JPWO2005028648A1 - リンパ腫の病型および予後診断方法 - Google Patents
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Abstract
CD5+DLBCL患者と、CD5−DLBCL患者の予後を診断する方法を提供する。リンパ腫患者から染色体DNAにおいて、(1)13q21.1−131.3領域の増幅があるCD5+DLBCL患者の予後は不良;(2)1p36.21−p36.13領域の欠失があるCD5+DLBCL患者の予後は不良;および(3)5p15.33−p14.2領域の増幅があるCD5−DLBCL患者の予後は良好と判定する。
Description
この出願の発明は、リンパ腫の病型と予後診断方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、悪性リンパ腫の予後症状を分子生物学的に診断する方法と、この方法に使用する材料に関するものである。
びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)は非ホジキンリンパ腫症例の30%余を占めており、臨床的に不均質である(Harris,N.L.et al.Blood,84:1361−1392,1994;Gatter,K.C.and Warnke,R.A.Pathology & Genetics of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues,pp171−174.Washington:IARC press,Lyon,2001)。近年、DLBCLサンプルの転写産物に対するマイクロアレイ分析から、生物学的に異なり、臨床的にも有意であるDLBCLのサブタイプが明確に示されている(Alizadeh,A.A.et al.Nature(Lond.),403:503−511,2000;Shipp,M.A.et al.Nat.Med.,8:68−74,2002)。複数の遺伝子変異がDLBCLの病因に関連するものとして同定されているが、全ゲノムスクリーニングはまだ実施されていない(Offit,K.et al.N.Engl.J.Med.,331:74−80,1994;Kramer,M.H.H.et al.Blood,92:3152−3162,1998)。近年開発されたDNAアレイによる比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)技術によって、ゲノム全体にわたり高解像度でゲノムのコピー数変化を高速分析することが可能である。このようにして得られたDNAコピー数の定量的測定によって、腫瘍関連遺伝子の同定を行うことが容易になる可能性があり(Weiss,M.M.et al.J.Pathol.,200:320−326,2003)、またこれを用いれば腫瘍の分類が可能となると期待されている(O’Hagan,R.C.et al.Cancer Res.,63:5352−5356,2003)。
CD5は細胞表面分子の一つであり、T細胞上やリンパ器官ならびに腹腔の外套帯に位置するB細胞の部分集団上で生理学的に発現する。臨床上のCD5の発現は、慢性リンパ球性白血病(Muller−Hermelink,H.K.et al.Pathology & Genetics of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues,pp 127−130.Washington:IARC press,Lyon,2001)やマントル細胞リンパ腫(Swerdlow,S.H.et al.Pathology & Genetics of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues,pp 168−170.Washington:IARC press,Lyon,2001)に伴い生じることが多い。発明者らは、これまでDLBCLの症例において、CD5の発現が予後不良のマーカーであることを同定している。すなわちCD5陽性(CD5+)DLBCLは高齢時の発症、女性優勢、リンパ節外部位併発の増多に関連して生じている(Yamaguchi,M.et al.Blood,99:815−821,2002)。またCD5+とCD5陰性(CD5−)のDLBCL症例を比較して差分的に発現している転写産物に対して、マイクロアレイ分析を行うことにより、CD5+ DLBCLに独特な疾患像が示されている(Kobayashi,T.et al.Cancer Res.,63:60−66,2003;Gascoyne,R.D.et al.Blood,102:178a−179a,2003)。
一方、染色体増幅は、腫瘍内で遺伝子が過剰発現する際に頻繁にみられるメカニズムである。そのため、増幅領域に存在する腫瘍遺伝子の同定と特徴決定を行うことにより、発癌の原因に関する重要な洞察が得られる可能性がある(Schwab,M.Cancer.Biol.,9:319−325,1999)。神経芽腫のMYCNや乳癌のHER2などといった、活性化発癌遺伝子もやはり予後に関連がある(Schwab,M.Cancer.Biol.,4:13−18,1993;Brodeur,G.M.et al.Science(Wash.DC),224:1121−1124,1984;Slamon,D.J.et al.Science,235:177−182,1987)。
13q21−qterにみられる高度な増幅は、血液癌や他の充実性新生物に観察されている。13q12−qterの増幅は、(DLBCL)(Rao,P.H.et al.Blood,92:234−240,1998)、マントル細胞リンパ腫(MCL)(Monni,O.et al.Genes Chromosomes Cancer,21:298−307,1998)、濾胞性リンパ腫(Neat,M.J.et al.Genes Chromosomes Cancer,32:236−243,2001)、原発性皮膚B細胞リンパ腫(Mao,X.et al.Genes Chromosomes Cancer,35:144−155,2002)、鼻タイプNK/T細胞リンパ腫(Ko,Y.H.et al.Cytometry,46:85−91,2001)などにみられることが報告されている。13q21−qterの増幅症例は、さらに固形腫瘍にも観察されており、グリオーマ;非小細胞肺癌;膀胱癌;頭部ならびに頸部における扁平上皮細胞癌(Knuutila,S.et al.Am J Pathol.,152:1107−1123,1998)、末梢神経鞘腫瘍(Schmidt,H.et al.Genes Chromosomes Cancer,25:205−211,1999)、悪性繊維性組織球種(Lallamendy,M.L.et al.Am J Pathol.,151:1153−61,1997)、胞巣状横紋筋肉腫(Gordon,A.T.et al.Genes Chromosomes Cancer,28:220−226,2000)等にみられる。
CD5は細胞表面分子の一つであり、T細胞上やリンパ器官ならびに腹腔の外套帯に位置するB細胞の部分集団上で生理学的に発現する。臨床上のCD5の発現は、慢性リンパ球性白血病(Muller−Hermelink,H.K.et al.Pathology & Genetics of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues,pp 127−130.Washington:IARC press,Lyon,2001)やマントル細胞リンパ腫(Swerdlow,S.H.et al.Pathology & Genetics of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues,pp 168−170.Washington:IARC press,Lyon,2001)に伴い生じることが多い。発明者らは、これまでDLBCLの症例において、CD5の発現が予後不良のマーカーであることを同定している。すなわちCD5陽性(CD5+)DLBCLは高齢時の発症、女性優勢、リンパ節外部位併発の増多に関連して生じている(Yamaguchi,M.et al.Blood,99:815−821,2002)。またCD5+とCD5陰性(CD5−)のDLBCL症例を比較して差分的に発現している転写産物に対して、マイクロアレイ分析を行うことにより、CD5+ DLBCLに独特な疾患像が示されている(Kobayashi,T.et al.Cancer Res.,63:60−66,2003;Gascoyne,R.D.et al.Blood,102:178a−179a,2003)。
一方、染色体増幅は、腫瘍内で遺伝子が過剰発現する際に頻繁にみられるメカニズムである。そのため、増幅領域に存在する腫瘍遺伝子の同定と特徴決定を行うことにより、発癌の原因に関する重要な洞察が得られる可能性がある(Schwab,M.Cancer.Biol.,9:319−325,1999)。神経芽腫のMYCNや乳癌のHER2などといった、活性化発癌遺伝子もやはり予後に関連がある(Schwab,M.Cancer.Biol.,4:13−18,1993;Brodeur,G.M.et al.Science(Wash.DC),224:1121−1124,1984;Slamon,D.J.et al.Science,235:177−182,1987)。
13q21−qterにみられる高度な増幅は、血液癌や他の充実性新生物に観察されている。13q12−qterの増幅は、(DLBCL)(Rao,P.H.et al.Blood,92:234−240,1998)、マントル細胞リンパ腫(MCL)(Monni,O.et al.Genes Chromosomes Cancer,21:298−307,1998)、濾胞性リンパ腫(Neat,M.J.et al.Genes Chromosomes Cancer,32:236−243,2001)、原発性皮膚B細胞リンパ腫(Mao,X.et al.Genes Chromosomes Cancer,35:144−155,2002)、鼻タイプNK/T細胞リンパ腫(Ko,Y.H.et al.Cytometry,46:85−91,2001)などにみられることが報告されている。13q21−qterの増幅症例は、さらに固形腫瘍にも観察されており、グリオーマ;非小細胞肺癌;膀胱癌;頭部ならびに頸部における扁平上皮細胞癌(Knuutila,S.et al.Am J Pathol.,152:1107−1123,1998)、末梢神経鞘腫瘍(Schmidt,H.et al.Genes Chromosomes Cancer,25:205−211,1999)、悪性繊維性組織球種(Lallamendy,M.L.et al.Am J Pathol.,151:1153−61,1997)、胞巣状横紋筋肉腫(Gordon,A.T.et al.Genes Chromosomes Cancer,28:220−226,2000)等にみられる。
この出願の発明者らは、2,088種類のBAC/PACクローン(細菌人工染色体/P1−誘導性人工染色体)を二重反復でスポットした独自のDNAアレイによるCGHを確立し、これを26例のCD5+ならびに44例のCD5−DLBCL症例に適用した。その結果、両グループが共有するゲノム異常と、CD5+DLBCLに固有の異常を同定し、さらにそのようなゲノム異常がリンパ腫の予後診断に有用であることを見出した。
またさらに発明者らは、前記のDLBCL患者70例のうち18例には、13q31−q32を含む13qの増幅がみられることを見出すとともに、この増幅領域における新規遺伝子を同定した。そして、この新規遺伝子の発現レベルがリンパ腫の予後診断に有効でであることを見出した。
この出願の発明は、以上のとおりの新規な知見に基づくものである。すなわち、この出願は、以下の発明を提供する。
第1の発明は、CD5陽性のびまん性大細胞型B細胞リンパ腫(CD5+DLBCL)患者と、CD5陰性のびまん性大細胞型B細胞リンパ腫(CD5−DLBCL)患者の予後を診断する方法であって、それぞれのリンパ腫患者から染色体DNAを単離し、この染色体DNAにおいて、
(1) 第13染色体 q21.1−q31.3(13q21.1−131.3)領域の増幅があるCD5+DLBCL患者の予後は不良;
(2) 第1染色体 p36.21−p36.13(1p36.21−p36.13)領域の欠失があるCD5+DLBCL患者の予後は不良;および
(3) 第5染色体 p15.33−p14.2(5 p15.33−p14.2)領域の増幅があるCD5−DLBCL患者の予後は良好、
と判定することを特徴とする方法である。
第1発明の一態様は、染色体領域を含む複数のDNAプローブと患者からの染色体DNAとのハイブリダイゼーションによって染色体領域の増幅または欠損を測定する方法である。
第1発明の別の態様は、DNAプローブがBAC/PAC DNAクローンである方法である。
第1発明における前記態様における好ましい形態は、ハイブリダイゼーションを固相単体上で行う方法である。
第2発明は、前記のハイブリダイゼーションを固相単体上で行う方法に使用し、染色体領域を含む複数のDNAプローブを固相単体上に固定したDNAアレイである。
第2発明の一つの態様は、DNAプローブがBAC/PAC DNAクローンであるDNAアレイである。
第3発明は、CD5+DLBCL患者と、CD5−DLBCL患者の予後を診断する方法であって、リンパ腫患者から生体試料を単離し、この生体試料において、
(1) 13q21.1−131.3領域に含まれる遺伝子の発現増加があるCD5+DLBCL患者の予後は不良;
(2) 1p36.21−p36.13領域に含まれる遺伝子の発現低下があるCD5+DLBCL患者の予後は不良;および
(3) 5p15.33−p14.2領域に含まれる遺伝子の発現増加があるCD5−DLBCL患者の予後は良好、
と判定することを特徴とする方法である。
第3発明における一つの態様は、13q21.1−131.3領域に含まれる遺伝子が、以下の特徴:
(a) SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードすること;および/または
(b) 以下の前駆microRNA:
miR91−前駆−13microRNA、miR18−前駆−1、3microRNA、miR19a−前駆−13microRNA、miR19b−前駆−13microRNAおよびmiR92−前駆−13microRNAと、
以下の成熟microRNA:
miR−17、miR−91、miR−18、miR−19a、miR−20、miR−19bおよびmiR−92
を転写すること、
を有する遺伝子C13orf25である方法である。
第3発明に別の態様は、遺伝子の発現増加または発現減少を、遺伝子転写産物を測定することによって判定する方法である。
第3発明における上記態様における好ましい形態は、遺伝子転写産物がmRNAである方法である。
第3発明において、遺伝子転写産物がmRNAである上記形態におけるさらに好ましい形態は、遺伝子の全長または一部であるDNAプローブと、遺伝子mRNAまたはcDNAとのハイブリダイゼーションによって遺伝子の発現増加または発現減少を測定する方法である。
第3発明において、プローブとmRNAまたはcDNAとのハイブリダイゼーションを行う形態におけるさらに好ましい形態は、ハイブリダイゼーションを固相単体上で行う方法である。
第4発明は、前記ハイブリダイゼーションを固相単体上で行う方法に使用し、DNAプローブを固相単体上に固定したDNAアレイである。
第3発明の方法におけるさらに別の態様は、遺伝子転写産物がタンパク質である方法である。
前記のタンパク質の増減を測定する方法における一つの形態は、タンパク質に特異的に結合する抗体を用いる方法である。
第5発明は、前記抗体を用いて方法に使用する抗体であって、前記タンパク質と特異的に結合する抗体である。
第5発明の一態様は、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:5のアミノ酸配列を認識する抗体である。
第6発明は、以下の特徴:
(a) SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードすること;および/または
(b) 以下の前駆microRNA:
miR91−前駆−13microRNA、miR18−前駆−1、3microRNA、miR19a−前駆−13microRNA、miR19b−前駆−13microRNAおよびmiR92−前駆−13microRNAと、
以下の成熟microRNA:
miR−17、miR−91、miR−18、miR−19a、miR−20、miR−19bおよびmiR−92
を転写すること、
を有する遺伝子C13orf25の精製ポリヌクレオチドである。
第7発明は、前記第6発明のポリヌクレオチドの一部連続配列からなり、遺伝子C13orf24とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブである。
第8発明は、前記第7発明のオリゴヌクレオチドプローブを備えたDNAアレイである。
第9発明は、遺伝子C13orf25をPCR増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーである。
なお、この発明におけるDLBCL患者の「予後良好」とは、あるゲノム領域で差(増幅、欠失、正常何れも含む)をもつ2つのDLBCLの患者群間で、カプランマイヤー曲線を比較したとき、log rank testのp値が、0.05以下の有意差をもって生存率がよい患者群の状態を指す。また「予後不良」とはカプランマイヤー曲線を比較したとき、log rank testのp値が、0.05以下の有意差で生存率が悪い患者群の状態を指す。
またこの発明における用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。なお、用語は基本的にはIUPAC−IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。また発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はJ.Sambrook,E.F.Fritsch & T.Maniatis,”Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd edition)”,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989);D.M.Glover et al.ed.,”DNA Cloning”,2nd ed.,Vol.1 to 4,(The Practical Approach Series),IRL Press,Oxford University Press(1995);Ausubel,F.M.et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,N.Y,1995;日本生化学会編、「続生化学実験講座1、遺伝子研究法II」、東京化学同人(1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座2、核酸III(組換えDNA技術)」、東京化学同人(1992);R.Wu ed.,”Methods in Enzymology”,Vol.68(Recombinant DNA),Academic Press,New York(1980);R.Wu et al.ed.,”Methods in Enzymology”,Vol.100(Recombinant DNA,Part B)& 101(Recombinant DNA,Part C),Academic Press,New York(1983);R.Wu et al.ed.,”Methods in Enzymology”,Vol.153(Recombinant DNA,Part D),154(Recombinant DNA,Part E)& 155(Recombinant DNA,Part F),Academic Press,New York(1987)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。
またさらに発明者らは、前記のDLBCL患者70例のうち18例には、13q31−q32を含む13qの増幅がみられることを見出すとともに、この増幅領域における新規遺伝子を同定した。そして、この新規遺伝子の発現レベルがリンパ腫の予後診断に有効でであることを見出した。
この出願の発明は、以上のとおりの新規な知見に基づくものである。すなわち、この出願は、以下の発明を提供する。
第1の発明は、CD5陽性のびまん性大細胞型B細胞リンパ腫(CD5+DLBCL)患者と、CD5陰性のびまん性大細胞型B細胞リンパ腫(CD5−DLBCL)患者の予後を診断する方法であって、それぞれのリンパ腫患者から染色体DNAを単離し、この染色体DNAにおいて、
(1) 第13染色体 q21.1−q31.3(13q21.1−131.3)領域の増幅があるCD5+DLBCL患者の予後は不良;
(2) 第1染色体 p36.21−p36.13(1p36.21−p36.13)領域の欠失があるCD5+DLBCL患者の予後は不良;および
(3) 第5染色体 p15.33−p14.2(5 p15.33−p14.2)領域の増幅があるCD5−DLBCL患者の予後は良好、
と判定することを特徴とする方法である。
第1発明の一態様は、染色体領域を含む複数のDNAプローブと患者からの染色体DNAとのハイブリダイゼーションによって染色体領域の増幅または欠損を測定する方法である。
第1発明の別の態様は、DNAプローブがBAC/PAC DNAクローンである方法である。
第1発明における前記態様における好ましい形態は、ハイブリダイゼーションを固相単体上で行う方法である。
第2発明は、前記のハイブリダイゼーションを固相単体上で行う方法に使用し、染色体領域を含む複数のDNAプローブを固相単体上に固定したDNAアレイである。
第2発明の一つの態様は、DNAプローブがBAC/PAC DNAクローンであるDNAアレイである。
第3発明は、CD5+DLBCL患者と、CD5−DLBCL患者の予後を診断する方法であって、リンパ腫患者から生体試料を単離し、この生体試料において、
(1) 13q21.1−131.3領域に含まれる遺伝子の発現増加があるCD5+DLBCL患者の予後は不良;
(2) 1p36.21−p36.13領域に含まれる遺伝子の発現低下があるCD5+DLBCL患者の予後は不良;および
(3) 5p15.33−p14.2領域に含まれる遺伝子の発現増加があるCD5−DLBCL患者の予後は良好、
と判定することを特徴とする方法である。
第3発明における一つの態様は、13q21.1−131.3領域に含まれる遺伝子が、以下の特徴:
(a) SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードすること;および/または
(b) 以下の前駆microRNA:
miR91−前駆−13microRNA、miR18−前駆−1、3microRNA、miR19a−前駆−13microRNA、miR19b−前駆−13microRNAおよびmiR92−前駆−13microRNAと、
以下の成熟microRNA:
miR−17、miR−91、miR−18、miR−19a、miR−20、miR−19bおよびmiR−92
を転写すること、
を有する遺伝子C13orf25である方法である。
第3発明に別の態様は、遺伝子の発現増加または発現減少を、遺伝子転写産物を測定することによって判定する方法である。
第3発明における上記態様における好ましい形態は、遺伝子転写産物がmRNAである方法である。
第3発明において、遺伝子転写産物がmRNAである上記形態におけるさらに好ましい形態は、遺伝子の全長または一部であるDNAプローブと、遺伝子mRNAまたはcDNAとのハイブリダイゼーションによって遺伝子の発現増加または発現減少を測定する方法である。
第3発明において、プローブとmRNAまたはcDNAとのハイブリダイゼーションを行う形態におけるさらに好ましい形態は、ハイブリダイゼーションを固相単体上で行う方法である。
第4発明は、前記ハイブリダイゼーションを固相単体上で行う方法に使用し、DNAプローブを固相単体上に固定したDNAアレイである。
第3発明の方法におけるさらに別の態様は、遺伝子転写産物がタンパク質である方法である。
前記のタンパク質の増減を測定する方法における一つの形態は、タンパク質に特異的に結合する抗体を用いる方法である。
第5発明は、前記抗体を用いて方法に使用する抗体であって、前記タンパク質と特異的に結合する抗体である。
第5発明の一態様は、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:5のアミノ酸配列を認識する抗体である。
第6発明は、以下の特徴:
(a) SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードすること;および/または
(b) 以下の前駆microRNA:
miR91−前駆−13microRNA、miR18−前駆−1、3microRNA、miR19a−前駆−13microRNA、miR19b−前駆−13microRNAおよびmiR92−前駆−13microRNAと、
以下の成熟microRNA:
miR−17、miR−91、miR−18、miR−19a、miR−20、miR−19bおよびmiR−92
を転写すること、
を有する遺伝子C13orf25の精製ポリヌクレオチドである。
第7発明は、前記第6発明のポリヌクレオチドの一部連続配列からなり、遺伝子C13orf24とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブである。
第8発明は、前記第7発明のオリゴヌクレオチドプローブを備えたDNAアレイである。
第9発明は、遺伝子C13orf25をPCR増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーである。
なお、この発明におけるDLBCL患者の「予後良好」とは、あるゲノム領域で差(増幅、欠失、正常何れも含む)をもつ2つのDLBCLの患者群間で、カプランマイヤー曲線を比較したとき、log rank testのp値が、0.05以下の有意差をもって生存率がよい患者群の状態を指す。また「予後不良」とはカプランマイヤー曲線を比較したとき、log rank testのp値が、0.05以下の有意差で生存率が悪い患者群の状態を指す。
またこの発明における用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。なお、用語は基本的にはIUPAC−IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。また発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はJ.Sambrook,E.F.Fritsch & T.Maniatis,”Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd edition)”,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989);D.M.Glover et al.ed.,”DNA Cloning”,2nd ed.,Vol.1 to 4,(The Practical Approach Series),IRL Press,Oxford University Press(1995);Ausubel,F.M.et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,N.Y,1995;日本生化学会編、「続生化学実験講座1、遺伝子研究法II」、東京化学同人(1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座2、核酸III(組換えDNA技術)」、東京化学同人(1992);R.Wu ed.,”Methods in Enzymology”,Vol.68(Recombinant DNA),Academic Press,New York(1980);R.Wu et al.ed.,”Methods in Enzymology”,Vol.100(Recombinant DNA,Part B)& 101(Recombinant DNA,Part C),Academic Press,New York(1983);R.Wu et al.ed.,”Methods in Enzymology”,Vol.153(Recombinant DNA,Part D),154(Recombinant DNA,Part E)& 155(Recombinant DNA,Part F),Academic Press,New York(1987)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。
図1はREC1細胞株の全ゲノムプロファイルならびにゲノム増加と損失を調べたFISH分析の結果である。A:REC1細胞株の全ゲノムプロファイルである。1,966種類のBAC/PACクローンそれぞれに対するlog2比を、そのゲノム位置の関数としてプロットした。水平の点線は増加と減少の閾値を示す。B:BAC、RP11−430K10(赤色信号)を13q32に有する細胞株に対するFISH分析の結果である。矢印は13q32増幅を示す。C:二重色FISH分析による4q32.1減少の検出。分裂中間期の染色体には、それぞれ二対の赤色信号があり(BAC、RP11−154F14)、それらにはそれぞれ一対の緑色信号が矢印付近に存在する(BAC、RP11−312A15)。これら2種類のBAC間の物理的距離は0.75Mbである。分裂中期細胞と染色体はDAPIにより逆染色した。
図2はKarpas1718細胞株(SLVL)の第16染色体と第8p染色体の個別ゲノムプロファイルと、ゲノム増加(16p13.3)と減少(8p21)を調べるためのFISH分析の結果である。A:第16染色体の個々のゲノムプロファイル。これはBAC、RP11−27M24遺伝子座(16p13.3)の位置に大きな増幅を示している(log2比、+2.45)。B:BAC、RP11−27M24による分裂中期と中間期のFISH分析では、16p13.13におけるゲノム増幅がみられる(矢印)。C:第8p染色体の個別ゲノムプロファイル。8ptel−p21の位置に減少が示されている。D:BAC、RP11−353K12とBAC、RP11−369E15を用いた二重色FISH分析。8pのブレークポイントはこれらのBACs間に存在することが示されている。BAC、RP11−369E15はBAC、RP11−353K12に対して500kbだけ動原体側に存在する。分裂中間期ならびに中期の染色体にはそれぞれ二対の赤色信号があり(BAC、RP11−369E15)、それらにはそれぞれ一対の緑色信号が矢印付近に存在する(BAC、RP11−353K12)。
図3は、個別の腫瘍に関する代表的なアレイCGHプロファイルである。全ゲノムプロファイルを3種類の代表的なDLBCL症例について示した(A:CD5+症例1、B:CD5+症例2、C:CD5−症例3)。全てのクローンについて染色体位置を元にlog2比をプロットしたが、このとき垂直方向の点線棒は染色体の分離を示している。BACsの配列はゲノム中の位置により、1pテロメアから初めてXqテロメアで終了するように並べた。A:コピー数増加:1q21.2−q24.3、2p22.1−p16.1、7ptel−p21.3、7p21.1−p11.2、7q21.11−q31.1、8p11.23、8q24.13−qtel、11q22.3−qtel、13q21.32−13q32.2、13q34−qtel、15、17q、19q13.43−qtel、20、21。コピー数減少:1p36.32−p36.21、2ptel−p22.3、4ptel−p15.1、6p25.3−p22.3、7p21.3、7q31.33、8ptel−p12、8q12.1、13q34−qtel、14q22.2−q21.3、17p。B:コピー数増加:3p14.2−qtel、7、9ptel−q32.2、12ptel−p11.2、15q24.3−qtel、18。コピー数減少:1ptel−p35.1、9p21、15q14−q21.1、17p。C:コピー数増加:1p36、3、6p、7q21.11−qtel、11、16p13.3、17cen−q23.2、18。コピー数減少:3p14.2、6p25.1−p22.3、6q14.1−qtel、9q22.33、15q26.2−qtel、17p。単一BAC、RP11−48E21のlog2比率が−2.01であることから、3p14.2遺伝子座におけるホモ接合性の減少が考えられる。
図4は第3p染色体のゲノムプロファイルならびに最少共通減少をもとめるFISH分析の結果である。A:代表的な3pの個別ゲノムプロファイルを4種類示す。最少共通減少は太い矢印で3p14.2の位置に示す(BAC、RP11−48E21遺伝子座)。黒い3本線は、各DLBCL症例の個別プロファイルである。赤線は悪性腫瘍細胞株OCI−LY13.2の個別プロファイルである。テロメアの物理的距離は枠線の下に示す(Mb)。BとCのFISH分析で用いたプローブの位置も、同様に小さな太い水平線で示す。プローブA:BAC、RP11−391P4。プローブB:BAC、RP11−48E21。プローブC:BAC、RP11−611H10。プローブAはプローブBより1Mbテロメア側に存在する。プローブCはプローブBより1Mb動減退側に存在する。細い矢印は症例の減少領域を示す。BAC、RP11−48E21にはFHIT腫瘍抑制遺伝子が含まれている。B:プローブAとBを用いた、OCI−LY13.2細胞株に対する二重色FISH分析。分裂中期の染色体には二対の赤色(プローブA、赤)信号と、一対の緑色(プローブB、緑)信号があり、それによってプローブBのヘテロ接合的減少が示されている。C:プローブBとCを用いたOCI−LY13.2細胞株に対する二重色FISH分析。分裂中期の染色体には二対の赤色(プローブC、赤)信号と一対の緑色信号(プローブB、緑)があり、それによってプローブB(緑)のヘテロ接合的減少が示されている。
図5はCD5+ DLBCLの特徴的増加に関する個別ゲノムプロファイル。3種類の代表的事例を伴う第10染色体と第19染色体のアレイCGHプロファイルを示す。垂直線はlog2比を示す。水平線はpテロメアからqテロメアまでの物理的距離を示す(Mb)。Log2比が+0.2以上である場合にゲノムコピー数増加を示し、log2比が−0.2以下である場合にゲノムコピー数減少を示す。水平の点線は増加と減少の閾値を示す。太い矢印は、これら3種類の症例の共通増加領域を示す。細い矢印は個別症例の増加領域を示す。水平の点線矢印は、CD5+とCD5−DLBCLを比較して頻度に有意差のある増加領域を示す。A:第10染色体の3種類の代表的個別ゲノムプロファイル。B:第19染色体の3種類の代表的個別ゲノムプロファイル。
図6はCD5+DLBCLの特徴的減少の個別ゲノムプロファイルと最少共通領域。3種類の代表的症例を伴う、個々の染色体のアレイCGHプロファイルを示す。水平の点線は増加と減少の閾値を示す。太い矢印は、これら3種類の症例の共通減少領域を示す。細い矢印は、各症例の減少領域を示す。水平の点線矢印は、CD5+とCD5−DLBCLを比較して頻度に有意差のある増加領域を示す。A:第1q染色体の3種類の代表的個別ゲノムプロファイル。B:第8染色体の3種類の代表的個別ゲノムプロファイル。
図7は13q増加、1p36減少、5p増加がみられる場合とみられない場合の、CD5+ならびにCD5−DLBCL症例に対するカプラン−マイヤー生存曲線。総生存はCD5+とCD5−グループについて示す。横軸:総生存。縦軸:確率。A:13q21.1−q31.3増加の有無によるCD5+症例の生存曲線(6例と19例)、ならびに13q21.1−q31.3増加の有無によるCD5−症例の生存曲線(6例と35例)。B:1p36.21−p36.13減少の有無によるCD5+症例の生存曲線(6例と19例)、ならびに1p36.21−p36.13減少の有無によるCD5−症例の生存曲線(9例と32例)。C:5p15.33−p14.2減少の有無によるCD5+症例の生存曲線(4例と21例)、ならびに5p15.33−p14.2減少の有無によるCD5−症例の生存曲線(7例と34例)。
図8は正常例と女性を対象にしたアレイCGH分析。A:正常男性と正常女性のDNAsを用いたアレイCGHの代表的なゲノムプロファイルの比較。正常男性同士の同時ハイブリダイゼーション6例を実施し、log2比率(log2 cy3/cy5)における正常変動を定義した。対照実験では、各スポット(2x 1,966クローン)に対して測定した蛍光log2比率の95%以上が+0.2?−0.2の範囲であった(データ示さず)。従って増加ならびに減少のlog2比率に対する閾値を、それぞれlog2比率+0.2ならびに−0.2の範囲に定めた。アレイのデータは、各クローン毎に対する二重スポットの平均log2比としてプロットした。横線は増加ならびに減少のlog2比率に関する閾値を表す。それぞれのBACクローンに対するlog2比率は、それに対するゲノム位置の関数としてプロットしたが、このとき、第1染色体は左に、X染色体は右に、またそれぞれの染色体について、その順序は短腕テロメア側から長腕テロメア側に並べている。B:X染色体のコピー数変化に対する正規化log2比。正常男性DNAを全ハイブリダイゼーションの参照として用いた。アレイハイブリダイゼーションを試験ゲノムDNAを用いて行ったが、このDNAは正常男性(1X染色体)、正常女性(2X染色体)、X染色体のコピーを3個、4個、5個含む3種類の細胞株に由来するものであった。各プロットは、X染色体に由来する57種類のクローンの正規化蛍光比全てに対する平均値を表す。それぞれのX染色体クローンに対する比率は、常染色体クローンの平均蛍光強度比により正規化した。正常男性と正常女性によるアレイハイブリダイゼーションの蛍光強度比を0として定義した。次に正規化値した値を元に、各プロットを計算した。直線は、全データにわたる線形回帰を表し、傾きは0.51、切片は0.72であった。
