KR20110135911A - 바이오마커 - Google Patents

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KR20110135911A
KR20110135911A KR1020110128973A KR20110128973A KR20110135911A KR 20110135911 A KR20110135911 A KR 20110135911A KR 1020110128973 A KR1020110128973 A KR 1020110128973A KR 20110128973 A KR20110128973 A KR 20110128973A KR 20110135911 A KR20110135911 A KR 20110135911A
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periodontitis
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KR1020110128973A
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조제열
이재목
최영진
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경북대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 치은열구액으로부터 분리한 치주염 진단용 바이오 마커에 관한 것이다. 본 발명에 의해 치주염 환자의 치은열구액에서 정상인에 비해 특이적으로 증가하거나 감소하는 단백질에 특이적으로 결합하는 분자 또는 상기 단백질을 암호화하는 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 유효성분으로 포함하는 치주염 진단용 조성물이 제공된다.

Description

바이오마커{BIOMARKER}
본 발명은 바이오마커에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 치주염의 바이오마커에 관한 것이다.
서방 세계에서 성인의 약 7 내지 15%가 치주염을 앓고 있으며, 이는 가장 일반적인 질환의 하나이다. 치아와 잇몸 사이의 낭(pocket)에 병원성 박테리아의 존재가 필수적이기는 하나 충분한 기준이 아닌 경우가 많은 다인성 질환이다. 숙주 염증계 및 면역계가 또한 상기 질환의 발병에 중요한 역할을 한다. 치주염의 진행은 치아의 지지 조직의 파괴를 초래하는 치은하 박테리아에 대한 만성 염증성 반응이라고 생각된다. 이의 거동은 순환적이며 초기 단계에서는 간과된 채로 있을 수 있다.
현재까지 전 세계적으로 치주질환과 관련된 다양한 연구가 진행 중이지만 정작 치주질환을 조기에 진단하고 이를 예방할 수 있는 구체적인 대안을 마련하고 있지 못하고 있다. 특히 치주질환이 어느 정도 진행된 후에 이를 치료하는 것에 연구가 집중되어 있으며, 이러한 연구를 토대로 치료약의 시장이 아주 크게 형성되어 있는 실정이다.
치주염은 뼈와 결합조직의 방사선학적 소견에 의해 진단되는데 이것은 감염 개시 후 수년이 지난 후에 발견되기도 한다. 따라서 현재까지 치주염을 일으키는 병원균의 감염을 초기에 진단할 수 있는 효과적인 방법이 없는 실정이다.
본 발명의 목적은 치주염을 일으키는 병원균의 감염을 조기에 진단할 수 있는 효과적인 마커를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 치주염이 발생하면 즉각적인 상황변화에 반응하여 여러 염증성 물질들을 함유하게 되는 치은열구액(gingival crevicural fluid; GCF)의 프로테옴 분석을 통해 치주염에 대한 바이오마커를 찾기 위한 연구를 거듭한 끝에 본 발명을 완성하였다.
그러므로 상기와 같은 본 발명의 목적은 본 발명의 액틴-연관 단백질 2(ACTR2), 아데닐일 시클라제-연관 단백질 1(CAP1), 마크로파지-캡핑 단백질(CAPG), F-액틴-캡핑 단백질 서브유닛 베타의 이소폼 1(CAPZB), 카탈라제(CAT), 카텝신 G(CTSG), 피브로겐 알파쇄의 이소폼 1(FGA), 호르네린(HRNR), 루코트리엔 A-4 히드롤라제의 이소폼 1(LTA4H), 플라스틴-2(LCP1), 피브리노겐 베타쇄(FGB), 알파-액티닌-1(ACTN1), 백혈구 엘라스타제(ELA2), 미엘로블라스틴(PRTN3), 아주로시딘(AZU1), 미오신-9의 이소폼 1(MYH9), 아넥신 A3(ANXA3), F-액틴-캡핑 단백질 서브유닛 알파-1(CAPZA1), 헤모글로빈 서브유닛 델타(HBB; HBD), 로(Rho) GDP-해리 억제제 2(ARHGDIB), 코로닌-1A(CORO1A), 헤모글로빈 서브유닛 베타(HBB), 헤모글로빈 서브유닛 알파(HBA1; HBA2), 아세틸-CoA 카르복실라제 2의 장형 이소폼(ACACB), hCG2011852 유사체(LOC643677), 알파-2-마크로글로불린(A2M), 코필린-1(CFL1), 알파 골격근 액틴(ACTA1), 알파-1B-당단백질(A1BG), Rab GDP-해리 억제제 베타 고유사체 cDNA FLJ60299(GDI2), 세포질 말레이트 디히드로게네이즈(MDH1), 히스톤 H4(HIST1H4F; HIST1H4J; HIST1H4A; HIST1H4C; HIST1H4E; HIST1H4L; HIST1H4K; HIST1H4I; HIST2H4B; HIST4H4; HIST1H4D; HIST1H4B; HIST1H4H; HIST2H4A), 알파-1-안티트립신의 이소폼 1(SERPINA1), 호중구 젤라티나제-관련 리포칼린(LCN20), 글리세랄데히드-3-포스페이트 디히드로게나제(GAPDH) 및 프로필린-1(PFN1)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 단백질로서 치주염시 증가되는 것을 특징으로 하는 치주염 진단용 바이오마커를 통해 달성된다.
