655−1660）の検出に効果的であることが示された。

歯周疾患は、現在のところ、例えば、ポケット深さ、プロービング時の出血、およびＸ線写真などの臨床パラメータを評価することにより診断される。これらのパラメータには、それらが将来の付着損失を予測する能力に欠け、過去の疾患活動性の存在についてのみの情報を提供する、という限界がある。さらに、歯周疾患活動性について、臨床パラメータは予測性を示さなかった（“Clinical risk indicators for periodontal attachment loss，”Journal of Clinical Periodontology 1991：v．18：117−125”）。今日の臨床診療における診断方法は、例えば、非破壊性歯肉炎などの炎症の開始を検出することおよび将来の歯周炎の破壊形態を発現させる可能性を同定すること、の両方の能力を欠く。

よって、過去の口腔疾患活動性の存在を認識することができるだけでなく、口腔疾患のより初期段階を診断して評価することもできる、効率的で、正確で精度の高い口腔液診断方法についての、当該技術分野における必要性がある。歯周炎の場合には、口腔液診断方法は、少なくとも健康な患者と、歯肉炎、より軽度の形態の歯周炎および／またはより重度の形態の歯周炎を発現した患者とを、区別することができなければならない。この診断方法には、有利には、口腔液中に存在する、特定のタンパク質バイオマーカーの定量が含まれてもよい。これらの口腔液を、歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）および／または唾液として患者から非侵襲的に入手してもよい。

Tabak，2007，Ann N Y Acad Sci1098：7−14 Li et al．，2004，Clin Cancer Res 10：8442−8450；Zimmerman et al．，2008，Oral Oncol．44（5）：425−9 Delaney et al．，2006，Aids 20：1655−1660 "Clinical risk indicators for periodontal attachment loss，"Journal of Clinical Periodontology 1991：v．18：117−125"

簡単な要約
例示的な態様において、歯周疾患の状態を診断するための方法が、本明細書において実証される。前記方法には、歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）サンプルおよび唾液サンプルの少なくとも一方を提供すること、歯周炎の特定の状態を同定するための１セットのタンパク質バイオマーカーを選択すること、ならびに歯周疾患の状態を診断するための、前記選択されたセットのタンパク質バイオマーカーの発現レベルを決定すること、が含まれる。

前記方法の側面において、前記セットのタンパク質バイオマーカーを、歯肉炎の状態と歯周炎の状態とを区別するために選択する。
前記方法の別の側面において、前記セットのタンパク質バイオマーカーを、歯周的健康状態と疾患状態とを区別するために選択する。

前記方法の、なお別の側面において、前記セットのタンパク質バイオマーカーを、軽度の歯周炎の状態と重度の歯周炎の状態とを区別するために選択する。
前記方法のいくつかの側面において、前記セットのタンパク質バイオマーカーには、ヘモグロビン鎖アルファおよびベータ、炭酸脱水酵素１（国際タンパク質目録または「ＩＰＩ」 ＃ＩＰＩ００９８０６７４）、ならびにプラスチン１からなる群から選択される、少なくとも１種のタンパク質が含まれる。

前記方法の別の側面において、前記セットのタンパク質バイオマーカーには、Ｓ１００−Ｐ、トランスアルドラーゼ、Ｓ１００−Ａ８（カルグラニュリン−Ａ）、ミオシン−９、ヘモグロビンアルファおよびヘモグロビンベータからなる群から選択される、少なくとも１種のタンパク質が含まれる。
前記方法の、なお別の側面において、前記セットのタンパク質バイオマーカーには、アルファ−１−酸性糖タンパク質１および２、マトリクスメタロプロテイナーゼ−９、ペプチジル−プロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼＡ、ならびにハプトグロビン関連タンパク質（ＩＰＩ００４３１６４５．１）からなる群から選択される、少なくとも１種のタンパク質が含まれる。

前記方法のある側面において、前記セットのタンパク質バイオマーカーには、ＮＡＤＰＨオキシダーゼおよびアルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼからなる群から選択される、少なくとも１種のタンパク質が含まれる。
前記方法の側面において、前記セットのタンパク質バイオマーカーには、アルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼが含まれる。

前記方法の別の側面において、前記セットのタンパク質バイオマーカーには、タンパク質 Ｓ１００−Ａ１１（ＩＰＩ０００１３８９５．１）、タンパク質 ＩＰＩ０００３７０７０．３、カタラーゼ（ＩＰＩ００４６５４３６．４）、コリントランスポーター様タンパク質２誘導体（ＩＰＩ００９０３２４５．１）、およびチチンのアイソフォーム Ｎ２−Ｂ（ＩＰＩ００９８５３３４．２）からなる群から選択される、少なくとも１種のタンパク質が含まれる。
前記方法の、なお別の側面において、前記セットのタンパク質バイオマーカーには、２種または３種以上のバイオマーカーが含まれる。

前記方法のいくつかの側面において、前記方法は、さらに、ＧＣＦサンプルおよび唾液サンプルの両方を提供すること、ＧＣＦサンプルおよび唾液サンプルのプロテオームを分析することにより第１および第２タンパク質プロファイルを生じさせること、ならびに前記第１および第２タンパク質プロファイル間の重複領域を決定すること、を含む。前記セットのタンパク質バイオマーカーを、歯周炎の特定の状態を区別するために選択し、これは、歯周炎の異なる段階の間の前記重複領域内でのタンパク質の存在量（abundance）の変化を計算すること、および歯周炎の単一状態の間に、低発現するまたは高発現する（under or over expressed）、それらのタンパク質を選択すること、を含む。
前記方法の別の側面において、前記方法は、さらに、前記少なくとも１種の口腔液サンプルのプロテオームを分析することによりタンパク質プロファイルを生じさせること、および前記タンパク質プロファイルをクラスタリングして１セットのタンパク質バイオマーカーを決定すること、を含む。

例示的な態様において、歯周疾患の状態を診断するためのキットが、本明細書において実証される。前記キットには、歯肉炎および歯周炎を区別するために選択された、１セットのタンパク質バイオマーカーが含まれる。

前記キットの側面において、前記セットのタンパク質バイオマーカーには、ヘモグロビン鎖アルファおよびベータ、炭酸脱水酵素１（国際タンパク質目録または「ＩＰＩ」 ＃ＩＰＩ００９８０６７４）、ならびにプラスチン−１からなる群から選択される、少なくとも１種のタンパク質が含まれる。
前記キットの別の側面において、前記キットは、歯肉炎または軽度の歯周炎を診断し、前記セットのタンパク質バイオマーカーには、さらに、唾液データクラスター１Ｂ、１Ｄ、１Ａ４、および１Ａ５からの、少なくとも１種のタンパク質バイオマーカーが含まれる。
図面の簡単な説明
前記開示された方法およびキットにより可能となる、これらのおよび他の側面、特徴および利点は、添付の図面を参照して、前記方法およびキットの態様の以下の記載から明らかとなり、説明される。