図9はアレイCGHのゲノムプロファイル。A:Karpas1718を用いた代表的なアレイCGHのゲノムプロファイル。BACsの配列は1pテロメアから始まり、Xqテロメアで終わるゲノム内位置による。グラフ上の黒矢印は高レベルの増幅を示す(log2比>1で定義)。B:3種類の細胞株(Karpas1718、Rec1、OCI−Ly7)ならびに1例のDLBCL患者における、第13染色体の詳細ゲノムプロファイル。68種類のBACならびにPACクローンそれぞれに対するlog2比率は、それに対するゲノム位置の関数としてプロットしたが、このとき、染色体13qセントロメアは左に、13qテロメアは右になっている。水平の点線は増加と減少に関する閾値を示す。太い矢印は高レベルの増幅を(log2比>1で定義)、細い矢印は中程度レベルの増幅を示す(0.2>log2比>1で定義)。Karpas1718は第13q染色体の50Mb以上におよぶ広範囲の増幅を示している。さらに、Karpas1718の高レベル増加が13q22.2から13q31.3まで観察され、ここで特に13q31.3が最高レベルの増幅を示している(log2比>2)。同様な方法で、13q31.3にはOCI−Ly7と Rec1の高レベル増幅が見られる。Rec1もまた13q31.3の近傍において広範囲の減少を示している。患者試料(D778)では13q21.2−13q31.3ならびに13q33.3−qterに広範囲の増幅が見られ、特に13q31.1−q31.3は高レベルの増幅を示していた。
図10は13q31−q32に増幅が見られる細胞株と見られない細胞株に対する、FISH分析ならびにCGH分析。4種類の細胞株(Karpas1718、Rec1、OCI−Ly4、Jurkat)に対するCGHの結果を示す。各染色体の右(緑)ならびに左(赤)に位置する線は、それぞれ増加または減少した領域を示す。BAC、RP11−487A2による分裂中期FISHの代表的な結果を、各パネルの右側に示す。CGHを用いて検査した第13染色体も、各記号の近くに示している。3種類のB細胞リンパ腫細胞株、すなわちKarpas1718(A)、Rec1(B)、OCI−Ly4(C)には13q31−q32に増幅が見られたが、Jurkat(D)にはそれは見られなかった。FISH分析では3種類のB細胞株に15コピー以上の増幅が示されているが、Jurkatには増幅が見られなかった。それぞれの分裂中期染色体は、DAPIで逆染色した。
図11はアレイCGHと分裂間期FISHの組み合わせによる13q31−q32の分析。A:3種類の細胞株(Rec1、Karpas1718、OCI−Ly7)と1種類のDLBCL患者(D778)に対するアレイCGH分析データのまとめ。縦軸はlog2比を示す。水平の点線は増加と減少に関する閾値を示し、それぞれ+0.2と−0.2のlog2比に設定してある。灰色のカコミ部分は、3種類の細胞株における高レベル増幅(Log2比>1)の共通領域を示しており、これはRP11−360A9から RP11−481A22まで伸長している。B:3種類の細胞株(Karpas1718、OCI−Ly4、Rec1)のDNAシーケンスコピー数データのまとめ。この測定は分裂中期FISHにより実施し、13q31.3のBACクローン19種類を用いたが、これにはアレイCGHで用いなかった新しいBACであるRP11−93M14が含まれている。10種類の分裂中間期の細胞を分析し、それぞれの細胞株ごとに、BACクローンシグナルの平均コピー数を計数した。縦軸はコピー数を、水平の点線は正常な2種類のコピーを示す。灰色のカコミ部分はコピー数増幅の共通領域を示しており、これはRP11−29C8からRP11−93M14までの範囲に伸長している。STSマーカーならびに全てのBACクローンの位置はEnsembl Genome Data Resource(http://www.ensembl.org/)による記録情報をもとに確認した。下線のあるBACクローンをFISH分析とアレイCGHに用いた。細い矢印はGPC5遺伝子座を示す。
図12は13q31−q32増幅の候補遺伝子に対するノーザンブロット分析。ノーザンブロット分析を次の6種類のRNAに対して実施した。ヒト胎盤(レーン1)、3種類のB細胞リンパ腫細胞株で13q31−q32に増幅が見られるもの(レーン2:Rec1、レーン3:Karpas1718、レーン4:OCI−Ly4)、2種類のT細胞リンパ腫細胞株で増幅が見られないもの(レーン5:Jurkat、レーン6:ATN−1)。30種類のESTsのうち8種類とGPC5について、代表的で特徴的な発現パターンを示す。GPC5とBI481522の発現には有意差はなかったが、LOC160824、AF339828、BC040320、AF339802、LOC121734、AA705439、N49442は明らかに異なる発現パターンを示した。特にAF339828とBC040320は同様なハイブリダイゼーションパターンを示しており、その発現は13q31−q32におけるコピー数増加に対する索引となる。
図13、14、15はGPC5とBC040320に対する発現試験。細胞株とDLBCL患者それぞれについて13q31−q32の増幅状態を、従来のCGHにより調べ、これを試料名の上に示した。図13:細胞株と、13q31−q32で増幅が見られる場合と見られない場合のDLBCL患者における、GPC5とBC040320の発現パターン。5種類の細胞株と、13q31−q32で増幅が見られるDLBCL患者2例におけるGPC5の発現には、他の細胞株や増幅の見られない患者における場合と比較しての有意差はなかった。BC040320は13q31−q32で増幅の見られる細胞株(レーン1?5)において発現しており、増幅の見られない細胞株ではこれより低いレベルで発現していた(レーン6〜8)。同様な方法で、BC040320は13q31−q32で増幅の見られるDLBCL患者で強く発現していたが(レーン9と10)、増幅の見られない細胞株での発現は非常に弱かった(レーン11と12)。図14:血液学的悪性度を有する複数の細胞株におけるGPC5とBC040320の発現パターン。13q31−q32に増幅の見られる細胞株の一部には(レーン9、11、12)、高レベルの増幅を示す2種類の細胞株(レーン1と2)に比べて弱いシグナルを示すものがある。GPC5の発現は若干変動のある非常に弱いシグナルを示すが、有意差は無かった。AML:急性骨髄性白血病細胞株。MM:多発性骨髄腫細胞株。NK/T:NK/T細胞リンパ腫/白血病細胞株。図15:複数の正常組織中におけるBC040320とGPC5の発現パターン。13q31−q32で高レベル増幅を示す2種類の細胞株の場合(レーン1と2)と比較して、正常組織中でのBC040320の発現は、肺、胸腺、リンパ節を例外としてほとんど視認できない。
図16はC13orf25遺伝子のエクソン−イントロン構造。A:BC040320とAF339828の2種類のESTsは、13q31.3で増幅を示す細胞株で過剰発現されるものであり、これを水平の点線上に示す。BC040320は4個のエクソンに分割され、これは2種類のBACクローン、すなわちRP11−282D2とRP11−121J7を囲んでいる。AF339828はBC040320のテロメア側に位置しており、BC040320から約300bp離れている。RT−PCRに用いたプライマセットを、エクソンの下に示す。B:RT−PCRにより得られた2種類の転写産物。一方(転写産物−A)はBC040320シーケンスと同一であり、965−bpのヌクレオチドを含む4個のエクソンにより構成される。他方(転写産物−B)は5058−bpのヌクレオチドを含む2個のエクソンにより構成される。コンピュータ分析により、bA121J7.2(Vega_gene ID)の32−AAポリペプチドが転写産物−AのcDNA中にコードされていることが判った。ORFsの可能性がある部分を、灰色のボックスで示す。転写産物−Bシーケンスより5種類の前駆体microRNAs(miRNAs)(miR91−前駆体−13マイクロRNA、miR18−前駆体−13マイクロRNA、miR19a−前駆体−13マイクロRNA、miR19b−前駆体−13マイクロRNA、miR92−前駆体−13マイクロRNA)が得られ、転写産物−B中の黒いボックスにより示しているが、これには7種類の成熟したmicroRNAが含まれている(microRNA miR−17、miR−91、miR−18、miR−19a、miR−20、miR−19b、miR−92)。C:ポリペプチドシーケンスを同様に構造の下に示している。13−AAのポリペプチドは転写産物−Aと転写産物−Bにより共有されており、これを下線により示している。
図2はKarpas1718細胞株(SLVL)の第16染色体と第8p染色体の個別ゲノムプロファイルと、ゲノム増加(16p13.3)と減少(8p21)を調べるためのFISH分析の結果である。A:第16染色体の個々のゲノムプロファイル。これはBAC、RP11−27M24遺伝子座(16p13.3)の位置に大きな増幅を示している(log2比、+2.45)。B:BAC、RP11−27M24による分裂中期と中間期のFISH分析では、16p13.13におけるゲノム増幅がみられる(矢印)。C:第8p染色体の個別ゲノムプロファイル。8ptel−p21の位置に減少が示されている。D:BAC、RP11−353K12とBAC、RP11−369E15を用いた二重色FISH分析。8pのブレークポイントはこれらのBACs間に存在することが示されている。BAC、RP11−369E15はBAC、RP11−353K12に対して500kbだけ動原体側に存在する。分裂中間期ならびに中期の染色体にはそれぞれ二対の赤色信号があり(BAC、RP11−369E15)、それらにはそれぞれ一対の緑色信号が矢印付近に存在する(BAC、RP11−353K12)。
図3は、個別の腫瘍に関する代表的なアレイCGHプロファイルである。全ゲノムプロファイルを3種類の代表的なDLBCL症例について示した(A:CD5+症例1、B:CD5+症例2、C:CD5−症例3)。全てのクローンについて染色体位置を元にlog2比をプロットしたが、このとき垂直方向の点線棒は染色体の分離を示している。BACsの配列はゲノム中の位置により、1pテロメアから初めてXqテロメアで終了するように並べた。A:コピー数増加:1q21.2−q24.3、2p22.1−p16.1、7ptel−p21.3、7p21.1−p11.2、7q21.11−q31.1、8p11.23、8q24.13−qtel、11q22.3−qtel、13q21.32−13q32.2、13q34−qtel、15、17q、19q13.43−qtel、20、21。コピー数減少:1p36.32−p36.21、2ptel−p22.3、4ptel−p15.1、6p25.3−p22.3、7p21.3、7q31.33、8ptel−p12、8q12.1、13q34−qtel、14q22.2−q21.3、17p。B:コピー数増加:3p14.2−qtel、7、9ptel−q32.2、12ptel−p11.2、15q24.3−qtel、18。コピー数減少:1ptel−p35.1、9p21、15q14−q21.1、17p。C:コピー数増加:1p36、3、6p、7q21.11−qtel、11、16p13.3、17cen−q23.2、18。コピー数減少:3p14.2、6p25.1−p22.3、6q14.1−qtel、9q22.33、15q26.2−qtel、17p。単一BAC、RP11−48E21のlog2比率が−2.01であることから、3p14.2遺伝子座におけるホモ接合性の減少が考えられる。
図4は第3p染色体のゲノムプロファイルならびに最少共通減少をもとめるFISH分析の結果である。A:代表的な3pの個別ゲノムプロファイルを4種類示す。最少共通減少は太い矢印で3p14.2の位置に示す(BAC、RP11−48E21遺伝子座)。黒い3本線は、各DLBCL症例の個別プロファイルである。赤線は悪性腫瘍細胞株OCI−LY13.2の個別プロファイルである。テロメアの物理的距離は枠線の下に示す(Mb)。BとCのFISH分析で用いたプローブの位置も、同様に小さな太い水平線で示す。プローブA:BAC、RP11−391P4。プローブB:BAC、RP11−48E21。プローブC:BAC、RP11−611H10。プローブAはプローブBより1Mbテロメア側に存在する。プローブCはプローブBより1Mb動減退側に存在する。細い矢印は症例の減少領域を示す。BAC、RP11−48E21にはFHIT腫瘍抑制遺伝子が含まれている。B:プローブAとBを用いた、OCI−LY13.2細胞株に対する二重色FISH分析。分裂中期の染色体には二対の赤色(プローブA、赤)信号と、一対の緑色(プローブB、緑)信号があり、それによってプローブBのヘテロ接合的減少が示されている。C:プローブBとCを用いたOCI−LY13.2細胞株に対する二重色FISH分析。分裂中期の染色体には二対の赤色(プローブC、赤)信号と一対の緑色信号(プローブB、緑)があり、それによってプローブB(緑)のヘテロ接合的減少が示されている。
図5はCD5+ DLBCLの特徴的増加に関する個別ゲノムプロファイル。3種類の代表的事例を伴う第10染色体と第19染色体のアレイCGHプロファイルを示す。垂直線はlog2比を示す。水平線はpテロメアからqテロメアまでの物理的距離を示す(Mb)。Log2比が+0.2以上である場合にゲノムコピー数増加を示し、log2比が−0.2以下である場合にゲノムコピー数減少を示す。水平の点線は増加と減少の閾値を示す。太い矢印は、これら3種類の症例の共通増加領域を示す。細い矢印は個別症例の増加領域を示す。水平の点線矢印は、CD5+とCD5−DLBCLを比較して頻度に有意差のある増加領域を示す。A:第10染色体の3種類の代表的個別ゲノムプロファイル。B:第19染色体の3種類の代表的個別ゲノムプロファイル。
図6はCD5+DLBCLの特徴的減少の個別ゲノムプロファイルと最少共通領域。3種類の代表的症例を伴う、個々の染色体のアレイCGHプロファイルを示す。水平の点線は増加と減少の閾値を示す。太い矢印は、これら3種類の症例の共通減少領域を示す。細い矢印は、各症例の減少領域を示す。水平の点線矢印は、CD5+とCD5−DLBCLを比較して頻度に有意差のある増加領域を示す。A:第1q染色体の3種類の代表的個別ゲノムプロファイル。B:第8染色体の3種類の代表的個別ゲノムプロファイル。
図7は13q増加、1p36減少、5p増加がみられる場合とみられない場合の、CD5+ならびにCD5−DLBCL症例に対するカプラン−マイヤー生存曲線。総生存はCD5+とCD5−グループについて示す。横軸:総生存。縦軸:確率。A:13q21.1−q31.3増加の有無によるCD5+症例の生存曲線(6例と19例)、ならびに13q21.1−q31.3増加の有無によるCD5−症例の生存曲線(6例と35例)。B:1p36.21−p36.13減少の有無によるCD5+症例の生存曲線(6例と19例)、ならびに1p36.21−p36.13減少の有無によるCD5−症例の生存曲線(9例と32例)。C:5p15.33−p14.2減少の有無によるCD5+症例の生存曲線(4例と21例)、ならびに5p15.33−p14.2減少の有無によるCD5−症例の生存曲線(7例と34例)。
図8は正常例と女性を対象にしたアレイCGH分析。A:正常男性と正常女性のDNAsを用いたアレイCGHの代表的なゲノムプロファイルの比較。正常男性同士の同時ハイブリダイゼーション6例を実施し、log2比率(log2 cy3/cy5)における正常変動を定義した。対照実験では、各スポット(2x 1,966クローン)に対して測定した蛍光log2比率の95%以上が+0.2?−0.2の範囲であった(データ示さず)。従って増加ならびに減少のlog2比率に対する閾値を、それぞれlog2比率+0.2ならびに−0.2の範囲に定めた。アレイのデータは、各クローン毎に対する二重スポットの平均log2比としてプロットした。横線は増加ならびに減少のlog2比率に関する閾値を表す。それぞれのBACクローンに対するlog2比率は、それに対するゲノム位置の関数としてプロットしたが、このとき、第1染色体は左に、X染色体は右に、またそれぞれの染色体について、その順序は短腕テロメア側から長腕テロメア側に並べている。B:X染色体のコピー数変化に対する正規化log2比。正常男性DNAを全ハイブリダイゼーションの参照として用いた。アレイハイブリダイゼーションを試験ゲノムDNAを用いて行ったが、このDNAは正常男性(1X染色体)、正常女性(2X染色体)、X染色体のコピーを3個、4個、5個含む3種類の細胞株に由来するものであった。各プロットは、X染色体に由来する57種類のクローンの正規化蛍光比全てに対する平均値を表す。それぞれのX染色体クローンに対する比率は、常染色体クローンの平均蛍光強度比により正規化した。正常男性と正常女性によるアレイハイブリダイゼーションの蛍光強度比を0として定義した。次に正規化値した値を元に、各プロットを計算した。直線は、全データにわたる線形回帰を表し、傾きは0.51、切片は0.72であった。
図9はアレイCGHのゲノムプロファイル。A:Karpas1718を用いた代表的なアレイCGHのゲノムプロファイル。BACsの配列は1pテロメアから始まり、Xqテロメアで終わるゲノム内位置による。グラフ上の黒矢印は高レベルの増幅を示す(log2比>1で定義)。B:3種類の細胞株(Karpas1718、Rec1、OCI−Ly7)ならびに1例のDLBCL患者における、第13染色体の詳細ゲノムプロファイル。68種類のBACならびにPACクローンそれぞれに対するlog2比率は、それに対するゲノム位置の関数としてプロットしたが、このとき、染色体13qセントロメアは左に、13qテロメアは右になっている。水平の点線は増加と減少に関する閾値を示す。太い矢印は高レベルの増幅を(log2比>1で定義)、細い矢印は中程度レベルの増幅を示す(0.2>log2比>1で定義)。Karpas1718は第13q染色体の50Mb以上におよぶ広範囲の増幅を示している。さらに、Karpas1718の高レベル増加が13q22.2から13q31.3まで観察され、ここで特に13q31.3が最高レベルの増幅を示している(log2比>2)。同様な方法で、13q31.3にはOCI−Ly7と Rec1の高レベル増幅が見られる。Rec1もまた13q31.3の近傍において広範囲の減少を示している。患者試料(D778)では13q21.2−13q31.3ならびに13q33.3−qterに広範囲の増幅が見られ、特に13q31.1−q31.3は高レベルの増幅を示していた。
図10は13q31−q32に増幅が見られる細胞株と見られない細胞株に対する、FISH分析ならびにCGH分析。4種類の細胞株(Karpas1718、Rec1、OCI−Ly4、Jurkat)に対するCGHの結果を示す。各染色体の右(緑)ならびに左(赤)に位置する線は、それぞれ増加または減少した領域を示す。BAC、RP11−487A2による分裂中期FISHの代表的な結果を、各パネルの右側に示す。CGHを用いて検査した第13染色体も、各記号の近くに示している。3種類のB細胞リンパ腫細胞株、すなわちKarpas1718(A)、Rec1(B)、OCI−Ly4(C)には13q31−q32に増幅が見られたが、Jurkat(D)にはそれは見られなかった。FISH分析では3種類のB細胞株に15コピー以上の増幅が示されているが、Jurkatには増幅が見られなかった。それぞれの分裂中期染色体は、DAPIで逆染色した。
図11はアレイCGHと分裂間期FISHの組み合わせによる13q31−q32の分析。A:3種類の細胞株(Rec1、Karpas1718、OCI−Ly7)と1種類のDLBCL患者(D778)に対するアレイCGH分析データのまとめ。縦軸はlog2比を示す。水平の点線は増加と減少に関する閾値を示し、それぞれ+0.2と−0.2のlog2比に設定してある。灰色のカコミ部分は、3種類の細胞株における高レベル増幅(Log2比>1)の共通領域を示しており、これはRP11−360A9から RP11−481A22まで伸長している。B:3種類の細胞株(Karpas1718、OCI−Ly4、Rec1)のDNAシーケンスコピー数データのまとめ。この測定は分裂中期FISHにより実施し、13q31.3のBACクローン19種類を用いたが、これにはアレイCGHで用いなかった新しいBACであるRP11−93M14が含まれている。10種類の分裂中間期の細胞を分析し、それぞれの細胞株ごとに、BACクローンシグナルの平均コピー数を計数した。縦軸はコピー数を、水平の点線は正常な2種類のコピーを示す。灰色のカコミ部分はコピー数増幅の共通領域を示しており、これはRP11−29C8からRP11−93M14までの範囲に伸長している。STSマーカーならびに全てのBACクローンの位置はEnsembl Genome Data Resource(http://www.ensembl.org/)による記録情報をもとに確認した。下線のあるBACクローンをFISH分析とアレイCGHに用いた。細い矢印はGPC5遺伝子座を示す。
図12は13q31−q32増幅の候補遺伝子に対するノーザンブロット分析。ノーザンブロット分析を次の6種類のRNAに対して実施した。ヒト胎盤(レーン1)、3種類のB細胞リンパ腫細胞株で13q31−q32に増幅が見られるもの(レーン2:Rec1、レーン3:Karpas1718、レーン4:OCI−Ly4)、2種類のT細胞リンパ腫細胞株で増幅が見られないもの(レーン5:Jurkat、レーン6:ATN−1)。30種類のESTsのうち8種類とGPC5について、代表的で特徴的な発現パターンを示す。GPC5とBI481522の発現には有意差はなかったが、LOC160824、AF339828、BC040320、AF339802、LOC121734、AA705439、N49442は明らかに異なる発現パターンを示した。特にAF339828とBC040320は同様なハイブリダイゼーションパターンを示しており、その発現は13q31−q32におけるコピー数増加に対する索引となる。
図13、14、15はGPC5とBC040320に対する発現試験。細胞株とDLBCL患者それぞれについて13q31−q32の増幅状態を、従来のCGHにより調べ、これを試料名の上に示した。図13:細胞株と、13q31−q32で増幅が見られる場合と見られない場合のDLBCL患者における、GPC5とBC040320の発現パターン。5種類の細胞株と、13q31−q32で増幅が見られるDLBCL患者2例におけるGPC5の発現には、他の細胞株や増幅の見られない患者における場合と比較しての有意差はなかった。BC040320は13q31−q32で増幅の見られる細胞株(レーン1?5)において発現しており、増幅の見られない細胞株ではこれより低いレベルで発現していた(レーン6〜8)。同様な方法で、BC040320は13q31−q32で増幅の見られるDLBCL患者で強く発現していたが(レーン9と10)、増幅の見られない細胞株での発現は非常に弱かった(レーン11と12)。図14:血液学的悪性度を有する複数の細胞株におけるGPC5とBC040320の発現パターン。13q31−q32に増幅の見られる細胞株の一部には(レーン9、11、12)、高レベルの増幅を示す2種類の細胞株(レーン1と2)に比べて弱いシグナルを示すものがある。GPC5の発現は若干変動のある非常に弱いシグナルを示すが、有意差は無かった。AML:急性骨髄性白血病細胞株。MM:多発性骨髄腫細胞株。NK/T:NK/T細胞リンパ腫/白血病細胞株。図15:複数の正常組織中におけるBC040320とGPC5の発現パターン。13q31−q32で高レベル増幅を示す2種類の細胞株の場合(レーン1と2)と比較して、正常組織中でのBC040320の発現は、肺、胸腺、リンパ節を例外としてほとんど視認できない。
図16はC13orf25遺伝子のエクソン−イントロン構造。A:BC040320とAF339828の2種類のESTsは、13q31.3で増幅を示す細胞株で過剰発現されるものであり、これを水平の点線上に示す。BC040320は4個のエクソンに分割され、これは2種類のBACクローン、すなわちRP11−282D2とRP11−121J7を囲んでいる。AF339828はBC040320のテロメア側に位置しており、BC040320から約300bp離れている。RT−PCRに用いたプライマセットを、エクソンの下に示す。B:RT−PCRにより得られた2種類の転写産物。一方(転写産物−A)はBC040320シーケンスと同一であり、965−bpのヌクレオチドを含む4個のエクソンにより構成される。他方(転写産物−B)は5058−bpのヌクレオチドを含む2個のエクソンにより構成される。コンピュータ分析により、bA121J7.2(Vega_gene ID)の32−AAポリペプチドが転写産物−AのcDNA中にコードされていることが判った。ORFsの可能性がある部分を、灰色のボックスで示す。転写産物−Bシーケンスより5種類の前駆体microRNAs(miRNAs)(miR91−前駆体−13マイクロRNA、miR18−前駆体−13マイクロRNA、miR19a−前駆体−13マイクロRNA、miR19b−前駆体−13マイクロRNA、miR92−前駆体−13マイクロRNA)が得られ、転写産物−B中の黒いボックスにより示しているが、これには7種類の成熟したmicroRNAが含まれている(microRNA miR−17、miR−91、miR−18、miR−19a、miR−20、miR−19b、miR−92)。C:ポリペプチドシーケンスを同様に構造の下に示している。13−AAのポリペプチドは転写産物−Aと転写産物−Bにより共有されており、これを下線により示している。
第1発明は、CD5+DLBCL患者とCD5−DLBCL患者から染色体DNAを単離し、この染色体DNAの特定領域の増幅および欠損について以下のとおりに判定する方法である
(1) 第13染色体 q21.1−q31.3(13q21.1−131.3)領域の増幅があるCD5+DLBCL患者の予後は不良と判定する。
(2) 第1染色体 p36.21−p36.13(1p36.21−p36.13)領域の欠失があるCD5+DLBCL患者の予後は不良と判定する。
(3) 第5染色体 p15.33−p14.2(5 p15.33−p14.2)領域の増幅があるCD5−DLBCL患者の予後は良好と判定する。
この第1発明の一態様は、染色体領域を含む複数のDNAプローブと患者からの染色体DNAとのハイブリダイゼーションによって染色体領域の増幅または欠損を測定する方法であり、DNAプローブとしては、公知のBAC/PAC DNAクローンを使用することができる。すなわち、表2〜7に示した各染色体に対するBAC/PAC DNAクローンのうち、前記(1)〜(3)の各染色体領域とハイブリダイズするクローンを選択して用いることができる。また、液相系で行うもともできるが、固相系、特にBAC/PAC DNAクローンを固相単体上に固定したDNAアレイを用いて行うことができる。このようなDNAアレイを用いた方法は、後記の実施例に示した「アレイCGH」法に準じてDNAアレイを作成し、実施することができる。
第3発明は、前記3つの染色体領域(13q21.1−131.3領域、1p36.21−p36.13領域、5p15.33−p14.2領域)に含まれる遺伝子発現の増減を指標としてDLBCL患者の予後を判定する方法である。このような遺伝子は、表2〜7に示した各染色体領域の遺伝子を対象として行うことができる。またこの出願の発明は、このような遺伝子として、13q21.1−131.3領域に含まれる遺伝子C13orf24を提供する(具体的な構成等については後記実施例2を参照)。
第3発明の予後診断方法は、患者の生体試料における各遺伝子(例えばC13orf24)の発現量を測定し、この遺伝子の発現量を指標としてDLBCL患者の予後を診断する方法である。すなわち、各染色体領域の遺伝子発現量が健常者の生体試料と比較して有意に多いかまたは少ない患者を、DLBCL予後不良患者またはそのハイリスク者と判定する。また遺伝子発現量が「有意に多い」とは、患者の遺伝子発現量が健常者生体試料において測定された同一遺伝子と比較して、10%以上、好ましくは30%以上、さらに好ましくは70%以上、最も好ましくは100%以上である場合を意味する。またさらに、この「有意に多い」とは、例えば同一被験者の複数試料についての当該遺伝子発現量の平均値と、複数の健常者試料における同様の平均値とを統計的に検定した場合、前者が後者よりも有意に多い場合である。
被験対象となる各遺伝子はそれぞれ公知の方法によって容易に取得することができる。例えば、cDNAの場合には、公知の方法(Mol.Cell Biol.2,161−170,1982;J.Gene 25,263−269,1983;Gene,150,243−250,1994)を用いてcDNAライブラリーを合成し、それぞれ公知の塩基塩基配列に基づいて作製したプローブDNAを用いて、それぞれのcDNAを単離する方法によって取得することができる。得られたcDNAは、例えば、PCR(Polymerase Chain Reaction)法、NASBN(Nucleic acid sequence based amplification)法、TMA(Transcription−mediated amplification)法およびSDA(Strand Displacement Amplification)法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。また、この発明によって提供されるプライマーセットを用い、ヒト細胞から単離したmRNAを鋳型とするRT−PCR法によっても必要量の各cDNAを得ることができる。
以上のとおりの遺伝子発現量を指標とする予後診断方法は、公知の遺伝子工学および分子生物学的技術に従い、当該分野で特定の遺伝子の発現を検知測定するために知られた手法、例えばin situハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、ドットブロット、RNaseプロテクションアッセイ、RT−PCR、Real−Time PCR(Journal of Molecular Endocrinology,25,169−193(2000)およびそこで引用されている文献)、DNAアレイ解析法(Mark Shena編、”Microarray Biochip Technology”,Eaton Publishing,2000年3月)などによってHRFポリヌクレオチド発現量を検知・測定して実施することができる。こうした技術を利用した遺伝子発現測定系、DLBCL疾患の検出系、DLBCL疾患のリスク検出系、それに利用する試薬、方法、プロセス、解析プログラムなどは、すべてこの発明の技術およびそれに利用するシステムに含まれる。
この出願は、前記の第3発明の方法に使用する材料として、特に以下の発明を提供する。
すなわち、オリゴヌクレオチドプローブは、被験対象の遺伝子とストリンジェント(stringent)な条件下でハイブリダイゼーションすることを特徴とする。
このようなオリゴヌクレオチドプローブは、例えば被験対象遺伝子の精製ポリヌクレオチドまたはそのcDNAを適当な制限酵素で切断することによっても得ることができる。あるいは、Carruthers(1982)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47:411−418;Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105:661;Belousov(1997)Nucleic Acid Res.25:3440−3444;Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19:373−380;Blommers(1994)Biochemistry 33:7886−7896;Narang(1979)Meth.Enzymol.68:90;Brown(1979)Meth.Enzymol.68:109;Beaucage(1981)Tetra.Lett.22:1859;米国特許第4,458,066号に記載されているような周知の化学合成技術により、in vitroにおいて合成することができる。
またストリンジェントな条件とは、前記のポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドプローブとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒(例えば、ホルムアミド)、温度、およびその他公知の条件によって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー(stringency)は増加する。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、NaCl約750mM以下およびクエン酸三ナトリウム約75mM以下、より好ましくはNaCl約500mM以下およびクエン酸三ナトリウム約50mM以下、最も好ましくはNaCl約250mM以下およびクエン酸三ナトリウム約25mM以下である。ストリンジェントな有機溶媒濃度は、ホルムアミド約35%以上、最も好ましくは約50%以上である。ストリンジェントな温度条件は、約30℃以上、より好ましくは約37℃以上、最も好ましくは約42℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤(例えば、SDS)の濃度、およびキャリアーDNAの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。1つの好まし態様としては、750mM NaCl、75mM クエン酸三ナトリウムおよび1% SDSの条件で、30℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。より好ましい態様としては、500mM NaCl、50mM クエン酸三ナトリウム、1% SDS、35%ホルムアミド、100μg/mlの変性サケ精子DNAの条件で、37℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。最も好ましい態様としては、250mM NaCl、25mM クエン酸三ナトリウム、1% SDS、50%ホルムアミド、200μg/mlの変性サケ精子DNAの条件で、42℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。また、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。例えば、洗浄のためのストリンジェントな塩条件は、好ましくはNaCl約30mM以下およびクエン酸三ナトリウム約3mM以下、最も好ましくはNaCl約15mM以下およびクエン酸三ナトリウム約1.5mM以下である。洗浄のためのストリンジェントな温度条件は、約25℃以上、より好ましくは約42℃以上、最も好ましくは約68℃以上である。1つの好ましい態様としては、30mM NaCl、3mM クエン酸三ナトリウムおよび0.1% SDSの条件で、25℃の温度により洗浄を行う。より好ましい態様としては、15mM NaCl、1.5mM クエン酸三ナトリウムおよび0.1% SDSの条件で、42℃の温度により洗浄を行う。最も好ましい態様としては、15mM NaCl、1.5mM クエン酸三ナトリウムおよび0.1% SDSの条件で、68℃の温度により洗浄を行うことである。
またこのオリゴヌクレオチドプローブは当該技術分野で使用されている標識を付加することもできる。標識は、ラジオアイソトープ(RI)法または非RI法によって行うことができるが、非RI法を用いることが好ましい。非RI法としては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍光物質としては、オリゴヌクレオチドの塩基部分と結合できるものを適宜に選択して用いることができるが、シアニン色素(例えば、CyDyeTMシリーズのCy3、Cy5等)、ローダミン6G試薬、N−アセトキシ−N2−アセチルアミノフルオレン(AAF)、AAIF(AAFのヨウ素誘導体)などを使用することができる。また標識法としては、当該分野で知られた方法(例えばランダムプライム法、ニック・トランスレーション法、PCRによるDNAの増幅、ラベリング/テイリング法、in vitro transcription法等)を適宜選択して使用できる。例えば、HRFオリゴヌクレオチドに官能基(例えば、第一級脂肪族アミノ基、SH基など)を導入し、こうした官能基に前記の標識を結合して標識化オリゴヌクレオチドプローブを作成することができる。
この発明のDNAアレイは、前記のオリゴヌクレオチドプローブまたは遺伝子cDNAの全長または一部をターゲットキャプチャープローブとしている。DNAアレイの作製方法としては、固相担体表面で直接オリゴヌクレオチドを合成する方法(オン・チップ法)と、予め調製したオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを固相担体表面に固定する方法とが知られている。この発明のDNAアレイは、このいずれの方法でも作製することができる。オン・チップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術および固相合成技術とを組み合わせて、微少なマトリックスの所定の領域での選択的合成を行う方法(マスキング技術:例えば、Fodor,S.P.A.Science 251:767,1991)等によって行うことができる。一方、予め調製したオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを固相担体表面に固定する場合には、官能基を導入したオリゴヌクレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面にオリゴヌグレオチドを点着し、共有結合させる(例えば、Lamture,J.B.et al.Nucl.Acids Res.22:2121−2125,1994;Guo,Z.et al.Nucl,Acids Res.22:5456−5465,1994)。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、一般的には、表面処理した固相担体にスペーサーやクロスリンカーを介して共有結合させる。ガラス表面にポリアクリルアミドゲルの微小片を整列させ、そこに合成オリゴヌクレオチドを共有結合させる方法も知られている(Yershov,G.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4913,1996)。また、シリカマイクロアレイ上に微小電極のアレイを作製し、電極上にはストレプトアビジンを含むアガロースの浸透層を設けて反応部位とし、この部位をプラスに荷電させることでビオチン化オリゴヌクレオチドを固定し、部位の荷電を制御することで、高速で厳密なハイブリダイゼーションを可能にする方法も知られている(Sosnowski,R.G.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:1119−1123,4997)。また、プローブを固相基体表面に滴下させてスポッティングを行う場合には、ピン方式(例えば米国特許第5,807,5223号)によって行うこともできるが、JP2001−116750A公報やJP 2001−186881A公報に開示されているインクジェット方式を採用することが、均一で一定形状のスポット形成のために好ましい。また、このインクジェット方式では、個々のプローブスポットに含まれるプローブ数を等しくすることができるため、プローブ長の違いによるハイブリダイゼーションの違いを正確に測定することができる。さらに、JP 2001−186880A公報に開示されているような、スポッティング重ね打ちを行うこと、あるいはWO 03/038089A1号パンフレットに開示された組成からなるプローブ溶液(保湿性物質を含む溶液)を使用することも、好ましいスポット形成のために推奨される。