또한 본 발명의 목적은 헤모펙신(HPX), IGKV1-5 단백질(IGKV1-5), 14-3-3 단백질 제타/델타(YWHAZ), IGHA1 단백질(IGHA1; IGHV3OR16-13a), IGHA1 단백질(IGHA1; IGHV3OR16-13), 시스타틴-A(CSTA), IGLV3-25 단백질(IGLV3-25), 단백질 DKFZp686K04218(단편), 면역글로불린 J쇄(IGJ), 타이미딘 포스포릴라제(TYMP), Ig 카파쇄 V-III 구역 HIC, 상피 지방산 결합 단백질(FABP5L7; FABP5), 시스타틴-B(CSTB), 리포폴리사카라이드-반응성 베이지양(beige-like) 앵커 단백질(LRBA), 시스타틴-SN(CST1), 미오신-반응성 면역글로불린 경쇄 가변영역(IGKV3D-15), 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나아제 B(NME2), 14-3-3 단백질 엡실론(YWHAE), 알파-2-당단백질 1 아연(AZGP1), 열충격단백질 베타-1(HSPB1), IGL@ 단백질(IGL@), 글루타치온 S-트랜스퍼라제 P(GSTP1), 프롤락틴-유도성 단백질(PIP), 단백질 S100-A2(S100A2), 중합체성 면역글로불린 수용체(PIGR), 글루타치온 트랜스퍼라제 오메가-1(GSTO1), 카르보닐 리덕타제[NADPH] 1(CBR1), 세르핀 B3의 이소폼 1(SERPINB3), 알도-케토 리덕타제 패밀리 1 멤버 B10(AKR1B10) 및 cDNA FLJ75207(CRISP3)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 단백질로서 치주염시 감소하는 것을 특징으로 하는 치주염 진단용 바이오 마커에 의해 달성된다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 상세한 설명 및 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이다.
본 발명의 바이오마커에 의해서 치주염을 초기에 진단할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 치주염 환자와 정상인의 치은열구액 시료의 SDS-PAGE 분석 도면이다. P: 치주염 환자, N: 정상인.
도 2는 치주염 환자와 정상인의 치은열구액 시료에서의 아주로시딘 검출 ELISA 결과를 나타낸 도면이다. N: 정상인, E/P: 초기/경도 치주염, M/P: 중도 치주염, S/P: 심도 치주염.
도 3은 치주염 환자와 정상인의 잇몸에서 채취한 시료에서의 아주로시딘 검출 웨스턴 블롯 도면이다. N: 정상인, E/P: 초기/경도 치주염, M/P: 중도 치주염, S/P: 심도 치주염.
본 발명은 액틴-연관 단백질 2(ACTR2), 아데닐일 시클라제-연관 단백질 1(CAP1), 마크로파지-캡핑 단백질(CAPG), F-액틴-캡핑 단백질 서브유닛 베타의 이소폼 1(CAPZB), 카탈라제(CAT), 카텝신 G(CTSG), 피브로겐 알파쇄의 이소폼 1(FGA), 호르네린(HRNR), 루코트리엔 A-4 히드롤라제의 이소폼 1(LTA4H), 플라스틴-2(LCP1), 피브리노겐 베타쇄(FGB), 알파-액티닌-1(ACTN1), 백혈구 엘라스타제(ELA2), 미엘로블라스틴(PRTN3), 아주로시딘(AZU1), 미오신-9의 이소폼 1(MYH9), 아넥신 A3(ANXA3), F-액틴-캡핑 단백질 서브유닛 알파-1(CAPZA1), 헤모글로빈 서브유닛 델타(HBB; HBD), 로(Rho) GDP-해리 억제제 2(ARHGDIB), 코로닌-1A(CORO1A), 헤모글로빈 서브유닛 베타(HBB), 헤모글로빈 서브유닛 알파(HBA1; HBA2), 아세틸-CoA 카르복실라제 2의 장형 이소폼(ACACB), hCG2011852 유사체(LOC643677), 알파-2-마크로글로불린(A2M), 코필린-1(CFL1), 알파 골격근 액틴(ACTA1), 알파-1B-당단백질(A1BG), Rab GDP-해리 억제제 베타 고유사체 cDNA FLJ60299(GDI2), 세포질 말레이트 디히드로게네이즈(MDH1), 히스톤 H4(HIST1H4F; HIST1H4J; HIST1H4A; HIST1H4C; HIST1H4E; HIST1H4L; HIST1H4K; HIST1H4I; HIST2H4B; HIST4H4; HIST1H4D; HIST1H4B; HIST1H4H; HIST2H4A), 알파-1-안티트립신의 이소폼 1(SERPINA1), 호중구 젤라티나제-관련 리포칼린(LCN20), 글리세랄데히드-3-포스페이트 디히드로게나제(GAPDH) 및 프로필린-1(PFN1)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 단백질로서 치주염시 증가되는 것을 특징으로 하는 치주염 진단용 바이오마커를 제공한다.