図１は、一態様による口腔疾患の状態を診断するための方法のフローチャートの例示である； 図２は、患者の唾液サンプルについてのＵＶ吸収（ｍＡＵ）対時間（分）のグラフである。前記ＵＶトレース（trace）は、２１４ｎｍにおけるＳＣＸシステム記録ＵＶ吸収（SCX system recording UV Absorbance）の出力値として得られた。 図３は、患者のＧＣＦサンプルについてのＵＶ吸収（ｍＡＵ）対時間（分）のグラフである。前記ＵＶトレースは、２１４ｎｍにおけるＳＣＸシステム記録ＵＶ吸収の出力値として得られた。 図４は、ＧＣＦサンプルデータについて、タンパク質存在量（底２の対数目盛（a base 2 logarithmic scale）の変化により変換されたもの）対六（６）種のプロテオームＭＳ分析群（表３に定義されたもの）を示す、群平均クラスタリンググラフである。前記群平均クラスタリングは、タンパク質バイオマーカーの六（６）種の異なるクラスターを同定した。クラスター１は、前記タンパク質の主要部（２４３種のタンパク質）を含み、クラスター２は、１９種のタンパク質を含み、クラスター３、５および６は、それぞれ１種のタンパク質のみを含み、クラスター４は、５種のタンパク質を含むものであった。 図５は、ＧＣＦサンプルデータについて、タンパク質存在量（底２の対数目盛により変換されたもの）の変化対六（６）種のプロテオームＭＳ分析群（表３に定義されたもの）を示す、第１回（first round）再クラスタリンググラフである。図４からのクラスター１を、４つのクラスター群に再クラスタリングし、ここで、群Ａは、前記タンパク質の主要部（２３３種）を含み、群ＢおよびＣは、それぞれ２種のタンパク質を含み、群Ｄは、６種のタンパク質を含むものであった。 図６は、ＧＣＦサンプルデータについて、タンパク質存在量（底２の対数目盛により変換されたもの）の変化対六（６）種のプロテオームＭＳ分析群（表３に定義されたもの）を示す、第２回再クラスタリンググラフである。図５からのクラスターＡを、４つのクラスター群に再クラスタリングし、ここで、最大クラスター（１Ａ１）は、なお１７１種のタンパク質を含み、クラスター１Ａ２は、５０種のタンパク質を含み、１Ａ３は、１０種のタンパク質を含み、１Ａ４は、２種のタンパク質を含むものであった。 図７は、ＧＣＦサンプルデータについて、タンパク質存在量（底２の対数目盛により変換されたもの）の変化対六（６）種のプロテオームＭＳ分析群（表３に定義されたもの）を示す、最終回再クラスタリンググラフである。図６からのクラスター１Ａ１を、４つのクラスター群に再クラスタリングした。タンパク質存在量の変化は、ここでは１．０の大きさ未満であるので、この分析からのクラスターは関心の対象にならないと思われる。 図８は、唾液サンプルデータについて、タンパク質存在量（底２の対数目盛により変換されたもの）の変化対六（６）種のプロテオームＭＳ分析群（表３に定義されたもの）を示す、群平均クラスタリンググラフである。前記群平均クラスタリングは、タンパク質バイオマーカーの五（５）種の異なるクラスターを同定した。最大クラスター（１）は、２９７種のタンパク質を含み、クラスター２および５は、それぞれ１種のタンパク質を含むものであった。クラスター３は、１１種のタンパク質を含み、クラスター４は、３種のタンパク質を含むものであった。クラスター２は、重度の歯周炎とより軽度な状態とを区別すると思われる。 図９は、ＧＣＦサンプルデータについて、タンパク質存在量（底２の対数目盛により変換されたもの）の変化対六（６）種のプロテオームＭＳ分析群（表３に定義されたもの）を示す、第１回再クラスタリンググラフである。図８からのクラスター１を、４つのクラスター群に再クラスタリングし、そのうちの最大のものは、１６６種のタンパク質を含むものであった（クラスター１Ａ）。クラスター１Ｂおよび１Ｄは、それぞれ１４種および１種のタンパク質を含むものであった。これらの２つの群は、歯肉炎／軽度の歯周炎および重度の歯周炎を区別し得る。 図１０は、ＧＣＦサンプルデータについて、タンパク質存在量（底２の対数目盛により変換されたもの）の変化対六（６）種のプロテオームＭＳ分析群（表３に定義されたもの）を示す、第２回再クラスタリンググラフである。図９からのクラスター１Ａを、５つのクラスター群に再クラスタリングし、最大のものは、１５０種のタンパク質を含むものであった。存在量の変化の欠如に基づき、ここでは、いかなる顕著なクラスターであるとも思われない。 図１１は、ＧＣＦサンプルデータについて、タンパク質存在量（底２の対数目盛により変換されたもの）の変化対六（６）種のプロテオームＭＳ分析群（表３に定義されたもの）を示す、第２回再クラスタリンググラフである。図９からのクラスター１Ｃを、３つのクラスターに再クラスタリングした。７種のタンパク質を含むクラスター１Ｃ２は、処置後による減少（reduction post treatment）の前の、重度の歯周炎まで、タンパク質存在量の近線形的増加を示す。 図１２は、ＧＣＦサンプルデータについて、タンパク質存在量（底２の対数目盛により変換されたもの）の変化対六（６）種のプロテオームＭＳ分析群（表３に定義されたもの）を示す、最終回再クラスタリンググラフである。クラスター１Ａ１は、図１０からのものである。５つのクラスターが、観測され、重度の歯周炎についての存在量の増加を示すタンパク質の群（クラスター１Ａ１ｂ）が観測されたが、その他の群には観測されなかった。このクラスター中で同定された、５種のタンパク質があった。 図１３は、前記ＧＣＦおよび唾液サンプルデータセット間の前記重複を示す、ベン図である。 図１４は、組み合わせられたＧＣＦおよび唾液サンプルデータにおける、タンパク質 Ｓ１００−ＰのＬｏｇ（２）変換された存在レベル（Log（2） transformed abundance levels）対六（６）種のプロテオームＭＳ分析群（表３に定義されたもの）を示す、クラスターグラフである。 図１５は、組み合わせられたＧＣＦおよび唾液サンプルデータにおける、タンパク質 Ｓ１００−Ａ８のＬｏｇ（２）変換された存在レベル対六（６）種のプロテオームＭＳ分析群（表３に定義されたもの）を示す、クラスターグラフである。 図１６は、組み合わせられたＧＣＦおよび唾液サンプルデータにおける、ミオシン−９のＬｏｇ（２）変換された存在レベル対六（６）種のプロテオームＭＳ分析群（表３に定義されたもの）を示す、クラスターグラフである。 図１７は、組み合わせられたＧＣＦおよび唾液サンプルデータにおける、トランスアルドラーゼのＬｏｇ（２）変換された存在レベル対六（６）種のプロテオームＭＳ分析群（表３に定義されたもの）を示す、クラスターグラフである。 図１８は、組み合わせられたＧＣＦおよび唾液サンプルデータにおける、ヘモグロビンベータのＬｏｇ（２）変換された存在レベル対六（６）種のプロテオームＭＳ分析群（表３に定義されたもの）を示す、クラスターグラフである。

態様の詳細な説明
当業者が前記開示された方法およびキットを実施することができるために、本願の前記方法およびキットのいくつかの態様を、添付の図面を参照して、以下でより詳細に説明する。しかしながら、前記方法およびキットを、多くの異なる形態で具体化してもよく、本明細書に記載される前記態様に限定されるものとみなしてはならない。むしろ、これらの態様を提供することにより、この開示が徹底され、完全にされ、当業者には本開示の方法およびキットの範囲を完全に伝達するであろう。前記態様は、開示された方法およびキットの範囲を限定するものではない。前記態様は、添付の特許請求の範囲により限定されるのみである。さらに、前記添付の図面において例示される前記特定の態様の詳細な説明において使用される専門用語は、前記開示された方法またはキットを限定することを意図するものでない。

本願は、例えば、歯周炎などの口腔疾患の状態を診断するための方法を詳述する。前記方法は、１セットのバイオマーカーの発現レベルを決定することを含んでもよい。前記セットのタンパク質バイオマーカーには、１種または２種以上のタンパク質バイオマーカーが含まれてもよく、これらは、口腔疾患の特定段階において、存在量を変化させることを示した。したがって、前記セットのタンパク質バイオマーカーを、口腔疾患の異なる状態を区別するために、発現により同定して定量してもよい（may be identified and quantified in expression）。

本願の方法は、例えば、歯肉炎、軽度の歯周炎などの、重症度の種々のレベルでの歯周炎の指標として役立つバイオマーカーについての役割を実証する。本明細書に記載される研究（work）は、複数のバイオマーカーの上昇レベルを、例えば、歯周炎などの口腔疾患の状態を正確におよび迅速に決定するためのツールとして使用することができることを実証する。

本明細書において使用されるとおり、用語「歯周的健康状態」は、閾値条件に基づくもの（a threshold criteria based）であり、単なる健康の漠然とした状態ではない。歯周的健康状態を有する患者は、１．０のＧ．Ｉ．またはＢ．Ｏ．Ｐ．を有する＜１０％のサイトを示し、２．０または３．０のＧ．Ｉ．を有するサイトはない（＜10％ sites with G．I．of 1．0 or B．O．P．and no sites with G．I．of 2．0 or 3．0）。さらに、それらは、隣接歯間の付着損失を有するサイトを有さず、ｐｐｄ＞３ｍｍを有するサイトを有しない。

本明細書において使用されるとおり、用語「歯周炎状態」は、広汎型（generalized）歯周炎を示す患者に基づく閾値条件であり、単なる漠然とした状態ではない。広汎型歯周炎は、Ｇ．Ｉ．＞２．０を有する、＞３０％のサイトを示す患者に現れ、隣接歯間の付着損失を有するサイトはなく、ｐｐｄ＞４ｍｍを有するサイトはない。

本明細書において使用されるとおり、用語「軽度の歯周炎状態」は、軽度〜中等度の（mild−moderate）歯周炎を示す患者に基づく閾値条件であり、単なる漠然とした状態ではない。軽度〜中等度の歯周炎は、５〜７ｍｍのｐｐｄおよび＞８本の歯で２〜４ｍｍの隣接歯間ＣＡＬを示す患者に現れる。

本明細書において使用されるとおり、用語「重度の歯周炎状態」は、重度の歯周炎を示す患者に基づく閾値条件であり、単なる漠然とした状態ではない。重度の歯周炎は、＞７ｍｍのｐｐｄおよび＞１２本の歯で＞５ｍｍの隣接歯間ＣＡＬを示す患者に現れる。