スポッティングの後は、冷却、スポットに対する水分付加(湿度〜80%程度に一定時間保持)、焼成乾燥による固定化処理等を行うことによって、各スポットを固相基体上に固定するし、マイクロアレイを完成することができる。なお、マイクロアレイの固相基体は、通常のマイクロアレイに使用されるガラス(スライドガラス)の他、プラスチック、シリコーン、セラミック等を使用することもできる。
このマイクロアレイを使用して診断する場合には、例えば患者の細胞から単離したmRNAを鋳型として、cDNAを合成し、PCR増幅する。その際に、標識dNTPを取り込ませて標識cDNAとする。この標識cDNAをマクロアレイに接触させ、マイクロアレイのキャプチャープローブ(オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド)にハイブリダイズしたcDNAを検出する。ハイブリダイゼーションは、96穴もしくは384穴プラスチックプレートに分注して標識cDNA水性液を、マイクロアレイ上に点着することによって実施することができる。点着の量は、1〜100nl程度とすることができる。ハイブリダイゼーションは、室温〜70℃の温度範囲で、6〜20時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の標識cDNAを除去する。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが好ましい。
この発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、各遺伝子の公知の塩基塩基配列に基づき設計し、合成・精製の各工程を経て調製することができる。なお、プライマー設計の留意点として、例えば以下を挙げることができる。プライマーのサイズ(塩基数)は、鋳型DNAとの間の特異的なアニーリングを満足させることを考慮し、15−40塩基、望ましくは15−30塩基である。ただし、LA(long accurate)PCRを行う場合には、少なくとも30塩基が効果的である。センス鎖(5’末端側)とアンチセンス鎖(3’末端側)からなる1組あるいは1対(2本)のプライマーが互いにアニールしないよう、両プライマー間の相補的配列を避けると共に、プライマー内のヘアピン構造の形成を防止するため自己相補配列をも避けるようにする。さらに、鋳型DNAとの安定な結合を確保するためGC含量を約50%にし、プライマー内においてGC−richあるいはAT−richが偏在しないようにする。アニーリング温度はTm(melting temperature)に依存するので、特異性の高いPCR産物を得るため、Tm値が55−65℃で互いに近似したプライマーを選定する。また、PCRにおけるプライマー使用の最終濃度が約0.1〜約1μMになるよう調整する等を留意することも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えばOligoTM[National Bioscience Inc.(米国)製]、GENETYX[ソフトウェア開発(株)(日本)製]等を用いることもできる。
以上のとおりの材料を使用することによって、CD5+DLBCL患者の予後を、例えば以下のように判定することができる。
一つの形態は、オリゴヌクレオチドプローブを用いて被験対象遺伝子(例えばC13orf25)の発現量(mRNA量)を検出する方法(ノーザンブロット分析法)である。この診断方法は、少なくとも以下の工程:
(a) 患者の生体試料よりRNAを調製する工程;
(b) 工程(a)で調製されたRNAを電気泳動分離する工程;
(c) 工程(b)で分離されたRNAをオリゴヌクレオチドプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする工程;
(d) 工程(e)でRNAにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブの標識量を遺伝子発現量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程;および
(e) 正常生体試料と比較して有意に高いかまたは低い遺伝子発現量を、DLBCL患者の予後の程度を示す指標として使用する工程、
を含むことを特徴とする。
また別の形態は、DNAアレイを使用する方法である。この方法は、少なくとも以下の工程:
(a) 患者の生体試料よりRNAを調製する工程;
(b) 工程(a)で調製したRNAから、標識cDNAを調製する工程、
(c) 工程(b)で調製した標識cDNAをDNAアレイに接触させる工程;
(d) 工程(c)でDNAアレイのキャプチャープローブにハイブリダイズした標識cDNAの標識量を遺伝子発現量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程;および
(e) 正常生体試料と比較して有意に高いかまたは低い遺伝子発現量を、DLBCL患者予後の程度を示す指標として使用する工程、
を含むことを特徴とする。
さらに別の形態は、プライマーセットを用いて、遺伝子mRNAの発現量を測定する方法(RT−PCT法)である。この方法は、少なくとも以下の工程:
(a) 患者の生体試料よりRNAを調製する工程;
(b) 工程(a)で調製したRNAを鋳型とし、プライマーセットを用いてcDNAを合成する工程;
(c) 工程(b)で合成されたcDNA量を遺伝子発現量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程;および
(d) 正常生体試料と比較して有意に高いかまたは低い遺伝子発現量を、DLBCL患者の予後の程度を示す指標として使用する工程、
を含むことを特徴とする。
またさらに、第3発明の診断方法は、前記のノーザンブロット法、DNAアレイ法、RT−PCR法を適宜に組み合わせて行うこともできる。
なお、以上の各診断方法においては、標識の観察や標識量の測定には、標識の種類に応じて当該分野で知られた方法を適宜選択して使用でき、例えば暗視野顕微鏡、位相差顕微鏡、反射コントラスト顕微鏡、螢光顕微鏡、デジタルイメージング顕微鏡、電子顕微鏡などによる方法も使用することができる。
第3発明の別の態様は、各被験遺伝子の転写産物として、タンパク質を対象とする方法である。タンパク質量を指標とする予後診断方法は、公知の遺伝子工学および分子生物学的技術に従い、当該分野で特定のタンパク質量を検知測定するために知られた手法、例えばin situハイブリダイゼーション、ウェスタンブロッティング、各種の免疫組織学的方法などによって被験タンパク質量を検知・測定して実施することができる。こうした技術を利用したタンパク質量測定系、DLBCLの予後検出系、DLBCLのリスク検出系、それに利用する試薬、方法、プロセス、解析プログラムなどは、すべてこの発明の技術およびそれに利用するシステムに含まれる。
この第3発明における予後診断は、一つの好ましい形態として、被験タンパク質に特異的に結合する抗体を使用する。なおここで言う「抗体」とは、広義の意味で使用されるものであってよく、所望のポリペプチドおよび関連ペプチド断片に対するモノクローナル抗体の単一のものや各種エピトープに対する特異性を持つ抗体組成物であってよく、また1価抗体または多価抗体並びにポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含むものであり、さらに天然型(intact)分子並びにそれらのフラグメントおよび誘導体も表すものであり、F(ab’)2、Fab’およびFabといったフラグメントを包含し、さらに少なくとも二つの抗原またはエピトープ(epitope)結合部位を有するキメラ抗体若しくは雑種抗体、または、例えば、クワドローム(quadrome)、トリオーム(triome)などの二重特異性組換え抗体、種間雑種抗体、抗イディオタイプ抗体、さらには化学的に修飾あるいは加工などされてこれらの誘導体と考えられるもの、公知の細胞融合またはハイブリドーマ技術や抗体工学を適用したり、合成あるいは半合成技術を使用して得られた抗体、抗体生成の観点から公知である従来技術を適用したり、DNA組換え技術を用いて調製される抗体、本明細書で記載し且つ定義する標的抗原物質あるいは標的エピトープに関して中和特性を有したりする抗体または結合特性を有する抗体を包含していてよい。特に好ましい抗体は、天然型のタンパク質(ポリペプチド)を特異的に識別できるものである。
すなわち、抗体は被験タンパク質の部分ペプチドを抗原として調製された抗体であり、好ましくは、一つのタンパク質の異なる部位を認識する抗体のセットして使用される。このような抗体作成のためのペプチドは、例えば、C13orf24遺伝子産物を対象タンパク質とする場合には、SEQ ID NO:4および5のアミノ酸配列からなるペプチドであり、ペプチド合成機を使用して、例えばFmoc−bop法で合成する。HRFペプチドのN末端にはシステインを導入してもよい。合成したペプチドはμBondasphere、C18カラム(Waters)などを用いた高速液体クロマトグラフィーなどにより精製して免疫抗原として使用する。
このような抗体は、例えばポリクローナル抗体の場合には、タンパク質やその一部断片(オリゴペプチド)を免疫原として動物を免役した後、血清から得ることができる。あるいは、タンパク質ポリヌクレオチドの組換えベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、ニワトリなどが用いられる。さらには、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましい場合もある。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われ、例えば村松繁、他編、実験生物学講座14、免疫生物学、丸善株式会社、昭和60年、日本生化学会編、続生化学実験講座5、免疫生化学研究法、東京化学同人、1986年、日本生化学会編、新生化学実験講座12、分子免疫学III、抗原・抗体・補体、東京化学同人、1992年などに記載の方法に準じて行うことができる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物などの腹腔内または皮下に注射することにより行われる。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。免疫化剤を(必要に応じアジバントと共に)一回又はそれ以上の回数哺乳動物に注射することにより免疫化される。代表的には、該免疫化剤および/またはアジバントを哺乳動物に複数回皮下注射あるいは腹腔内注射することによりなされる。免疫化剤は、上記抗原ペプチドあるいはその関連ペプチド断片を含むものが挙げられる。免疫化剤は、免疫処理される哺乳動物において免疫原性であることの知られているタンパク質(例えば上記担体タンパク質類など)とコンジュゲートを形成させて使用してもよい。アジュバントとしては、例えばフロイント完全アジュバント、リビ(Ribi)アジュバント、百日咳ワクチン、BCG、リピッドA、リポソーム、水酸化アルミニウム、シリカなどが挙げられる。
ポリクローナル抗体を含む抗血清は、免疫された動物を所定の期間飼育した後、当該動物から採血した血液から調製することができる。得られた抗血清は、HRFを認識するものであることを確認した後、本発明所定の活性成分として供される。
この発明の抗体としては、哺乳動物由来のモノクローナル抗体として得られたものを使用することもできる。抗原物質に対して作製されるモノクローナル抗体は、培養中の一連のセルラインにより抗体分子の産生を提供することのできる任意の方法を用いて産生される。修飾語「モノクローナル」とは、実質上均質な抗体の集団から得られているというその抗体の性格を示すものであって、何らかの特定の方法によりその抗体が産生される必要があるとみなしてはならない。個々のモノクローナル抗体は、自然に生ずるかもしれない変異体が僅かな量だけ存在しているかもしれないという以外は、同一であるような抗体の集団を含んでいるものである。モノクローナル抗体は、高い特異性を持ち、それは単一の抗原性をもつサイトに対して向けられているものである。異なった抗原決定基(エピトープ)に対して向けられた種々の抗体を典型的には含んでいる通常の(ポリクローナル)抗体調製物と対比すると、それぞれのモノクローナル抗体は当該抗原上の単一の抗原決定基に対して向けられているものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリン類の夾雑がないあるいは少ない点でも優れている。モノクローナル抗体は、ハイブリッド抗体及びリコンビナント抗体を含むものである。それらは、所望の生物活性を示す限り、その由来や免疫グロブリンクラスやサブクラスの種別に関わりなく、可変領域ドメインを定常領域ドメインで置き換えたり、あるいは軽鎖を重鎖で置き換えたり、ある種の鎖を別の種の鎖でもって置き換えたり、あるいはヘテロジーニアスなタンパク質と融合せしめたりして得ることができる(例えば、米国特許第4816567号;Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.79−97,Marcel Dekker,Inc.,New York,1987など)。
また、モノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作製法(「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、1990年;”Monoclonal Antibody”James W.Goding,third edition,Academic Press,1996)に従い作製することができる。
この発明の抗体は必要に応じてそれをより精製された形態のものとして使用される。抗体を精製・単離する手法としては、従来公知の方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラフィー法、高速液体クロマトグララィー法などにより精製して用いることができる。好ましくは、抗血清、モノクローナル抗体を含有する腹水などは、硫安分画した後、DEAE−セファロースの如き、陰イオン交換ゲル及びプロテインAカラムの如きアフィニティ・カラムなどで処理し精製分離処理できる。特に好ましくは抗原又は抗原断片(例えば合成ペプチド、組換え抗原タンパク質あるいはペプチド、抗体が特異的に認識する部位など)を固定化したアフィニティ・クロマトグラフィー、プロテインAを固定化したアフィニティ・クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィーなどが挙げられる。
これら抗体をトリプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理して、場合により還元して得られるFab、Fab’、F(ab’)2といった抗体フラグメントにして使用してもよい。抗体は、既知の任意の検定法、例えば競合的結合検定、直接及び間接サンドイッチ検定、及び免疫沈降検定に使用することができる(Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques,pp.147−158(CRC Press,Inc.,1987)。
抗体を検出可能な原子団にそれぞれコンジュゲートするには、当分野で知られる任意の方法を使用することができ、例えば、David et al.,Biochemistry,13巻,1014−1021頁(1974);Pain et al,J.Immunol.Meth.,40:pp.219−231(1981);及び”Methods in Enzymology”,Vol.184,pp.138−163(1990)により記載の方法が挙げられる。標識物を付与する抗体としては、IgG画分、更にはペプシン消化後還元して得られる特異的結合部Fab’を用いることができる。
抗原あるいは抗体を固相化できる多くの担体が知られており、この発明ではそれらから適宜選んで用いることができる。担体としては、抗原抗体反応などに使用されるものが種々知られており、この発明においても勿論これらの公知のものの中から選んで使用できる。特に好適に使用されるものとしては、例えばガラス、例えばアミノアルキルシリルガラスなどの活性化ガラス、多孔質ガラス、シリカゲル、シリカ−アルミナ、アルミナ、磁化鉄、磁化合金などの無機材料、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリカーボネート、ポリメタクリレート、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、スチレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体など、架橋化アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、デキストラン、アガロース、架橋アガロース、セルロース、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートなどの天然または変成セルロース、架橋デキストラン、ナイロンなどのポリアミド、ポリウレタン、ポリエポキシ樹脂などの有機高分子物質、さらにそれらを乳化重合して得られたもの、シリコンガムなど、細胞、赤血球などで、必要に応じ、シランカップリング剤などで官能性基を導入してあるものが挙げられる。
担体としては、粒子、微粒子、マイクロパーティクル、メンブレン、ろ紙、ビーズ、チューブ、キュベット、試験容器の内壁、例えば試験管、タイタープレート、タイターウェル、マイクロプレート、ガラスセル、合成樹脂製セルなどの合成材料からなるセル、ガラス棒、合成材料からなる棒、末端を太くしたりあるいは細くしたりした棒、末端に丸い突起をつけたりあるいは偏平な突起をつけた棒、薄板状にした棒などの固体物質(物体)の表面などが挙げられる。
これら担体と抗体との結合は、吸着などの物理的な手法、あるいは縮合剤などを用いたり、活性化されたものなどを用いたりする化学的な方法、さらには相互の化学的な結合反応を利用した手法などにより行うことが出来る。
この発明の抗体には、それぞれ標識物質によって標識化された抗体も含まれる。標識としては、酵素、酵素基質、酵素阻害物質、補欠分子類、補酵素、酵素前駆体、アポ酵素、蛍光物質、色素物質、化学ルミネッセンス化合物、発光物質、発色物質、磁気物質、金属粒子、例えば金コロイドなど、非金属元素粒子、例えばセレンコロイドなど、放射性物質などを挙げることができる。好ましい標識物質は、酵素、放射性同位体または蛍光色素をふくむ化学物質を使用することができる。酵素は、turnover numberが大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常のEIAに用いられる酵素を使用できる。酵素としては、脱水素酵素、還元酵素、酸化酵素などの酸化還元酵素、例えばアミノ基、カルボキシル基、メチル基、アシル基、リン酸基などを転移するのを触媒する転移酵素、例えばエステル結合、グリコシド結合、エーテル結合、ペプチド結合などを加水分解する加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどを挙げることができる。酵素は複数の酵素を複合的に用いて検知に利用することもできる。例えば酵素的サイクリングを利用することもできる。酵素標識などは、ビオチン標識体と酵素標識アビジン(ストレプトアビジン)に置き換えることも可能である。このように、ビオチン−アビジン系を使用したり、抗HRF抗体に対する抗体などの二次的な抗体を使用するなど、当該分野で公知の感度増強法を適宜採用することができる。標識は、複数の異なった種類の標識を使用することもできる。こうした場合、複数の測定を連続的に、あるいは非連続的に、そして同時にあるいは別々に行うことを可能にすることもできる。
代表的な酵素標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ、大腸菌β−D−ガラクトシダーゼなどのガラクトシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース−6−リン酸化脱水素酵素、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、カタラーゼ、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、大腸菌アルカリホスファターゼなどのアルカリフォスファターゼなどが挙げられる。
これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができ、4−メチルウンベリフェリルフォスフェートなどのウンベリフェロン誘導体、ニトロフェニルホスフェートなどのリン酸化フェノール誘導体などが挙げられ、例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。本発明においては、信号の形成に4−ヒドロキシフェニル酢酸、o−フェニレンジアミン(OPD)、テトラメチルベンジジン(TMB)、5−アミノサリチル酸、3,3−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド(DAB)、3−アミノ−9−エチルカルバゾール(AEC)、チラミン、ルミノール、ルシゲニンルシフェリン及びその誘導体、Pholad luciferinなどと西洋ワサビ・ペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ、ルミジェンPPD、(4−メチル)ウンベリフェリル−リン酸、p−ニトロフェノール−リン酸、フェノール−リン酸、ブロモクロロインドリルリン酸(BCIP)、AMPAKTM(DAKO)、AmpliQTM(DAKO)などとアルカリフォスファターゼ、4−メチルウンベリフェリル−β−D−ガラクトシドといったウンベリフェリルガラクトシド、o−ニトロフェノール−β−D−ガラクトシドといったニトロフェニルガラクトシドなどとβ−D−ガラクトシダーゼ、グルコース−6−リン酸・デヒドロゲナーゼ、ABTSなどとグルコースオキシダーゼなどの酵素試薬の組合わせも利用でき、ヒドロキノン、ヒドロキシベンゾキノン、ヒドロキシアントラキノンなどのキノール化合物、リポ酸、グルタチオンなどのチオール化合物、フェノール誘導体、フェロセン誘導体などを酵素などの働きで形成しうるものが使用できる。
放射性同位体としては、32P、125I、14C、35S、3H等の通常のRIAで用いられているものを使用することができる。蛍光物質あるいは化学ルミネッセンス化合物としては、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、例えばローダミンBイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(RITC)、テトラメチルローダミンイソチオシアネートアイソマーR(TRITC)などのローダミン誘導体、7−アミノ−4−クマリン−3−酢酸、ダンシルクロリド、ダンシルフルオリド、フルオレスカミン、フィコビリプロテイン、アクリジニウム塩、ルミフェリン、ルシフェラーゼ、エクォリンなどのルミノール、イミダゾール、シュウ酸エステル、希土類キレート化合物、クマリン誘導体などが挙げられる。蛍光色素としては、通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。発色、螢光などを含めた生成する信号などを検知するには、視覚によることもできるが、公知の装置を使用することもでき、例えば螢光光度計、プレートリーダーなども使用できる。また、放射性同位体(アイソトープ)などの出す信号を検知するには、公知の装置を使用することもでき、例えばガンマーカウンター、シンチレーションなども使用することができる。
抗体を標識するには、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジルジスルフィド基とチオール基の反応、アミノ基とアルデヒド基の反応などを利用して行うことができ、公知の方法あるいは当該分野の当業者が容易になしうる方法、さらにはそれらを修飾した方法の中から適宜選択して適用できる。免疫原性複合体作製に使用されることのできる縮合剤、担体との結合に使用されることのできる縮合剤などを用いることができる。縮合剤としては、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソチオシアネート、N,N’−ポリメチレンビスヨードアセトアミド、N,N’−エチレンビスマレイミド、エチレングリコールビススクシニミジルスクシネート、ビスジアゾベンジジン、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド、スクシンイミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、N−スクシンイミジル 4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(SMCC)、N−スルホスクシンイミジル 4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート、N−スクシンイミジル(4−ヨードアセチル)アミノベンゾエート、N−スクシンイミジル 4−(1−マレイミドフェニル)ブチレート、N−(ε−マレイミドカプロイルオキシ)コハク酸イミド(EMCS)、イミノチオラン、S−アセチルメルカプトコハク酸無水物、メチル−3−(4’−ジチオピリジル)プロピオンイミデート、メチル−4−メルカプトブチリルイミデート、メチル−3−メルカプトプロピオンイミデート、N−スクシンイミジル−S−アセチルメルカプトアセテートなどが挙げられる。
このような抗体を用いた診断方法における一つの態様は、抗体と被験タンパク質との結合を液相系において検出する方法である。例えば、抗体を標識化した標識化抗体と生体試料とを接触させて標識化抗体とタンパク質を結合させ、この結合体を分離する。分離は、タンパク質+標識化抗体の結合体を公知の分離手段(クロマト法、固相法等)によって分離する方法等によって行うことができる。また公知のウエスタンブロット法に準じた方法を採用することもできる。標識シグナルの測定は、標識として酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射生同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。
液相系での診断の別の方法は、抗体(一次抗体)と生体試料とを接触させて一次抗体と被験タンパク質を結合させ、この結合体に標識化した二次抗体を結合させ、この三者の結合体における標識シグナルを検出する。あるいは、さらにシグナルを増強させるためには、非標識の二次抗体を先ず抗体+抗原ペプチド結合体に結合させ、この二次抗体に標識物質を結合させるようにしてもよい。このような二次抗体への標識物質の結合は、例えば二次抗体をビオチン化し、標識物質をアビジン化しておくことによって行うことができる。あるいは、二次抗体の一部領域(例えば、Fc領域)を認識する抗体(三次抗体)を標識し、この三次抗体を二次抗体に結合させるようにしてもよい。なお、一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。液相からの結合体の分離やシグナルの検出は前記と同様とすることができる。
抗体を用いた別の診断法は、抗体とタンパク質との結合を固相系において試験する方法である。この固相系における方法は、極微量の被験タンパク質の検出と操作の簡便化のため好ましい方法である。すなわちこの固相系の方法は、抗体を樹脂プレートまたはメンブレン等に固定化し、この固定化抗体に被験タンパク質を結合させ、非結合タンパク質を洗浄除去した後、プレート上に残った抗体+タンパク質結合体に標識化した二次抗体を結合させて、この標識化抗体のシグナルを検出する方法である。この方法は、いわゆる「サンドイッチ法」と呼ばれる方法であり、マーカーとして酵素を用いる場合には、「ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)」として広く用いられている方法である。2週類の抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、いずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。
この発明での予後診断はまた、免疫染色、例えば組織あるいは細胞染色、免疫電子顕微鏡、イムノアッセイ、例えば競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで行うことができ、放射免疫測定法(RIA)、蛍光免疫測定法(FIA)、ルミネッセント免疫測定法(LIA)、酵素免疫測定法(EIA)、ELISAなどを用いることができ、B−F分離を行ってもよいし、あるいは行わないでその測定を行うことができる。好ましくはRIA、EIA、FIA、LIAであり、さらにサンドイッチ型アッセイが挙げられる。サンドイッチ型アッセイには、同時サンドイッチ型アッセイ、フォワード(forward)サンドイッチ型アッセイあるいは逆サンドイッチ型アッセイなどが包含されてよい。
この出願の発明におけるタンパク質量の測定系としては、例えば組織に対しては免疫染色、免疫電子顕微鏡などの蛋白測定系、組織抽出物、血液、体液等に対してはEIA、RIA、FIA、LIA、ウエスタンブロッティングなどの蛋白測定系を実施することもできる。
EIAの測定系において、例えば競合法では、抗体を固相化抗体として使用し、標識抗原および非標識抗原(抗原としては、被験タンパク質あるいはそのフラグメントペプチドなどが挙げられる)を使用し、また非競合法で、例えばサンドイッチ法では、固相化抗体や標識抗体を利用できる他、抗体を直接標識したり、固相化せずに、抗体に対する抗体を標識したり、固相化して行うこともできる。感度増幅法としては、例えば、非酵素標識一次抗体との組み合わせでは、高分子ポリマーと酵素と一次抗体を利用するもの(Envision試薬を応用したもの;Enhanced polymer one−step staining(EPOS))が挙げられ、非酵素標識二次抗体との組合せでは、例えばPAP(peroxidase−antiperoxidase)法などの酵素と抗酵素抗体複合体の組合せ、SABC(avidin−biotinylated peroxidase complex)法などのビオチン標識二次抗体とビオチン標識酵素−アビジン複合体の組合せ、ABC(streptavidin−biotin complex)法、LSAB(labeled streptavidin−biotin)法などのビオチン標識二次抗体とビオチン標識酵素−ストレプトアビジン複合体の組合せ、CSA(catalyzed signal amplification)法などのSABCとビオチン標識タイラマイドと酵素標識ストレプトアビジンの組合せ、高分子ポリマーで二次抗体と酵素を標識してあるものなどが挙げられる。
これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、入江 寛編,「ラジオイムノアッセイ」,講談社,昭和49年発行;入江 寛編,「続ラジオイムノアッセイ」,講談社,昭和54年発行;石川栄治ら編,「酵素免疫測定法」,医学書院,昭和53年発行;石川栄治ら編,「酵素免疫測定法」(第2版),医学書院,昭和57年発行;石川栄治ら編,「酵素免疫測定法」(第3版),医学書院,昭和62年発行;H.V.Vunakis et al.(ed.),”Methods in Enzymology”,Vol.70(Immunochemical Techniques,Part A),Academic Press,New York(1980);J.J.Langone et al.(ed.),”Methods in Enzymology”,Vol.73(Immunochemical Techniques,Part B),Academic Press,New York(1981);J.J.Langone et al.(ed.),”Methods in Enzymology”,Vol.74(Immunochemical Techniques,Part C),Academic Press,New York(1981);J.J.Langone et al.(ed.),”Methods in Enzymology”,Vol.84(Immunochemical Techniques,Part D:Selected Immunoassays),Academic Press,New York(1982);J.J.Langone et al.(ed.),”Methods in Enzymology”,Vol.92(Immunochemical Techniques,Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods),Academic Press,New York(1983);J.J.Langone et al.(ed.),”Methods in Enzymology”,Vol.121(Immunochemical Techniques,Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies),Academic Press,New York(1986);J.J.Langone et al.(ed.),”Methods in Enzymology”,Vol.178(Antibodies,Antigens,and Molecular Mimicry),Academic Press,New York(1989);M.Wilchek et al.(ed.),“Methods in Enzymology”,Vol.184(Avidin−Biotin Technology),Academic Press,New York(1990);J.J.Langone et al.(ed.),”Methods in Enzymology”,Vol.203(Molecular Design and Modeling:Concepts and Applications,Part B:Anibodies and Antigens,Nucleic Acids,Polysaccharides,and Drugs),Academic Press,New York(1991)等の記載、あるいはそこで引用された文献中にある記載〕。
なお、この出願によって提供される予後診断方法は、タンパク質量を測定する方法と、遺伝子の発現量を測定する方法(例えばノーザンブロッティング法、RT−PCR法、DNAアレイ法等)とを適宜に組み合わせて行うこともできる。
以下、実施例を示してこの出願の発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例によって限定されるものではない。
(1) 第13染色体 q21.1−q31.3(13q21.1−131.3)領域の増幅があるCD5+DLBCL患者の予後は不良と判定する。
(2) 第1染色体 p36.21−p36.13(1p36.21−p36.13)領域の欠失があるCD5+DLBCL患者の予後は不良と判定する。
(3) 第5染色体 p15.33−p14.2(5 p15.33−p14.2)領域の増幅があるCD5−DLBCL患者の予後は良好と判定する。
この第1発明の一態様は、染色体領域を含む複数のDNAプローブと患者からの染色体DNAとのハイブリダイゼーションによって染色体領域の増幅または欠損を測定する方法であり、DNAプローブとしては、公知のBAC/PAC DNAクローンを使用することができる。すなわち、表2〜7に示した各染色体に対するBAC/PAC DNAクローンのうち、前記(1)〜(3)の各染色体領域とハイブリダイズするクローンを選択して用いることができる。また、液相系で行うもともできるが、固相系、特にBAC/PAC DNAクローンを固相単体上に固定したDNAアレイを用いて行うことができる。このようなDNAアレイを用いた方法は、後記の実施例に示した「アレイCGH」法に準じてDNAアレイを作成し、実施することができる。
第3発明は、前記3つの染色体領域(13q21.1−131.3領域、1p36.21−p36.13領域、5p15.33−p14.2領域)に含まれる遺伝子発現の増減を指標としてDLBCL患者の予後を判定する方法である。このような遺伝子は、表2〜7に示した各染色体領域の遺伝子を対象として行うことができる。またこの出願の発明は、このような遺伝子として、13q21.1−131.3領域に含まれる遺伝子C13orf24を提供する(具体的な構成等については後記実施例2を参照)。