또한 본 발명은 헤모펙신(HPX), IGKV1-5 단백질(IGKV1-5), 14-3-3 단백질 제타/델타(YWHAZ), IGHA1 단백질(IGHA1; IGHV3OR16-13a), IGHA1 단백질(IGHA1; IGHV3OR16-13), 시스타틴-A(CSTA), IGLV3-25 단백질(IGLV3-25), 단백질 DKFZp686K04218(단편), 면역글로불린 J쇄(IGJ), 타이미딘 포스포릴라제(TYMP), Ig 카파쇄 V-III 구역 HIC, 상피 지방산 결합 단백질(FABP5L7; FABP5), 시스타틴-B(CSTB), 리포폴리사카라이드-반응성 베이지양(beige-like) 앵커 단백질(LRBA), 시스타틴-SN(CST1), 미오신-반응성 면역글로불린 경쇄 가변영역(IGKV3D-15), 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나아제 B(NME2), 14-3-3 단백질 엡실론(YWHAE), 알파-2-당단백질 1 아연(AZGP1), 열충격단백질 베타-1(HSPB1), IGL@ 단백질(IGL@), 글루타치온 S-트랜스퍼라제 P(GSTP1), 프롤락틴-유도성 단백질(PIP), 단백질 S100-A2(S100A2), 중합체성 면역글로불린 수용체(PIGR), 글루타치온 트랜스퍼라제 오메가-1(GSTO1), 카르보닐 리덕타제 [NADPH] 1(CBR1), 세르핀 B3의 이소폼 1(SERPINB3), 알도-케토 리덕타제 패밀리 1 멤버 B10(AKR1B10) 및 cDNA FLJ75207(CRISP3)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 단백질로서 치주염시 감소하는 것을 특징으로 하는 치주염 진단용 바이오 마커를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 마커 단백질에 특이적으로 결합하는 분자를 이용한 치주염 진단용 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 구체예에서 상기 분자는 항체이다.
생물학적 시료 중에서 특정 단백질의 존재여부는 시료를 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시켜 항원-항체 복합체의 형성여부를 측정함으로써 확인할 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"란 생물학적 시료 중의 특정 단백질과 이를 특이적으로 인지하는 항체의 결합물을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 "생물학적 시료" 또는 "시료"는 타액, 치은열구액 및 생물학적 기원의 기타 시료를 말한다. 바람직하게는, 상기 생물학적 시료 또는 시료는 치은열구액이다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다.
상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 세포 용해, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다.
본 발명에서 "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에 사용되는 항체는 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편(예를 들어, Fab 또는 (Fab)2 단편), 항체 중쇄, 인간화 항체, 항체 경쇄, 유전자 조작된 단일쇄 F 분자, 키메릭 항체 등일 수 있다.
본 발명의 마커 단백질들은 공지된 단백질이므로 본 발명에 사용되는 항체는 상기 공지된 단백질을 항원으로 하여 면역학 분야에서 널리 알려져 있는 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 항체의 항원으로서 사용되는 단백질은 천연에서 추출하거나 합성될 수 있으며 DNA 서열을 기초로 하여 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 형질 전환체에서 목적으로 하는 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 후 형질 전환체로부터 목적으로 하는 단백질을 회수함으로써 수득될 수 있다.
예를 들어, 다클론 항체는 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 칠면조, 토끼, 마우스 또는 래트와 같은 여러 온혈 동물을 이용하여 제조할 수 있다.
단클론 항체도 공지된 융합방법, 재조합 DNA 방법 및 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 진단용 조성물은 단백질에 특이적인 항체 이외에 면역학적 분석에 사용되는 당 업계에 공지된 시약을 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 예를 들어, 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법(radioimmunoassays), 효소결합면역법(ELISA: Enzyme Linked Immunoabsorbent assay), 면역 블롯(immunoblotting), 파아르 분석법 (Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 면역크로마토그래피법, 단백질 칩 및 면역형광법이 있다.
면역학적 분석에 사용되는 시약으로는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함된다. 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.
상기에서 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하며, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등을 사용할 수 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 형광물로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 리간드로는 비오틴 유도체 등이 있으며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있다. 방사성 동위원소로는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있는 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 마커 단백질의 존재여부를 확인할 수 있는 방법으로는 본 발명의 마커 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 이용할 수 있다. 그러므로 본 발명은 본 발명의 마커 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 치주염 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 진단용 조성물은 진단의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 적합한 담체 또는 지지체상에 공지된 다양한 방법을 이용하여 고정화된 상태로 제공될 수 있다. 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카르복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 치주염 진단용 조성물은 진단용 키트 또는 마이크로어레이 형태로 제공될 수 있다.
상기 진단용 키트로는 예를 들면, 시료 중의 특정 단백질을 검출하기 위해 면역크로마토그래피법을 기초로 하는 측방 유동 검정 키트(lateral flow assay kit)의 형태로 제공될 수 있다. 측방 유동 검정 키트는 시료가 적용되는 샘플패드 (sample pad), 탐지용 항체가 코팅되어 있는 방출패드(releasing pad), 시료가 이동하여 분리되고 항원-항체 반응이 일어나는 전개용 막(예를 들어 니트로셀룰로스) 또는 스트립, 그리고 흡수패드(absorption pad)로 이루어져 있다.