本明細書において使用されるとおり、用語「バイオマーカー」は、客観的に測定され、通常の生物学的プロセス、発病プロセス、または治療介入への薬理学的応答の指標として評価される物質を意味する。

本明細書において、口腔疾患の選択された状態（a select status）を示す、予測的タンパク質バイオマーカーの測定により前記口腔疾患の状態を診断するための方法が提供される。例示的態様において、前記口腔疾患は歯周炎であり、前記タンパク質バイオマーカーは、歯肉炎、軽度の歯周炎、または重度の歯周炎のいずれかを示す。

口腔疾患のさまざまな状態を有する患者から採取した歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）および唾液サンプルのプロテオーム分析により、タンパク質バイオマーカーを、同定してもよく、これらは、歯周炎の明確なフェーズの間に、存在量が増加するかまたは減少する。少なくとも１種のタンパク質バイオマーカーを、単独でまたは組み合わせて使用して、健康な患者、歯肉炎を患っている患者、および軽度のまたは重度の歯周炎を患っている患者を区別してもよい。

プロテオーム分析を、液体クロマトグラフィーおよび質量スペクトル法の組み合わせにより行ってもよい。特に、ＧＣＦおよび唾液口腔液サンプルの前記プロテオームを、フーリエ変換−タンデム質量スペクトル法（ＦＴ ＭＳ／ＭＳ）により分析してもよい。健康な口腔状態および疾患の口腔状態を区別するであろうバイオマーカーのパネルを試行して解明するために、前記ＦＴ ＭＳ／ＭＳプロテオームアプローチを、歯周病について健康な（periodontally healthy）ボランティア、歯肉炎のボランティア、軽度のおよび重度の歯周炎のボランティア、ならびに無歯ボランティア（無歯対照）から採取した、ＧＣＦおよび唾液サンプルに適用してもよい。特に、前記ＦＴ ＭＳ／ＭＳアプローチがなされることにより、歯周病について健康的かおよび疾患的かを、歯肉炎および歯周炎を、ならびに軽度および重度の歯周炎を、歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）および誘導唾液（stimulated saliva）の非推定プロテオーム分析の使用により区別することができる、新規なタンパク質バイオマーカーを見出し得る。

本発明者らは、驚くべきことに、１つの小セット（a small set）の特定のタンパク質バイオマーカーの発現を決定して、歯肉炎または軽度の歯周炎を同定し得ることを見出した。これらのタンパク質バイオマーカーは、歯肉炎／歯周炎の軽度の疾患状態の間に、強化された存在量の変化（増加または減少のいずれか）を示し、歯周炎の重度の状態の間は、ほとんど変化を示さない。さらに、１つの小セットの特定のタンパク質バイオマーカーの発現を決定して、重度の歯周炎を同定し得る。これらのタンパク質バイオマーカーは、歯周炎の重度の状態の間に、強化された存在量の変化（増加または減少のいずれか）を示し、歯肉炎および歯周炎の軽度の状態の間は、ほとんど変化を示さない。重度の歯肉炎を同定して区別するための、前記セットのタンパク質バイオマーカーは、軽度の歯周炎または歯肉炎に関連する。

図１を参照して、口腔疾患の状態を診断するための方法（Ｓ１００）は、Ｓ１０１でスタートする。例示的態様によれば、前記口腔疾患は歯周炎であり、歯周炎の状態には、歯周炎としての健康、歯肉炎、軽度の歯周炎、および重度の歯周炎が含まれ得る。

Ｓ１０２において、少なくとも１種の口腔液サンプルが提供される。一態様によれば、前記口腔疾患は歯周炎であり、ＧＣＦおよび唾液サンプルの少なくとも一方が提供される。前記サンプルは、非侵襲的に患者から採取され得る。

Ｓ１０４において、タンパク質プロファイルが、ＧＣＦおよび唾液サンプルの少なくとも一方のプロテオームを分析することにより生じる。別の態様において、前記タンパク質プロファイルを、ＬＣ ＦＴ ＭＳ／ＭＳを使用して見出す。

Ｓ１０６において、前記タンパク質プロファイルをクラスターして、１セットのタンパク質バイオマーカー中で役立つために最良に調和する、それらのタンパク質を決定する。クラスタリングを、主成分分析、ガンマ統計法（gamma statistics）、および計量多次元尺度法（ＭＭＤＳ）を含む統計法の組み合わせを使用して行ってもよい。一態様において、群平均リンク階層的クラスタリング（group average link hierarchical clustering）を用いて、前記セットのタンパク質バイオマーカーを決定する。別の態様において、完全リンク階層的クラスタリング（complete link hierarchical clustering）法を用いて、前記セットのタンパク質バイオマーカーを決定する。

Ｓ１０８において、１セットのタンパク質バイオマーカーを、口腔疾患の異なる状態を区別するために選択する。一態様において、前記口腔疾患は歯周炎であり、前記セットのタンパク質バイオマーカーを、歯肉炎および歯周炎を区別するために選択する。別の態様において、前記口腔疾患は歯周炎であり、前記セットのタンパク質バイオマーカーを、軽度の歯周炎および重度の歯周炎を区別するために選択する。
Ｓ１１０において、前記選択されたセットのタンパク質バイオマーカー中の前記タンパク質の発現レベルを決定して、前記口腔疾患の状態を診断する。

前記方法の一側面によれば、口腔疾患の状態を診断するための方法には、少なくとも１種の口腔液サンプルを提供すること、前記少なくとも１種の口腔液サンプルのプロテオームを分析することによりタンパク質プロファイルを生じさせること、前記タンパク質プロファイルをクラスタリングして１セットのタンパク質バイオマーカーを決定すること、口腔疾患の特定の状態を区別するための１セットのタンパク質バイオマーカーを選択すること、および前記選択されたセットのタンパク質バイオマーカーにおける発現レベルを決定して前記口腔疾患の状態を診断すること、が含まれる。

前記方法のなお別の側面によれば、歯周疾患の状態を診断するための方法には、歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）サンプルおよび唾液サンプルの少なくとも一方を提供すること、歯周炎の特定の状態を同定するための１セットのタンパク質バイオマーカーを選択すること、ならびに前記歯周疾患の状態を診断するための、前記選択されたセットのタンパク質バイオマーカーにおける発現レベルを決定すること、が含まれる。

前記方法のある側面において、前記セットのタンパク質バイオマーカーを、歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）および唾液のプロテオームを分析することにより選択する。プロテオーム分析には、タンパク質のフーリエ変換−タンデム質量スペクトル（ＦＴ ＭＳ／ＭＳ）分析が含まれてもよく、これは、歯周炎の状態の変化において、高発現するかまたは低発現することが同定される。

前記方法の別の側面について、前記バイオマーカーには、疾患状態の診断に有用な、１種のみの特定のバイオマーカーまたは特定のバイオマーカーの組み合わせが、含まれてもよい。１種、２種、または３種以上のタンパク質バイオマーカーの発現レベルを決定して、口腔疾患の状態を決定する。さらなる側面において、３種、４種、５種、または６種以上のバイオマーカーを決定して、口腔疾患の状態を決定するのに使用してもよい。

前記方法の種々の側面において、前記１種または２種以上のタンパク質バイオマーカーを、ヘモグロビン鎖アルファおよびベータ、炭酸脱水酵素１（国際タンパク質目録または「ＩＰＩ」 ＃ＩＰＩ００９８０６７４）、ならびにプラスチン１からなる群から選択する。この側面による前記方法を使用して、歯周炎の健康状態、歯肉炎状態、軽度の状態、および重度の状態を区別してもよい。

前記方法のなお別の側面において、１種または２種以上のタンパク質バイオマーカーを、Ｓ１００−Ｐ、トランスアルドラーゼ、Ｓ１００−Ａ８（カルグラニュリン−Ａ）、ミオシン−９、ヘモグロビンアルファ、およびヘモグロビンベータからなる群から選択する。この側面による前記方法を使用して、歯周炎の重度の状態を同定してもよく、例えば、軽度の歯周炎および歯肉炎などのより軽度の状態と歯周炎の重度の状態とを区別してもよい。

前記開示される方法のいくつかの側面において、１種または２種以上のタンパク質バイオマーカーを、アルファ−１−酸性糖タンパク質１および２、マトリクスメタロプロテイナーゼ−９、ペプチジル−プロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼＡ、ならびにハプトグロビン関連タンパク質（ＩＰＩ００４３１６４５．１）からなる群から選択する。この側面による前記方法を使用して、歯周炎の重度の状態を同定してもよく、例えば、軽度の歯周炎および歯肉炎などのより軽度の状態と歯周炎の重度の状態とを区別してもよい。