第3発明の予後診断方法は、患者の生体試料における各遺伝子(例えばC13orf24)の発現量を測定し、この遺伝子の発現量を指標としてDLBCL患者の予後を診断する方法である。すなわち、各染色体領域の遺伝子発現量が健常者の生体試料と比較して有意に多いかまたは少ない患者を、DLBCL予後不良患者またはそのハイリスク者と判定する。また遺伝子発現量が「有意に多い」とは、患者の遺伝子発現量が健常者生体試料において測定された同一遺伝子と比較して、10%以上、好ましくは30%以上、さらに好ましくは70%以上、最も好ましくは100%以上である場合を意味する。またさらに、この「有意に多い」とは、例えば同一被験者の複数試料についての当該遺伝子発現量の平均値と、複数の健常者試料における同様の平均値とを統計的に検定した場合、前者が後者よりも有意に多い場合である。
被験対象となる各遺伝子はそれぞれ公知の方法によって容易に取得することができる。例えば、cDNAの場合には、公知の方法(Mol.Cell Biol.2,161−170,1982;J.Gene 25,263−269,1983;Gene,150,243−250,1994)を用いてcDNAライブラリーを合成し、それぞれ公知の塩基塩基配列に基づいて作製したプローブDNAを用いて、それぞれのcDNAを単離する方法によって取得することができる。得られたcDNAは、例えば、PCR(Polymerase Chain Reaction)法、NASBN(Nucleic acid sequence based amplification)法、TMA(Transcription−mediated amplification)法およびSDA(Strand Displacement Amplification)法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。また、この発明によって提供されるプライマーセットを用い、ヒト細胞から単離したmRNAを鋳型とするRT−PCR法によっても必要量の各cDNAを得ることができる。
以上のとおりの遺伝子発現量を指標とする予後診断方法は、公知の遺伝子工学および分子生物学的技術に従い、当該分野で特定の遺伝子の発現を検知測定するために知られた手法、例えばin situハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、ドットブロット、RNaseプロテクションアッセイ、RT−PCR、Real−Time PCR(Journal of Molecular Endocrinology,25,169−193(2000)およびそこで引用されている文献)、DNAアレイ解析法(Mark Shena編、”Microarray Biochip Technology”,Eaton Publishing,2000年3月)などによってHRFポリヌクレオチド発現量を検知・測定して実施することができる。こうした技術を利用した遺伝子発現測定系、DLBCL疾患の検出系、DLBCL疾患のリスク検出系、それに利用する試薬、方法、プロセス、解析プログラムなどは、すべてこの発明の技術およびそれに利用するシステムに含まれる。
この出願は、前記の第3発明の方法に使用する材料として、特に以下の発明を提供する。
すなわち、オリゴヌクレオチドプローブは、被験対象の遺伝子とストリンジェント(stringent)な条件下でハイブリダイゼーションすることを特徴とする。
このようなオリゴヌクレオチドプローブは、例えば被験対象遺伝子の精製ポリヌクレオチドまたはそのcDNAを適当な制限酵素で切断することによっても得ることができる。あるいは、Carruthers(1982)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47:411−418;Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105:661;Belousov(1997)Nucleic Acid Res.25:3440−3444;Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19:373−380;Blommers(1994)Biochemistry 33:7886−7896;Narang(1979)Meth.Enzymol.68:90;Brown(1979)Meth.Enzymol.68:109;Beaucage(1981)Tetra.Lett.22:1859;米国特許第4,458,066号に記載されているような周知の化学合成技術により、in vitroにおいて合成することができる。
またストリンジェントな条件とは、前記のポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドプローブとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒(例えば、ホルムアミド)、温度、およびその他公知の条件によって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー(stringency)は増加する。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、NaCl約750mM以下およびクエン酸三ナトリウム約75mM以下、より好ましくはNaCl約500mM以下およびクエン酸三ナトリウム約50mM以下、最も好ましくはNaCl約250mM以下およびクエン酸三ナトリウム約25mM以下である。ストリンジェントな有機溶媒濃度は、ホルムアミド約35%以上、最も好ましくは約50%以上である。ストリンジェントな温度条件は、約30℃以上、より好ましくは約37℃以上、最も好ましくは約42℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤(例えば、SDS)の濃度、およびキャリアーDNAの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。1つの好まし態様としては、750mM NaCl、75mM クエン酸三ナトリウムおよび1% SDSの条件で、30℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。より好ましい態様としては、500mM NaCl、50mM クエン酸三ナトリウム、1% SDS、35%ホルムアミド、100μg/mlの変性サケ精子DNAの条件で、37℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。最も好ましい態様としては、250mM NaCl、25mM クエン酸三ナトリウム、1% SDS、50%ホルムアミド、200μg/mlの変性サケ精子DNAの条件で、42℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。また、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。例えば、洗浄のためのストリンジェントな塩条件は、好ましくはNaCl約30mM以下およびクエン酸三ナトリウム約3mM以下、最も好ましくはNaCl約15mM以下およびクエン酸三ナトリウム約1.5mM以下である。洗浄のためのストリンジェントな温度条件は、約25℃以上、より好ましくは約42℃以上、最も好ましくは約68℃以上である。1つの好ましい態様としては、30mM NaCl、3mM クエン酸三ナトリウムおよび0.1% SDSの条件で、25℃の温度により洗浄を行う。より好ましい態様としては、15mM NaCl、1.5mM クエン酸三ナトリウムおよび0.1% SDSの条件で、42℃の温度により洗浄を行う。最も好ましい態様としては、15mM NaCl、1.5mM クエン酸三ナトリウムおよび0.1% SDSの条件で、68℃の温度により洗浄を行うことである。
またこのオリゴヌクレオチドプローブは当該技術分野で使用されている標識を付加することもできる。標識は、ラジオアイソトープ(RI)法または非RI法によって行うことができるが、非RI法を用いることが好ましい。非RI法としては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍光物質としては、オリゴヌクレオチドの塩基部分と結合できるものを適宜に選択して用いることができるが、シアニン色素(例えば、CyDyeTMシリーズのCy3、Cy5等)、ローダミン6G試薬、N−アセトキシ−N2−アセチルアミノフルオレン(AAF)、AAIF(AAFのヨウ素誘導体)などを使用することができる。また標識法としては、当該分野で知られた方法(例えばランダムプライム法、ニック・トランスレーション法、PCRによるDNAの増幅、ラベリング/テイリング法、in vitro transcription法等)を適宜選択して使用できる。例えば、HRFオリゴヌクレオチドに官能基(例えば、第一級脂肪族アミノ基、SH基など)を導入し、こうした官能基に前記の標識を結合して標識化オリゴヌクレオチドプローブを作成することができる。
この発明のDNAアレイは、前記のオリゴヌクレオチドプローブまたは遺伝子cDNAの全長または一部をターゲットキャプチャープローブとしている。DNAアレイの作製方法としては、固相担体表面で直接オリゴヌクレオチドを合成する方法(オン・チップ法)と、予め調製したオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを固相担体表面に固定する方法とが知られている。この発明のDNAアレイは、このいずれの方法でも作製することができる。オン・チップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術および固相合成技術とを組み合わせて、微少なマトリックスの所定の領域での選択的合成を行う方法(マスキング技術:例えば、Fodor,S.P.A.Science 251:767,1991)等によって行うことができる。一方、予め調製したオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを固相担体表面に固定する場合には、官能基を導入したオリゴヌクレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面にオリゴヌグレオチドを点着し、共有結合させる(例えば、Lamture,J.B.et al.Nucl.Acids Res.22:2121−2125,1994;Guo,Z.et al.Nucl,Acids Res.22:5456−5465,1994)。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、一般的には、表面処理した固相担体にスペーサーやクロスリンカーを介して共有結合させる。ガラス表面にポリアクリルアミドゲルの微小片を整列させ、そこに合成オリゴヌクレオチドを共有結合させる方法も知られている(Yershov,G.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4913,1996)。また、シリカマイクロアレイ上に微小電極のアレイを作製し、電極上にはストレプトアビジンを含むアガロースの浸透層を設けて反応部位とし、この部位をプラスに荷電させることでビオチン化オリゴヌクレオチドを固定し、部位の荷電を制御することで、高速で厳密なハイブリダイゼーションを可能にする方法も知られている(Sosnowski,R.G.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:1119−1123,4997)。また、プローブを固相基体表面に滴下させてスポッティングを行う場合には、ピン方式(例えば米国特許第5,807,5223号)によって行うこともできるが、JP2001−116750A公報やJP 2001−186881A公報に開示されているインクジェット方式を採用することが、均一で一定形状のスポット形成のために好ましい。また、このインクジェット方式では、個々のプローブスポットに含まれるプローブ数を等しくすることができるため、プローブ長の違いによるハイブリダイゼーションの違いを正確に測定することができる。さらに、JP 2001−186880A公報に開示されているような、スポッティング重ね打ちを行うこと、あるいはWO 03/038089A1号パンフレットに開示された組成からなるプローブ溶液(保湿性物質を含む溶液)を使用することも、好ましいスポット形成のために推奨される。
スポッティングの後は、冷却、スポットに対する水分付加(湿度〜80%程度に一定時間保持)、焼成乾燥による固定化処理等を行うことによって、各スポットを固相基体上に固定するし、マイクロアレイを完成することができる。なお、マイクロアレイの固相基体は、通常のマイクロアレイに使用されるガラス(スライドガラス)の他、プラスチック、シリコーン、セラミック等を使用することもできる。
このマイクロアレイを使用して診断する場合には、例えば患者の細胞から単離したmRNAを鋳型として、cDNAを合成し、PCR増幅する。その際に、標識dNTPを取り込ませて標識cDNAとする。この標識cDNAをマクロアレイに接触させ、マイクロアレイのキャプチャープローブ(オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド)にハイブリダイズしたcDNAを検出する。ハイブリダイゼーションは、96穴もしくは384穴プラスチックプレートに分注して標識cDNA水性液を、マイクロアレイ上に点着することによって実施することができる。点着の量は、1〜100nl程度とすることができる。ハイブリダイゼーションは、室温〜70℃の温度範囲で、6〜20時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の標識cDNAを除去する。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが好ましい。
この発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、各遺伝子の公知の塩基塩基配列に基づき設計し、合成・精製の各工程を経て調製することができる。なお、プライマー設計の留意点として、例えば以下を挙げることができる。プライマーのサイズ(塩基数)は、鋳型DNAとの間の特異的なアニーリングを満足させることを考慮し、15−40塩基、望ましくは15−30塩基である。ただし、LA(long accurate)PCRを行う場合には、少なくとも30塩基が効果的である。センス鎖(5’末端側)とアンチセンス鎖(3’末端側)からなる1組あるいは1対(2本)のプライマーが互いにアニールしないよう、両プライマー間の相補的配列を避けると共に、プライマー内のヘアピン構造の形成を防止するため自己相補配列をも避けるようにする。さらに、鋳型DNAとの安定な結合を確保するためGC含量を約50%にし、プライマー内においてGC−richあるいはAT−richが偏在しないようにする。アニーリング温度はTm(melting temperature)に依存するので、特異性の高いPCR産物を得るため、Tm値が55−65℃で互いに近似したプライマーを選定する。また、PCRにおけるプライマー使用の最終濃度が約0.1〜約1μMになるよう調整する等を留意することも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えばOligoTM[National Bioscience Inc.(米国)製]、GENETYX[ソフトウェア開発(株)(日本)製]等を用いることもできる。
以上のとおりの材料を使用することによって、CD5+DLBCL患者の予後を、例えば以下のように判定することができる。
一つの形態は、オリゴヌクレオチドプローブを用いて被験対象遺伝子(例えばC13orf25)の発現量(mRNA量)を検出する方法(ノーザンブロット分析法)である。この診断方法は、少なくとも以下の工程:
(a) 患者の生体試料よりRNAを調製する工程;
(b) 工程(a)で調製されたRNAを電気泳動分離する工程;
(c) 工程(b)で分離されたRNAをオリゴヌクレオチドプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする工程;
(d) 工程(e)でRNAにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブの標識量を遺伝子発現量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程;および
(e) 正常生体試料と比較して有意に高いかまたは低い遺伝子発現量を、DLBCL患者の予後の程度を示す指標として使用する工程、
を含むことを特徴とする。
また別の形態は、DNAアレイを使用する方法である。この方法は、少なくとも以下の工程:
(a) 患者の生体試料よりRNAを調製する工程;
(b) 工程(a)で調製したRNAから、標識cDNAを調製する工程、
(c) 工程(b)で調製した標識cDNAをDNAアレイに接触させる工程;
(d) 工程(c)でDNAアレイのキャプチャープローブにハイブリダイズした標識cDNAの標識量を遺伝子発現量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程;および
(e) 正常生体試料と比較して有意に高いかまたは低い遺伝子発現量を、DLBCL患者予後の程度を示す指標として使用する工程、
を含むことを特徴とする。
さらに別の形態は、プライマーセットを用いて、遺伝子mRNAの発現量を測定する方法(RT−PCT法)である。この方法は、少なくとも以下の工程:
(a) 患者の生体試料よりRNAを調製する工程;
(b) 工程(a)で調製したRNAを鋳型とし、プライマーセットを用いてcDNAを合成する工程;
(c) 工程(b)で合成されたcDNA量を遺伝子発現量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程;および
(d) 正常生体試料と比較して有意に高いかまたは低い遺伝子発現量を、DLBCL患者の予後の程度を示す指標として使用する工程、
を含むことを特徴とする。
またさらに、第3発明の診断方法は、前記のノーザンブロット法、DNAアレイ法、RT−PCR法を適宜に組み合わせて行うこともできる。
なお、以上の各診断方法においては、標識の観察や標識量の測定には、標識の種類に応じて当該分野で知られた方法を適宜選択して使用でき、例えば暗視野顕微鏡、位相差顕微鏡、反射コントラスト顕微鏡、螢光顕微鏡、デジタルイメージング顕微鏡、電子顕微鏡などによる方法も使用することができる。
第3発明の別の態様は、各被験遺伝子の転写産物として、タンパク質を対象とする方法である。タンパク質量を指標とする予後診断方法は、公知の遺伝子工学および分子生物学的技術に従い、当該分野で特定のタンパク質量を検知測定するために知られた手法、例えばin situハイブリダイゼーション、ウェスタンブロッティング、各種の免疫組織学的方法などによって被験タンパク質量を検知・測定して実施することができる。こうした技術を利用したタンパク質量測定系、DLBCLの予後検出系、DLBCLのリスク検出系、それに利用する試薬、方法、プロセス、解析プログラムなどは、すべてこの発明の技術およびそれに利用するシステムに含まれる。
この第3発明における予後診断は、一つの好ましい形態として、被験タンパク質に特異的に結合する抗体を使用する。なおここで言う「抗体」とは、広義の意味で使用されるものであってよく、所望のポリペプチドおよび関連ペプチド断片に対するモノクローナル抗体の単一のものや各種エピトープに対する特異性を持つ抗体組成物であってよく、また1価抗体または多価抗体並びにポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含むものであり、さらに天然型(intact)分子並びにそれらのフラグメントおよび誘導体も表すものであり、F(ab’)2、Fab’およびFabといったフラグメントを包含し、さらに少なくとも二つの抗原またはエピトープ(epitope)結合部位を有するキメラ抗体若しくは雑種抗体、または、例えば、クワドローム(quadrome)、トリオーム(triome)などの二重特異性組換え抗体、種間雑種抗体、抗イディオタイプ抗体、さらには化学的に修飾あるいは加工などされてこれらの誘導体と考えられるもの、公知の細胞融合またはハイブリドーマ技術や抗体工学を適用したり、合成あるいは半合成技術を使用して得られた抗体、抗体生成の観点から公知である従来技術を適用したり、DNA組換え技術を用いて調製される抗体、本明細書で記載し且つ定義する標的抗原物質あるいは標的エピトープに関して中和特性を有したりする抗体または結合特性を有する抗体を包含していてよい。特に好ましい抗体は、天然型のタンパク質(ポリペプチド)を特異的に識別できるものである。
すなわち、抗体は被験タンパク質の部分ペプチドを抗原として調製された抗体であり、好ましくは、一つのタンパク質の異なる部位を認識する抗体のセットして使用される。このような抗体作成のためのペプチドは、例えば、C13orf24遺伝子産物を対象タンパク質とする場合には、SEQ ID NO:4および5のアミノ酸配列からなるペプチドであり、ペプチド合成機を使用して、例えばFmoc−bop法で合成する。HRFペプチドのN末端にはシステインを導入してもよい。合成したペプチドはμBondasphere、C18カラム(Waters)などを用いた高速液体クロマトグラフィーなどにより精製して免疫抗原として使用する。
このような抗体は、例えばポリクローナル抗体の場合には、タンパク質やその一部断片(オリゴペプチド)を免疫原として動物を免役した後、血清から得ることができる。あるいは、タンパク質ポリヌクレオチドの組換えベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、ニワトリなどが用いられる。さらには、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましい場合もある。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われ、例えば村松繁、他編、実験生物学講座14、免疫生物学、丸善株式会社、昭和60年、日本生化学会編、続生化学実験講座5、免疫生化学研究法、東京化学同人、1986年、日本生化学会編、新生化学実験講座12、分子免疫学III、抗原・抗体・補体、東京化学同人、1992年などに記載の方法に準じて行うことができる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物などの腹腔内または皮下に注射することにより行われる。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。免疫化剤を(必要に応じアジバントと共に)一回又はそれ以上の回数哺乳動物に注射することにより免疫化される。代表的には、該免疫化剤および/またはアジバントを哺乳動物に複数回皮下注射あるいは腹腔内注射することによりなされる。免疫化剤は、上記抗原ペプチドあるいはその関連ペプチド断片を含むものが挙げられる。免疫化剤は、免疫処理される哺乳動物において免疫原性であることの知られているタンパク質(例えば上記担体タンパク質類など)とコンジュゲートを形成させて使用してもよい。アジュバントとしては、例えばフロイント完全アジュバント、リビ(Ribi)アジュバント、百日咳ワクチン、BCG、リピッドA、リポソーム、水酸化アルミニウム、シリカなどが挙げられる。
ポリクローナル抗体を含む抗血清は、免疫された動物を所定の期間飼育した後、当該動物から採血した血液から調製することができる。得られた抗血清は、HRFを認識するものであることを確認した後、本発明所定の活性成分として供される。
この発明の抗体としては、哺乳動物由来のモノクローナル抗体として得られたものを使用することもできる。抗原物質に対して作製されるモノクローナル抗体は、培養中の一連のセルラインにより抗体分子の産生を提供することのできる任意の方法を用いて産生される。修飾語「モノクローナル」とは、実質上均質な抗体の集団から得られているというその抗体の性格を示すものであって、何らかの特定の方法によりその抗体が産生される必要があるとみなしてはならない。個々のモノクローナル抗体は、自然に生ずるかもしれない変異体が僅かな量だけ存在しているかもしれないという以外は、同一であるような抗体の集団を含んでいるものである。モノクローナル抗体は、高い特異性を持ち、それは単一の抗原性をもつサイトに対して向けられているものである。異なった抗原決定基(エピトープ)に対して向けられた種々の抗体を典型的には含んでいる通常の(ポリクローナル)抗体調製物と対比すると、それぞれのモノクローナル抗体は当該抗原上の単一の抗原決定基に対して向けられているものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリン類の夾雑がないあるいは少ない点でも優れている。モノクローナル抗体は、ハイブリッド抗体及びリコンビナント抗体を含むものである。それらは、所望の生物活性を示す限り、その由来や免疫グロブリンクラスやサブクラスの種別に関わりなく、可変領域ドメインを定常領域ドメインで置き換えたり、あるいは軽鎖を重鎖で置き換えたり、ある種の鎖を別の種の鎖でもって置き換えたり、あるいはヘテロジーニアスなタンパク質と融合せしめたりして得ることができる(例えば、米国特許第4816567号;Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.79−97,Marcel Dekker,Inc.,New York,1987など)。
また、モノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作製法(「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、1990年;”Monoclonal Antibody”James W.Goding,third edition,Academic Press,1996)に従い作製することができる。
この発明の抗体は必要に応じてそれをより精製された形態のものとして使用される。抗体を精製・単離する手法としては、従来公知の方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラフィー法、高速液体クロマトグララィー法などにより精製して用いることができる。好ましくは、抗血清、モノクローナル抗体を含有する腹水などは、硫安分画した後、DEAE−セファロースの如き、陰イオン交換ゲル及びプロテインAカラムの如きアフィニティ・カラムなどで処理し精製分離処理できる。特に好ましくは抗原又は抗原断片(例えば合成ペプチド、組換え抗原タンパク質あるいはペプチド、抗体が特異的に認識する部位など)を固定化したアフィニティ・クロマトグラフィー、プロテインAを固定化したアフィニティ・クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィーなどが挙げられる。
これら抗体をトリプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理して、場合により還元して得られるFab、Fab’、F(ab’)2といった抗体フラグメントにして使用してもよい。抗体は、既知の任意の検定法、例えば競合的結合検定、直接及び間接サンドイッチ検定、及び免疫沈降検定に使用することができる(Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques,pp.147−158(CRC Press,Inc.,1987)。
抗体を検出可能な原子団にそれぞれコンジュゲートするには、当分野で知られる任意の方法を使用することができ、例えば、David et al.,Biochemistry,13巻,1014−1021頁(1974);Pain et al,J.Immunol.Meth.,40:pp.219−231(1981);及び”Methods in Enzymology”,Vol.184,pp.138−163(1990)により記載の方法が挙げられる。標識物を付与する抗体としては、IgG画分、更にはペプシン消化後還元して得られる特異的結合部Fab’を用いることができる。
抗原あるいは抗体を固相化できる多くの担体が知られており、この発明ではそれらから適宜選んで用いることができる。担体としては、抗原抗体反応などに使用されるものが種々知られており、この発明においても勿論これらの公知のものの中から選んで使用できる。特に好適に使用されるものとしては、例えばガラス、例えばアミノアルキルシリルガラスなどの活性化ガラス、多孔質ガラス、シリカゲル、シリカ−アルミナ、アルミナ、磁化鉄、磁化合金などの無機材料、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリカーボネート、ポリメタクリレート、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、スチレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体など、架橋化アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、デキストラン、アガロース、架橋アガロース、セルロース、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートなどの天然または変成セルロース、架橋デキストラン、ナイロンなどのポリアミド、ポリウレタン、ポリエポキシ樹脂などの有機高分子物質、さらにそれらを乳化重合して得られたもの、シリコンガムなど、細胞、赤血球などで、必要に応じ、シランカップリング剤などで官能性基を導入してあるものが挙げられる。
担体としては、粒子、微粒子、マイクロパーティクル、メンブレン、ろ紙、ビーズ、チューブ、キュベット、試験容器の内壁、例えば試験管、タイタープレート、タイターウェル、マイクロプレート、ガラスセル、合成樹脂製セルなどの合成材料からなるセル、ガラス棒、合成材料からなる棒、末端を太くしたりあるいは細くしたりした棒、末端に丸い突起をつけたりあるいは偏平な突起をつけた棒、薄板状にした棒などの固体物質(物体)の表面などが挙げられる。
これら担体と抗体との結合は、吸着などの物理的な手法、あるいは縮合剤などを用いたり、活性化されたものなどを用いたりする化学的な方法、さらには相互の化学的な結合反応を利用した手法などにより行うことが出来る。
この発明の抗体には、それぞれ標識物質によって標識化された抗体も含まれる。標識としては、酵素、酵素基質、酵素阻害物質、補欠分子類、補酵素、酵素前駆体、アポ酵素、蛍光物質、色素物質、化学ルミネッセンス化合物、発光物質、発色物質、磁気物質、金属粒子、例えば金コロイドなど、非金属元素粒子、例えばセレンコロイドなど、放射性物質などを挙げることができる。好ましい標識物質は、酵素、放射性同位体または蛍光色素をふくむ化学物質を使用することができる。酵素は、turnover numberが大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常のEIAに用いられる酵素を使用できる。酵素としては、脱水素酵素、還元酵素、酸化酵素などの酸化還元酵素、例えばアミノ基、カルボキシル基、メチル基、アシル基、リン酸基などを転移するのを触媒する転移酵素、例えばエステル結合、グリコシド結合、エーテル結合、ペプチド結合などを加水分解する加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどを挙げることができる。酵素は複数の酵素を複合的に用いて検知に利用することもできる。例えば酵素的サイクリングを利用することもできる。酵素標識などは、ビオチン標識体と酵素標識アビジン(ストレプトアビジン)に置き換えることも可能である。このように、ビオチン−アビジン系を使用したり、抗HRF抗体に対する抗体などの二次的な抗体を使用するなど、当該分野で公知の感度増強法を適宜採用することができる。標識は、複数の異なった種類の標識を使用することもできる。こうした場合、複数の測定を連続的に、あるいは非連続的に、そして同時にあるいは別々に行うことを可能にすることもできる。
代表的な酵素標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ、大腸菌β−D−ガラクトシダーゼなどのガラクトシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース−6−リン酸化脱水素酵素、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、カタラーゼ、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、大腸菌アルカリホスファターゼなどのアルカリフォスファターゼなどが挙げられる。
これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができ、4−メチルウンベリフェリルフォスフェートなどのウンベリフェロン誘導体、ニトロフェニルホスフェートなどのリン酸化フェノール誘導体などが挙げられ、例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。本発明においては、信号の形成に4−ヒドロキシフェニル酢酸、o−フェニレンジアミン(OPD)、テトラメチルベンジジン(TMB)、5−アミノサリチル酸、3,3−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド(DAB)、3−アミノ−9−エチルカルバゾール(AEC)、チラミン、ルミノール、ルシゲニンルシフェリン及びその誘導体、Pholad luciferinなどと西洋ワサビ・ペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ、ルミジェンPPD、(4−メチル)ウンベリフェリル−リン酸、p−ニトロフェノール−リン酸、フェノール−リン酸、ブロモクロロインドリルリン酸(BCIP)、AMPAKTM(DAKO)、AmpliQTM(DAKO)などとアルカリフォスファターゼ、4−メチルウンベリフェリル−β−D−ガラクトシドといったウンベリフェリルガラクトシド、o−ニトロフェノール−β−D−ガラクトシドといったニトロフェニルガラクトシドなどとβ−D−ガラクトシダーゼ、グルコース−6−リン酸・デヒドロゲナーゼ、ABTSなどとグルコースオキシダーゼなどの酵素試薬の組合わせも利用でき、ヒドロキノン、ヒドロキシベンゾキノン、ヒドロキシアントラキノンなどのキノール化合物、リポ酸、グルタチオンなどのチオール化合物、フェノール誘導体、フェロセン誘導体などを酵素などの働きで形成しうるものが使用できる。
放射性同位体としては、32P、125I、14C、35S、3H等の通常のRIAで用いられているものを使用することができる。蛍光物質あるいは化学ルミネッセンス化合物としては、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、例えばローダミンBイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(RITC)、テトラメチルローダミンイソチオシアネートアイソマーR(TRITC)などのローダミン誘導体、7−アミノ−4−クマリン−3−酢酸、ダンシルクロリド、ダンシルフルオリド、フルオレスカミン、フィコビリプロテイン、アクリジニウム塩、ルミフェリン、ルシフェラーゼ、エクォリンなどのルミノール、イミダゾール、シュウ酸エステル、希土類キレート化合物、クマリン誘導体などが挙げられる。蛍光色素としては、通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。発色、螢光などを含めた生成する信号などを検知するには、視覚によることもできるが、公知の装置を使用することもでき、例えば螢光光度計、プレートリーダーなども使用できる。また、放射性同位体(アイソトープ)などの出す信号を検知するには、公知の装置を使用することもでき、例えばガンマーカウンター、シンチレーションなども使用することができる。
抗体を標識するには、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジルジスルフィド基とチオール基の反応、アミノ基とアルデヒド基の反応などを利用して行うことができ、公知の方法あるいは当該分野の当業者が容易になしうる方法、さらにはそれらを修飾した方法の中から適宜選択して適用できる。免疫原性複合体作製に使用されることのできる縮合剤、担体との結合に使用されることのできる縮合剤などを用いることができる。縮合剤としては、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソチオシアネート、N,N’−ポリメチレンビスヨードアセトアミド、N,N’−エチレンビスマレイミド、エチレングリコールビススクシニミジルスクシネート、ビスジアゾベンジジン、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド、スクシンイミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、N−スクシンイミジル 4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(SMCC)、N−スルホスクシンイミジル 4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート、N−スクシンイミジル(4−ヨードアセチル)アミノベンゾエート、N−スクシンイミジル 4−(1−マレイミドフェニル)ブチレート、N−(ε−マレイミドカプロイルオキシ)コハク酸イミド(EMCS)、イミノチオラン、S−アセチルメルカプトコハク酸無水物、メチル−3−(4’−ジチオピリジル)プロピオンイミデート、メチル−4−メルカプトブチリルイミデート、メチル−3−メルカプトプロピオンイミデート、N−スクシンイミジル−S−アセチルメルカプトアセテートなどが挙げられる。
このような抗体を用いた診断方法における一つの態様は、抗体と被験タンパク質との結合を液相系において検出する方法である。例えば、抗体を標識化した標識化抗体と生体試料とを接触させて標識化抗体とタンパク質を結合させ、この結合体を分離する。分離は、タンパク質+標識化抗体の結合体を公知の分離手段(クロマト法、固相法等)によって分離する方法等によって行うことができる。また公知のウエスタンブロット法に準じた方法を採用することもできる。標識シグナルの測定は、標識として酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射生同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。