상기 마이크로어레이는 일반적으로 특정 시약으로 처리된 슬라이드 글라스 표면 위에 항체를 부착하여 항원-항체 반응에 의해 상기 항체에 특이적으로 부착하는 단백질을 검출할 수 있도록 하는 것이다.
또한 본 발명은 상기 마커 단백질을 암호화하는 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 치주염 진단용 조성물을 제공한다.
프라이머를 이용한 특정 핵산의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 목적 유전자의 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 유전자의 증폭여부를 확인함으로써 수행될 수 있다. 또한, 프로브를 이용한 특정 핵산의 검출은 적합한 조건하에서 시료 핵산을 프로브와 접촉시킨 후 하이브리드화되는 핵산의 존재여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.
상기 "프라이머"란 짧은 자유 수산화기를 가지는 핵산서열로서 상보적인 템플리트와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플리트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산서열을 말한다. 본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
상기 "프로브"는 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수 개 내지 수백 개의 염기로 이루어진 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하고, 라벨링되어 있어 특정 mRNA의 존재유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고 비오틴, FITC, 로다민, DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위 원소 등으로 표지될 수 있다.
또한, 상기 프로브는 검출 가능한 물질 예를 들면, 적합한 신호를 제공하고 충분한 반감기를 갖는 방사성 표지로 표지할 수 있다. 표지된 프로브는 공지된 바와 같은 고체 지지체 상의 핵산에 하이브리드화시킬 수 있다.
상기 프로브나 프라이머를 이용하여 특정 핵산을 검출할 수 있는 방법으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 중합효소 연쇄반응(PCR), DNA 시퀀싱, RT-PCR, 프라이머 연장법, 올리고뉴클레오타이드 연장 분석, 대립형질 특이적 PCR법, RNase 불일치 절단, 단일가닥 입체 다형화, SSCP 및 헤테로두플렉스 동시 분석법, 변성 구배 젤 전기영동(DGGE), 변성 고압 액체 크로마토그래피, 혼성화 반응, DNA 칩 등이 있다. 상기 혼성화 반응의 예로는 노던 하이브리다이제이션, 인시츄 하이브리다이제이션 및 마이크로어레이 방법 등이 있다.
상기 본 발명의 치주염 진단용 조성물은 상술한 핵산을 검출하는 방법에 일반적으로 사용되는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, PCR 반응에 요구되는 dNTP(deoxynulceotide triphosphate), 내열성 중합효소(polymerase), 염화마그네슘 등의 금속이온염이 포함할 수 있으며, 시퀀싱에 요구되는 dNTP, 시쿼나제 (sequenase) 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 치주염 진단용 조성물은, 예를 들면 이에 한정되지는 않지만 본 발명의 마커 유전자에 대하여 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함하는 RT-PCR 키트, 본 발명의 마커 유전자의 cDNA 또는 올리고뉴클레오타이드가 부착된 기판을 포함하는 DNA 칩 등과 같은 진단용 키트 또는 마이크로어레이의 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 치주염 환자와 정상인의 각 20의 GCF를 SDS-PAGE로 분석했다. 전기영동 후 쿠마시 블루 염색을 통해 확인한 결과 환자와 정상인 간에 37kD에서 차이가 나타났다(도 1). 각 레인을 15등분하여 분석을 실시하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는 치은열구액 시료에 대해서 LS-MS/MS 분석을 수행하였다. 15등분의 겔을 잘라 인-겔 소화를 시킨 후 분리된 펩타이드를 LC-MS/MS분석하였다. 전체적으로 발견된 단백질의 수는 115개이며, 치주염 환자에서 발견 비율이 1.5배 이상인 단백질은 표 1에, 0.6배 내지 1.5배인 단백질은 표 2에, 그리고 0.6배 이하인 단백질들은 표 3에 나타내었다. 그 중에서 아주로시딘(azurocidin)은 약 4.8배 정도의 차이를 보이며 두 번의 분석에서 비슷한 양상을 보였다. 아주로시딘이 약 27kD의 크기를 가지므로 다시 그 크기에 해당하는 밴드만을 재분석한 결과는 표 4에 나타냈다.