前記方法のなお別の側面において、タンパク質バイオマーカーである、アルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを、歯肉炎および軽度の歯周炎状態を同定するために、ならびにそれらを重度の歯周炎状態と区別するために選択する。
前記方法のさらなる側面において、歯肉炎または軽度の歯周炎を同定するために、ならびにそれらを重度の歯周炎状態と区別するために、１種または２種以上のタンパク質バイオマーカーを、ＮＡＤＰＨオキシダーゼおよびアルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼから選択する。

いくつかの側面によれば、口腔疾患の状態を診断するための前記方法には、さらに、前記ＧＣＦサンプルおよび唾液サンプルを提供すること、ＧＣＦサンプルおよび唾液サンプルのプロテオームを分析することにより第１および第２タンパク質プロファイルを生じさせること、ならびに前記第１および第２タンパク質プロファイル間の重複領域を決定すること、が含まれる。前記歯周炎の特定の状態を区別するための前記セットのタンパク質バイオマーカーを選択することには、歯周炎の異なる段階の間の前記重複領域内でのタンパク質の存在量の変化を計算すること、および歯周炎の単一状態の間に、低発現するまたは高発現する、それらのタンパク質を選択すること、が含まれる。

なお別の側面において、上記態様により開示されたとおりの口腔疾患の状態を診断するための前記方法を、診断キットにより行う。前記診断キットには、口腔疾患の状態を診断するための１セットのタンパク質バイオマーカーが含まれる。前記キットには、前記開示された方法のアッセイを実行するために必要な試薬が含まれる。

本願を、種々の態様および例の観点から説明してきた一方で、変形および改善が生じるであろうことが、当業者には理解される。したがって、特許請求の範囲において現れるとおりのかかる限定のみが、前記開示された態様に置かれなければならない（only such limitations as appear in the claims should be placed on the disclosed embodiments）。

例
例１
歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）および唾液のプロテオームを分析して、例えば、歯肉炎、軽度の歯周炎、および重度の歯周炎などの異なる口腔疾患の状態のバイオマーカーを同定した。ＧＣＦおよび唾液サンプルを、何人かの患者の口腔から非侵襲的に採取した。フーリエ変換−タンデム質量スペクトル計（ＦＴ ＭＳ／ＭＳ）に連結された、液体クロマトグラフィー法を使用して、前記サンプル内からタンパク質バイオマーカーを分離して、前記タンパク質バイオマーカーを同定した。

健康な口腔状態および疾患の口腔状態を区別するであろうバイオマーカーのパネルを試行して解明するために、前記ＦＴ ＭＳ／ＭＳプロテオームアプローチを、歯周病について健康なボランティア、歯肉炎のボランティア、軽度のおよび重度の歯周炎のボランティア、ならびに無歯ボランティア（無歯対照）から採取したサンプルに適用した。特に、前記ＦＴ ＭＳ／ＭＳアプローチがなされることにより：
１．歯周病について健康的かおよび疾患的かを区別すること
２．歯肉炎および歯周炎を区別すること
３．軽度および重度の歯周炎を区別すること
ができる、新規なタンパク質バイオマーカーを、歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）および誘導唾液の非推定プロテオーム分析により見出した。

研究計画
表１

患者ボランティアの５つの群を、表１に定義するとおりに採用した。臨床的に示唆され得るルーチンの治療以外に計画された介入なしで（with no interventions planned other than routine therapy that may be clinically indicated）、前記研究を横断的研究として行った。サンプリングのために、１回の来院のみがベースラインにおいて必要であったが、群３および４の患者は、ルーチンの歯周測定（periodontal scaling）、歯根表面創面切除および予防を必要とし、したがって、彼らの治療の完了後、再検査され、３か月後にサンプリングした。したがって、縦断的分析が、群３および４について利用可能であった。前記臨床評価を、熟練した研究歯科医（a trained study dental surgeon）により実行した。

サンプル採取
ボランティアは、標準ろ紙片（Periopapers（登録商標））上で非侵襲的に、前記歯肉（歯茎）縁から採取されたＧＣＦの６個のサンプルを提供することを求められた。彼らはまた、滅菌マーブル（sterile marble）を彼らの口腔内を５分間回転させて、体積測定用段階的滅菌ガラス採取バイル（a graduated sterile glass collection vile）中に吐き出すことより、誘導唾液サンプルを提供することを求められた。

ＧＣＦおよび唾液を、１０人のボランティアから採取し、そのそれぞれを５つの表現型群：健康、歯肉炎、軽度の歯周炎、重度の歯周炎、および−ｖｅ対照群（a −ve control group）として無歯患者、に明確に定義した。したがって、合計５０人のボランティアを採用してサンプリングした。前記歯周組織炎を除去して改善された健康を回復するために、歯周炎のボランティア（群３および４）を次いで非外科的に処置した。ＧＣＦおよび唾液をまた、これらの２つの群においては、処置後３か月後に採取して、縦断的データを提供した。

表２は、ベースライン時点および治療後の時点で、５つの発現型群を表す５０人の患者から得られた平均臨床データを提示する。ＧＣＦおよび唾液サンプルを、１０人のボランティアから採取し、そのそれぞれを５つの表現型群：群Ｉ（健康）、群ＩＩ（歯肉炎）、群ＩＩＩ（軽度の歯周炎）、群ＩＶ（重度の歯周炎）、群Ｖ（陰性対照群としての無歯患者）、に明確に定義し、ここで、前記表現型群を、予め定義された臨床データ閾値に基づいて定義する。前記歯周組織炎を除去して改善された健康を回復するために、歯周炎のボランティア（群３および４）を、非外科的に処置したので、「ベースライン」および「再調査」の両方の臨床データを有する。

表２

サンプル処理
ＧＣＦサンプル
ＧＣＦサンプルを、ボランティア毎に６本の歯の近心面頬面（mesio−buccal）サイトから、従来のとおりに（as is convention）３０秒間、Perotron 8000（登録商標）で体積を読み、Periopaper片上に採取した（Chapple et al 1999）。これらを１．５ｍＬ スクリュートップクライオチューブ中の、４００μＬの１００ｍＭ 炭酸アンモニウム緩衝液中に置いた。前記ＧＣＦサンプルを、直ちに−８０℃まで凍結した。分析に先立って、ＧＣＦを氷上で解凍した。前記チューブを３０秒間ボルテックスして、溶液を清潔なスナップトップエッペンドルフチューブ中に除去した。２００μＬの炭酸アンモニウム（１００ｍＭ）を、前記片に添加した。これらを、３０秒間、再度ボルテックスして、１３，０００ＲＰＭで５分間、再度遠心分離した。溶液を除去して、前のものに添加した。群内の各サンプルから、１５０μＬを合わせて、群毎に、単一の「プールされた（pooled）」サンプルを得た。個別の患者サンプルを戻して（held back）、いったん好ましいバイオマーカーパネルが解明されたところで、患者特有レベルでの研究後の再評価が可能となるようにした。したがって、６×１．５ｍＬ「母集団」サンプルが、表３に示すとおり、ＭＳによるプロテオーム分析に利用可能であった。

表３

唾液サンプル
唾液の分泌を、滅菌マーブルを使用して誘導し、１５ｍＬファルコンチューブ中に５分間採取した。チューブを、−８０℃で凍結させた。分析に先立って、前記唾液を４℃で解凍した。追加のファルコンチューブを、解凍前に秤量して、透明の（clarified）唾液を移動した。いったん解凍されたところで、前記唾液を、１．５ｍＬ スナップトップエッペンドルフチューブ中に等分して、１３，０００ＲＰＭで５分間、遠心分離した。上澄みを、前記予め秤量されたチューブ中に移動した。前記破片ペレット（debris pellet）をまた、今後の分析のために保持した。唾液の重量および体積の両方を記録した。群毎に、１０μＬの各唾液サンプルを、ＧＣＦサンプルと同様のやり方で合わせた。しかしながら、ＧＣＦとは異なり、唾液は、無歯患者群（群５）から利用可能であったため、合計７×１０５μＬの「母集団」の唾液サンプルとなった。ＧＣＦについては、前記個別の患者サンプルを戻して、今後の「患者レベル」分析が可能となるようにした。前記プールされた唾液サンプルを、１３，０００ＲＰＭで５分間、遠心分離して、１００μＬを保持した。これは、最終サンプル中に、破片が移動されないことを保証するものであった。炭酸アンモニウム（１００μＬ、２００ｍＭ）を、各サンプルに添加した。