液相系での診断の別の方法は、抗体(一次抗体)と生体試料とを接触させて一次抗体と被験タンパク質を結合させ、この結合体に標識化した二次抗体を結合させ、この三者の結合体における標識シグナルを検出する。あるいは、さらにシグナルを増強させるためには、非標識の二次抗体を先ず抗体+抗原ペプチド結合体に結合させ、この二次抗体に標識物質を結合させるようにしてもよい。このような二次抗体への標識物質の結合は、例えば二次抗体をビオチン化し、標識物質をアビジン化しておくことによって行うことができる。あるいは、二次抗体の一部領域(例えば、Fc領域)を認識する抗体(三次抗体)を標識し、この三次抗体を二次抗体に結合させるようにしてもよい。なお、一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。液相からの結合体の分離やシグナルの検出は前記と同様とすることができる。
抗体を用いた別の診断法は、抗体とタンパク質との結合を固相系において試験する方法である。この固相系における方法は、極微量の被験タンパク質の検出と操作の簡便化のため好ましい方法である。すなわちこの固相系の方法は、抗体を樹脂プレートまたはメンブレン等に固定化し、この固定化抗体に被験タンパク質を結合させ、非結合タンパク質を洗浄除去した後、プレート上に残った抗体+タンパク質結合体に標識化した二次抗体を結合させて、この標識化抗体のシグナルを検出する方法である。この方法は、いわゆる「サンドイッチ法」と呼ばれる方法であり、マーカーとして酵素を用いる場合には、「ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)」として広く用いられている方法である。2週類の抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、いずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。
この発明での予後診断はまた、免疫染色、例えば組織あるいは細胞染色、免疫電子顕微鏡、イムノアッセイ、例えば競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで行うことができ、放射免疫測定法(RIA)、蛍光免疫測定法(FIA)、ルミネッセント免疫測定法(LIA)、酵素免疫測定法(EIA)、ELISAなどを用いることができ、B−F分離を行ってもよいし、あるいは行わないでその測定を行うことができる。好ましくはRIA、EIA、FIA、LIAであり、さらにサンドイッチ型アッセイが挙げられる。サンドイッチ型アッセイには、同時サンドイッチ型アッセイ、フォワード(forward)サンドイッチ型アッセイあるいは逆サンドイッチ型アッセイなどが包含されてよい。
この出願の発明におけるタンパク質量の測定系としては、例えば組織に対しては免疫染色、免疫電子顕微鏡などの蛋白測定系、組織抽出物、血液、体液等に対してはEIA、RIA、FIA、LIA、ウエスタンブロッティングなどの蛋白測定系を実施することもできる。
EIAの測定系において、例えば競合法では、抗体を固相化抗体として使用し、標識抗原および非標識抗原(抗原としては、被験タンパク質あるいはそのフラグメントペプチドなどが挙げられる)を使用し、また非競合法で、例えばサンドイッチ法では、固相化抗体や標識抗体を利用できる他、抗体を直接標識したり、固相化せずに、抗体に対する抗体を標識したり、固相化して行うこともできる。感度増幅法としては、例えば、非酵素標識一次抗体との組み合わせでは、高分子ポリマーと酵素と一次抗体を利用するもの(Envision試薬を応用したもの;Enhanced polymer one−step staining(EPOS))が挙げられ、非酵素標識二次抗体との組合せでは、例えばPAP(peroxidase−antiperoxidase)法などの酵素と抗酵素抗体複合体の組合せ、SABC(avidin−biotinylated peroxidase complex)法などのビオチン標識二次抗体とビオチン標識酵素−アビジン複合体の組合せ、ABC(streptavidin−biotin complex)法、LSAB(labeled streptavidin−biotin)法などのビオチン標識二次抗体とビオチン標識酵素−ストレプトアビジン複合体の組合せ、CSA(catalyzed signal amplification)法などのSABCとビオチン標識タイラマイドと酵素標識ストレプトアビジンの組合せ、高分子ポリマーで二次抗体と酵素を標識してあるものなどが挙げられる。
これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、入江 寛編,「ラジオイムノアッセイ」,講談社,昭和49年発行;入江 寛編,「続ラジオイムノアッセイ」,講談社,昭和54年発行;石川栄治ら編,「酵素免疫測定法」,医学書院,昭和53年発行;石川栄治ら編,「酵素免疫測定法」(第2版),医学書院,昭和57年発行;石川栄治ら編,「酵素免疫測定法」(第3版),医学書院,昭和62年発行;H.V.Vunakis et al.(ed.),”Methods in Enzymology”,Vol.70(Immunochemical Techniques,Part A),Academic Press,New York(1980);J.J.Langone et al.(ed.),”Methods in Enzymology”,Vol.73(Immunochemical Techniques,Part B),Academic Press,New York(1981);J.J.Langone et al.(ed.),”Methods in Enzymology”,Vol.74(Immunochemical Techniques,Part C),Academic Press,New York(1981);J.J.Langone et al.(ed.),”Methods in Enzymology”,Vol.84(Immunochemical Techniques,Part D:Selected Immunoassays),Academic Press,New York(1982);J.J.Langone et al.(ed.),”Methods in Enzymology”,Vol.92(Immunochemical Techniques,Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods),Academic Press,New York(1983);J.J.Langone et al.(ed.),”Methods in Enzymology”,Vol.121(Immunochemical Techniques,Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies),Academic Press,New York(1986);J.J.Langone et al.(ed.),”Methods in Enzymology”,Vol.178(Antibodies,Antigens,and Molecular Mimicry),Academic Press,New York(1989);M.Wilchek et al.(ed.),“Methods in Enzymology”,Vol.184(Avidin−Biotin Technology),Academic Press,New York(1990);J.J.Langone et al.(ed.),”Methods in Enzymology”,Vol.203(Molecular Design and Modeling:Concepts and Applications,Part B:Anibodies and Antigens,Nucleic Acids,Polysaccharides,and Drugs),Academic Press,New York(1991)等の記載、あるいはそこで引用された文献中にある記載〕。
なお、この出願によって提供される予後診断方法は、タンパク質量を測定する方法と、遺伝子の発現量を測定する方法(例えばノーザンブロッティング法、RT−PCR法、DNAアレイ法等)とを適宜に組み合わせて行うこともできる。
以下、実施例を示してこの出願の発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例によって限定されるものではない。
CD5+ならびにCD5−のDLBCL症例におけるゲノム異常をDNAアレイCGHによって分析した。
1.材料と方法
1−1.患者
26例のde novo CD5+ DLBCL症例ならびに44例のCD5− DLBCLのDNA試料を分析した。これらの試料は愛知がんセンターならびに協力施設において、施設の審査会による承認を得て、患者よりインフォームドコンセントを得た状態で入手した。全ての患者は既発表論文で報告されている(Yamaguchi,M.et al.Blood,99:815−821,2002;Harada,S.et al.Leukemia,13:1441−1447,1999;Karnan,S.et al.Genes Chromosomes Cancer,39:77−81,2004)。CD5+ならびにCD5−症例の年齢中央値は、それぞれ61歳と56歳であった。CD5+症例のうち68%が女性であり、80%が進行期にあり(III−IV)、72%にLDH上昇が見られ、24%が一般状態不良、28%がリンパ節外部位の併発を有していた。CD5−症例の患者では41%が女性、52%が進行期にあり(III−IV)、45%にLDH上昇が見られ、10%が一般状態不良、38%がリンパ節外部位の併発を有していた。全試料とも、治療開始以前の診断時に取得した。
1−2.DNA試料
DNA抽出は、合計70例のDLBCL症例、すなわち26例のCD5+ DLBCL症例ならびに44例のCD5− DLBCL症例より得たリンパ腫標本を元に、標準的なフェノール・クロロホルム法を用いて実施した。正常DNAの調製は健常な男性ドナーの末梢血リンパ球を元に行った。
1−3.悪性リンパ細胞株
この実験で用いた細胞株は、Karpas1718(有毛リンパ球を有する脾臓リンパ腫:SLVL、Dr.A.Karpass,Cambridge University,UKより提供)、OCI−LY13.2(DLBCL、Dr.R.Dalla−Favera,Columbia Universityより提供)(Tweeddale,M.E.et al.Blood,69:1307−1314,1987)、REC1(マントル細胞リンパ腫細胞株、Dr.M.Dyer,Leicester University,UKより提供)(Martinez−Climent,J.A.et al.Blood,98:3479−3482,2001)であった。細胞株は37℃、5% CO2−95%空気中にて、10%胎児ウシ血清を添加したRPMI1640培地において維持した。
1−4.コピー数の線形性評価
複製数変化に伴うアレイCGHシグナルの線形性を試すために、以下の細胞株のうち一つに対して、正常男性DNAのアレイハイブリダイゼーションを実施した。GM04626;47XXX、GM01415D;48XXXX、GM05009C;49XXXXX(Kallioniemi,A.et al.Science(Wash.DC),258:818−821,1992;Pinkel,D.et al.Nat.Genet.,23:41−46,1998)。これらの細胞株はNIGMS Human Genetics Cell Repository Coriell Institute for Medical Researchより入手し、37℃、5% CO2−95%空気中にて、2x必須アミノ酸類、ビタミン類、ならびに20%胎児ウシ血清を添加したMEM Eagle−Earle培地において維持した。
1−5.アレイCGHのためのBAC/PACクローンの選別
アレイは2,088種類のBAC/PACクローンにより構成されており、概して1.5−Mbの解像度で全ヒトゲノムをカバーしている。BACクローン(BACs)はRP11ならびにRP13ライブラリより得ており、PACクローン(PACs)はRP1、RP3、RP4、RP5ライブラリより得ている。使用するBAC/PACクローンの選別は、NIBC(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)ならびにEnsembl Genome Data Resouces(http://www.ensembl.org/)より得た情報を元に実施した。これらのクローンの取得元は、Children’s Hospital(Oakland Research Institute,Oakland,CA;Http://bacpac.chori.org/)にあるBACPAC Resource Centerであった。クローンのシーケンス分析は1番〜22番染色体ならびにX染色体を元に行った。それぞれの染色体内部でのクローンのシーケンス分析は)Ensembl Genome Data Resources of Sanger Center Instituteの2004年1月版を元に実施した。アレイCGHに使用する全てのクローンは、FISH分析により染色体上の位置を確認した。
1−6.スライド上スポッティングのためのDNA増幅
10ngのBAC(またはPAC)DNAをテンプレートに、変性オリゴヌクレオチドをプライマーに用いたPCR(DOP−PCR)(Hakan,T.et al.Genomics,13:718−725,1992)を5’−アミン修正DOPプライマ:
を用いて行い、TaKaRa PCR Thermal Cycler MP(TaKaRa、Tokyo、Japan)によりEx Taqポリメラーゼ(TaKaRa)を用いて増幅した。3分間の94℃変性段階に続き、94℃で30秒間、37−72℃の直線傾斜で10分間、72℃で1分間の過程を25回繰り返し、最後に72℃で7分間の伸長を行った。
1−7.DNAスポッティングとガラススライドの品質管理
DOP−PCR産物をエタノール沈殿させ、蒸留水中に溶解し、次に等量のDNAスポッティング液DSP0050(Matsunami、Osaka、Japan)を添加した(〜1μgのDNA/μl)。その結果得られたDNA試料をインクジェット方式(NGK、Nagoya、Japan)による自動装置で、CodeLinkTM活性化スライド(Amersham Biosciences、Piscataway、NJ)上に二重反復的にスポットした。試験には、2,088種類のクローンが完全かつ均一に二重反復的スポットされていることが確認されたガラススライドのみを使用した。
1−8.アレイハイブリダイゼーション
アレイ製造ならびにハイブリダイゼーションは、Pinkel et al(Nature(Lond.),20:207−211,1998)ならびにHodggson et al.(Nat Genet.,29:459−464,2001)の方法に従って実施した。詳細なプロトコルはカリフォルニア大学(San Francisco、CA)のJoe Gray博士から提供頂いた。試験対象(腫瘍)ならびに対照(正常)DNAの1μgをDpnIIで消化し、それぞれcyanine3−dUTPならびにcyanine5−dUTP(Amersham Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ)を用いたBio prime DNA標識システム(Invitrogen Life Technologies,Inc.、Tokyo、Japan)により標識した。未取り込み蛍光ヌクレオチドはSephadex G−50スピンカラム(Amersham Biosciences)を用いて除去した。試験対象DNAならびに対照DNAは、50μgのヒトCot−1 DNA(Invitrogen Life Technologiies)と混合し、沈殿させ、45μlのハイブリダイゼーション混合液中で再懸濁したが、この混合液の成分は50%ホルムアミド、10%硫酸デキストラン、2x SSC、4%SDS、10μg/μl酵母tRNA(Invitrogen Life Technologies)であった。ハイブリダイゼーション溶液は73℃まで加熱して5分間置くことでDNA変性を行い、続いて37℃で45分間インキュベートすることで反復シーケンスをブロックした。DNAをスポットしたガラススライドは、70%ホルムアミド/2x SSC中で73℃で4分間にわたり変性し、続いて冷却した70%、85%、100%エタノール中でそれぞれ5分間脱水し、風乾した。ハイブリダイゼーションは200μlの50%ホルムアミド/2x SSCを用いて、緩やかに振動するテーブル上の容器中で66時間にわたり実施し、続いてハイブリダイゼーション後洗浄を、50%ホルムアミド/2x SSC中で50℃にて15分間、2x SSC/0.1%SDS中で50℃にて30分間、そしてPN緩衝液(0.1M NaH2PO4、pH 8を得るための0.1M Na2HPO4、0.1%NP−40)中で室温にて15分間にわたり実施した。次にガラススライドを室温にて2x SSC中に浸し、さいごに室温にてそれぞれ2分ずつ70%、85%、100%エタノール中で脱水し、風乾した。スライドのスキャニングは、Agilent Micro Array Scanner(Agilent Technologies,Palo Alto,CA)を用いて実施し、得られたアレイ像の分析を、Genepix Pro 4.1(Axon Instruments,Inc.,Foster City,CA)を用いて行った。DNAスポットを自動的にセグメント化し、局所バックグラウンドを減算し、シグナル強度を得た。次に2種類の色素のシグナル強度比(Cy3強度/Cy5強度)を各スポット毎に計算し、染色体位置の順にExcelシート上でlog2比に変換してから正規化した。
1−9.データセットの正規化
各試料の「log2比」に対する正規化は、全てのクローンについて、log2比率の中間値を計算することにより実施した。この「log2比」は、各クローンについて二重化されたスポットの平均log2比を示す。続いて、log2比が「中央値+SDxA」以上であるか、「中央値−SDxA」未満であるクローンを選別した。「A」は各実験における全クローンのlog2比プロットを参照することにより、正常領域として視覚的に決定した。「A」の範囲はほぼ0.5から1.0であった。次に選択したクローンの平均log2比率を計算し、これを「X」として定義した。最終的に、各クローンのlog2比から対応する「X」値を減算して「Y」値を得た。この試験ではそれぞれのlog2比の分析を「Y」値をもとに行った。クローンを視覚的に選択し、各実験毎にSDを計算し、SDが0.15を超えないことを確認した。
1−10.FISH分析
正常な男性リンパ球と細胞株から、分裂中期の染色体を調製した。ニックトランスレーションキット(Vysis Inc.、Downers Grove、IL)によりSpectrum Green−dUTPまたはSpectrum Red−dUTP(Vysis)を用いて、約200ngのBAC/PACsを標識した。標識化DNAと10μgのヒトCot−1 DNAをエタノール中で共沈殿させ、3μlの蒸留水と7μlのハイブリダイゼーション緩衝液(50%ホルムアミド、20%デキストラン硫酸、2x SSC)に溶解した。細胞株の分裂間期染色体スライドの調製は、標準法に従って行った。ハイブリダイゼーションは、70%ホルムアミド/2x SSC中73℃で変性させたスライド上において、37℃で12−24時間にわたり実施した。次にこのスライドを、0.4x SSC/0.3%NP−40中75℃で、また2x SSC/0.1%NP−40中室温で洗浄した。スライドの乾燥後、DAPI(4,6−diamino−2−phenylindole)−II(Vysis)を用いて染色体を逆染色した。染色体の同定は、DAPI−染色の縞模様を元に行った。デジタルイメージ分析は BX−60−RF顕微鏡(Olympus)ならびに IP Lab Scientific Imaging Software(Scanalytics Inc.、Fairfax、VA)を用いて実施した。
1−11.統計分析
ゲノム領域を分析して2種類の患者グループ間における統計的差違を求めるため、次のようにデータセットを構築した。ゲノム変化は、コピー数増加について+0.2、コピー数減少について−0.2のlog2比の閾値により定義した。各症例について、増加したクローン(log2比>+0.2)は「1」、増加のないクローン(log2比<0.2)は「0」としてエクセルテンプレートに入力した。同様に減少したクローンは「1」、減少のないクローンは「0」として各症例ごとに別のエクセルテンプレートに入力した。遺伝子増加または減少を示す症例は、CD5+グループまたはCD5−グループの各単一クローン毎にExcelを用いて計数した(合計1,966クローン)。その後以下の目的のためにデータ分析を行った。1)CD5+とCD5−グループ間における、各単一クローンの増加または減少頻度の比較(増加・減少それぞれ1,966回試験、合計3,932回試験)。2)単一クローンの増加または減少を示す症例と、それぞれの増加または減少を示さない症例の間における、総生存の比較(CD5発現の有無状態につき増加と減少それぞれ1,966回試験、最大合計7,864回試験)。前者の分析にはフィッシャーの直接確率検定を適用し、後者の分析には2群の間の生存曲線を比較するログランク検定を適用した。各分析毎に候補クローンをスクリーニングするためのP値はP<0.05であった。候補クローンが同定された場合には、以下のクローンを有するクローン集団を評価した。n番目のクローンとそれに続くk個のクローン(K≧0)が候補クローンであることが判明した場合には、連続した関連を求めるためのp値は次式(1)にて計算される:
この時、各クローンはゲノム全体にわたり独立していると仮定する。ここでは複数回の試験を適用したため(最大11,796回試験)、従来のボンフェローニ法を適用してアルファエラーを定義し、最終結論を求めた。従ってここでは、p値が0.05/12,000(=4.2×10−6)未満である場合を統計的有意であると定義した(Wright,SP.Biometrics,48:1005−1013,1992)。統計分析の実施は、全て統計パッケージSTATA ver.8(College Station,TX)を用いて行った。
2.結果
2−1.CGHアレイの品質
CGHアレイを評価するため、ここでは最初に正常な男性DNA同士のハイブリダイゼーションを6例の異なる場合について実施した。クローンあたりSEの平均は、6例の正常試料中の平均クローン変動性を示しており、この対照群では3%になった。スポットされた42例のクローンは、全クローンの平均蛍光強度の10%未満を示すことが判明した。62例のクローンは、参照比率の偏差が1.0からとなる最も極端な平均試験になり、18例のクローンはこの正常対照群において最大SDを有していた。そのため122例のクローンを以後の分析から外した。各スポット(二重化した1,966クローン)の蛍光のlog2比は+0.2から−0.2の範囲内であった。そのためlog2比率がこの範囲を超える場合に有意と考えた。コピー数とlog2比率の間の線形性は、X染色体のコピー数が異なるヒト繊維芽細胞株を用いて確認した(実施例2参照)。次に複数の悪性リンパ腫細胞株に対してアレイCGHを実施し、この系が増加と減少を検出出来るかどうか確認した。図1AにはREC1細胞株の全ゲノムプロファイルを示すが、この株は13q31.3(BAC、RP11−430K10)の増加と4q32.1(BAC、RP11−154F14)の減少等の、複数の遺伝子座におけるゲノム異常を有することが判明している。アレイCGHデータに従うように、対応するBACを用いたFISH分析によっても、これらの増加と減少が引き続き検出された(図1B)。図2に示すのは、Karpass1718細胞株の第16染色体(図2A)ならびに第8p染色体(図2C)に対する、個々のアレイCGHプロファイルである。このプロファイルに示されるのは、単一ピークの16p13.13の増加(BAC、RP11−24M12)(図2A)ならびにBAC、RP11−353K12とBAC、RP11−369E15の間の8p21区切り点であった。これらの結果は同様に、その後で行ったFISH分析により確認された(図2Bと2D)。これらの知見から、アレイCGHの精度と高い分解能が示された。
2−2.DLBCL症例に関するゲノムプロファイルとデータ分析
次にアレイCGH分析を実施し、CD5+ならびにCD5−DLBCL症例の間のゲノム変化を比較した。X染色体上の全クローン(57クローン)は性別が不一致であるため個別に分析した。合計70例のDLBCL症例を登録した。4例(CD5+DLBCL症例で1例、CD5−の症例で3例)にはなんらゲノム異常は見られなかった。このため、CD5+DLBCLである25症例とCD5−DLBCLである41症例をデータ分析に供した。CD5+ならびにCD5−DLBCLのゲノム増加と減少の平均サイズを表1に示す。全ゲノム中におけるこれらの有効範囲率も表中にまとめてある。平均して、CD5+グループはCD5−グループより大きなコピー数増加分画を含む一方、前者は後者より小さなコピー数減少分画を含んでいた。
図3に示すのは、代表的な2種類のCD5+(図3Aと3B)試料と、1種類のCD5−(図3C)試料の全ゲノムプロファイルである。コピー数の変化は高解像度でゲノム全体にわたり容易に検出できた。低レベル増幅を示す領域(log2比率+2.0〜+1.0として定義)、ならびにヘテロ接合性欠失が示唆される領域(log2比率−1.0〜−0.2として定義)も同様に識別可能であった。
この発明では、「増加または消失の共通領域」を次のように定義した。i)少なくとも3種類の連続するクローンが連続して配列しており(解像度3〜5Mb以上)、それらのクローンが20%以上の症例で増加または減少を示す場合、あるいは、ii)3種類未満であるならば、クローンが大きなコピー数増加を示すか(log2比率>+1.0で定義)、ホモ接合性の減少を示す場合(log2比率<−1.0で定義)(2p16.1の増加、3p14の減少、9p21の減少)。「共通領域」内部において、「最少共通領域」を最大症例数により共有される領域として定義した。「最少共通領域」内に最も頻出するBAC/PACクローン、及びそれに含まれる代表的な遺伝子(悪性リンパ腫の公知の候補腫瘍遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子)(Monni,O.et al.Blood,87:5269−5278,1996;Rao,P.H.et al.Blood,92:234−240,1998;Wright,G.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100:9991−9996.2003)は表2及び3に記載してある。
CD5+グループ(25例)の共通増加領域は、1q21.2−q32.3、1q42.2−q42.3、2p16.1、3、5p13.2−p13.1、6p25.3−p22.3、7p22.2−q31.1、8q24.13−q24.22、11q22.1−q25、12、13q21.1−q34、16p13.3−q21、17q23.2−q24.3、18、19p13.13−q13.43、Xであり、CD5+グループの共通減少領域は1p36.32−p36.23、1p36.21−p36.13、1p35.1−p34.3、1q43−q44、3p14.2、6q14.1−q27、8p23.3−p21.2、9p21、15q13.1−q14、17p13.3−p11.2であった。
CD5−グループ(41例)の共通増加領域は、s1q21.1−q31.1、1q32.1−q32.2、3p25.2−q29、5q13.2−p13.1、5p14.1−p13.2、6p25.3−p12.3、7、8q24.13−q24.21、9q24.2−p13.2、11q23.2−q24.2、12q13.2−q21.2、16p13.3、18、Xであり、CD5−グループの共通減少領域は1p36.32−p36.23、3p14.2、6q12−q25.2、6q27、9p21、15q15.2−q21.1、17p13.3−p11.2であった。
CD5+とCD5−の両グループのうち20%以上の事例で観察される増加領域は、1q21.1−q31.1、1q32.1−q32.2、3p25.2−q29、5p13.2−p13.1、6p25.3−p21.1、7p22.2−q31.1、8q24.13−q24.21、11q23.2−q24.3、12q13.2−q21.2、16p13.3、18、Xであり、CD5+とCD5−の両グループのうち20%以上の事例で観察される減少領域は、1p36.32−p36.31、3p14.2、6q14.1−q25.2、6q27、9p21、17p13.3−p11.2であった。
以上のCD5+またはCD5−グループのいずれかの共通領域の中で、2p16.1(REL遺伝子座、BAC、RP11−17D23)の増加、3p14.2(FHIT遺伝子座)の減少、9p21.1(p16INK4a遺伝子座)の減少を示す症例の一部には、単一クローンまたは連続する2クローンによるゲノム異常が見られた。2p16.1増加をみた13症例のうち3例にこのような増加が見られた。DLBCL状態で2p16.1増加をみた3症例中2例には、連続するわずか2個のクローン(BACs、RP11−17D23ならびにRP11−511111)に著しく高レベルの増加(log2比>+1.5)がみられた。DLBCL状態での3p14.2の減少はこれまでに報告されていない。
全66例中18例(28%)に3p14.2の減少がみられた。3p14を含むクローンのうち、BAC、RP11−48E21(FHIT座)が単独減少していたのは18例中13例であり(CD5+DLBCLの7例とCD5−の11例)、このとき周辺のBACsで明確なコピー数減少を示すものはなかった(図4A)。単独減少をみた13例のうち、13例中2例がホモ接合性減少であると思われた(log2比<−1.0)。従ってこのFHIT座は最少共通領域であると考えられ、またこれは進行性悪性リンパ腫患者より確立したOCI−LY13.2細胞株においても欠失していた(Karnan,S.et al.Genes Chromosomes Cancer,39:77−81,2004)。FISH分析はこのアレイ CGHデータに一致していた(図4BとC)。同様にBACクローンRP11−149I2(p16INK4a座を含む)は、合計66例のDLBCL症例のうち9p21の減少を示す32例の9例にて単独減少しており(9例中2例がホモ接合性減少と思われる)、従ってこれが最少共通領域であると考えられる。
最後に、男性患者のみについてX染色体を分析した(CD5+グループ:10例、CD5−グループ:25例)。CD5+グループの10例中2例と、CD5−グループの15例中3例には、X染色体全域にわたり軽度のコピー数増加がみられ(+0.2<log2比率<+1.0)、重度の増加はみられなかった。CD5+グループの2例について、Xq21に軽度の減少(−1<log2比率<−0.2)がみられた。
2−3.CD5+DLBCLのゲノムコピー数変化特性
次に、CD5+とCD5−グループ間のクローン増加と減少の頻度を比較した。候補クローンについて単一クローンベースのスクリーニングを行ったところ、48種類のクローンが、CD5−グループと比較してCD5+グループのほうにおいて高頻度(p<0.05)で増加または減少していることが判明した。これら48種類のクローンでは、10p15.3−p14では6種類中6種類(6/6)のクローンが、12p12では3種類中3種類(3/3)のクローンが、16p12では5種類中3種類(3/5)のクローンが、19p13.33−q13.4では9種類中9種類(9/9)のクローンが連続的に配列していた(Sanger Center InstituteのEnsembl Genome Data Resources、2004年1月版の全ゲノムマッピング位置による)。16p12における5例中2例(2/5)のクローンと、残る48例中25例のクローンは単一でP<0.05を示し、すなわち隣接するクローンにCD5+とCD5−グループ間での差違がみられなかった。
CD5−グループと比べてCD5+グループにおいて、20種類のクローンが比較的高頻度で有意に減少していることが判明した。これらの中で、1q43では9例中3例(3/9)のクローンが、1q43−q44では9例中6例(6/9)のクローンが、8p23では7例中2例(2/7)のクローンが、8p23では7例中5例(5/7)のクローンが連続的であり、残る20例中4例のクローンは単一でP<0.05を示し、すなわち隣接するクローンにCD5+とCD5−グループ間での差違がみられなかった。
多重比較を行ったため、上記のように単一クローンベースでスクリーニングしたクローンについて、その後多重比較修正を実施し、CD5+とCD5−グループ間で頻度差が存在するという意味で統計的に有意であるクローンを判別した。n番目のクローンとそれに続くk個のクローン(k≧0)が候補クローンであることがスクリーニングにより判明した場合は、連続した関連を求めるためのp値は前記1−11の式(1)にて計算される。この時、各クローンは独立していると仮定する。ここでは複数回の試験を適用したため(最大11,796回試験)、従来のボンフェローニ法を適用してアルファエラーを定義し、最終結論を求めた。従ってここでは、p値が0.05/12,000(=4.2×10−6)未満である場合を統計的有意であると定義した。CD5+DLBCLの10p15.3−p14増加、19p13.33−q13.43増加、1q43−q44減少、8p23.2−p23.1減少の式(1)の値は<4.2x10−6であったため、これらの領域はCD5+グループに特徴的であると考えられる。しかし CD5+DLBCLにおける他のクローンの式(1)の値はこの基準では有意性を示さなかった。
10種類の増加クローンと6種類の減少クローンについて、CD5+とCD5−グループ間の症例頻度に差違が見られたが(p<0.05)、複数比較修正を実施した後には、これらのクローンに有意性はみられなかった。
従って10p15.3−p14ならびに19q13.33−q13.43の増加と、1q43−q44ならびに8p23.2−p23.1の減少はCD5+DLBCLに特徴的である。またCD5−DLBCLに特徴的である増加や減少は無かった。CD5+DLBCLとその中に含まれるBACクローンに特徴的な領域を、表4(増加)ならびに表5(減少)中にリストアップしている。CD5+DLBCL症例の第10染色体、第19染色体、第1q染色体、第8染色体に対する個別ゲノムプロファイリングの代表例3種類を、それぞれ図5A、図5B、図6、図6Bに示す。
2−4.DLBCL症例の予後に影響するゲノムコピー数変化
次に、特定ゲノム増加または減少の存在の有無に従って症例を層別化し、カプラン−メイヤー法とログランク検定を用いてこれらの症例の生存確率を分析した。CD5+またはCD5−グループ中でコピー数変化(増加/減少)の異常を示すクローンを、全てスクリーニング対象とした。続いて、複数比較修正を実施し、スクリーニングログランク検定によりp<0.05を示すクローンを調べた。
CD5+グループでは、252種類のクローン(増加が98種類、減少が154種類)が単一クローンベースのログランク検定により、予後に関してp<0.05であることが示された。これら252種類のクローンのうち、18種類のクローンが1p36.21−p34.3に連続配列しており、複数比較修正によって生存について有害な影響を及ぼすことが判明した(p<4.2x10−6)。252種類中44種類のクローンは、13qについて分析された65種類のクローンに分類された。13q21.1−q31.3では44例中29例(29/44)のクローンが、また13q31.3−q34では44例中15例(15/44)のクローンが、それぞれ連続的に配列されたクローンであり、複数比較修正により予後不良に結びつくことが判明した(p<4.2x10−6)。
残る190例のクローンは、統計的有意性に欠けると分類された(p<4.2x10− 6)。
CD5−グループでは252種類のクローン(増加が197例、減少が55例)が予後について単一クローンベースでp<0.05となった。これらのクローン252種類のうち、34種類のクローンが5pについて分析した38種類のクローンに分類された。34種類のクローンのうち、5p15.33−p14.2では34例中19例が、また5p13.2−p12では34例中5例が、それぞれ連続配列したクローンであり、複数比較修正により生存に対して望ましい影響があることが判明した(p<4.2x10−6)。残る218例のクローンは統計的に有意ではなかった(p>4.2x10−6)。
13q21.33−q31.1増加、1p36.21−p36.13減少、5P15.33−p14.2増加の存在の有無によるCD5+とCD5−症例の生存曲線を、それぞれ図7に示す。
表6に示すように、13q21.1−q34増加を示すCD5+DLBCL症例では、当該遺伝子領域の増加がみられないCD5+症例と比較して有意に生存が悪化していた。同様に1p36.21−p34.3の減少を示すCD5+DLBCL症例は、当該遺伝子領域の減少がみられないCD5+症例と比較して、有意に生存が悪化していた(図7)。対照的にこれに対応する領域の減少は、CD5−DLBCL症例の生存に影響しなかった。逆に5pが増加しているCD5−DLBCL症例の総生存は当該増加のみられない場合と比べて優れていたが、CD5+DLBCL症例の生存に対して5p増加は影響しなかった(データ示さず)。
3.考察
DLBCLは臨床的に不均質であることが知られているが、不均質性の原因となる分子イベントを解明する手段はこれまでに存在しない。しかし現在、アレイ技術の出現によって、そのような分析が可能となりつつある。遺伝子転写産物に対するマイクロアレイ分析により、DLBCLは少なくとも3種類の、臨床的関連を有する異なるサブグループにより構成されていることが判明した(Wright,G.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100:9991−9996.2003)。アレイCGH法をうまく利用して各種腫瘍のゲノム変異の分析が行われているが(Hackett,C.S.et al.Cancer Res.,63:5266−5273,2003;Veltman,J.A.et al.Cancer Res.,63:2872−2880,2003;Wilhelm,M.et al.Cancer Res.,62:957−960,2002)、DLBCLについては実施されていない。この試験では、独自のアレイCGHを確立し、DLBCL70症例について分析を行った。この分析により、DLBCLにおけるゲノムの増加ならびに減少が初めて明らかになった。また、ゲノム増加ならびに減少のみられる領域を同定することができたが、これらは臨床的サブタイプと患者の生存に関連していた。