표 1의 단백질 중 S100A8, S100A9, MMP9는 종래 치주염과의 관련성이 연구된 단백질이지만 액틴-연관 단백질 2(ACTR2), 아데닐일 시클라제-연관 단백질 1(CAP1), 마크로파지-캡핑 단백질(CAPG), F-액틴-캡핑 단백질 서브유닛 베타의 이소폼 1(CAPZB), 카탈라제(CAT), 카텝신 G(CTSG), 피브로겐 알파쇄의 이소폼 1(FGA), 호르네린(HRNR), 루코트리엔 A-4 히드롤라제의 이소폼 1(LTA4H), 플라스틴-2(LCP1), 피브리노겐 베타쇄(FGB), 알파-액티닌-1(ACTN1), 백혈구 엘라스타제(ELA2), 미엘로블라스틴(PRTN3), 아주로시딘(AZU1), 미오신-9의 이소폼 1(MYH9), 아넥신 A3(ANXA3), F-액틴-캡핑 단백질 서브유닛 알파-1(CAPZA1), 헤모글로빈 서브유닛 델타(HBB; HBD), 로(Rho) GDP-해리 억제제 2(ARHGDIB), 코로닌-1A( CORO1A), 헤모글로빈 서브유닛 베타(HBB), 헤모글로빈 서브유닛 알파(HBA1;HBA2), 아세틸-CoA 카르복실라제 2의 장형 이소폼(ACACB), hCG2011852 유사체(LOC643677), 알파-2-마크로글로불린(A2M), 코필린-1(CFL1), 알파 골격근 액틴(ACTA1), 알파-1B-당단백질(A1BG), Rab GDP-해리 억제제 베타 고유사체 cDNA FLJ60299(GDI2), 세포질 말레이트 디히드로게네이즈(MDH1), 히스톤 H4(HIST1H4F; HIST1H4J; HIST1H4A; HIST1H4C; HIST1H4E; HIST1H4L; HIST1H4K; HIST1H4I; HIST2H4B; HIST4H4; HIST1H4D; HIST1H4B; HIST1H4H; HIST2H4A), 알파-1-안티트립신의 이소폼 1(SERPINA1), 호중구 젤라티나제-관련 리포칼린(LCN20), 글리세랄데히드-3-포스페이트 디히드로게나제(GAPDH) 및 프로필린-1(PFN1)의 경우에는 치주염시 증가된다는 사실이 알려지지 않았다. 따라서 이들 단백질들은 치주염 진단을 위한 새로운 마커 단백질로 쓰일 수 있다.
또한 표 3의 헤모펙신(HPX), IGKV1-5 단백질(IGKV1-5), 14-3-3 단백질 제타/델타(YWHAZ), IGHA1 단백질(IGHA1; IGHV3OR16-13a), IGHA1 단백질(IGHA1; IGHV3OR16-13), 시스타틴-A(CSTA), IGLV3-25 단백질(IGLV3-25), 단백질 DKFZp686K04218(단편), 면역글로불린 J쇄(IGJ), 타이미딘 포스포릴라제(TYMP), Ig 카파쇄 V-III 구역 HIC, 상피 지방산 결합 단백질(FABP5L7; FABP5), 시스타틴-B(CSTB), 리포폴리사카라이드-반응성 베이지양(beige-like) 앵커 단백질(LRBA), 시스타틴-SN(CST1), 미오신-반응성 면역글로불린 경쇄 가변영역(IGKV3D-15), 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나아제 B(NME2), 14-3-3 단백질 엡실론(YWHAE), 알파-2-당단백질 1 아연(AZGP1), 열충격단백질 베타-1(HSPB1), IGL@ 단백질(IGL@), 글루타치온 S-트랜스퍼라제 P(GSTP1), 프롤락틴-유도성 단백질(PIP), 단백질 S100-A2(S100A2), 중합체성 면역글로불린 수용체(PIGR), 글루타치온 트랜스퍼라제 오메가-1(GSTO1), 카르보닐 리덕타제 [NADPH] 1(CBR1), 세르핀 B3의 이소폼 1(SERPINB3), 알도-케토 리덕타제 패밀리 1 멤버 B10(AKR1B10) 및 cDNA FLJ75207(CRISP3)도 본 발명자들에 의해 치주염에서 감소함이 새로이 밝혀진 단백질들로 치주염 진단을 위한 새로운 마커 단백질로 이용될 수 있다.
표 1
Figure pat00001
표 2
Figure pat00002
표 3
Figure pat00003
표 4
Figure pat00004
* N : 정상인, P : 치주염 환자
본 발명의 다른 실시예에서는 치주염 환자에서 LC-MS/MS 분석 결과 아주로시딘이 4.8배 높게 나타난 것을 확인한 후에 다시 ELISA법으로 검증을 실시하였다. 치주염 정도가 정상인 16명, 경도 19명, 중도 22명, 심도18명을 대상으로 실시를 하였는데 치주염이 있는 환자에서 아주로시딘의 발현정도가 높다는 것을 확인할 수 있었다(도 2). 65pg/ml이하로 검출된 경우를 제외하고, 정상인에 대한 특이도가 68.8%이고, 경도, 중도, 심도에 대한 민감도가 각각 63.2, 68.2, 66.7%였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 정상인과 치주염 환자의 잇몸에서 얻은 단백질을 웨스턴 블롯 분석법으로 검사하였다. 정상인 6명과 치주염의 정도에 따라 경도 6명, 중도 6명, 심도 6명의 환자를 대상으로 실시하였으며, 정상인의 잇몸에서 발현되는 아주로시딘은 치주염 환자에서 발현되는 양보다 적음을 확인할 수 있었다(도 3).
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
치은열구액 ( GCF ) 시료
경북대학교 치과대학 치주과 내원 환자들의 GCF를 채취하였다. 채취한 구액 시료는 0.9% 생리식염수에 희석하여 정량 후 -70 에서 보관을 하였다. 정상인의 시료 12개와 치주염 중기의 병리학적 소견을 가진 환자 13명의 시료를 준비하였다.