ＬＣ ＦＴ ＭＳ／ＭＳによるサンプル分析
ジチオトレイトール（dithiothrietol）を、ＧＣＦおよび唾液サンプルの両方に添加し（２０μＬ、５０ｍＭ）、これらを、６０℃で４５分間振とうしながらインキュベートして、あらゆるジスルフィド結合を還元した。前記サンプルを、ヨードアセトアミド（１００μＬ、２２ｍＭ）の添加および暗所での２５分間室温でのインキュベートの前に室温に戻した。ヨードアセトアミドは、システイン残基上の遊離チオール基をアルキル化する。ジチオトレイトール（２．８μＬ、５０ｍＭ）を添加して、残留する、あらゆるヨードアセトアミドをクエンチした。１μｇのＬｙｓ−Ｃ（リシン残基のＣ末端でタンパク質を切断するもの）を、各サンプル（１：１００ 酵素：タンパク質）に添加して、３７℃で振とうしながら４時間インキュベートした。２μｇのトリプシン（リシンおよびアルギニン残基のＣ末端でタンパク質を切断するもの）を添加し、一晩３７℃で、消化を継続した。

前記サンプルを、（ｉＴＲＡＱラベリングに必要な）脱塩に先立って真空遠心分離乾燥した。前記サンプルを酸性化して（２００μＬ、０．５％ ＴＦＡ）、マクロトラップ（Michrom）を使用して脱塩を行った。前記トラップをアセトニトリルで湿らせ（３×５０％、２００μＬ）、続いてトリフルオロ酢酸で洗浄した（３×０．１％、２００μＬ）。前記サンプルを、次いで前記トラップをにより負荷し、溶離液は、再度前記トラップを通った。前記トラップを、再度トリフルオロ酢酸で洗浄し（３×０．１％、２００μＬ）、最終的にペプチドをアセトニトリルで溶離した（７０％、１００μＬ）。前記サンプルを、真空遠心分離乾燥した。

前記乾燥サンプルを、以下の表４に示すとおり、前記ｉＴＲＡＱ ８−ｐｌｅｘラベルでラベルした。前記ラベリングにより、全てのサンプルが連続的に混合され、一連の条件下で、三連で（in triplicate）行うことが可能となる。続いて、前記個別群のサンプルを、前記ｉＴＲＡＱラベルから同定した。

表４

全ての個別のサンプルを、ＧＣＦおよび唾液のそれぞれについて、一緒に混合する前に、前記サンプルをラベルして２時間室温でインキュベートした。前記合わせたサンプル（１つのプールされた唾液および１つのプールされたＧＣＦ）を、真空遠心分離乾燥した。前記サンプルを、前記ＳＣＸシステムのための１００μＬの移動相Ａ中に再懸濁させた（１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ ３、２０％ ＭｅＣＮ）。前記ペプチドを上記の移動相Ａおよび移動相Ｂを使用した、強カチオン交換クロマトグラフィーを使用して、分離した（１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、５００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ ３、２０％ ＭｅＣＮ）。勾配を、９０分間かけた。１５個の画分を回収した。画分１５および１２を合わせて、同様に１３および１４を合わせて、１３画分を得た。

図２および３を参照して、２１４ｎｍで記録された前記ＵＶを有する、得られたＳＣＸ ＵＶトレースを、唾液サンプルおよびＧＣＦサンプルのそれぞれについて示す。前記唾液およびＧＣＦサンプルを、次いで、上記のマクロトラップＬＣカラムで脱塩して、真空遠心分離して、２００μＬの０．１％ギ酸中に再度懸濁した。２０μＬの前記サンプルを、２個のジップチップ（ziptip）で脱塩して、２０μＬ中で溶離した。

画分分析
各画分を、三連で、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。ペプチドを移動相Ａ（０．１％ ギ酸）中で、１５０ｍｍ Acclaim PepMap100 C18カラム上に負荷した。ペプチドを、３５０ｎｌ／分の流速で、３．２％から４４％の移動相Ｂ（アセトニトリル＋０．１％ ギ酸）の線形勾配により、分離した。３．２％の移動相Ｂにおいて再平衡化する前に、前記カラムを、次いで９０％の移動相Ｂで洗浄した。前記カラムオーブンを、３５℃まで加熱した。前記ＬＣシステムを、Advion Triversa Nanomate（Advion，Ithaca，NY）に連結し、これは、１．７ｋＶのスプレー電圧で前記ペプチドを注入した。ペプチドを、前記LTQ−Orbitrap Velos ETD(Thermo Fischer Scientific，Bremen，ドイツ国)中に、直接注入した。前記質量分析計に、フルＦＴ−ＭＳスキャン（ｍ／ｚ ３８０〜１６００）を行い、続いて、３種の最も存在量のあるイオンの解離衝突誘起解離（ＣＩＤ）ＭＳ／ＭＳスキャンを行い、これに続いて同一の３種のイオンの高エネルギー衝突解離（ＨＩＤ）を行った。前記ＣＩＤスペクトルを使用して、前記ペプチドを同定し、前記ＨＣＤスペクトルを使用してそれらを定量した。

データ分析
前記データを、Proteome Discoverer（V1.2，Thermo Fisher Scientific）を使用して分析した。データを技術的反復（technical repeat）として分析した。MascotおよびSEQUESTアルゴリズムを使用して、使用した同一の設定で前記データを探索した。前記データベースは、Socranskyにより記載されたとおりの、口腔細菌が補充された前記ＩＰＩヒトデータベースであった。このデータベースを、リバースバージョン（reverse version）で連結して、過誤率（false discovery rate）を提供した。前記データを、以下の設定で探索した：セミトリプシンを、最大で２個の切断部欠如を有する前記酵素として選択し、前記前駆体イオンについて５ｐｐｍの質量精度であり、フラグメントイオン質量許容差を０．５Ｄａに設定した（semi−trypsin was selected as the enzyme with a maximum of 2 missed cleavages，5 ppm mass accuracy for the precursor ion，fragment ion mass tolerance was set to 0.5 Da）。システインのカルボキシアミドメチル化ならびにＮ−末端およびリシン残渣へのｉＴＲＡＱ添加を、静的修正として設定した。セリン、トレオニンおよびチロシンのホスホリル化を、メチオニンの酸化およびチロシンへのｉＴＲＡＱ添加と同様に、可変修正（variable modification）として設定した。

各技術的複製からの前記探索結果を合わせて、２つまたは３つ以上のペプチドで同定されたタンパク質を、同定されたとおりに分類した。唯一のペプチドのみが、タンパク質定量に使用され、タンパク質グループ化を用いた（唯一のペプチドを含むタンパク質のみが使用された）。

ＧＣＦ分析予備結果−見出されたタンパク質
全てのＧＣＦサンプルの前記分析から、２７０種のタンパク質が、２つまたは３つ以上のペプチドで同定された。これは、２６４種のヒトタンパク質および６種の細菌タンパク質を含むものであった。前記同定されたタンパク質を、添付の追加の表１において、関連する定量値に沿って示す。全てのタンパク質を、健康な対照群に対する比で示す（ラベル１１３−健康）。このデータを、続いて、採取されたＧＣＦ体積に正規化して、またｌｏｇ変換して（底２）、陽性または陰性生存量値を得た。

あらゆる前記疾患状態において、単に同定されるタンパク質はなかった。前記タンパク質の大部分は、健康なもの、歯肉炎および疾患間での、存在量の減少を示した（歯肉炎では２２９種の、軽度の歯周炎では１９５種の、および重度の歯周炎では１７４種のタンパク質が、健康なものと比較してより低い存在量であった）。前記群にわたる存在量のこの減少は、組織がより炎症を起こすものとして、および表２に証明されるとおり、ＧＣＦ体積の増加によるものであり得る。代替的に、ＧＣＦの「非正規化」分析を、この問題に対処するために行ってもよく、これは、文献において認識されている（Lamster et al 1986，Chapple et al 1994＆1999）。

見出されたタンパク質に行われた、ＧＣＦクラスタリング分析
見出されたタンパク質を、前記PolySNAP 3ソフトウェアを使用してクラスタリングした。PolySNAP 3は、各一次元タンパク質プロファイルを、他の全てと比較し、ピアソンパラメータのおよびスピアマン非パラメータの相関係数の加重平均を使用して、類似スコアを生じさせる。前記プロファイルを、主成分分析、ガンマ統計法、および計量多次元尺度法（ＭＭＤＳ）を含む統計法の組み合わせを使用してクラスタリングした。前記データを、次いで、系統樹、ＰＣＡプロット、およびＭＭＤＳプロットで視覚化した。この分析において、群平均リンク階層的クラスタリング法および完全リンク階層的クラスタリング法を使用して、前記データをグループ化した。全ての場合において、使用したクラスターの数を、自動的にPolySNAP 3により設定した。
前記群平均クラスタリングから、３回のクラスタリングを行った。最大数のタンパク質を有する前記群を、各点において再クラスタリングした。