使用するアレイ CGHの精度を確認するため、ここではまず、正常な男性DNAを用いた試験ハイブリダイゼーションにおいて予想される蛍光を示さないクローンは除外した。次にコピー数に従ってlog2比率を確認した。最後に既知のゲノム異常を有するリンパ腫細胞株を用いて、使用するアレイが予想される増加と減少を検出できることを確認した。精度を確認した次に、アレイの分解能を調べた。その目的のため、ここではアレイCGHを、DLBCL試料のゲノム異常を検出するための従来のCGH法と比較した(従来のCGHによるデータは他に報告されている)(Karnan,S.et al.Genes Chromosomes Cancer,39:77−81,2004)。アレイCGHによって従来のCGHでは検出不可能であった、複数の遺伝子座の異常が判明した。3p14.2の減少はそのような一例である。この減少部位は、アレイCGHではDLBCL症例66例中18例に検出されたが、従来のCGHでは全く検出されなかった。18例中13例の原因となる領域は、単一BACのRP11−48E21によりカバーされていたが、これはFHIT腫瘍抑制遺伝子を含んでいた。従って、アレイCGHは従来のCGHより高感度であることが判った。これらの知見から、アレイCGHは異常遺伝子の同定ならびに絞り込みを行うための有用なツールになると思われる。しかしアレイCGHはゲノムコピー数変化のみを同定するものであり、そのため遺伝子発現に影響しうる染色体の転座、変異や後生的なイベントなどを検出することはできない。アレイCGH法を、転写産物に対するマイクロアレイ分析や、染色体のSKY分析などといった他の新規開発技術と組み合わせて応用すれば、DLBCLの原因となる分子イベントの理解がさらに容易になることだろう。
従来のCGHによりこの試験で用いた患者試料を分析したところ、6種類の増加頻発領域(3q、6p、11q21−q24、12q、13q22−q32、18q、X)ならびに4種類の減少頻発領域(1p、6q、17p、19p)が判明している(Karnan,S.et al.Genes Chromosomes Cancer,39:77−81,2004)。同じ患者試料集団を対象にアレイCGH分析を行ったところ、(ここでは通常、連続する3クローンのレベルを一般に増加または減少領域として定義しているため)CGHにより同定された領域以外に、少なくとも5種類の増加頻発領域が新しく判明した。3p14や9p21などといった、最少一般減少領域も判明した。しかしCGHにより判明している19pの減少は、アレイCGHでは確認されなかった。このように従来CGHとアレイCGHの間に見かけ上の不一致が生じる理由は、現時点で全く不明というわけではない。一つの可能性として第19染色体には異質染色質のブロックが含まれており、これらは従来のCGHによる評価が難しい。そのためこれらの領域に対する従来CGHの結果に対する信頼性が低いことが、不一致の理由かもしれない。他の研究者らによる報告によれば、従来のCGH法を用いると、1q21−q23、2p12−p16、3q26−q27、7q11、8q24、9q34、11cen−11q23、12p、12cen−q13、13q32、16p12、16q21、18q21−q22、22q12が増加頻発領域であり、また1ptel−1p34、6q23−qtel、8ptel−8p22、17p12、22qが減少頻発領域であった(Monni,O.et al.Blood,87:5269−5278,1996;Rao,P.H.et al.Blood,92:234−240,1998;Berglund,M.et al.Mod.Pathol.,15:807−816,2002)。これらの中で9q34と22q12については、今回実施したアレイCGHにより増加頻発領域として同定できず、9q34と22q12の増加は合計66例のDLBCL症例中、それぞれ5(7.6%)と6(9.1%)であった。この不一致はおそらく分析対象となった患者試料の違いと、採用方法の感度差が原因であろう。
アレイCGH分析によりCD5+ならびにCD5−グループの両方に、ほとんど同一のゲノム異常パターンが存在することが判明した。しかし10p15.3−p14と19p13.33−13.43の増加、ならびに1q43−q44と8p23.2−p23.1の減少(表4と5)はCD5+DLBCLに特徴的であることが判ったが、それにもかかわらずCD5+DLBCLにおける10p15.3−p14は低頻度であった(16%)。これらの知見を他の特徴的な臨床的挙動と併せることにより、CD5+DLBCLが別個の存在であることが示唆されうる。10p15.3−p14と1q43−q44の領域を含む遺伝子はこれまで悪性疾患に関連していると報告されたことはなかったが、19q13.4領域にはBAX、PEG3(Kohda,T.,et al.Genes Cells,6:237−247,2001)、CD37、IL4RIなどの腫瘍関連遺伝子が含まれており、このIL4RIは縦隔原発大細胞型B細胞リンパ腫の原因遺伝子であることが判明している(Copie−Bergman,C.et al.Blood,101:2756−2761,2003)。8p23のゲノム減少は白血病性マントル細胞リンパ腫(MCL)に頻繁に見いだされており、この遺伝子の欠失はおそらくMCL患者における白血病性の播種ならびに予後不良に関連している(Martinez−Climent,J.A.et al.Blood,98:3479−3482,2001)。8p23がMCLだけでなくCD5+DLBCLでも頻繁に減少していることから、この遺伝子座に腫瘍抑制遺伝子が含まれており、それはCD5+DLBCLならびに白血病性MCLの患者の予後不良の原因となっている可能性が考えられるだろう。
13q21.1−q34の増加と1p36.21−p34.3の減少はCD5+症例の生存に有害な影響を及ぼすことが判明したが、これらの領域はCD5−症例についてそのような影響を及ぼすことはなかった。
CD5+の症例とは対照的に、今回はCD5−DLBCLに特徴的なゲノム領域は、増加や減少のいずれにおいても見いだすことが出来なかった。しかしCD5−DLBCL症例において5pの増加に関連して、生存率の改善がみられた。より多くの症例を分析して、この領域が予後に果たす役割を解明する必要があることは明らかである。
まとめると、この試験ではDLBCL症例について初めてアレイCGH分析を行い、DLBCLにおいて頻繁に変化しているゲノム領域を見いだした。CD5+とCD5−の症例を比較して、CD5+DLBCLグループに特有なゲノム変化を同定できた。アレイCGH分析はリンパ腫発生の遺伝的背景に関する新しい洞察を提供することになる。
1.材料と方法
1−1.患者
26例のde novo CD5+ DLBCL症例ならびに44例のCD5− DLBCLのDNA試料を分析した。これらの試料は愛知がんセンターならびに協力施設において、施設の審査会による承認を得て、患者よりインフォームドコンセントを得た状態で入手した。全ての患者は既発表論文で報告されている(Yamaguchi,M.et al.Blood,99:815−821,2002;Harada,S.et al.Leukemia,13:1441−1447,1999;Karnan,S.et al.Genes Chromosomes Cancer,39:77−81,2004)。CD5+ならびにCD5−症例の年齢中央値は、それぞれ61歳と56歳であった。CD5+症例のうち68%が女性であり、80%が進行期にあり(III−IV)、72%にLDH上昇が見られ、24%が一般状態不良、28%がリンパ節外部位の併発を有していた。CD5−症例の患者では41%が女性、52%が進行期にあり(III−IV)、45%にLDH上昇が見られ、10%が一般状態不良、38%がリンパ節外部位の併発を有していた。全試料とも、治療開始以前の診断時に取得した。
1−2.DNA試料
DNA抽出は、合計70例のDLBCL症例、すなわち26例のCD5+ DLBCL症例ならびに44例のCD5− DLBCL症例より得たリンパ腫標本を元に、標準的なフェノール・クロロホルム法を用いて実施した。正常DNAの調製は健常な男性ドナーの末梢血リンパ球を元に行った。
1−3.悪性リンパ細胞株
この実験で用いた細胞株は、Karpas1718(有毛リンパ球を有する脾臓リンパ腫:SLVL、Dr.A.Karpass,Cambridge University,UKより提供)、OCI−LY13.2(DLBCL、Dr.R.Dalla−Favera,Columbia Universityより提供)(Tweeddale,M.E.et al.Blood,69:1307−1314,1987)、REC1(マントル細胞リンパ腫細胞株、Dr.M.Dyer,Leicester University,UKより提供)(Martinez−Climent,J.A.et al.Blood,98:3479−3482,2001)であった。細胞株は37℃、5% CO2−95%空気中にて、10%胎児ウシ血清を添加したRPMI1640培地において維持した。
1−4.コピー数の線形性評価
複製数変化に伴うアレイCGHシグナルの線形性を試すために、以下の細胞株のうち一つに対して、正常男性DNAのアレイハイブリダイゼーションを実施した。GM04626;47XXX、GM01415D;48XXXX、GM05009C;49XXXXX(Kallioniemi,A.et al.Science(Wash.DC),258:818−821,1992;Pinkel,D.et al.Nat.Genet.,23:41−46,1998)。これらの細胞株はNIGMS Human Genetics Cell Repository Coriell Institute for Medical Researchより入手し、37℃、5% CO2−95%空気中にて、2x必須アミノ酸類、ビタミン類、ならびに20%胎児ウシ血清を添加したMEM Eagle−Earle培地において維持した。
1−5.アレイCGHのためのBAC/PACクローンの選別
アレイは2,088種類のBAC/PACクローンにより構成されており、概して1.5−Mbの解像度で全ヒトゲノムをカバーしている。BACクローン(BACs)はRP11ならびにRP13ライブラリより得ており、PACクローン(PACs)はRP1、RP3、RP4、RP5ライブラリより得ている。使用するBAC/PACクローンの選別は、NIBC(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)ならびにEnsembl Genome Data Resouces(http://www.ensembl.org/)より得た情報を元に実施した。これらのクローンの取得元は、Children’s Hospital(Oakland Research Institute,Oakland,CA;Http://bacpac.chori.org/)にあるBACPAC Resource Centerであった。クローンのシーケンス分析は1番〜22番染色体ならびにX染色体を元に行った。それぞれの染色体内部でのクローンのシーケンス分析は)Ensembl Genome Data Resources of Sanger Center Instituteの2004年1月版を元に実施した。アレイCGHに使用する全てのクローンは、FISH分析により染色体上の位置を確認した。
1−6.スライド上スポッティングのためのDNA増幅
10ngのBAC(またはPAC)DNAをテンプレートに、変性オリゴヌクレオチドをプライマーに用いたPCR(DOP−PCR)(Hakan,T.et al.Genomics,13:718−725,1992)を5’−アミン修正DOPプライマ:
を用いて行い、TaKaRa PCR Thermal Cycler MP(TaKaRa、Tokyo、Japan)によりEx Taqポリメラーゼ(TaKaRa)を用いて増幅した。3分間の94℃変性段階に続き、94℃で30秒間、37−72℃の直線傾斜で10分間、72℃で1分間の過程を25回繰り返し、最後に72℃で7分間の伸長を行った。
1−7.DNAスポッティングとガラススライドの品質管理
DOP−PCR産物をエタノール沈殿させ、蒸留水中に溶解し、次に等量のDNAスポッティング液DSP0050(Matsunami、Osaka、Japan)を添加した(〜1μgのDNA/μl)。その結果得られたDNA試料をインクジェット方式(NGK、Nagoya、Japan)による自動装置で、CodeLinkTM活性化スライド(Amersham Biosciences、Piscataway、NJ)上に二重反復的にスポットした。試験には、2,088種類のクローンが完全かつ均一に二重反復的スポットされていることが確認されたガラススライドのみを使用した。
1−8.アレイハイブリダイゼーション
アレイ製造ならびにハイブリダイゼーションは、Pinkel et al(Nature(Lond.),20:207−211,1998)ならびにHodggson et al.(Nat Genet.,29:459−464,2001)の方法に従って実施した。詳細なプロトコルはカリフォルニア大学(San Francisco、CA)のJoe Gray博士から提供頂いた。試験対象(腫瘍)ならびに対照(正常)DNAの1μgをDpnIIで消化し、それぞれcyanine3−dUTPならびにcyanine5−dUTP(Amersham Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ)を用いたBio prime DNA標識システム(Invitrogen Life Technologies,Inc.、Tokyo、Japan)により標識した。未取り込み蛍光ヌクレオチドはSephadex G−50スピンカラム(Amersham Biosciences)を用いて除去した。試験対象DNAならびに対照DNAは、50μgのヒトCot−1 DNA(Invitrogen Life Technologiies)と混合し、沈殿させ、45μlのハイブリダイゼーション混合液中で再懸濁したが、この混合液の成分は50%ホルムアミド、10%硫酸デキストラン、2x SSC、4%SDS、10μg/μl酵母tRNA(Invitrogen Life Technologies)であった。ハイブリダイゼーション溶液は73℃まで加熱して5分間置くことでDNA変性を行い、続いて37℃で45分間インキュベートすることで反復シーケンスをブロックした。DNAをスポットしたガラススライドは、70%ホルムアミド/2x SSC中で73℃で4分間にわたり変性し、続いて冷却した70%、85%、100%エタノール中でそれぞれ5分間脱水し、風乾した。ハイブリダイゼーションは200μlの50%ホルムアミド/2x SSCを用いて、緩やかに振動するテーブル上の容器中で66時間にわたり実施し、続いてハイブリダイゼーション後洗浄を、50%ホルムアミド/2x SSC中で50℃にて15分間、2x SSC/0.1%SDS中で50℃にて30分間、そしてPN緩衝液(0.1M NaH2PO4、pH 8を得るための0.1M Na2HPO4、0.1%NP−40)中で室温にて15分間にわたり実施した。次にガラススライドを室温にて2x SSC中に浸し、さいごに室温にてそれぞれ2分ずつ70%、85%、100%エタノール中で脱水し、風乾した。スライドのスキャニングは、Agilent Micro Array Scanner(Agilent Technologies,Palo Alto,CA)を用いて実施し、得られたアレイ像の分析を、Genepix Pro 4.1(Axon Instruments,Inc.,Foster City,CA)を用いて行った。DNAスポットを自動的にセグメント化し、局所バックグラウンドを減算し、シグナル強度を得た。次に2種類の色素のシグナル強度比(Cy3強度/Cy5強度)を各スポット毎に計算し、染色体位置の順にExcelシート上でlog2比に変換してから正規化した。
1−9.データセットの正規化
各試料の「log2比」に対する正規化は、全てのクローンについて、log2比率の中間値を計算することにより実施した。この「log2比」は、各クローンについて二重化されたスポットの平均log2比を示す。続いて、log2比が「中央値+SDxA」以上であるか、「中央値−SDxA」未満であるクローンを選別した。「A」は各実験における全クローンのlog2比プロットを参照することにより、正常領域として視覚的に決定した。「A」の範囲はほぼ0.5から1.0であった。次に選択したクローンの平均log2比率を計算し、これを「X」として定義した。最終的に、各クローンのlog2比から対応する「X」値を減算して「Y」値を得た。この試験ではそれぞれのlog2比の分析を「Y」値をもとに行った。クローンを視覚的に選択し、各実験毎にSDを計算し、SDが0.15を超えないことを確認した。
1−10.FISH分析
正常な男性リンパ球と細胞株から、分裂中期の染色体を調製した。ニックトランスレーションキット(Vysis Inc.、Downers Grove、IL)によりSpectrum Green−dUTPまたはSpectrum Red−dUTP(Vysis)を用いて、約200ngのBAC/PACsを標識した。標識化DNAと10μgのヒトCot−1 DNAをエタノール中で共沈殿させ、3μlの蒸留水と7μlのハイブリダイゼーション緩衝液(50%ホルムアミド、20%デキストラン硫酸、2x SSC)に溶解した。細胞株の分裂間期染色体スライドの調製は、標準法に従って行った。ハイブリダイゼーションは、70%ホルムアミド/2x SSC中73℃で変性させたスライド上において、37℃で12−24時間にわたり実施した。次にこのスライドを、0.4x SSC/0.3%NP−40中75℃で、また2x SSC/0.1%NP−40中室温で洗浄した。スライドの乾燥後、DAPI(4,6−diamino−2−phenylindole)−II(Vysis)を用いて染色体を逆染色した。染色体の同定は、DAPI−染色の縞模様を元に行った。デジタルイメージ分析は BX−60−RF顕微鏡(Olympus)ならびに IP Lab Scientific Imaging Software(Scanalytics Inc.、Fairfax、VA)を用いて実施した。
1−11.統計分析
ゲノム領域を分析して2種類の患者グループ間における統計的差違を求めるため、次のようにデータセットを構築した。ゲノム変化は、コピー数増加について+0.2、コピー数減少について−0.2のlog2比の閾値により定義した。各症例について、増加したクローン(log2比>+0.2)は「1」、増加のないクローン(log2比<0.2)は「0」としてエクセルテンプレートに入力した。同様に減少したクローンは「1」、減少のないクローンは「0」として各症例ごとに別のエクセルテンプレートに入力した。遺伝子増加または減少を示す症例は、CD5+グループまたはCD5−グループの各単一クローン毎にExcelを用いて計数した(合計1,966クローン)。その後以下の目的のためにデータ分析を行った。1)CD5+とCD5−グループ間における、各単一クローンの増加または減少頻度の比較(増加・減少それぞれ1,966回試験、合計3,932回試験)。2)単一クローンの増加または減少を示す症例と、それぞれの増加または減少を示さない症例の間における、総生存の比較(CD5発現の有無状態につき増加と減少それぞれ1,966回試験、最大合計7,864回試験)。前者の分析にはフィッシャーの直接確率検定を適用し、後者の分析には2群の間の生存曲線を比較するログランク検定を適用した。各分析毎に候補クローンをスクリーニングするためのP値はP<0.05であった。候補クローンが同定された場合には、以下のクローンを有するクローン集団を評価した。n番目のクローンとそれに続くk個のクローン(K≧0)が候補クローンであることが判明した場合には、連続した関連を求めるためのp値は次式(1)にて計算される:
この時、各クローンはゲノム全体にわたり独立していると仮定する。ここでは複数回の試験を適用したため(最大11,796回試験)、従来のボンフェローニ法を適用してアルファエラーを定義し、最終結論を求めた。従ってここでは、p値が0.05/12,000(=4.2×10−6)未満である場合を統計的有意であると定義した(Wright,SP.Biometrics,48:1005−1013,1992)。統計分析の実施は、全て統計パッケージSTATA ver.8(College Station,TX)を用いて行った。
2.結果
2−1.CGHアレイの品質
CGHアレイを評価するため、ここでは最初に正常な男性DNA同士のハイブリダイゼーションを6例の異なる場合について実施した。クローンあたりSEの平均は、6例の正常試料中の平均クローン変動性を示しており、この対照群では3%になった。スポットされた42例のクローンは、全クローンの平均蛍光強度の10%未満を示すことが判明した。62例のクローンは、参照比率の偏差が1.0からとなる最も極端な平均試験になり、18例のクローンはこの正常対照群において最大SDを有していた。そのため122例のクローンを以後の分析から外した。各スポット(二重化した1,966クローン)の蛍光のlog2比は+0.2から−0.2の範囲内であった。そのためlog2比率がこの範囲を超える場合に有意と考えた。コピー数とlog2比率の間の線形性は、X染色体のコピー数が異なるヒト繊維芽細胞株を用いて確認した(実施例2参照)。次に複数の悪性リンパ腫細胞株に対してアレイCGHを実施し、この系が増加と減少を検出出来るかどうか確認した。図1AにはREC1細胞株の全ゲノムプロファイルを示すが、この株は13q31.3(BAC、RP11−430K10)の増加と4q32.1(BAC、RP11−154F14)の減少等の、複数の遺伝子座におけるゲノム異常を有することが判明している。アレイCGHデータに従うように、対応するBACを用いたFISH分析によっても、これらの増加と減少が引き続き検出された(図1B)。図2に示すのは、Karpass1718細胞株の第16染色体(図2A)ならびに第8p染色体(図2C)に対する、個々のアレイCGHプロファイルである。このプロファイルに示されるのは、単一ピークの16p13.13の増加(BAC、RP11−24M12)(図2A)ならびにBAC、RP11−353K12とBAC、RP11−369E15の間の8p21区切り点であった。これらの結果は同様に、その後で行ったFISH分析により確認された(図2Bと2D)。これらの知見から、アレイCGHの精度と高い分解能が示された。
2−2.DLBCL症例に関するゲノムプロファイルとデータ分析
次にアレイCGH分析を実施し、CD5+ならびにCD5−DLBCL症例の間のゲノム変化を比較した。X染色体上の全クローン(57クローン)は性別が不一致であるため個別に分析した。合計70例のDLBCL症例を登録した。4例(CD5+DLBCL症例で1例、CD5−の症例で3例)にはなんらゲノム異常は見られなかった。このため、CD5+DLBCLである25症例とCD5−DLBCLである41症例をデータ分析に供した。CD5+ならびにCD5−DLBCLのゲノム増加と減少の平均サイズを表1に示す。全ゲノム中におけるこれらの有効範囲率も表中にまとめてある。平均して、CD5+グループはCD5−グループより大きなコピー数増加分画を含む一方、前者は後者より小さなコピー数減少分画を含んでいた。
図3に示すのは、代表的な2種類のCD5+(図3Aと3B)試料と、1種類のCD5−(図3C)試料の全ゲノムプロファイルである。コピー数の変化は高解像度でゲノム全体にわたり容易に検出できた。低レベル増幅を示す領域(log2比率+2.0〜+1.0として定義)、ならびにヘテロ接合性欠失が示唆される領域(log2比率−1.0〜−0.2として定義)も同様に識別可能であった。
この発明では、「増加または消失の共通領域」を次のように定義した。i)少なくとも3種類の連続するクローンが連続して配列しており(解像度3〜5Mb以上)、それらのクローンが20%以上の症例で増加または減少を示す場合、あるいは、ii)3種類未満であるならば、クローンが大きなコピー数増加を示すか(log2比率>+1.0で定義)、ホモ接合性の減少を示す場合(log2比率<−1.0で定義)(2p16.1の増加、3p14の減少、9p21の減少)。「共通領域」内部において、「最少共通領域」を最大症例数により共有される領域として定義した。「最少共通領域」内に最も頻出するBAC/PACクローン、及びそれに含まれる代表的な遺伝子(悪性リンパ腫の公知の候補腫瘍遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子)(Monni,O.et al.Blood,87:5269−5278,1996;Rao,P.H.et al.Blood,92:234−240,1998;Wright,G.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100:9991−9996.2003)は表2及び3に記載してある。
CD5+グループ(25例)の共通増加領域は、1q21.2−q32.3、1q42.2−q42.3、2p16.1、3、5p13.2−p13.1、6p25.3−p22.3、7p22.2−q31.1、8q24.13−q24.22、11q22.1−q25、12、13q21.1−q34、16p13.3−q21、17q23.2−q24.3、18、19p13.13−q13.43、Xであり、CD5+グループの共通減少領域は1p36.32−p36.23、1p36.21−p36.13、1p35.1−p34.3、1q43−q44、3p14.2、6q14.1−q27、8p23.3−p21.2、9p21、15q13.1−q14、17p13.3−p11.2であった。
CD5−グループ(41例)の共通増加領域は、s1q21.1−q31.1、1q32.1−q32.2、3p25.2−q29、5q13.2−p13.1、5p14.1−p13.2、6p25.3−p12.3、7、8q24.13−q24.21、9q24.2−p13.2、11q23.2−q24.2、12q13.2−q21.2、16p13.3、18、Xであり、CD5−グループの共通減少領域は1p36.32−p36.23、3p14.2、6q12−q25.2、6q27、9p21、15q15.2−q21.1、17p13.3−p11.2であった。
CD5+とCD5−の両グループのうち20%以上の事例で観察される増加領域は、1q21.1−q31.1、1q32.1−q32.2、3p25.2−q29、5p13.2−p13.1、6p25.3−p21.1、7p22.2−q31.1、8q24.13−q24.21、11q23.2−q24.3、12q13.2−q21.2、16p13.3、18、Xであり、CD5+とCD5−の両グループのうち20%以上の事例で観察される減少領域は、1p36.32−p36.31、3p14.2、6q14.1−q25.2、6q27、9p21、17p13.3−p11.2であった。
以上のCD5+またはCD5−グループのいずれかの共通領域の中で、2p16.1(REL遺伝子座、BAC、RP11−17D23)の増加、3p14.2(FHIT遺伝子座)の減少、9p21.1(p16INK4a遺伝子座)の減少を示す症例の一部には、単一クローンまたは連続する2クローンによるゲノム異常が見られた。2p16.1増加をみた13症例のうち3例にこのような増加が見られた。DLBCL状態で2p16.1増加をみた3症例中2例には、連続するわずか2個のクローン(BACs、RP11−17D23ならびにRP11−511111)に著しく高レベルの増加(log2比>+1.5)がみられた。DLBCL状態での3p14.2の減少はこれまでに報告されていない。
全66例中18例(28%)に3p14.2の減少がみられた。3p14を含むクローンのうち、BAC、RP11−48E21(FHIT座)が単独減少していたのは18例中13例であり(CD5+DLBCLの7例とCD5−の11例)、このとき周辺のBACsで明確なコピー数減少を示すものはなかった(図4A)。単独減少をみた13例のうち、13例中2例がホモ接合性減少であると思われた(log2比<−1.0)。従ってこのFHIT座は最少共通領域であると考えられ、またこれは進行性悪性リンパ腫患者より確立したOCI−LY13.2細胞株においても欠失していた(Karnan,S.et al.Genes Chromosomes Cancer,39:77−81,2004)。FISH分析はこのアレイ CGHデータに一致していた(図4BとC)。同様にBACクローンRP11−149I2(p16INK4a座を含む)は、合計66例のDLBCL症例のうち9p21の減少を示す32例の9例にて単独減少しており(9例中2例がホモ接合性減少と思われる)、従ってこれが最少共通領域であると考えられる。
最後に、男性患者のみについてX染色体を分析した(CD5+グループ:10例、CD5−グループ:25例)。CD5+グループの10例中2例と、CD5−グループの15例中3例には、X染色体全域にわたり軽度のコピー数増加がみられ(+0.2<log2比率<+1.0)、重度の増加はみられなかった。CD5+グループの2例について、Xq21に軽度の減少(−1<log2比率<−0.2)がみられた。
2−3.CD5+DLBCLのゲノムコピー数変化特性
次に、CD5+とCD5−グループ間のクローン増加と減少の頻度を比較した。候補クローンについて単一クローンベースのスクリーニングを行ったところ、48種類のクローンが、CD5−グループと比較してCD5+グループのほうにおいて高頻度(p<0.05)で増加または減少していることが判明した。これら48種類のクローンでは、10p15.3−p14では6種類中6種類(6/6)のクローンが、12p12では3種類中3種類(3/3)のクローンが、16p12では5種類中3種類(3/5)のクローンが、19p13.33−q13.4では9種類中9種類(9/9)のクローンが連続的に配列していた(Sanger Center InstituteのEnsembl Genome Data Resources、2004年1月版の全ゲノムマッピング位置による)。16p12における5例中2例(2/5)のクローンと、残る48例中25例のクローンは単一でP<0.05を示し、すなわち隣接するクローンにCD5+とCD5−グループ間での差違がみられなかった。
CD5−グループと比べてCD5+グループにおいて、20種類のクローンが比較的高頻度で有意に減少していることが判明した。これらの中で、1q43では9例中3例(3/9)のクローンが、1q43−q44では9例中6例(6/9)のクローンが、8p23では7例中2例(2/7)のクローンが、8p23では7例中5例(5/7)のクローンが連続的であり、残る20例中4例のクローンは単一でP<0.05を示し、すなわち隣接するクローンにCD5+とCD5−グループ間での差違がみられなかった。
多重比較を行ったため、上記のように単一クローンベースでスクリーニングしたクローンについて、その後多重比較修正を実施し、CD5+とCD5−グループ間で頻度差が存在するという意味で統計的に有意であるクローンを判別した。n番目のクローンとそれに続くk個のクローン(k≧0)が候補クローンであることがスクリーニングにより判明した場合は、連続した関連を求めるためのp値は前記1−11の式(1)にて計算される。この時、各クローンは独立していると仮定する。ここでは複数回の試験を適用したため(最大11,796回試験)、従来のボンフェローニ法を適用してアルファエラーを定義し、最終結論を求めた。従ってここでは、p値が0.05/12,000(=4.2×10−6)未満である場合を統計的有意であると定義した。CD5+DLBCLの10p15.3−p14増加、19p13.33−q13.43増加、1q43−q44減少、8p23.2−p23.1減少の式(1)の値は<4.2x10−6であったため、これらの領域はCD5+グループに特徴的であると考えられる。しかし CD5+DLBCLにおける他のクローンの式(1)の値はこの基準では有意性を示さなかった。
10種類の増加クローンと6種類の減少クローンについて、CD5+とCD5−グループ間の症例頻度に差違が見られたが(p<0.05)、複数比較修正を実施した後には、これらのクローンに有意性はみられなかった。
従って10p15.3−p14ならびに19q13.33−q13.43の増加と、1q43−q44ならびに8p23.2−p23.1の減少はCD5+DLBCLに特徴的である。またCD5−DLBCLに特徴的である増加や減少は無かった。CD5+DLBCLとその中に含まれるBACクローンに特徴的な領域を、表4(増加)ならびに表5(減少)中にリストアップしている。CD5+DLBCL症例の第10染色体、第19染色体、第1q染色体、第8染色体に対する個別ゲノムプロファイリングの代表例3種類を、それぞれ図5A、図5B、図6、図6Bに示す。
2−4.DLBCL症例の予後に影響するゲノムコピー数変化
次に、特定ゲノム増加または減少の存在の有無に従って症例を層別化し、カプラン−メイヤー法とログランク検定を用いてこれらの症例の生存確率を分析した。CD5+またはCD5−グループ中でコピー数変化(増加/減少)の異常を示すクローンを、全てスクリーニング対象とした。続いて、複数比較修正を実施し、スクリーニングログランク検定によりp<0.05を示すクローンを調べた。
CD5+グループでは、252種類のクローン(増加が98種類、減少が154種類)が単一クローンベースのログランク検定により、予後に関してp<0.05であることが示された。これら252種類のクローンのうち、18種類のクローンが1p36.21−p34.3に連続配列しており、複数比較修正によって生存について有害な影響を及ぼすことが判明した(p<4.2x10−6)。252種類中44種類のクローンは、13qについて分析された65種類のクローンに分類された。13q21.1−q31.3では44例中29例(29/44)のクローンが、また13q31.3−q34では44例中15例(15/44)のクローンが、それぞれ連続的に配列されたクローンであり、複数比較修正により予後不良に結びつくことが判明した(p<4.2x10−6)。
残る190例のクローンは、統計的有意性に欠けると分類された(p<4.2x10− 6)。
CD5−グループでは252種類のクローン(増加が197例、減少が55例)が予後について単一クローンベースでp<0.05となった。これらのクローン252種類のうち、34種類のクローンが5pについて分析した38種類のクローンに分類された。34種類のクローンのうち、5p15.33−p14.2では34例中19例が、また5p13.2−p12では34例中5例が、それぞれ連続配列したクローンであり、複数比較修正により生存に対して望ましい影響があることが判明した(p<4.2x10−6)。残る218例のクローンは統計的に有意ではなかった(p>4.2x10−6)。
13q21.33−q31.1増加、1p36.21−p36.13減少、5P15.33−p14.2増加の存在の有無によるCD5+とCD5−症例の生存曲線を、それぞれ図7に示す。
表6に示すように、13q21.1−q34増加を示すCD5+DLBCL症例では、当該遺伝子領域の増加がみられないCD5+症例と比較して有意に生存が悪化していた。同様に1p36.21−p34.3の減少を示すCD5+DLBCL症例は、当該遺伝子領域の減少がみられないCD5+症例と比較して、有意に生存が悪化していた(図7)。対照的にこれに対応する領域の減少は、CD5−DLBCL症例の生存に影響しなかった。逆に5pが増加しているCD5−DLBCL症例の総生存は当該増加のみられない場合と比べて優れていたが、CD5+DLBCL症例の生存に対して5p増加は影響しなかった(データ示さず)。
3.考察
DLBCLは臨床的に不均質であることが知られているが、不均質性の原因となる分子イベントを解明する手段はこれまでに存在しない。しかし現在、アレイ技術の出現によって、そのような分析が可能となりつつある。遺伝子転写産物に対するマイクロアレイ分析により、DLBCLは少なくとも3種類の、臨床的関連を有する異なるサブグループにより構成されていることが判明した(Wright,G.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100:9991−9996.2003)。アレイCGH法をうまく利用して各種腫瘍のゲノム変異の分析が行われているが(Hackett,C.S.et al.Cancer Res.,63:5266−5273,2003;Veltman,J.A.et al.Cancer Res.,63:2872−2880,2003;Wilhelm,M.et al.Cancer Res.,62:957−960,2002)、DLBCLについては実施されていない。この試験では、独自のアレイCGHを確立し、DLBCL70症例について分析を行った。この分析により、DLBCLにおけるゲノムの増加ならびに減少が初めて明らかになった。また、ゲノム増加ならびに減少のみられる領域を同定することができたが、これらは臨床的サブタイプと患者の生存に関連していた。
使用するアレイ CGHの精度を確認するため、ここではまず、正常な男性DNAを用いた試験ハイブリダイゼーションにおいて予想される蛍光を示さないクローンは除外した。次にコピー数に従ってlog2比率を確認した。最後に既知のゲノム異常を有するリンパ腫細胞株を用いて、使用するアレイが予想される増加と減少を検出できることを確認した。精度を確認した次に、アレイの分解能を調べた。その目的のため、ここではアレイCGHを、DLBCL試料のゲノム異常を検出するための従来のCGH法と比較した(従来のCGHによるデータは他に報告されている)(Karnan,S.et al.Genes Chromosomes Cancer,39:77−81,2004)。アレイCGHによって従来のCGHでは検出不可能であった、複数の遺伝子座の異常が判明した。3p14.2の減少はそのような一例である。この減少部位は、アレイCGHではDLBCL症例66例中18例に検出されたが、従来のCGHでは全く検出されなかった。18例中13例の原因となる領域は、単一BACのRP11−48E21によりカバーされていたが、これはFHIT腫瘍抑制遺伝子を含んでいた。従って、アレイCGHは従来のCGHより高感度であることが判った。これらの知見から、アレイCGHは異常遺伝子の同定ならびに絞り込みを行うための有用なツールになると思われる。しかしアレイCGHはゲノムコピー数変化のみを同定するものであり、そのため遺伝子発現に影響しうる染色体の転座、変異や後生的なイベントなどを検出することはできない。アレイCGH法を、転写産物に対するマイクロアレイ分析や、染色体のSKY分析などといった他の新規開発技術と組み合わせて応用すれば、DLBCLの原因となる分子イベントの理解がさらに容易になることだろう。