< 실시예 2>
SDS - PAGE 및 쿠마시블루 염색
1차에서 정상인 6명, 치주염 환자 7명, 2차에서 정상인 6명, 치주염 환자 6명의 시료를 동일한 양으로 수집하였다. 수집한 GCF샘플을 정량한 후 20씩을 단백질 전기영동에 사용하였고, 전기영동은 12% 아크릴아미드 겔에서 70~120V로 2시간 동안 진행했다. 그 다음, 아크릴아미드 겔을 증류수로 씻고 나서, 쿠마시 염색액(Coomissie G250 stain; BioRad)에 담그고 상온에서 1시간 흔들어주면서 염색했다. 그 다음 겔을 증류수에 밤새 넣어두어 탈색을 마쳤다.
< 실시예 3>
인-겔 소화
쿠마시 염색으로 확인된 겔을 15등분하여 밴드를 자른 후 75mM 중탄산암모늄 용액과 40% 에탄올을 1:1로 섞은 탈염용액에 넣어서 탈색시켰다. 쿠마시 블루의 색이 모두 사라진 겔에 5mM DTT/25mM 중탄산암모늄 용액 300 를 넣고 60 에서 30분간 환원시킨 후, 용액을 모두 제거하였다. 25mM 중탄산암모늄 용액으로 씻은 후, 55mM 이오도아세타미드/25mM 중탄산암모늄 용액으로 37 에서 30분간 알킬화했다. 이 후 겔 조각을 100% ACN(acetonitrile)을 사용하여 탈수시킨 후 말렸다. 말린 겔 조각에 20mg/ml의 변형 서열 등급 트립신(Roche Applied Science)을 함유하는 25mM 중탄산암모늄 용액을 넣고 37 에서 밤새 반응시켜서 단백질을 펩타이드로 분해시켰다. 다음날 0.1% 포름산을 가해 10분간 초음파처리하고 펩타이드를 용리시켰다.
< 실시예 4>
LC - MS / MS 분석
Thermo Finingans ProteomeX workstation LTQ linear IT MS(Thermo Elctron, San Jose, CA, USA)를 사용하여 LC-MS/MS 분석을 했다. 각 시료 12㎕를 5mm, 세공크기 300Å C18로 채워진 10cm 길이의 RP PicoFrit 칼럼에 주입하여 H2O와 ACN의 구배용액으로 유리시켜 펩타이드 분석을 했다.
< 실시예 5>
데이터 분석
MS/MS 시료는 SEQUST 알고리즘 기반의 Sorcerer Software 3.10.4를 이용해서 분석을 하였고, HUMAN3.49(Entires:87061)를 IPI 데이터베이스로 사용하였다. Scaffold2(version Scaffold_2_06_00, Proteome Software Inc., Portland, OR)에서 MS/MS결과를 재분석하여 최종적으로 단백질 분석을 마쳤다. 펩타이드 예측 알고리즘(Kellerm, A et al Anal. Chem. 2002;74(20):5383-92)에 따라 90.0% 이상의 가능성을 갖는 것들을 확인하였고 단백질 예측 알고리즘(Nesvizhskii, AI Anal Chem. 2003 Sep 1;75(17):4646-58)에 따라 95.0% 이상의 가능성과 2개 이상의 펩타이드 수를 갖는 것을 기준으로 하여 단백질을 확인하였다.
< 실시예 6>
ELISA
인간 아주로시딘, AZU ELISA 키트(Catalog No. CSB_E09698H, Cusabio)를 이용해서 치주염의 정도가 정상, 경도, 중도와 심도로 확인 된 환자의 GCF에서의 아주로시딘의 발현 정도를 확인을 하였다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (10)

  1. 액틴-연관 단백질 2(ACTR2), 아데닐일 시클라제-연관 단백질 1(CAP1), 마크로파지-캡핑 단백질(CAPG), F-액틴-캡핑 단백질 서브유닛 베타의 이소폼 1(CAPZB), 카탈라제(CAT), 카텝신 G(CTSG), 피브로겐 알파쇄의 이소폼 1(FGA), 호르네린(HRNR), 루코트리엔 A-4 히드롤라제의 이소폼 1(LTA4H), 플라스틴-2(LCP1), 피브리노겐 베타쇄(FGB), 알파-액티닌-1(ACTN1), 백혈구 엘라스타제(ELA2), 미엘로블라스틴(PRTN3), 미오신-9의 이소폼 1(MYH9), 아넥신 A3(ANXA3), F-액틴-캡핑 단백질 서브유닛 알파-1(CAPZA1), 헤모글로빈 서브유닛 델타(HBB; HBD), 로(Rho) GDP-해리 억제제 2(ARHGDIB), 코로닌-1A(CORO1A), 헤모글로빈 서브유닛 베타(HBB), 헤모글로빈 서브유닛 알파(HBA1; HBA2), 아세틸-CoA 카르복실라제 2의 장형 이소폼(ACACB), hCG2011852 유사체(LOC643677), 알파-2-마크로글로불린(A2M), 코필린-1(CFL1), 알파 골격근 액틴(ACTA1), 알파-1B-당단백질(A1BG), Rab GDP-해리 억제제 베타 고유사체 cDNA FLJ60299(GDI2), 세포질 말레이트 디히드로게네이즈(MDH1), 히스톤 H4(HIST1H4F; HIST1H4J; HIST1H4A; HIST1H4C; HIST1H4E; HIST1H4L; HIST1H4K; HIST1H4I; HIST2H4B; HIST4H4; HIST1H4D; HIST1H4B; HIST1H4H; HIST2H4A), 알파-1-안티트립신의 이소폼 1(SERPINA1), 호중구 젤라티나제-관련 리포칼린(LCN20), 글리세랄데히드-3-포스페이트 디히드로게나제(GAPDH) 및 프로필린-1(PFN1)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 단백질로서
    치주염시 증가되는 것을 특징으로 하는 치주염 진단용 바이오 마커 단백질.