第１回のクラスタリング
図４を参照すると、第１回の分析により、６個のクラスターが提供された。クラスター１は、前記タンパク質の大部分（２４３種のタンパク質）を含み、クラスター２は、１９種のタンパク質を含み、クラスター３、５および６は、それぞれ１種のみのタンパク質を含み、クラスター４は、５種のタンパク質を含むものであった。

引き続き図４を参照すると、クラスター４は、疾患の間に存在量が減少するが、分割後に（post−resolution）ベースラインに戻らない、１セットのタンパク質を含むため、関心の対象であり得る。クラスター２として同定された前記１９種のタンパク質は、歯周炎でのレベルのようにベースラインに戻る前に、歯肉炎で存在量の増加を示す。これは、血液を含む前記ＧＣＦサンプルの１種によるものであり得るが、出血は、歯肉炎および歯周炎の決定的な臨床サインであり、血液関連タンパク質は、健康および疾患について極めて識別的であり得る。ヘモグロビンアルファおよびベータを含むこの群において同定された、数種の血液関連タンパク質がある。これは、血液が存在する可能性があるにもかかわらず、歯肉炎および歯周炎および健康を区別し得る群として関心の対象であり得る。クラスター３および５は、例えば、未処置の歯周炎を、健康／歯肉炎と区別すると思われる。
前記タンパク質、同定された、関心のあるクラスターである、クラスター３、４および５を、添付の追加の表２に示す。

第２回のクラスタリング
図５を参照すると、図４のクラスター１からの前記２４３種のタンパク質を再クラスタリングし、合計４つの群を得た。群１Ａは、前記タンパク質の主要部（２３３種）を含み、群１Ｂおよび１Ｃは、それぞれ２種のタンパク質を含み、群１Ｄは、６種のタンパク質を含むものであった。群１Ｄは、歯周炎で増加する前に、健康および歯肉炎間でほとんど変化を示さない。軽度の歯周炎および処置された軽度の歯周炎間で相対的存在量が下落して、前記処置された重度の歯周炎でベースラインへ戻っている。群１Ｃで同定された前記２種のタンパク質は、前記処置されたサンプル中で前記ベースラインに向かって戻る前に、歯肉炎まで減少して２つの歯周炎群まで大きく減少して、疾患に従うと思われる（appear to follow）。かかるタンパク質は、処置が成功したか否かの結果測定として分析したものと想定され得る。
関心のあるクラスター中で同定された前記タンパク質である、クラスター１Ｃおよび１Ｄを、添付の追加の表３に示す。

第３回のクラスタリング
図６を参照すると、図５のクラスター１Ａからの前記２３３種のタンパク質を再度クラスタリングし、４つのクラスターを得たが、存在量の変化は、ここでは、対数スケールで２より小さい（４倍の増加／減少）。最大クラスター（１Ａ１）は、なお１７１種のタンパク質を含み、クラスター１Ａ２は、５０種のタンパク質を含み、１Ａ３は、１０種のタンパク質を含み、１Ａ４は、２種のタンパク質を含むものであった。再び、この分析において、潜在的に関心のある群があるように思われる。
関心のある各クラスター中で同定された前記タンパク質である、クラスター１Ａ３および１Ａ４を、添付の追加の表４に示す。

最終回のクラスタリング
図７を参照すると、図６のクラスター１Ａ１からの前記１７１種のタンパク質について、最終回のクラスタリングが行われた。これにより、図６に示す４つの群が得られた。この分析から、関心があると思われるクラスターはない。
複数回のクラスタリング分析により、ＧＣＦ中に、歯周炎の異なる疾患状態を区別し得る、いくつかの群があることが示唆される。

唾液分析予備結果−見出されたタンパク質
全ての唾液サンプルを、ＧＣＦサンプルと同様に分析した。３１４種のタンパク質が、２つまたは３つ以上のペプチドで同定され、これは、３０７種のヒトタンパク質および７種の細菌タンパク質を含むものであった。１種のタンパク質を、１種のサンプル群（無歯）においてのみ同定した。前記同定されたタンパク質を、添付の追加の表５において、関連する定量値に沿って示す。

見出されたタンパク質に行われた唾液クラスタリング分析
第１回のクラスタリング
前記クラスタリング分析について、前記無歯サンプルは含まれなかった。PolySNAP 3を使用してクラスタリング分析を行った。図８を参照すると、第１回のクラスタリングにより、５個のクラスターを得た。最大クラスター（１）は、２９７種のタンパク質を含む一方で、クラスター２および５は、それぞれ１種のタンパク質を含むものであった。クラスター３は、１１種のタンパク質を含み、クラスター４は、３種のタンパク質を含むものであった。前記ＧＣＦデータセットと同様に、疾患で下方制御されて処置後にベースラインに戻らない、タンパク質の群がある。クラスター２は、重度の歯周炎を、より軽度の状態と区別すると思われる。
関心のある前記クラスターにおいて同定された前記タンパク質である、クラスター２を、添付の追加の表６に示す。

第２回のクラスタリング
図９を参照して、図８からのクラスター１を、再クラスタリングして、さらに４つのクラスター群を得た。最大の群は、１６６種のタンパク質を含むものであった（クラスター１Ａ）。クラスター１Ｂおよび１Ｄは、それぞれ１４種および１種のタンパク質を含むものであった。これらの２つの群は、歯肉炎／軽度の歯周炎および重度の歯周炎を区別し得る。しかしながら、両方の場合において、重度の歯周炎への前記シグナルは健康レベルに近いが、処置後に、軽度および重度の歯周炎の両方についてタンパク質存在量の増加が起こる。クラスター１Ｃは、１１６種のタンパク質を含むものであった。この群において、健康および歯肉炎間ではほとんど変化を示さず、その後、重度の歯周炎への大幅な増加の前に、軽度の歯周炎への増加がある。これらの値は、前記処置されたサンプルにおいて減少するが、前記歯肉炎の群より、なお高いレベルである。
関心のある各クラスターにおいて同定された前記タンパク質である、クラスター１Ｂおよび１Ｃを、添付の追加の表７に示す。

第３回のクラスタリング
図１０を参照すると、図９からのクラスター１Ａを、再クラスタリングした。クラスター１Ａにより、５つの群が得られ、最大クラスター（１Ａ１）は、１５０種のタンパク質を含むものであった。ここでは、いかなる顕著なクラスターがあるとも思われない。クラスター１Ａ４により、３種のタンパク質が提供され、クラスター１Ａ５により、１種のタンパク質が提供された。クラスター１Ａ４および１Ａ５における前記タンパク質バイオマーカーは全て、軽度の歯周炎におけるものよりは大きく、重度の歯周炎におけるものよりは小さい、健康および歯肉炎間でタンパク質存在量の増加または減少を示す。
クラスター１Ａ４および１Ａ５において同定された前記タンパク質を、添付の追加の表８に示す。

図１１を参照すると、図９からのクラスター１Ｃを、再クラスタリングして、３つのクラスターを得た。クラスター１Ｃ２は、７種のタンパク質を含み、これらは、処置後の減少の前の、重度の歯周炎まで、タンパク質存在量の近線形的増加を示す。この群は、さらにクラスタリングされなかった。クラスター１Ｃ２において同定された前記タンパク質を、添付の追加の表９に示す。

最終回のクラスタリング
図１２を参照すると、図１０からのクラスター１Ａ１を再クラスタリングした。５つのクラスターが観測され、重度の歯周炎についての存在量の増加を示すタンパク質の群（クラスター１Ａ１ｂ）が観測されたが、その他の群には観測されなかった。このクラスター中で同定された、５種のタンパク質があった。クラスター１Ａ１ｂにおいて同定された前記タンパク質を、添付の追加の表１０に示す。

ＧＣＦおよび唾液データセットの比較
前記２個のデータセットにおいて観測された前記タンパク質を比較して、唾液およびＧＣＦサンプルの両方において見出されたタンパク質バイオマーカーを同定した。図１３を参照すると、９５種のタンパク質が、前記ＧＣＦおよび唾液中で同定され、図１３のベン図の重複領域により表される。これは、前記ＧＣＦデータセットで同定されたタンパク質の総数のおよそ３分の１である。

前記重複領域において観測された前記タンパク質を、添付の追加の表１１に示す。追加の表１１中の前記タンパク質についての関連する存在量データを回収して、続いて、観測された前記タンパク質存在量について変換して、Ｌｏｇ（２）比を描いた。さらに、前記ＧＣＦについての２つの値を測定して、一方を回収した体積に正規化し、他方についてはしなかった。

ＧＣＦが、唾液の構成成分であるとされる場合には、および唾液が、前記同一のＧＣＦ体積に正規化されない場合には、前記３つの値を比較することが有用であり得る。これらの三重の値の分析は、これらのタンパク質のいくつかが極めて類似のプロファイルを有することを示す。存在量の値の大きな増加または減少を伴う、それらのタンパク質バイオマーカーのいくつかを、図１４〜１７に描く。