従来のCGHによりこの試験で用いた患者試料を分析したところ、6種類の増加頻発領域(3q、6p、11q21−q24、12q、13q22−q32、18q、X)ならびに4種類の減少頻発領域(1p、6q、17p、19p)が判明している(Karnan,S.et al.Genes Chromosomes Cancer,39:77−81,2004)。同じ患者試料集団を対象にアレイCGH分析を行ったところ、(ここでは通常、連続する3クローンのレベルを一般に増加または減少領域として定義しているため)CGHにより同定された領域以外に、少なくとも5種類の増加頻発領域が新しく判明した。3p14や9p21などといった、最少一般減少領域も判明した。しかしCGHにより判明している19pの減少は、アレイCGHでは確認されなかった。このように従来CGHとアレイCGHの間に見かけ上の不一致が生じる理由は、現時点で全く不明というわけではない。一つの可能性として第19染色体には異質染色質のブロックが含まれており、これらは従来のCGHによる評価が難しい。そのためこれらの領域に対する従来CGHの結果に対する信頼性が低いことが、不一致の理由かもしれない。他の研究者らによる報告によれば、従来のCGH法を用いると、1q21−q23、2p12−p16、3q26−q27、7q11、8q24、9q34、11cen−11q23、12p、12cen−q13、13q32、16p12、16q21、18q21−q22、22q12が増加頻発領域であり、また1ptel−1p34、6q23−qtel、8ptel−8p22、17p12、22qが減少頻発領域であった(Monni,O.et al.Blood,87:5269−5278,1996;Rao,P.H.et al.Blood,92:234−240,1998;Berglund,M.et al.Mod.Pathol.,15:807−816,2002)。これらの中で9q34と22q12については、今回実施したアレイCGHにより増加頻発領域として同定できず、9q34と22q12の増加は合計66例のDLBCL症例中、それぞれ5(7.6%)と6(9.1%)であった。この不一致はおそらく分析対象となった患者試料の違いと、採用方法の感度差が原因であろう。
アレイCGH分析によりCD5+ならびにCD5−グループの両方に、ほとんど同一のゲノム異常パターンが存在することが判明した。しかし10p15.3−p14と19p13.33−13.43の増加、ならびに1q43−q44と8p23.2−p23.1の減少(表4と5)はCD5+DLBCLに特徴的であることが判ったが、それにもかかわらずCD5+DLBCLにおける10p15.3−p14は低頻度であった(16%)。これらの知見を他の特徴的な臨床的挙動と併せることにより、CD5+DLBCLが別個の存在であることが示唆されうる。10p15.3−p14と1q43−q44の領域を含む遺伝子はこれまで悪性疾患に関連していると報告されたことはなかったが、19q13.4領域にはBAX、PEG3(Kohda,T.,et al.Genes Cells,6:237−247,2001)、CD37、IL4RIなどの腫瘍関連遺伝子が含まれており、このIL4RIは縦隔原発大細胞型B細胞リンパ腫の原因遺伝子であることが判明している(Copie−Bergman,C.et al.Blood,101:2756−2761,2003)。8p23のゲノム減少は白血病性マントル細胞リンパ腫(MCL)に頻繁に見いだされており、この遺伝子の欠失はおそらくMCL患者における白血病性の播種ならびに予後不良に関連している(Martinez−Climent,J.A.et al.Blood,98:3479−3482,2001)。8p23がMCLだけでなくCD5+DLBCLでも頻繁に減少していることから、この遺伝子座に腫瘍抑制遺伝子が含まれており、それはCD5+DLBCLならびに白血病性MCLの患者の予後不良の原因となっている可能性が考えられるだろう。
13q21.1−q34の増加と1p36.21−p34.3の減少はCD5+症例の生存に有害な影響を及ぼすことが判明したが、これらの領域はCD5−症例についてそのような影響を及ぼすことはなかった。
CD5+の症例とは対照的に、今回はCD5−DLBCLに特徴的なゲノム領域は、増加や減少のいずれにおいても見いだすことが出来なかった。しかしCD5−DLBCL症例において5pの増加に関連して、生存率の改善がみられた。より多くの症例を分析して、この領域が予後に果たす役割を解明する必要があることは明らかである。
まとめると、この試験ではDLBCL症例について初めてアレイCGH分析を行い、DLBCLにおいて頻繁に変化しているゲノム領域を見いだした。CD5+とCD5−の症例を比較して、CD5+DLBCLグループに特有なゲノム変化を同定できた。アレイCGH分析はリンパ腫発生の遺伝的背景に関する新しい洞察を提供することになる。
1.材料と方法
1−1.細胞株、腫瘍標本とCGH法
使用した細胞株はKarpas 1718(有毛リンパ球を有する脾リンパ腫:SLVL)(Martinez−Climent,J.A.et al.Blood,101:3109−3117,2003)、OCI−Ly4、OCI−Ly7、OCI−ly8(DLBCL、Columbia University,NY,NYの R.Dalla−Favera博士から提供)、Rec1(マントル細胞リンパ腫:MCL、Leicester University,Leicester,UKのM.Dyer博士から提供)(Martinez−Climent,J.A.et al.Blood,98:3479−3482,2001)、Karpas 422(B細胞リンパ腫細胞株)(Dyer,M.J.et al.Blood,75:709−714,1990)、ATN−1(成人T細胞リンパ腫細胞株、Nagoya University School of Medicine,Nagoya,JapanのT.Naoe博士から提供)(Naoe,T.et al.Cancer Genet Cytogenet.,34:77−88.1988)であった。SUDHL6(Southwestern University Diffuse Histiocytic Lymphoma細胞株、B細胞リンパ腫)、SP49(MCL細胞株)、Jurkat(T細胞急性リンパ性白血病)、その他の細胞株については他の文献に説明されている(Takizawa,J.et al.Jpn J cancer Res.,89:712−718,1998)。各種コピー数のX染色体を持つ細胞株は、NIGMS Human Genetics Cell Repository Coriell Institute for Medical Research(Camden、NJ)より購入した。患者試料はインフォームドコンセントにより収集しており、またこの実験は愛知がんセンターのIRB(施設審査委員会)の承認を得た。細胞株は全て10%ウシ胎児血清を添加したRPMI1640中で維持した。ゲノムDNAの抽出は、プロテイナーゼK消化とフェノール・クロロホルム抽出を用いた標準処置により行った。従来CGHとアレイCGHで使用する正常DNAの調製は、正常男性より得た末梢血リンパ球を用いて行った。「従来型」CGHの実施は、メーカーのプロトコルに従って実施した(Vysis、Downers Grove、IL)。
1−2.アレイCGH
アレイ製造ならびにハイブリダイゼーションの実施は、それぞれHodgson et al(Nat Genet.,29:459−464,2001)ならびにPinkel et al(Nat.Genet.,23:41−46,1998)に記載の方法に従って行った。アレイは2,088種類のBACならびにPACクローンにより構成され、ほぼ1.5−Mbの解像度でヒトゲノムをカバーしており、BACクローンについてはRP11、13のライブラリを、PACクローンについてはRP1、3、4、5をもとにしている。これらのクローンの入手先は、Oakland、CAにあるChildren’s Hospital Oakland Rescarch Institute内のBACPAC Resource Center(http://bacpac.chori.org/)である。各クローンの培養は、クロラムフェニコール(25μg/ml)存在下のTerrific Broth(TB)培地中で行い、BACならびにPACDNAの抽出はplasmid Mini−kit(QIAGEN、Germantown、MD)を用いて行った。各クローンの位置確認はやはりFISH分析により行った。これらのクローンのおよそ10%は予想された位置に確認されなかったため試験から除外し、確認されたクローンを用いてアレイCGHを行った。10ngのBACならびにPACDNAをテンプレートに用いて、プライマー5’−CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG−3’(SEQ ID NO:1)を用いた変性オリゴヌクレオチドプライマー使用PCR(DOP−PCR)を行った(Hakan,T.et al.Genomics,13:718−725,1992)。増幅はTakara PCR Thermal Cycler MP(TaKaRa、Tokyo、Japan)とExTaqポリメラーゼ(TaKaRa)を用いて行った。DOP−PCR産物をエタノール沈殿により濃縮し、蒸留水で溶解し、続いて等量のDNAスポッティング溶液DSP0050(MATSUNAMI、OSAKA、JAPAN)を添加した(〜1μg/μl)。DNAは二重に、CodeLinkTM活性化スライド(Amersham Biosciences、Piscataway、NJ)上に機械的にスポットした(NGK Insulators,Ltd.、Nagoya、Japan)。試験DNAならびに対照DNA(各1μg)をDpnIIで消化し、Bio prime DNA labeling system(Invitrogen Life Technologies,Inc.、Tokyo、Japan)により、それぞれcyanine3−dUTPならびにcyanine5−dUTP(Amersham Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ)を用いて標識した。取り込まれなかった蛍光ヌクレオチドは、SephadexG−50スピンカラム(Amersham Biosciences)を用いて除去した。標識化された1μgの試験DNAならびに対照DNA試料を、100μgのHuman Cot−1 DNA(Invitrogen Life Technologies)と混合して沈殿させ、その後45μlのハイブリダイゼーション混合液中にペレットを再懸濁したが、この混合液の内容は50%ホルムアミド、10%デキストラン硫酸、2x SSC、4%SDS、10μg/μl酵母tRNA(Invitrogen Life Technologies)であった。このハイブリダイゼーション溶液を73℃で5分間加熱してDNAを変性させ、続いて37℃で45分間インキュベートして反復配列のブロッキングがなされるようにした。DNAをスポットしたスライドは、70%ホルムアミド/2x SSCを含む溶液中で73℃で4分間にわたり変性させ、続いてそれぞれ5分ずつ、70%、85%、100%冷エタノール中で脱水して風乾させた。ハイブリダイゼーションは、緩やかに振動するテーブル上で、湿度調節のために200μlの50%ホルムアミドと2x SSCを含む容器中で48時間にわたり行い、これに続いてハイブリダイゼーション後洗浄を、50%ホルムアミド/2x SSC中50℃で15分間、2x SSC/0.1%SDS中50℃で30分間、0.1M NaH2PO4、pH8の0.1M Na2HPO4、0.1%NP−40により構成されるPN緩衝液中室温で15分間行い、2x SSC中室温ですすぎを行い、最後に室温にてそれぞれ2分ずつ70%、85%、100%エタノール中で脱水して風乾した。スキャニング分析は基本的にAgilent Micro Array Scanner(Agilent Technologies、Palo Alto、CA)を用いて実施した。このようにして得たアレイ像を、Genepix Pro 4.1を用いて分析した(Axon Instruments,Inc.、Foster City、CA)。DNAスポットを自動的に分割し、局所的バックグラウンドを減算し、2種類の色素の全体的強度と蛍光強度比を各スポットごとに計算した。2種類の色素の蛍光強度比(Cy3強度/Cy5強度)はlog2強度比に変換した(log2比)。
この実験で用いるアレイについて、正常男性に対する正常男性の同時ハイブリダイゼーション6種類を実施し、log2比の正規変動を定義した。この実験では122種類のクローンが、全クローンの蛍光強度の平均値の1/10未満を示したため、これらをアレイCGH分析から除外した。残った1,966種類のクローンを用いて、アレイCGH分析を行った。各スポット(2x 1,966クローン)について測定された蛍光log2比率の95%以上が+0.2?−0.2の範囲になった。増加と減少のlog2比の閾値は、それぞれ+0,2と−0.2のlog2比に設定した。また、各試料のlog2比を次に述べる方法に従って正規化した。
全クローンの平均log2比を計算し、log2比が「中央値+SD×A」以上、または「中央値−SD×A」未満であるクローンを選択した。「A」は各実験ごとの全てのクローンのlog2比のプロットを参照することにより、正常領域として視覚的に定義した。また「A」はほぼ0.3から0.7の範囲に割り当てられた。次に選択されたクローンについて、平均log2比率を計算し、この平均log2比率を「X」とした。最後に各クローンのlog2比から「X」を引いて「Y」値を得た。この試験では、それぞれのlog2比について「Y」値をもとに分析した。ここではクローンを視覚的に選択し、それぞれの実験ごとにSD値を計算し、そのSD値が0.15を上回らないことを確認した。もし上回る場合には当該値はCGH分析のために信頼できないと見なした。
正常男性と正常女性のアレイハイブリダイゼーションを実施し、X染色体のあるコピー数に何らかの変化があるかどうかを調べた。コピー数変化に伴う線形性を確認するため、正常に対して、異なるX染色体数を有する各細胞株(GM04626:47XXX;GM01415D:48XXXX;GM05009C:49XXXXX)のアレイハイブリダイゼーションも、同様に実施した。これらの細胞株はNIGMS Human Genetics Cell Repository Coriell Institute for Medical Researchより取得した。X染色体のBACまたはPACクローン57種類をこの分析に用いた。それぞれのハイブリダイゼーションごとに、これらのクローンの平均log2比率を計算した。
1−3.FISH分析
13q31−q32上のBACクローンの位置を、Ensembl Genome Data Resources(http://www.ensembl.org/)による保管データをもとに確認した。およそ15MbをカバーするアレイCGHにより示された、13q31−q32の高レベル増幅領域周辺に位置する19種類のBACクローンを用いたFISH分析を、3種類の細胞株に対して用いた(Karpas 1718、OCI−Ly4、Rec1)。細胞株のそれぞれの分裂間期染色体スライドは、標準法に従って調製した。FISHの実施は文献(Tagawa,H.et al.Oncogene,in press,2003)記載の方法に従って実施した。
1−4.ESTsと遺伝子の位置
13q31.3染色体領域上に位置するESTsと遺伝子は、National Center for Biotechnology Information(NCBI;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、Ensembl genome data resource(http://www.ensembl.org/)、the University of California at Santa Cruz(UCSC;http://www.genome.ucsc.edu/)を参照した。アレイCGHとFISH分析により、13q31−q32における共通増幅領域はBACのRP11−360A9からBACのRP11−93M14までに渡っていることが示された。この領域には互いに重複しない65種類の独立したESTsと、GPC5が含まれていた(表8)。
1−5.逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)分析
FISHならびにアレイCGHにより、13q31.3上に高い増幅が見られた3種類の細胞株、すなわちRec1、Karpas 1718、OCI−Ly4を用いてRT−PCR分析を行った。胎児脳より得たcDNAも分析した。RNA試料中に混在したゲノムDNAによる増幅を避けるため、RNAを増幅グレードのDNaseI(Invitrogen Life Technologies,Inc.)で処置し、その後で試料のcDNA合成を行ったが、これはSuperScriptII(GIBCO−BRL、Div.of Life Technologies,Inc.、Gaitherburg、USA)を用いて実施した。すなわち、それぞれ5μlのトータルRNAを逆転写し、40μlの蒸留水中に溶解したcDNAとした。RT−PCRは65種類のESTsとGPC5について、特異的プライマーを用いて実施した(表8)。各プライマーの設計は、Tm値が55℃から 60℃の範囲になるようにした。増幅の実施にはThermal Cycler(Perkin−Elmer Corporation、Norwalk、CT)を用いた。RT−PCRは、文献(Motegi,M.et al.Am J Pathol.,156:807−812,2000)に記載されているタッチダウンPCR法により実施した。すなわち反応の内容は、10サイクルの変性(94℃、0.5分)、アニーリング(63℃、0.5分、2サイクルごとに1℃減少)、伸長(72℃、2.5分)に続き、35サイクルの変性(94℃、0.5分)、アニーリング(58℃、0.5分)、伸長(72℃、2.5分)を行い、最後に72℃、5分の最終伸長を行った。原則として反応のアニーリング温度は63℃から58℃の範囲であった。さらにRT−PCRを異なる条件下においても実施したが、これはアニーリング温度を65℃から60℃に、または60℃から55℃に変化させて行った。PCR産物が得られなかった場合には、新しいプライマーセットを設計してそれらが本当に陰性であることを確認した。PCR産物は全て電気泳動により分離し、QIA quickTM Gel Extraction Kit(QIAGEN)を用いて精製した。精製PCR産物に対するTAクローニングを、pBluescriptII SK(−)を用いて実施し、ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems,Foster City,VA)を用いてシーケンス分析を行った。
1−6.ノーザンブロット分析
ノーザンブロットは、30種類のESTsとGPC5 cDNAを用いて、5種類の細胞株(Rec1、Karpas 1718、OCI−Ly4、Jurkat、ATN−1)ならびにヒト胎盤に対して実施した。さらに行った分析では候補遺伝子であるBC040320とGPC5を用いたが、これは当該領域に対する候補遺伝子としてこれまでに報告されていることから対象に含めた(Yu,W.et al.J Hum Genet.,48:331−335,2003)。ここでは13q31−q32において高度な増幅を示す細胞株(Rec1、Karpas 1718、OCI−Ly4)、ならびに増幅を示さない細胞株(Jurkat、ATN−1)に対して、各ESTsとGPC5の発現を比較した。BC040320とGPC5の発現を詳しく調べるため、複数の細胞株と患者についてノーザンブロット分析も実施した。ノーザンブロットハイブリダイゼーション法は標準法により実施した(Naoe,T.et al.Cancer Genet Cytogenet.,34:77−88.1988)。それぞれのRT−PCR産物を、PCRを用いて標識した特異的プローブとして用いた。すなわち、10ngのRT−PCR産物を[α−32P]−dCTPを用いて、PCRにより標識化した。反応の実施は変性(94℃、0.5分)、アニーリング(55℃、0.5分)、伸長(72℃、2.5分)の過程を25回繰り返し、5分間にわたり72℃最終伸長を行うというものであった。全ての細胞RNA(5μg)は、1%アガロース/0.66Mホルムアルデヒドゲル上で大きさにより分画し、Hybond−N+ナイロン膜(Amersham Pharmacia Biotech、Tokyo、Japan)上に転写した。次にこの膜を42℃で[α−32P]−dCTP標識化プローブを用いて一夜にわたりハイブリッド化し、洗浄し、その後BIOMAXTM MSフィルムに曝露した(EKC、Rochester、NY)。
1−7.候補遺伝子の分析
BC040320は13q31−q32増幅領域の候補遣伝子であるが、これをさらに分析した。候補遺伝子のシーケンスを確認するためにBC040320のエクソン1とエクソン4の間でRT−PCRを行ったが、ここではBC040320のエクソン1側についてデザインしたプライマー5’−TCCGGTCGTAGTAAAGCGCAGGCG−3’(SEQ ID NO:2)と、エクソン4側についてデザインした5’−CTGAAGTCTCAAGTGGGCAT−3’(SEQ ID NO:3)を用いた。PCR反応はRT−PCRの箇所で説明した方法と同様に行った。
2.結果
2−1.アレイCGH分析
BAC/PACクローン1,966種類からなるアレイCGHを、正常男性と正常女性を比較して調査し、常染色体に由来する信号のlog2比はほとんどが+0.2から−0.2の範囲にあることを示した(図8A)。コピー数変化の線形性については、異なる数のX染色体を有する細胞株を用いて調べた。図8Bに示すように、それぞれ計算された平均蛍光比率をプロットした結果から、蛍光比は一つのコピー数の変化に比例することが示された。4種類の細胞株(Karpas 1718、Rec1、OCI−Ly4、OCI−Ly7)と1例のDLBCL患者(D778)を調べるために用いたアレイCGHによって、13q31−q32にコピー数変化の高度な増加が見られることが判った。図9Aには、Karpas 1718に関するアレイCGHの代表的な結果を示している。3種類の細胞株(Karpas 1718、Rec1、OCI−Ly7)ならびに1例のDLBCL患者(D778)より得られた第13染色体に関する詳細な結果は、図8Bに示している。従来のCGHならびにFISH分析により、これらのアレイCGHデータが明確に確認された(図9)。
2−2.13q31−q32における共通増幅領域
13q31−q32における単位複製配列を絞り込むため、3種類の細胞株(Karpas 1718、Rec1、OCI−Ly4)について、13q31−q32に位置する19BAC/PACプローブ(図10A)を用いてFISH分析を実施したところ、13q31−q32での共通増幅領域は、RP11−29C8とRP11−93M14の間に位置することが判明した。高分解能アレイCGHデータは図10Bに示している。Karpas1718とD778(DLBCL患者試料)では、第13q染色体に50Mbを超える広範囲の増幅が見られた。高レベルの増幅(log2比>1として定義)を示す小規模なゲノム領域が13q22.2から13q31.3まで伸長しており、ここで特に13q31.3の領域は2を上回る、比較的高いlog2比を示していた。同様に、OCI−Ly7とRec1もやはり高レベルの増幅を示し、それは13q31.3に限定されていた。これらの結果から、高レベルの共通増幅領域はRP11−360A9からRP11−481A22まで伸長していることが明らかになった。このFISHならびにアレイCGHの結果をもとに、RP11−360A9とRP11−93M14の間のゲノム領域を、4種類の細胞株と1例のDLBCL患者における共通かつ最少の増幅領域として規定した。
2−3.染色体13q31.3のESTsに関するRT−PCR分析
65種類のESTsとGPC5は13q31.3の共通増幅領域に位置しているが、これらの発現について、3種類の細胞株(Karpas 1718、OCI−Ly4p、Rec1)ならびに胎児脳に由来するcDNAを用いて、RT−PCR解析を行った。RT−PCR産物をゲル電気泳動により調べた。陽性シグナルが見られる場合に、予想サイズのバンドが検出されたと定義した。その結果のまとめを表8に示す。30種類のESTsとGPC5が予想サイズのバンドを示し、これらは13q31.3の増幅が見られる3種類の細胞株全てにおいて陽性であることが判明し、またそれらをヌクレオチド配列により確認した。15種類のESTsも同様に予想サイズを示したが、RT−PCR分析ではわずか1または2種類の細胞株でしか示されず、そのためこれらは、13q31.3における増幅に関連する候補ESTsより除外した。残った21種類のESTsはOCI−Ly4と胎児脳のいずれにおいてもバンドを全く示さなかった。これらについて、同様に他のプライマセットを用いて調べたが、やはりバンドが検出されなかったため、これらも候補ESTsより除外した。このようにして、65種類中35種類のESTsを除外し、以後の分析を行わなかった。
2−4.ノーザンブロット処理
30種類のESTsとGPC5の発現パターンを同定するため、ヒト胎盤である6種類のRNAs、13q31.3増幅を示す3種類のB細胞リンパ腫細胞株(Rec1、Karpas 1718、OCI−Ly4)、13q31.3増幅を示さない2種類のT細胞リンパ腫細胞株(Jurkat、ATN−1)について、ノーザンブロットを用いた。22種類のESTsについては、全ての細胞株においてほとんど検出可能なバンドが見られなかった(表9)。図11に代表的なESTsの発現パターンを示す。AF339828とBC040320では、約6kbの転写産物と6kbより大きなスメア状のバンドによる同様な発現パターンが見られた。信号が観察されたのは3種類のB細胞リンパ腫細胞株のみであり、ヒト胎盤やT細胞株では観察されなかった。GPC5は13q31−q32における共通増幅領域の内部に不完全に含まれる遺伝子であるが、これは全ての細胞株とヒト胎盤において、約5kbの転写産物の弱い発現を同様な強度で示した。他のESTsの13q31.3におけるコピー数に関しては、細胞株とヒト胎盤を比べてなんら違いが見られなかった。そのため、AF339828とBC040320を13q31.3における増幅に関する最も可能性の高い標的遺伝子であると考えた。2種類のESTsを用いて、患者試料や正常組織を含む各種試料に対する研究をさらに行い、また13q31.3増幅に関する標的遺伝子であると報告されているGPC5についても調べた。
BC040320プローブを用いたノーザンブロットの結果を図12に示す。13q31−q32における増幅を示す細胞株5種類(Rec1、Karpas 1718、OCI−Ly4、OCI−Ly7、OCI−Ly8)において、高レベルのBC040320発現が観察された。この5種類の細胞株の場合より低レベルの発現が、増幅の見られない3種類の細胞株(Karpas 422、SP49、SUDHL6)で観察された。さらに、増幅を示す患者2例では、増幅を示さない他の患者2例と比較して高い発現が見られた。これらの結果から示されるのは、従来のCGHとアレイCGHの両方により示されるコピー数の増加と並行して、BC040320の発現が生じていることである。同じ膜上で、13q31−q32での増幅を示す細胞株5種類におけるGPC5の発現は、増幅を示さないそれ以外の細胞株の場合と顕著に異なることはなく、そのためにGPC5は候補遺伝子である可能性が低いと考えられる。また、各種造血性細胞株(T細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄性白血病、NK/T細胞リンパ腫)についてBC040320の発現パターンを調べた(図14)。高レベル増幅を示す2種類の細胞株と比較した場合に、一部の細胞株は弱いシグナルを示した。GPC5cDNAもやはり非常に弱いシグナルを示し、顕著な違いはなかったが、ある程度の変化があった。正常組織を調べた場合、肺、胸腺、リンパ節を例外としてBC040320シグナルはほとんど観察できなかった(図15)。
結論として、それぞれのプローブを用いたノーザンブロットの結果から、13q31−q32におけるコピー数の増加と並行してBC040320の発現が生じており、従ってBC040320が候補遺伝子である可能性が最も高いことが判明した。
2−5.候補遺伝子の全長、ゲノム位置、特徴決定
FISH、アレイCGH、ノーザンブロット分析の結果をもとに、AF339828とBC040320が可能性の最も高い候補遺伝子であるところまで絞り込んだ。これらの候補遺伝子をC13orf25(Chromosome 13 open reading frame 25)と命名したが、これはHUGO Gene Nomenclature Committee(http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/)の勧告に従っている。
この遺伝子とcDNA構造の特徴をさらに調べるために、ここでBC040320のエクソン1−エクソン4についてRT−PCRを実施した。2種類の転写産物を入手し、シーケンス分析により短いものが転写産物−A、長いものが転写産物−Bであることが判明した(図14)。Vega Genome Browserを用いたデータベース検索によれば、bA121J7.2(Vega_gene ID)もやはりこの領域に存在することが示された(http://vega.sanger.ac.uk/)。32アミノ酸(AA)からなるペプチドがbA121J7.2であると予想された。またこのbA121J7.2であると予想される32−AAペプチドは、転写産物−Aであると予想された。さらに同じ開始コドンから、70−AAのポリペプチドが転写産物−Bであると予想された。また特筆すべき点として、7種類のmicroRNAs(miRNA)(microRNA miR−17、miR−91、miR−18、miR−19a、miR−20、miR−19b、miR−92)を含む、5種類の前駆体microRNAs(miR91−前駆体−13マイクロRNA、miR18−前駆体−13マイクロRNA、miR19a−前駆体−13マイクロRNA、miR19b−前駆体−13マイクロRNA、miR92−前駆体−13マイクロRNA)もやはり転写産物−Bのシーケンス内に認められた(図14)。
3.考察
これまでに広範囲のヒト腫瘍について13qの遺伝子変化が報告されていおり、これには造血性悪性疾患も含まれている。FISHならびにCGHを用いた近年の分子遺伝学的研究により、造血性悪性疾患では13q31−q32における増幅がしばしば検出されることが示されている。B細胞悪性疾患においては、13q21−qterにおける増幅が頻繁に現れている(Rao,P.H.et al.Blood,92:234−240,1998;Monni,O.et al.Genes Chromosomes Cancer,21:298−307,1998;Neat,M.J.et al.Genes Chromosomes Cancer,32:236−243,2001;Mao,X.et al.Genes Chromosomes Cancer,35:144−155,2002)。近年、B細胞リンパ腫細胞株における13q31−q32増幅領域に対する候補遺伝子として、GPC5の存在が提唱されている(Yu,W.et al.J Hum Genet.,48:331−335,2003)。今回の試験では、アレイCGHを用いてGPC5遺伝子座のゲノム変異を、またノーザンブロットを用いてGPC5の発現を調べた。13q31.3における2Mbのゲノム領域中のGPC5シーケンスは、おおよそBAC、RP11−121J7からBAC、RP11−268K13までの範囲にわたっている。実施したRec1に関するアレイCGHデータによれば、エクソン6とエクソン7の間に存在するGPC5のイントロンを位置付けるBAC、RP11−481A22のlog2比は、コピー数の減少を示していることが判った(log2比=−0.76)。アレイデータの示すところによれば、このBACのテロメア側に位置する他のBACも、やはり減少を示しているという。GPC5のエクソン3、エクソン4、エクソン5を含む新しいBACクローンであるRP11−93M14を用いてRec1に対するFISHを行ったが、そのデータでもやはりコピー数の減少が見られた。これらの結果からGPC5遺伝子座は、細胞株の13q31−q32における共通増幅領域内部に完全には含まれておらず、この対立遺伝子中のGPC5は機能していないこともない可能性が考えられる。
ノーザンブロットにより同様に示されるところでは、13q31−q32の増幅を示す細胞株におけるGPC5の発現は、増幅を示さない他の細胞株の場合と比べて有意差がなかった。一方、BC040320とAF339828はいずれも13q31−q32の増幅を示すB細胞リンパ腫細胞株においてのみ発現しており、13q31−q32の増幅を示さないT細胞リンパ腫やヒト胎盤などでは発現しなかった。これらのESTsは13q31−q32における共通増幅領域に完全に含まれていた。ノーザンブロットを用いた詳細な分析から、BC040320の発現は、従来法ならびにアレイCGHの両者により示されるコピー数の増加に、ほぼ並行して見られることが示された。ノーザンブロット分析により、BC040320は13q31−q32の増幅が見られるB細胞リンパ腫細胞株において特に過剰発現しており、リンパ腫組織を含む正常組織ではほとんど発現していないことが示された。しかし13q31−q32の増幅が見られないSP49(MCL細胞株)やSUDHL6(B細胞リンパ腫細胞株)においても、BC040320のわずかなmRNAの発現が見られることから(図14)、この発現はコピー数の増加によるものではなく、おそらくまだ完全に理解されていない他の理由により生じているのだろう。これらの結果から、BC040320が13q31−q32の増幅に対する候補遺伝子である可能性が最も大きいと考えられる。発明者らはこの候補遺伝子をC13orf25(Chromosome 13 open reading frame 25)と命名した。
C13orf25 cDNAの妥当性を確認するためにRT−PCRを行い、2種類の転写産物(転写産物−Aと−B)が得られた。Vegaゲノムブラウザ(http://vega.sanger.ac.uk/)によりbA121J7.2という遺伝子の存在が予想されたが、これは転写産物−A cDNA内で32−AAポリペプチドをコードしている。転写産物−B中の可能性のあるORFも同様に予想され、これは同一のATGから開始する70−AAのポリペプチドをコードしている(図14)。C130rf25のゲノム構造は3側で不完全になっている可能性があるが、これはBC040320と同一のハイブリダイゼーションパターンを示すAF339828が、C13orf25の近傍に観察され、C13orf25の300−bp下流に位置しているためであった。BC040320を用いたノーザンブロット分析では複数のバンドが存在したため、各種トランスクリプトも同様に産生される可能性があったが、しかしRT−PCRでは主要な転写産物が示された。NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)を用いたコンピュータ解析の結果から、C13orf25の予想タンパク質にはこれらのトランスクリプト中の推定ドメインが含まれていないことが示された。
7種類のmicroRNA(miRNA)(microRNA miR−17、miR−91、miR−18、miR−19a、miR−20、miR−19b、miR−92)を含む、5種類の前駆体microRNAs(miR91−前駆体−13 マイクロ RNA、miR18−前駆体−13マイクロ RNA、miR19a−前駆体−13 マイクロ RNA、miR19b−前駆体−13 マイクロ RNA、miR92−前駆体−13 マイクロ RNA)が転写産物−Bのシーケンスから得られた。報告によれば、ヒト(Kawasaki,H.,and Taira,K.Nature(Lond.),423:838−842,2003)ならびにC.eleganss(.Lee,R.C.et al.Cell,75:843−854,1993;Reinhart,B.J.et al.Nature(Lond.),403:901−906,2000;Pasquinelli,A.E.et al.Nature(Lond.),408:86−89,2000;Slack,F.J.et al.Mol Cell,5:659−669,2000)におけるmicroRNAの機能は、標的遺伝子の発現を調節することでる。A.thalianaにおいて、miRNAsはやはりmRNAの開裂を媒介している(Llave,C.et al.Science(Wash.DC),297:2053−2056,2002;Tang,G.et al.Genes Dev.,17:49−63,2003)。近年のCalin et al.の報告(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:15534−15529,2002)によれば、慢性リンパ性白血病と、miR−15とmiR−16に関する遺伝子を含む第13染色体の節の欠失との間に関係があるという。C13orf25遺伝子上にこれらのmiRNAが存在することから、腫瘍発生過程に関する洞察が得られるであろう。
この実施例2の試験では、C13orf25が増幅に関する候補遺伝子として最も可能性が高く、GPC5はそうではないことを示すことができた。C13orf25遺伝子の発現はゲノム増幅に関連して生じ、腫瘍発生ならびにその結果生じる予後不良化に重要な役割を果たしている可能性がある。