  2. 헤모펙신(HPX), IGKV1-5 단백질(IGKV1-5), 14-3-3 단백질 제타/델타(YWHAZ), IGHA1 단백질(IGHA1; IGHV3OR16-13a), IGHA1 단백질(IGHA1; IGHV3OR16-13), 시스타틴-A(CSTA), IGLV3-25 단백질(IGLV3-25), 단백질 DKFZp686K04218(단편), 면역글로불린 J쇄(IGJ), 타이미딘 포스포릴라제(TYMP), Ig 카파쇄 V-III 구역 HIC, 상피 지방산 결합 단백질(FABP5L7; FABP5), 시스타틴-B(CSTB), 리포폴리사카라이드-반응성 베이지양(beige-like) 앵커 단백질(LRBA), 시스타틴-SN(CST1), 미오신-반응성 면역글로불린 경쇄 가변영역(IGKV3D-15), 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나아제 B(NME2), 14-3-3 단백질 엡실론(YWHAE), 알파-2-당단백질 1 아연(AZGP1), 열충격단백질 베타-1(HSPB1), IGL@ 단백질(IGL@), 글루타치온 S-트랜스퍼라제 P(GSTP1), 프롤락틴-유도성 단백질(PIP), 단백질 S100-A2(S100A2), 중합체성 면역글로불린 수용체(PIGR), 글루타치온 트랜스퍼라제 오메가-1(GSTO1), 카르보닐 리덕타제 [NADPH] 1(CBR1), 세르핀 B3의 이소폼 1(SERPINB3), 알도-케토 리덕타제 패밀리 1 멤버 B10(AKR1B10) 및 cDNA FLJ75207(CRISP3)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 단백질로서
    치주염시 감소하는 것을 특징으로 하는 치주염 진단용 바이오 마커 단백질.
  3. 액틴-연관 단백질 2(ACTR2), 아데닐일 시클라제-연관 단백질 1(CAP1), 마크로파지-캡핑 단백질(CAPG), F-액틴-캡핑 단백질 서브유닛 베타의 이소폼 1(CAPZB), 카탈라제(CAT), 카텝신 G(CTSG), 피브로겐 알파쇄의 이소폼 1(FGA), 호르네린(HRNR), 루코트리엔 A-4 히드롤라제의 이소폼 1(LTA4H), 플라스틴-2(LCP1), 피브리노겐 베타쇄(FGB), 알파-액티닌-1(ACTN1), 백혈구 엘라스타제(ELA2), 미엘로블라스틴(PRTN3), 미오신-9의 이소폼 1(MYH9), 아넥신 A3(ANXA3), F-액틴-캡핑 단백질 서브유닛 알파-1(CAPZA1), 헤모글로빈 서브유닛 델타(HBB; HBD), 로(Rho) GDP-해리 억제제 2(ARHGDIB), 코로닌-1A(CORO1A), 헤모글로빈 서브유닛 베타(HBB), 헤모글로빈 서브유닛 알파(HBA1; HBA2), 아세틸-CoA 카르복실라제 2의 장형 이소폼(ACACB), hCG2011852 유사체(LOC643677), 알파-2-마크로글로불린(A2M), 코필린-1(CFL1), 알파 골격근 액틴(ACTA1), 알파-1B-당단백질(A1BG), Rab GDP-해리 억제제 베타 고유사체 cDNA FLJ60299(GDI2), 세포질 말레이트 디히드로게네이즈(MDH1), 히스톤 H4(HIST1H4F; HIST1H4J; HIST1H4A; HIST1H4C; HIST1H4E; HIST1H4L; HIST1H4K; HIST1H4I; HIST2H4B; HIST4H4; HIST1H4D; HIST1H4B; HIST1H4H; HIST2H4A), 알파-1-안티트립신의 이소폼 1(SERPINA1), 호중구 젤라티나제-관련 리포칼린(LCN20), 글리세랄데히드-3-포스페이트 디히드로게나제(GAPDH) 및 프로필린-1(PFN1)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 분자를 포함하는 치주염 진단용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 분자는 항체 또는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 치주염 진단용 조성물.