図１４は、タンパク質 Ｓ１００−Ｐについての前記３つのトレースを示す。Ｓ１００−Ｐは、細胞周期の進行および分化の制御に関与する。ＧＣＦおよび唾液の両方について観測され、口腔扁平上皮がんについての潜在的バイオマーカーとして示唆された。図１４に示すとおり、Ｓ１００−Ｐタンパク質のｉＴＲＡＱ測定存在量は、軽度の歯周炎および重度の歯周炎間で、大きな増加があることを示す。したがって、Ｓ１００−Ｐは、軽度および重度の歯周炎を区別するための、有用なタンパク質バイオマーカーとして役立ち得る。

図１５は、カルグラニュリン−Ａとしても知られる、タンパク質 Ｓ１００−Ａ８についての、前記３つのトレースを示す。それは、細菌に対して抗菌活性を有する。炎症におけるプロ炎症（pro inflammatory）のメディエーターであり、ＩＬ８の放出を上方調整する（up−regulate）。高レベルのＳ１００−Ａ８が、慢性歯周炎を有する患者の血漿中で検出された。図１５において示すとおり、Ｓ１００−Ａ８ タンパク質のｉＴＲＡＱ測定存在量は、軽度の歯周炎および重度の歯周炎間で、大きな増加があることを示す。したがって、Ｓ１００−Ａ８は、軽度および重度の歯周炎を区別するための、有用なタンパク質バイオマーカーとして役立ち得る。

図１６は、タンパク質ミオシン−９についての、前記３つのトレースを示す。図１６において示すとおり、ミオシン−９タンパク質のｉＴＲＡＱ測定存在量は、軽度の歯周炎および重度の歯周炎間で、大きな増加があることを示す。したがって、ミオシン−９は、軽度および重度の歯周炎を区別するための、有用なタンパク質バイオマーカーとして役立ち得る。

図１７は、タンパク質トランスアルドラーゼについての、前記３つのトレースを示す。図１７において示すとおり、トランスアルドラーゼタンパク質のｉＴＲＡＱ測定存在量は、軽度の歯周炎および重度の歯周炎間で、大きな増加があることを示す。したがって、トランスアルドラーゼは、軽度および重度の歯周炎を区別するための、有用なタンパク質バイオマーカーとして役立ち得る。

図１８は、タンパク質ヘモグロビンベータについての、前記３つのトレースを示す。図１８において示すとおり、ヘモグロビンベータタンパク質のｉＴＲＡＱ測定存在量は、軽度の歯周炎および重度の歯周炎間で、大きな増加があることを示す。前記トレースはまた、全ての口腔疾患状態の範囲にわたって、増加および減少する。したがって、ヘモグロビンベータ（またはアルファ）は、軽度および重度の歯周炎、および／または他の口腔疾患状態を区別するための、有用なタンパク質バイオマーカーとして役立ち得る。

結果の検討
前記ＧＣＦおよび唾液データセットに、The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery（ＤＡＶＩＤ）を使用した、遺伝子オントロジー分析は、前記唾液データセットにおける最も顕著に強化された生物学的プロセスは、防御応答であり、ＧＣＦデータセットにおいては、細胞骨格形成であったことを示す。上位２０個のプロセスを、添付の追加の表１２に示す。前記２０個のうちの７個は、防御応答、刺激に対する応答、および解糖を含め、ＧＣＦおよび唾液の両方において強化される。

ＧＣＦおよび唾液の前記分析により、ＧＣＦ中で２７０種のタンパク質が同定され、唾液中で３１４種のタンパク質が同定され、そのうちの９５種は、両方において同定された。（無歯の唾液中で単に同定された）１種を除く全てのタンパク質を、前記異なる疾患および回復期にわたって定量した。ＧＣＦおよび唾液の両方において同定される前記タンパク質のうち、疾患により（ＧＣＦおよび唾液データセットの両方の）増加を示し、健康、歯肉炎、軽度および重度の歯周炎ならびに疾患の回復を区別するのに潜在的に使用し得る、いくつかのタンパク質がある。

例示的態様によれば、口腔疾患の状態を診断するための方法は：ヘモグロビン鎖アルファおよびベータ、炭酸脱水酵素１（ＩＰＩ００９８０６７４）、ならびにプラスチン１、からなる群からの少なくとも１種のタンパク質バイオマーカーを選択することを含む。前記方法は、さらに、健康状態、歯肉炎状態、および軽度および／または重度の歯周炎状態である、少なくとも１種の前記状態を診断することを含み得る。別の態様において、前記少なくとも１種のタンパク質バイオマーカーは、唾液データクラスター１Ｃ２（追加の表９）における前記タンパク質バイオマーカー：タンパク質 ＃ＩＰＩ０００１６３４７．５、タンパク質 ＃ＩＰＩ００３７７１２２．４、ヘモグロビンサブユニットアルファ（ＩＰＩ００４１０７１４．５）、ヘモグロビンサブユニットデルタ（ＩＰＩ００４７３０１１．３）、ヘモグロビンサブユニットベータ（ＩＰＩ００６５４７５５．３）、タンパク質 ＃ＩＰＩ００９８０６７４．１およびタンパク質受入番号＃Ｏ８３７７３、からなる群から選択される。

また、前記ＧＣＦおよび唾液データセットの両方において存在量の増加を示すことにより、重度の歯周炎についての潜在的指標である、いくつかのタンパク質バイオマーカーがある。例示的態様において、重度の歯周炎を診断するための方法は：Ｓ１００−Ｐ、トランスアルドラーゼ、Ｓ１００−Ａ８（カルグラニュリン−Ａ）、ミオシン−９、ヘモグロビンアルファ、およびヘモグロビンベータ、からなる群からの少なくとも１種のタンパク質バイオマーカーを選択することを含む。別の態様において、重度の歯周炎を診断するための前記方法は、唾液データクラスター１Ａ１ｂ（追加の表１０）における前記タンパク質バイオマーカー：タンパク質Ｓ１００−Ａ１１（ＩＰＩ０００１３８９５．１）、タンパク質ＩＰＩ０００３７０７０．３、カタラーゼ（ＩＰＩ００４６５４３６．４）、コリントランスポーター様タンパク質２誘導体（ＩＰＩ００９０３２４５．１）、およびチチンのアイソフォーム Ｎ２−Ｂ（ＩＰＩ００９８５３３４．２）、からなる群からの少なくとも１種のタンパク質バイオマーカーを選択することを含む。

なお別の側面において、重度の歯周炎を診断するための前記方法は：Ｓ１００−Ｐ、トランスアルドラーゼ、Ｓ１００−Ａ８（カルグラニュリン−Ａ）、ミオシン−９、ヘモグロビンアルファ、およびヘモグロビンベータ、アルファ−１−酸性糖タンパク質１および２、マトリクスメタロプロテイナーゼ−９、ペプチジル−プロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼＡ、ならびにハプトグロビン関連タンパク質（ＩＰＩ００４３１６４５．１）、からなる群からの、少なくとも１種のタンパク質バイオマーカーを選択することを含む。

別の例示的態様によれば、歯肉炎または軽度の歯周炎を診断するための方法は、唾液データクラスター１Ｂ、１Ｄ（追加の表７）におけるおよび／または唾液データクラスター１Ａ４、１Ａ５（追加の表８）における前記タンパク質バイオマーカーからなる群からの、少なくとも１種のタンパク質バイオマーカーを選択することを含む。これらのタンパク質バイオマーカーは全て、軽度の歯周炎におけるものよりは大きく、重度の歯周炎におけるものよりは小さい、健康および歯肉炎間でタンパク質存在量の増加または減少を示す。これらを使用して、歯肉炎および軽度の歯周炎と重度の歯周炎とを（between gingivitis and mild periodontitis with severe periodontitis）差別化することが、可能であり得る。

別の態様によれば、歯肉炎または軽度の歯周炎を診断するための方法は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性化剤−１およびアルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼからの少なくとも１種のタンパク質を選択することを含む。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性化剤−１は、反応性酸素種の産生に関与する。アルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、重度の歯周炎と比較して、歯肉炎および軽度の歯周炎について、いくつかの最大比を有する。このタンパク質は、糖脂質の分解に関与する。別の側面において、歯肉炎または軽度の歯周炎を診断するための前記方法は、アルファアルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼバイオマーカー（Alphaa alpha−N−acetylgalactosaminidase biomarker）を選択することを含む。