7種類のmiRNAsを含むC13orf25の機能についてさらに調査を行うことによって、腫瘍発生にC13orf25が果たす役割に関する洞察が得られることが期待される。
1−1.細胞株、腫瘍標本とCGH法
使用した細胞株はKarpas 1718(有毛リンパ球を有する脾リンパ腫:SLVL)(Martinez−Climent,J.A.et al.Blood,101:3109−3117,2003)、OCI−Ly4、OCI−Ly7、OCI−ly8(DLBCL、Columbia University,NY,NYの R.Dalla−Favera博士から提供)、Rec1(マントル細胞リンパ腫:MCL、Leicester University,Leicester,UKのM.Dyer博士から提供)(Martinez−Climent,J.A.et al.Blood,98:3479−3482,2001)、Karpas 422(B細胞リンパ腫細胞株)(Dyer,M.J.et al.Blood,75:709−714,1990)、ATN−1(成人T細胞リンパ腫細胞株、Nagoya University School of Medicine,Nagoya,JapanのT.Naoe博士から提供)(Naoe,T.et al.Cancer Genet Cytogenet.,34:77−88.1988)であった。SUDHL6(Southwestern University Diffuse Histiocytic Lymphoma細胞株、B細胞リンパ腫)、SP49(MCL細胞株)、Jurkat(T細胞急性リンパ性白血病)、その他の細胞株については他の文献に説明されている(Takizawa,J.et al.Jpn J cancer Res.,89:712−718,1998)。各種コピー数のX染色体を持つ細胞株は、NIGMS Human Genetics Cell Repository Coriell Institute for Medical Research(Camden、NJ)より購入した。患者試料はインフォームドコンセントにより収集しており、またこの実験は愛知がんセンターのIRB(施設審査委員会)の承認を得た。細胞株は全て10%ウシ胎児血清を添加したRPMI1640中で維持した。ゲノムDNAの抽出は、プロテイナーゼK消化とフェノール・クロロホルム抽出を用いた標準処置により行った。従来CGHとアレイCGHで使用する正常DNAの調製は、正常男性より得た末梢血リンパ球を用いて行った。「従来型」CGHの実施は、メーカーのプロトコルに従って実施した(Vysis、Downers Grove、IL)。
1−2.アレイCGH
アレイ製造ならびにハイブリダイゼーションの実施は、それぞれHodgson et al(Nat Genet.,29:459−464,2001)ならびにPinkel et al(Nat.Genet.,23:41−46,1998)に記載の方法に従って行った。アレイは2,088種類のBACならびにPACクローンにより構成され、ほぼ1.5−Mbの解像度でヒトゲノムをカバーしており、BACクローンについてはRP11、13のライブラリを、PACクローンについてはRP1、3、4、5をもとにしている。これらのクローンの入手先は、Oakland、CAにあるChildren’s Hospital Oakland Rescarch Institute内のBACPAC Resource Center(http://bacpac.chori.org/)である。各クローンの培養は、クロラムフェニコール(25μg/ml)存在下のTerrific Broth(TB)培地中で行い、BACならびにPACDNAの抽出はplasmid Mini−kit(QIAGEN、Germantown、MD)を用いて行った。各クローンの位置確認はやはりFISH分析により行った。これらのクローンのおよそ10%は予想された位置に確認されなかったため試験から除外し、確認されたクローンを用いてアレイCGHを行った。10ngのBACならびにPACDNAをテンプレートに用いて、プライマー5’−CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG−3’(SEQ ID NO:1)を用いた変性オリゴヌクレオチドプライマー使用PCR(DOP−PCR)を行った(Hakan,T.et al.Genomics,13:718−725,1992)。増幅はTakara PCR Thermal Cycler MP(TaKaRa、Tokyo、Japan)とExTaqポリメラーゼ(TaKaRa)を用いて行った。DOP−PCR産物をエタノール沈殿により濃縮し、蒸留水で溶解し、続いて等量のDNAスポッティング溶液DSP0050(MATSUNAMI、OSAKA、JAPAN)を添加した(〜1μg/μl)。DNAは二重に、CodeLinkTM活性化スライド(Amersham Biosciences、Piscataway、NJ)上に機械的にスポットした(NGK Insulators,Ltd.、Nagoya、Japan)。試験DNAならびに対照DNA(各1μg)をDpnIIで消化し、Bio prime DNA labeling system(Invitrogen Life Technologies,Inc.、Tokyo、Japan)により、それぞれcyanine3−dUTPならびにcyanine5−dUTP(Amersham Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ)を用いて標識した。取り込まれなかった蛍光ヌクレオチドは、SephadexG−50スピンカラム(Amersham Biosciences)を用いて除去した。標識化された1μgの試験DNAならびに対照DNA試料を、100μgのHuman Cot−1 DNA(Invitrogen Life Technologies)と混合して沈殿させ、その後45μlのハイブリダイゼーション混合液中にペレットを再懸濁したが、この混合液の内容は50%ホルムアミド、10%デキストラン硫酸、2x SSC、4%SDS、10μg/μl酵母tRNA(Invitrogen Life Technologies)であった。このハイブリダイゼーション溶液を73℃で5分間加熱してDNAを変性させ、続いて37℃で45分間インキュベートして反復配列のブロッキングがなされるようにした。DNAをスポットしたスライドは、70%ホルムアミド/2x SSCを含む溶液中で73℃で4分間にわたり変性させ、続いてそれぞれ5分ずつ、70%、85%、100%冷エタノール中で脱水して風乾させた。ハイブリダイゼーションは、緩やかに振動するテーブル上で、湿度調節のために200μlの50%ホルムアミドと2x SSCを含む容器中で48時間にわたり行い、これに続いてハイブリダイゼーション後洗浄を、50%ホルムアミド/2x SSC中50℃で15分間、2x SSC/0.1%SDS中50℃で30分間、0.1M NaH2PO4、pH8の0.1M Na2HPO4、0.1%NP−40により構成されるPN緩衝液中室温で15分間行い、2x SSC中室温ですすぎを行い、最後に室温にてそれぞれ2分ずつ70%、85%、100%エタノール中で脱水して風乾した。スキャニング分析は基本的にAgilent Micro Array Scanner(Agilent Technologies、Palo Alto、CA)を用いて実施した。このようにして得たアレイ像を、Genepix Pro 4.1を用いて分析した(Axon Instruments,Inc.、Foster City、CA)。DNAスポットを自動的に分割し、局所的バックグラウンドを減算し、2種類の色素の全体的強度と蛍光強度比を各スポットごとに計算した。2種類の色素の蛍光強度比(Cy3強度/Cy5強度)はlog2強度比に変換した(log2比)。
この実験で用いるアレイについて、正常男性に対する正常男性の同時ハイブリダイゼーション6種類を実施し、log2比の正規変動を定義した。この実験では122種類のクローンが、全クローンの蛍光強度の平均値の1/10未満を示したため、これらをアレイCGH分析から除外した。残った1,966種類のクローンを用いて、アレイCGH分析を行った。各スポット(2x 1,966クローン)について測定された蛍光log2比率の95%以上が+0.2?−0.2の範囲になった。増加と減少のlog2比の閾値は、それぞれ+0,2と−0.2のlog2比に設定した。また、各試料のlog2比を次に述べる方法に従って正規化した。
全クローンの平均log2比を計算し、log2比が「中央値+SD×A」以上、または「中央値−SD×A」未満であるクローンを選択した。「A」は各実験ごとの全てのクローンのlog2比のプロットを参照することにより、正常領域として視覚的に定義した。また「A」はほぼ0.3から0.7の範囲に割り当てられた。次に選択されたクローンについて、平均log2比率を計算し、この平均log2比率を「X」とした。最後に各クローンのlog2比から「X」を引いて「Y」値を得た。この試験では、それぞれのlog2比について「Y」値をもとに分析した。ここではクローンを視覚的に選択し、それぞれの実験ごとにSD値を計算し、そのSD値が0.15を上回らないことを確認した。もし上回る場合には当該値はCGH分析のために信頼できないと見なした。
正常男性と正常女性のアレイハイブリダイゼーションを実施し、X染色体のあるコピー数に何らかの変化があるかどうかを調べた。コピー数変化に伴う線形性を確認するため、正常に対して、異なるX染色体数を有する各細胞株(GM04626:47XXX;GM01415D:48XXXX;GM05009C:49XXXXX)のアレイハイブリダイゼーションも、同様に実施した。これらの細胞株はNIGMS Human Genetics Cell Repository Coriell Institute for Medical Researchより取得した。X染色体のBACまたはPACクローン57種類をこの分析に用いた。それぞれのハイブリダイゼーションごとに、これらのクローンの平均log2比率を計算した。
1−3.FISH分析
13q31−q32上のBACクローンの位置を、Ensembl Genome Data Resources(http://www.ensembl.org/)による保管データをもとに確認した。およそ15MbをカバーするアレイCGHにより示された、13q31−q32の高レベル増幅領域周辺に位置する19種類のBACクローンを用いたFISH分析を、3種類の細胞株に対して用いた(Karpas 1718、OCI−Ly4、Rec1)。細胞株のそれぞれの分裂間期染色体スライドは、標準法に従って調製した。FISHの実施は文献(Tagawa,H.et al.Oncogene,in press,2003)記載の方法に従って実施した。
1−4.ESTsと遺伝子の位置
13q31.3染色体領域上に位置するESTsと遺伝子は、National Center for Biotechnology Information(NCBI;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、Ensembl genome data resource(http://www.ensembl.org/)、the University of California at Santa Cruz(UCSC;http://www.genome.ucsc.edu/)を参照した。アレイCGHとFISH分析により、13q31−q32における共通増幅領域はBACのRP11−360A9からBACのRP11−93M14までに渡っていることが示された。この領域には互いに重複しない65種類の独立したESTsと、GPC5が含まれていた(表8)。
1−5.逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)分析
FISHならびにアレイCGHにより、13q31.3上に高い増幅が見られた3種類の細胞株、すなわちRec1、Karpas 1718、OCI−Ly4を用いてRT−PCR分析を行った。胎児脳より得たcDNAも分析した。RNA試料中に混在したゲノムDNAによる増幅を避けるため、RNAを増幅グレードのDNaseI(Invitrogen Life Technologies,Inc.)で処置し、その後で試料のcDNA合成を行ったが、これはSuperScriptII(GIBCO−BRL、Div.of Life Technologies,Inc.、Gaitherburg、USA)を用いて実施した。すなわち、それぞれ5μlのトータルRNAを逆転写し、40μlの蒸留水中に溶解したcDNAとした。RT−PCRは65種類のESTsとGPC5について、特異的プライマーを用いて実施した(表8)。各プライマーの設計は、Tm値が55℃から 60℃の範囲になるようにした。増幅の実施にはThermal Cycler(Perkin−Elmer Corporation、Norwalk、CT)を用いた。RT−PCRは、文献(Motegi,M.et al.Am J Pathol.,156:807−812,2000)に記載されているタッチダウンPCR法により実施した。すなわち反応の内容は、10サイクルの変性(94℃、0.5分)、アニーリング(63℃、0.5分、2サイクルごとに1℃減少)、伸長(72℃、2.5分)に続き、35サイクルの変性(94℃、0.5分)、アニーリング(58℃、0.5分)、伸長(72℃、2.5分)を行い、最後に72℃、5分の最終伸長を行った。原則として反応のアニーリング温度は63℃から58℃の範囲であった。さらにRT−PCRを異なる条件下においても実施したが、これはアニーリング温度を65℃から60℃に、または60℃から55℃に変化させて行った。PCR産物が得られなかった場合には、新しいプライマーセットを設計してそれらが本当に陰性であることを確認した。PCR産物は全て電気泳動により分離し、QIA quickTM Gel Extraction Kit(QIAGEN)を用いて精製した。精製PCR産物に対するTAクローニングを、pBluescriptII SK(−)を用いて実施し、ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems,Foster City,VA)を用いてシーケンス分析を行った。
1−6.ノーザンブロット分析
ノーザンブロットは、30種類のESTsとGPC5 cDNAを用いて、5種類の細胞株(Rec1、Karpas 1718、OCI−Ly4、Jurkat、ATN−1)ならびにヒト胎盤に対して実施した。さらに行った分析では候補遺伝子であるBC040320とGPC5を用いたが、これは当該領域に対する候補遺伝子としてこれまでに報告されていることから対象に含めた(Yu,W.et al.J Hum Genet.,48:331−335,2003)。ここでは13q31−q32において高度な増幅を示す細胞株(Rec1、Karpas 1718、OCI−Ly4)、ならびに増幅を示さない細胞株(Jurkat、ATN−1)に対して、各ESTsとGPC5の発現を比較した。BC040320とGPC5の発現を詳しく調べるため、複数の細胞株と患者についてノーザンブロット分析も実施した。ノーザンブロットハイブリダイゼーション法は標準法により実施した(Naoe,T.et al.Cancer Genet Cytogenet.,34:77−88.1988)。それぞれのRT−PCR産物を、PCRを用いて標識した特異的プローブとして用いた。すなわち、10ngのRT−PCR産物を[α−32P]−dCTPを用いて、PCRにより標識化した。反応の実施は変性(94℃、0.5分)、アニーリング(55℃、0.5分)、伸長(72℃、2.5分)の過程を25回繰り返し、5分間にわたり72℃最終伸長を行うというものであった。全ての細胞RNA(5μg)は、1%アガロース/0.66Mホルムアルデヒドゲル上で大きさにより分画し、Hybond−N+ナイロン膜(Amersham Pharmacia Biotech、Tokyo、Japan)上に転写した。次にこの膜を42℃で[α−32P]−dCTP標識化プローブを用いて一夜にわたりハイブリッド化し、洗浄し、その後BIOMAXTM MSフィルムに曝露した(EKC、Rochester、NY)。
1−7.候補遺伝子の分析
BC040320は13q31−q32増幅領域の候補遣伝子であるが、これをさらに分析した。候補遺伝子のシーケンスを確認するためにBC040320のエクソン1とエクソン4の間でRT−PCRを行ったが、ここではBC040320のエクソン1側についてデザインしたプライマー5’−TCCGGTCGTAGTAAAGCGCAGGCG−3’(SEQ ID NO:2)と、エクソン4側についてデザインした5’−CTGAAGTCTCAAGTGGGCAT−3’(SEQ ID NO:3)を用いた。PCR反応はRT−PCRの箇所で説明した方法と同様に行った。
2.結果
2−1.アレイCGH分析
BAC/PACクローン1,966種類からなるアレイCGHを、正常男性と正常女性を比較して調査し、常染色体に由来する信号のlog2比はほとんどが+0.2から−0.2の範囲にあることを示した(図8A)。コピー数変化の線形性については、異なる数のX染色体を有する細胞株を用いて調べた。図8Bに示すように、それぞれ計算された平均蛍光比率をプロットした結果から、蛍光比は一つのコピー数の変化に比例することが示された。4種類の細胞株(Karpas 1718、Rec1、OCI−Ly4、OCI−Ly7)と1例のDLBCL患者(D778)を調べるために用いたアレイCGHによって、13q31−q32にコピー数変化の高度な増加が見られることが判った。図9Aには、Karpas 1718に関するアレイCGHの代表的な結果を示している。3種類の細胞株(Karpas 1718、Rec1、OCI−Ly7)ならびに1例のDLBCL患者(D778)より得られた第13染色体に関する詳細な結果は、図8Bに示している。従来のCGHならびにFISH分析により、これらのアレイCGHデータが明確に確認された(図9)。
2−2.13q31−q32における共通増幅領域
13q31−q32における単位複製配列を絞り込むため、3種類の細胞株(Karpas 1718、Rec1、OCI−Ly4)について、13q31−q32に位置する19BAC/PACプローブ(図10A)を用いてFISH分析を実施したところ、13q31−q32での共通増幅領域は、RP11−29C8とRP11−93M14の間に位置することが判明した。高分解能アレイCGHデータは図10Bに示している。Karpas1718とD778(DLBCL患者試料)では、第13q染色体に50Mbを超える広範囲の増幅が見られた。高レベルの増幅(log2比>1として定義)を示す小規模なゲノム領域が13q22.2から13q31.3まで伸長しており、ここで特に13q31.3の領域は2を上回る、比較的高いlog2比を示していた。同様に、OCI−Ly7とRec1もやはり高レベルの増幅を示し、それは13q31.3に限定されていた。これらの結果から、高レベルの共通増幅領域はRP11−360A9からRP11−481A22まで伸長していることが明らかになった。このFISHならびにアレイCGHの結果をもとに、RP11−360A9とRP11−93M14の間のゲノム領域を、4種類の細胞株と1例のDLBCL患者における共通かつ最少の増幅領域として規定した。
2−3.染色体13q31.3のESTsに関するRT−PCR分析
65種類のESTsとGPC5は13q31.3の共通増幅領域に位置しているが、これらの発現について、3種類の細胞株(Karpas 1718、OCI−Ly4p、Rec1)ならびに胎児脳に由来するcDNAを用いて、RT−PCR解析を行った。RT−PCR産物をゲル電気泳動により調べた。陽性シグナルが見られる場合に、予想サイズのバンドが検出されたと定義した。その結果のまとめを表8に示す。30種類のESTsとGPC5が予想サイズのバンドを示し、これらは13q31.3の増幅が見られる3種類の細胞株全てにおいて陽性であることが判明し、またそれらをヌクレオチド配列により確認した。15種類のESTsも同様に予想サイズを示したが、RT−PCR分析ではわずか1または2種類の細胞株でしか示されず、そのためこれらは、13q31.3における増幅に関連する候補ESTsより除外した。残った21種類のESTsはOCI−Ly4と胎児脳のいずれにおいてもバンドを全く示さなかった。これらについて、同様に他のプライマセットを用いて調べたが、やはりバンドが検出されなかったため、これらも候補ESTsより除外した。このようにして、65種類中35種類のESTsを除外し、以後の分析を行わなかった。
2−4.ノーザンブロット処理
30種類のESTsとGPC5の発現パターンを同定するため、ヒト胎盤である6種類のRNAs、13q31.3増幅を示す3種類のB細胞リンパ腫細胞株(Rec1、Karpas 1718、OCI−Ly4)、13q31.3増幅を示さない2種類のT細胞リンパ腫細胞株(Jurkat、ATN−1)について、ノーザンブロットを用いた。22種類のESTsについては、全ての細胞株においてほとんど検出可能なバンドが見られなかった(表9)。図11に代表的なESTsの発現パターンを示す。AF339828とBC040320では、約6kbの転写産物と6kbより大きなスメア状のバンドによる同様な発現パターンが見られた。信号が観察されたのは3種類のB細胞リンパ腫細胞株のみであり、ヒト胎盤やT細胞株では観察されなかった。GPC5は13q31−q32における共通増幅領域の内部に不完全に含まれる遺伝子であるが、これは全ての細胞株とヒト胎盤において、約5kbの転写産物の弱い発現を同様な強度で示した。他のESTsの13q31.3におけるコピー数に関しては、細胞株とヒト胎盤を比べてなんら違いが見られなかった。そのため、AF339828とBC040320を13q31.3における増幅に関する最も可能性の高い標的遺伝子であると考えた。2種類のESTsを用いて、患者試料や正常組織を含む各種試料に対する研究をさらに行い、また13q31.3増幅に関する標的遺伝子であると報告されているGPC5についても調べた。
BC040320プローブを用いたノーザンブロットの結果を図12に示す。13q31−q32における増幅を示す細胞株5種類(Rec1、Karpas 1718、OCI−Ly4、OCI−Ly7、OCI−Ly8)において、高レベルのBC040320発現が観察された。この5種類の細胞株の場合より低レベルの発現が、増幅の見られない3種類の細胞株(Karpas 422、SP49、SUDHL6)で観察された。さらに、増幅を示す患者2例では、増幅を示さない他の患者2例と比較して高い発現が見られた。これらの結果から示されるのは、従来のCGHとアレイCGHの両方により示されるコピー数の増加と並行して、BC040320の発現が生じていることである。同じ膜上で、13q31−q32での増幅を示す細胞株5種類におけるGPC5の発現は、増幅を示さないそれ以外の細胞株の場合と顕著に異なることはなく、そのためにGPC5は候補遺伝子である可能性が低いと考えられる。また、各種造血性細胞株(T細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄性白血病、NK/T細胞リンパ腫)についてBC040320の発現パターンを調べた(図14)。高レベル増幅を示す2種類の細胞株と比較した場合に、一部の細胞株は弱いシグナルを示した。GPC5cDNAもやはり非常に弱いシグナルを示し、顕著な違いはなかったが、ある程度の変化があった。正常組織を調べた場合、肺、胸腺、リンパ節を例外としてBC040320シグナルはほとんど観察できなかった(図15)。
結論として、それぞれのプローブを用いたノーザンブロットの結果から、13q31−q32におけるコピー数の増加と並行してBC040320の発現が生じており、従ってBC040320が候補遺伝子である可能性が最も高いことが判明した。
2−5.候補遺伝子の全長、ゲノム位置、特徴決定
FISH、アレイCGH、ノーザンブロット分析の結果をもとに、AF339828とBC040320が可能性の最も高い候補遺伝子であるところまで絞り込んだ。これらの候補遺伝子をC13orf25(Chromosome 13 open reading frame 25)と命名したが、これはHUGO Gene Nomenclature Committee(http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/)の勧告に従っている。
この遺伝子とcDNA構造の特徴をさらに調べるために、ここでBC040320のエクソン1−エクソン4についてRT−PCRを実施した。2種類の転写産物を入手し、シーケンス分析により短いものが転写産物−A、長いものが転写産物−Bであることが判明した(図14)。Vega Genome Browserを用いたデータベース検索によれば、bA121J7.2(Vega_gene ID)もやはりこの領域に存在することが示された(http://vega.sanger.ac.uk/)。32アミノ酸(AA)からなるペプチドがbA121J7.2であると予想された。またこのbA121J7.2であると予想される32−AAペプチドは、転写産物−Aであると予想された。さらに同じ開始コドンから、70−AAのポリペプチドが転写産物−Bであると予想された。また特筆すべき点として、7種類のmicroRNAs(miRNA)(microRNA miR−17、miR−91、miR−18、miR−19a、miR−20、miR−19b、miR−92)を含む、5種類の前駆体microRNAs(miR91−前駆体−13マイクロRNA、miR18−前駆体−13マイクロRNA、miR19a−前駆体−13マイクロRNA、miR19b−前駆体−13マイクロRNA、miR92−前駆体−13マイクロRNA)もやはり転写産物−Bのシーケンス内に認められた(図14)。
3.考察
これまでに広範囲のヒト腫瘍について13qの遺伝子変化が報告されていおり、これには造血性悪性疾患も含まれている。FISHならびにCGHを用いた近年の分子遺伝学的研究により、造血性悪性疾患では13q31−q32における増幅がしばしば検出されることが示されている。B細胞悪性疾患においては、13q21−qterにおける増幅が頻繁に現れている(Rao,P.H.et al.Blood,92:234−240,1998;Monni,O.et al.Genes Chromosomes Cancer,21:298−307,1998;Neat,M.J.et al.Genes Chromosomes Cancer,32:236−243,2001;Mao,X.et al.Genes Chromosomes Cancer,35:144−155,2002)。近年、B細胞リンパ腫細胞株における13q31−q32増幅領域に対する候補遺伝子として、GPC5の存在が提唱されている(Yu,W.et al.J Hum Genet.,48:331−335,2003)。今回の試験では、アレイCGHを用いてGPC5遺伝子座のゲノム変異を、またノーザンブロットを用いてGPC5の発現を調べた。13q31.3における2Mbのゲノム領域中のGPC5シーケンスは、おおよそBAC、RP11−121J7からBAC、RP11−268K13までの範囲にわたっている。実施したRec1に関するアレイCGHデータによれば、エクソン6とエクソン7の間に存在するGPC5のイントロンを位置付けるBAC、RP11−481A22のlog2比は、コピー数の減少を示していることが判った(log2比=−0.76)。アレイデータの示すところによれば、このBACのテロメア側に位置する他のBACも、やはり減少を示しているという。GPC5のエクソン3、エクソン4、エクソン5を含む新しいBACクローンであるRP11−93M14を用いてRec1に対するFISHを行ったが、そのデータでもやはりコピー数の減少が見られた。これらの結果からGPC5遺伝子座は、細胞株の13q31−q32における共通増幅領域内部に完全には含まれておらず、この対立遺伝子中のGPC5は機能していないこともない可能性が考えられる。
ノーザンブロットにより同様に示されるところでは、13q31−q32の増幅を示す細胞株におけるGPC5の発現は、増幅を示さない他の細胞株の場合と比べて有意差がなかった。一方、BC040320とAF339828はいずれも13q31−q32の増幅を示すB細胞リンパ腫細胞株においてのみ発現しており、13q31−q32の増幅を示さないT細胞リンパ腫やヒト胎盤などでは発現しなかった。これらのESTsは13q31−q32における共通増幅領域に完全に含まれていた。ノーザンブロットを用いた詳細な分析から、BC040320の発現は、従来法ならびにアレイCGHの両者により示されるコピー数の増加に、ほぼ並行して見られることが示された。ノーザンブロット分析により、BC040320は13q31−q32の増幅が見られるB細胞リンパ腫細胞株において特に過剰発現しており、リンパ腫組織を含む正常組織ではほとんど発現していないことが示された。しかし13q31−q32の増幅が見られないSP49(MCL細胞株)やSUDHL6(B細胞リンパ腫細胞株)においても、BC040320のわずかなmRNAの発現が見られることから(図14)、この発現はコピー数の増加によるものではなく、おそらくまだ完全に理解されていない他の理由により生じているのだろう。これらの結果から、BC040320が13q31−q32の増幅に対する候補遺伝子である可能性が最も大きいと考えられる。発明者らはこの候補遺伝子をC13orf25(Chromosome 13 open reading frame 25)と命名した。
C13orf25 cDNAの妥当性を確認するためにRT−PCRを行い、2種類の転写産物(転写産物−Aと−B)が得られた。Vegaゲノムブラウザ(http://vega.sanger.ac.uk/)によりbA121J7.2という遺伝子の存在が予想されたが、これは転写産物−A cDNA内で32−AAポリペプチドをコードしている。転写産物−B中の可能性のあるORFも同様に予想され、これは同一のATGから開始する70−AAのポリペプチドをコードしている(図14)。C130rf25のゲノム構造は3側で不完全になっている可能性があるが、これはBC040320と同一のハイブリダイゼーションパターンを示すAF339828が、C13orf25の近傍に観察され、C13orf25の300−bp下流に位置しているためであった。BC040320を用いたノーザンブロット分析では複数のバンドが存在したため、各種トランスクリプトも同様に産生される可能性があったが、しかしRT−PCRでは主要な転写産物が示された。NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)を用いたコンピュータ解析の結果から、C13orf25の予想タンパク質にはこれらのトランスクリプト中の推定ドメインが含まれていないことが示された。
7種類のmicroRNA(miRNA)(microRNA miR−17、miR−91、miR−18、miR−19a、miR−20、miR−19b、miR−92)を含む、5種類の前駆体microRNAs(miR91−前駆体−13 マイクロ RNA、miR18−前駆体−13マイクロ RNA、miR19a−前駆体−13 マイクロ RNA、miR19b−前駆体−13 マイクロ RNA、miR92−前駆体−13 マイクロ RNA)が転写産物−Bのシーケンスから得られた。報告によれば、ヒト(Kawasaki,H.,and Taira,K.Nature(Lond.),423:838−842,2003)ならびにC.eleganss(.Lee,R.C.et al.Cell,75:843−854,1993;Reinhart,B.J.et al.Nature(Lond.),403:901−906,2000;Pasquinelli,A.E.et al.Nature(Lond.),408:86−89,2000;Slack,F.J.et al.Mol Cell,5:659−669,2000)におけるmicroRNAの機能は、標的遺伝子の発現を調節することでる。A.thalianaにおいて、miRNAsはやはりmRNAの開裂を媒介している(Llave,C.et al.Science(Wash.DC),297:2053−2056,2002;Tang,G.et al.Genes Dev.,17:49−63,2003)。近年のCalin et al.の報告(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:15534−15529,2002)によれば、慢性リンパ性白血病と、miR−15とmiR−16に関する遺伝子を含む第13染色体の節の欠失との間に関係があるという。C13orf25遺伝子上にこれらのmiRNAが存在することから、腫瘍発生過程に関する洞察が得られるであろう。
この実施例2の試験では、C13orf25が増幅に関する候補遺伝子として最も可能性が高く、GPC5はそうではないことを示すことができた。C13orf25遺伝子の発現はゲノム増幅に関連して生じ、腫瘍発生ならびにその結果生じる予後不良化に重要な役割を果たしている可能性がある。
7種類のmiRNAsを含むC13orf25の機能についてさらに調査を行うことによって、腫瘍発生にC13orf25が果たす役割に関する洞察が得られることが期待される。
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、DLBCL患者の予後が正確に診断可能となる。この出願の発明は、医療関係分野や各種の試薬製造分野等の産業分野で利用可能である。
Claims (21)
- CD5陽性のびまん性大細胞型B細胞リンパ腫(CD5+DLBCL)患者と、CD5陰性のびまん性大細胞型B細胞リンパ腫(CD5−DLBCL)患者の予後を診断する方法であって、それぞれのリンパ腫患者から染色体DNAを単離し、この染色体DNAにおいて、
(1) 第13染色体 q21.1−q31.3(13q21.1−131.3)領域の増幅があるCD5+DLBCL患者の予後は不良;
(2) 第1染色体 p36.21−p36.13(1p36.21−p36.13)領域の欠失があるCD5+DLBCL患者の予後は不良;および
(3) 第5染色体 p15.33−p14.2(5p15.33−p14.2)領域の増幅があるCD5−DLBCL患者の予後は良好、
と判定することを特徴とする方法。 - 染色体領域を含む複数のDNAプローブと患者からの染色体DNAとのハイブリダイゼーションによって染色体領域の増幅または欠損を測定する請求項1の方法。
- DNAプローブがBAC/PAC DNAクローンである請求項2の方法。
- ハイブリダイゼーションを固相単体上で行う請求項2または3の方法。
- 請求項4の方法に使用し、染色体領域を含む複数のDNAプローブを固相単体上に固定したDNAアレイ。
- DNAプローブがBAC/PAC DNAクローンである請求項5のDNAアレイ。
- CD5+DLBCL患者と、CD5−DLBCL患者の予後を診断する方法であって、リンパ腫患者から生体試料を単離し、この生体試料において、
(1) 13q21.1−131.3領域に含まれる遺伝子の発現増加があるCD5+DLBCL患者の予後は不良;
(2) 1p36.21−p36.13領域に含まれる遺伝子の発現低下があるCD5+DLBCL患者の予後は不良;および
(3) 5p15.33−p14.2領域に含まれる遺伝子の発現増加があるCD5−DLBCL患者の予後は良好、
と判定することを特徴とする方法。 - 13q21.1−131.3領域に含まれる遺伝子が、以下の特徴:
(a) SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードすること;および/または
(b) 以下の前駆microRNA:
miR91−前駆−13microRNA、miR18−前駆−1、3microRNA、miR19a−前駆−13microRNA、miR19b−前駆−13microRNAおよびmiR92−前駆−13microRNAと、
以下の成熟microRNA:
miR−17、miR−91、miR−18、miR−19a、miR−20、miR−19bおよびmiR−92
を転写すること、
を有する遺伝子C13orf25である請求項7の方法。 - 遺伝子の発現増加または発現減少を、遺伝子転写産物を測定することによって判定する請求項7の方法。
- 遺伝子転写産物がmRNAである請求項9の方法。
- 遺伝子の全長または一部であるDNAプローブと、遺伝子mRNAまたはcDNAとのハイブリダイゼーションによって遺伝子の発現増加または発現減少を測定する請求項10の方法。
- ハイブリダイゼーションを固相単体上で行う請求項11の方法。
- 請求項12の方法に使用し、DNAプローブを固相単体上に固定したDNAアレイ。
- 遺伝子転写産物がタンパク質である請求項9の方法。
- タンパク質に特異的に結合する抗体を用いて遺伝子転写産物の増減を判定する請求項14の方法。
- 請求項15の方法に使用する抗体。
- SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:5のアミノ酸配列を認識する請求項16の抗体。
- 以下の特徴:
(a) SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードすること:および/または
(b) 以下の前駆microRNA:
miR91−前駆−13microRNA、miR18−前駆−1、3microRNA、miR19a−前駆−13microRNA、miR19b−前駆−13microRNAおよびmiR92−前駆−13microRNAと、
以下の成熟microRNA:
miR−17、miR−91、miR−18、miR−19a、miR−20、miR−19bおよびmiR−92
を転写すること、
を有する遺伝子C13orf24の精製ポリヌクレオチド。 - 請求項18のポリヌクレオチドの一部連続配列からなり、遺伝子C13orf25とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ。
- 請求項19のオリゴヌクレオチドプローブを備えたDNAアレイ。
- 遺伝子C13orf25をPCR増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー。
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