  5. 헤모펙신(HPX), IGKV1-5 단백질(IGKV1-5), 14-3-3 단백질 제타/델타(YWHAZ), IGHA1 단백질(IGHA1;IGHV3OR16-13a), IGHA1 단백질(IGHA1;IGHV3OR16-13), 시스타틴-A(CSTA), IGLV3-25 단백질(IGLV3-25), 단백질 DKFZp686K04218(단편), 면역글로불린 J쇄(IGJ), 타이미딘 포스포릴라제(TYMP), Ig 카파쇄 V-III 구역 HIC, 상피 지방산 결합 단백질(FABP5L7; FABP5), 시스타틴-B(CSTB), 리포폴리사카라이드-반응성 베이지양(beige-like) 앵커 단백질(LRBA), 시스타틴-SN(CST1), 미오신-반응성 면역글로불린 경쇄 가변영역(IGKV3D-15), 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나아제 B(NME2), 14-3-3 단백질 엡실론(YWHAE), 알파-2-당단백질 1 아연(AZGP1), 열충격단백질 베타-1(HSPB1), IGL@ 단백질(IGL@), 글루타치온 S-트랜스퍼라제 P(GSTP1), 프롤락틴-유도성 단백질(PIP), 단백질 S100-A2(S100A2), 중합체성 면역글로불린 수용체(PIGR), 글루타치온 트랜스퍼라제 오메가-1(GSTO1), 카르보닐 리덕타제 [NADPH] 1(CBR1), 세르핀 B3의 이소폼 1(SERPINB3), 알도-케토 리덕타제 패밀리 1 멤버 B10(AKR1B10) 및 cDNA FLJ75207(CRISP3)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 분자를 포함하는 치주염 진단용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 분자는 항체 또는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 치주염 진단용 조성물.
  7. 액틴-연관 단백질 2(ACTR2), 아데닐일 시클라제-연관 단백질 1(CAP1), 마크로파지-캡핑 단백질(CAPG), F-액틴-캡핑 단백질 서브유닛 베타의 이소폼 1(CAPZB), 카탈라제(CAT), 카텝신 G(CTSG), 피브로겐 알파쇄의 이소폼 1(FGA), 호르네린(HRNR), 루코트리엔 A-4 히드롤라제의 이소폼 1(LTA4H), 플라스틴-2(LCP1), 피브리노겐 베타쇄(FGB), 알파-액티닌-1(ACTN1), 백혈구 엘라스타제(ELA2), 미엘로블라스틴(PRTN3), 미오신-9의 이소폼 1(MYH9), 아넥신 A3(ANXA3), F-액틴-캡핑 단백질 서브유닛 알파-1(CAPZA1), 헤모글로빈 서브유닛 델타(HBB; HBD), 로(Rho) GDP-해리 억제제 2(ARHGDIB), 코로닌-1A(CORO1A), 헤모글로빈 서브유닛 베타(HBB), 헤모글로빈 서브유닛 알파(HBA1; HBA2), 아세틸-CoA 카르복실라제 2의 장형 이소폼(ACACB), hCG2011852 유사체(LOC643677), 알파-2-마크로글로불린(A2M), 코필린-1(CFL1), 알파 골격근 액틴(ACTA1), 알파-1B-당단백질(A1BG), Rab GDP-해리 억제제 베타 고유사체 cDNA FLJ60299(GDI2), 세포질 말레이트 디히드로게네이즈(MDH1), 히스톤 H4(HIST1H4F; HIST1H4J; HIST1H4A; HIST1H4C; HIST1H4E; HIST1H4L; HIST1H4K; HIST1H4I; HIST2H4B; HIST4H4; HIST1H4D; HIST1H4B; HIST1H4H; HIST2H4A), 알파-1-안티트립신의 이소폼 1(SERPINA1), 호중구 젤라티나제-관련 리포칼린(LCN20), 글리세랄데히드-3-포스페이트 디히드로게나제(GAPDH) 및 프로필린-1(PFN1)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 단백질을 암호화하는 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 치주염 진단용 조성물.
  8. 헤모펙신(HPX), IGKV1-5 단백질(IGKV1-5), 14-3-3 단백질 제타/델타(YWHAZ), IGHA1 단백질(IGHA1; IGHV3OR16-13a), IGHA1 단백질(IGHA1; IGHV3OR16-13), 시스타틴-A(CSTA), IGLV3-25 단백질(IGLV3-25), 단백질 DKFZp686K04218(단편), 면역글로불린 J쇄(IGJ), 타이미딘 포스포릴라제(TYMP), Ig 카파쇄 V-III 구역 HIC, 상피 지방산 결합 단백질(FABP5L7; FABP5), 시스타틴-B(CSTB), 리포폴리사카라이드-반응성 베이지양(beige-like) 앵커 단백질(LRBA), 시스타틴-SN(CST1), 미오신-반응성 면역글로불린 경쇄 가변영역(IGKV3D-15), 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나아제 B(NME2), 14-3-3 단백질 엡실론(YWHAE), 알파-2-당단백질 1 아연(AZGP1), 열충격단백질 베타-1(HSPB1), IGL@ 단백질(IGL@), 글루타치온 S-트랜스퍼라제 P(GSTP1), 프롤락틴-유도성 단백질(PIP), 단백질 S100-A2(S100A2), 중합체성 면역글로불린 수용체(PIGR), 글루타치온 트랜스퍼라제 오메가-1(GSTO1), 카르보닐 리덕타제 [NADPH] 1(CBR1), 세르핀 B3의 이소폼 1(SERPINB3), 알도-케토 리덕타제 패밀리 1 멤버 B10(AKR1B10) 및 cDNA FLJ75207(CRISP3)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 단백질을 암호화하는 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 치주염 진단용 조성물.
  9. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 치주염 진단용 키트.
  10. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 치주염 진단용 마이크로 어레이.
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