簡単な要約
例示的な態様において、歯周疾患の状態を診断するための方法が、本明細書において実証される。前記方法には、歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）サンプルおよび唾液サンプルを提供すること、前記ＧＣＦサンプルのプロテオームを分析することにより第１タンパク質プロファイルを生じさせること、前記唾液サンプルのプロテオームを分析することにより第２タンパク質プロファイルを生じさせること、前記第１タンパク質プロファイルおよび前記第２タンパク質プロファイル間の重複領域を決定すること、歯周炎の特定の状態を同定するための１セットのタンパク質バイオマーカーを選択すること、ならびに歯周疾患の状態を診断するための、前記選択されたセットのタンパク質バイオマーカーの発現レベルを決定すること、が含まれ、ここで、前記歯周炎の状態を区別するための前記セットのタンパク質バイオマーカーを選択することには、歯周炎の異なる段階の間の前記重複領域内でのタンパク質の存在量（abundance）の変化を計算すること、および歯周炎の単一状態の間に、低発現するまたは高発現する（under or over expressed）、それらのタンパク質を選択すること、が含まれる。

前記方法の別の側面において、前記方法は、さらに、前記少なくとも１種の口腔液サンプルのプロテオームを分析することによりタンパク質プロファイルを生じさせること、および前記タンパク質プロファイルをクラスタリングして１セットのタンパク質バイオマーカーを決定すること、を含む。

例示的な態様において、歯周疾患の状態を診断するためのキットが、本明細書において実証される。前記キットには、歯周炎の段階を区別するために選択された、１セットのタンパク質バイオマーカーが含まれ、ここで、歯周炎の段階を区別するために選択された、前記セットのタンパク質バイオマーカーは、ＧＣＦサンプルのプロテオームを分析することにより第１タンパク質プロファイルを生じさせること、唾液サンプルのプロテオームを分析することにより第２タンパク質プロファイルを生じさせること、前記第１タンパク質プロファイルおよび前記第２タンパク質プロファイル間の重複領域を決定すること、歯周炎の異なる段階の間の前記重複領域内でのタンパク質の存在量の変化を計算すること、および歯周炎の単一状態の間に、低発現するまたは高発現する、それらのタンパク質を選択すること、により選択される。

前記キットの側面において、前記セットのタンパク質バイオマーカーには、ヘモグロビン鎖アルファおよびベータ、炭酸脱水酵素１（国際タンパク質目録または「ＩＰＩ」 ＃ＩＰＩ００９８０６７４）、ならびにプラスチン−１からなる群から選択される、少なくとも１種のタンパク質が含まれる。
前記キットの別の側面において、前記キットは、歯肉炎または軽度の歯周炎を診断し、前記セットのタンパク質バイオマーカーには、さらに、コイルドコイルドメイン含有タンパク質８６、チモーゲン微小体タンパク質１６ホモログＢ、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性化剤１のアイソフォーム２、唾液酸性プロリンリッチホスホタンパク質１／２、下垂体腫瘍形質転換遺伝子タンパク質、Ｒａｂ−３Ａについてのグアニンヌクレオチド交換ファクターのアイソフォーム２、ＡｎｇＲｅｍ５２、アルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、Ｂａｒｄｅｔ−Ｂｉｅｄｌ症候群１０タンパク質、ｃＤＮＡ ＦＬＪ５７３７４、１６ｋＤａ タンパク質、チチン アイソフォーム Ｎ２−Ｂ、未同定タンパク質 ＴＰ＿０４５１ ＯＳ＝梅毒トレポネーマ （株 Ｎｉｃｈｏｌｓ） ＧＮ＝ＴＰ＿０４５１ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１−［Ｙ４５１＿ＴＲＥＰＡ］、ｃＤＮＡ ＦＬＪ５５１４０、グルタミン酸デカルボキシラーゼ２、国際タンパク質目録または「ＩＰＩ」 ＃ＩＰＩ０１０２１１１８．１を有するタンパク質、ホスホキャリアータンパク質ＨＰｒ ＯＳ＝ストレプトコッカス サリバリウス ＧＮ＝ｐｔｓＨ ＰＥ＝１ ＳＶ＝２−［ＰＴＨＰ＿ＳＴＲＳＬ］、および唾液プロリンリッチタンパク質２から選択される、少なくとも１種のタンパク質バイオマーカーが含まれる。

Claims (16)

1. 歯周疾患の状態を診断するための方法であって、以下：
   歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）サンプルおよび唾液サンプルの少なくとも一方を提供すること；
   歯周炎の特定の状態を同定するための１セットのタンパク質バイオマーカーを選択すること；および
   歯周疾患の前記状態を診断するための、前記選択されたセットのタンパク質バイオマーカーの発現レベルを決定すること、
   を含む、方法。
2. 前記セットのタンパク質バイオマーカーを、歯肉炎の状態と歯周炎の状態とを区別するために選択する、請求項１に記載の方法。
3. 前記セットのタンパク質バイオマーカーを、歯周的健康状態と疾患状態とを区別するために選択する、請求項１に記載の方法。
4. 前記セットのタンパク質バイオマーカーを、軽度の歯周炎の状態と重度の歯周炎の状態とを区別するために選択する、請求項１に記載の方法。
5. 前記セットのタンパク質バイオマーカーに、ヘモグロビン鎖アルファおよびベータ、炭酸脱水酵素１（国際タンパク質目録または「ＩＰＩ」 ＃ＩＰＩ００９８０６７４）、ならびにプラスチン１からなる群から選択される、少なくとも１種のタンパク質が含まれる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記セットのタンパク質バイオマーカーに、Ｓ１００−Ｐ、トランスアルドラーゼ、Ｓ１００−Ａ８（カルグラニュリン−Ａ）、ミオシン−９、ヘモグロビンアルファおよびヘモグロビンベータからなる群から選択される、少なくとも１種のタンパク質が含まれる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記セットのタンパク質バイオマーカーに、アルファ−１−酸性糖タンパク質１および２、マトリクスメタロプロテイナーゼ−９、ペプチジル−プロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼＡ、ならびにハプトグロビン関連タンパク質（ＩＰＩ００４３１６４５．１）からなる群から選択される、少なくとも１種のタンパク質が含まれる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記セットのタンパク質バイオマーカーに、ＮＡＤＰＨオキシダーゼおよびアルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼからなる群から選択される、少なくとも１種のタンパク質が含まれる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記セットのタンパク質バイオマーカーに、アルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼが含まれる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記セットのタンパク質バイオマーカーに、タンパク質 Ｓ１００−Ａ１１（ＩＰＩ０００１３８９５．１）、タンパク質 ＩＰＩ０００３７０７０．３、カタラーゼ（ＩＰＩ００４６５４３６．４）、コリントランスポーター様タンパク質２誘導体（ＩＰＩ００９０３２４５．１）、およびチチンのアイソフォーム Ｎ２−Ｂ（ＩＰＩ００９８５３３４．２）からなる群から選択される、少なくとも１種のタンパク質が含まれる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記セットのタンパク質バイオマーカーに、２種または３種以上のバイオマーカーが含まれる、請求項５〜８および１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 歯肉炎および歯周炎を区別するために選択された、１セットのタンパク質バイオマーカーを含む、歯周疾患の状態を診断するためのキット。
13. 前記セットのタンパク質バイオマーカーに、ヘモグロビン鎖アルファおよびベータ、炭酸脱水酵素１（国際タンパク質目録または「ＩＰＩ」 ＃ＩＰＩ００９８０６７４）、ならびにプラスチン１からなる群から選択される、少なくとも１種のタンパク質が含まれる、請求項１２に記載のキット。
14. 前記キットが、歯肉炎または軽度の歯周炎を診断し、前記セットのタンパク質バイオマーカーに、さらに、唾液データクラスター１Ｂ、１Ｄ、１Ａ４、および１Ａ５からの、少なくとも１種のタンパク質バイオマーカーが含まれる、請求項１２に記載のキット。
15. 以下：
    前記ＧＣＦサンプルおよび唾液サンプルの両方を提供すること；
    ＧＣＦサンプルおよび唾液サンプルのプロテオームを分析することにより第１および第２タンパク質プロファイルを生じさせること；
    前記第１および第２タンパク質プロファイル間の重複領域を決定すること、
    をさらに含み、
    ここで、歯周炎の特定の状態を区別するために、前記セットのタンパク質バイオマーカーを選択することに、歯周炎の異なる段階の間の前記重複領域内でのタンパク質の存在量の変化を計算すること、および歯周炎の単一状態の間に、低発現するまたは高発現する、それらのタンパク質を選択すること、を含む、
    請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
16. さらに、以下：
    前記少なくとも１種の口腔液サンプルのプロテオームを分析することによりタンパク質プロファイルを生じさせること；および
    前記タンパク質プロファイルをクラスタリングして１セットのタンパク質バイオマーカーを決定すること、
    を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。

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