JP5728743B2 - 関節リウマチの診断のためのバイオマーカー、方法およびキット - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、２００９年３月３０日に出願された欧州特許出願第EP 09 305 266.1号および２００９年１１月６日に出願された欧州特許出願第09 306 063.0号の優先権を主張する。欧州特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

発明の背景
関節リウマチ（ＲＡ）は、世界人口の約１％が罹患する慢性的な自己免疫疾病である。それは、関節の滑膜の裏打ちにおける炎症および細胞増殖によって特徴付けられ、最終的には軟骨および骨の破壊、関節変形および可動性の低下が起こり得る。ＲＡは通常、同時にしばしば対称的にいくつかの関節に問題を引き起こす。初期ＲＡはまず、手首、手、足首、および足における関節などの、より小さな関節を冒す傾向がある。疾病が進行するにつれて、肩、肘、膝、股関節、顎および頸部の関節も罹患し得る。関節内または関節周辺の領域のみを冒す他の関節炎容態とは異なり、ＲＡは、皮膚、血管、心臓、肺および筋肉を含む身体全体の関節外組織における炎症も引き起こし得る全身性疾病である。

ＲＡは、疼痛、変形、生活の質の低下、および障害に関連し、これは次に患者が通常の生産的な生活を送る能力に影響を及ぼす。近年の研究は、疾病の発症から５年後に、ＲＡ患者の約３分の１がもはや働くことができず、そして１０年以内に患者の半分が実質的な機能障害を有することを示した（A. Young et al., Rheumatology, 2007, 46: 350-357）。結果として、ＲＡは、社会に対して重大な経済的重荷を課す。かなりの量のデータが、ＲＡが平均余命の低下に関連していることも示唆する。

ＲＡは詳細に研究されているが、疾病の病因および病態発生は依然として不完全にしか解明されていない。ＲＡのリスクを増加させ得る因子としては、個体の性別（女性は、疾病の発症において男性よりも２〜３倍可能性が高い）；年齢（ＲＡはより一般的には４０〜６０歳に起こるが、小児、ティーンエイジャーおよび高齢の成人にも起こり得る）；遺伝学（ＲＡは、遺伝性組織型主要組織適合複合体（ＭＨＣ）抗原ＨＬＡ−ＤＲ４、より具体的にはＤＲＢ１^＊０４０１およびＤＲＢ１^＊０４０４に強く関連していることが判明した）；および喫煙（ＲＡは、非喫煙者よりも喫煙者において約４倍より多く見られる）が挙げられる。

ＲＡのための信頼できる治癒法は現在ない。処置は、本質的には、疼痛の寛解、炎症の低減、並びに関節の傷害および骨の破壊の停止または減速に向けられる。現在の治療アプローチは、容態の初期において疾病修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤｓ）を処方することである。なぜなら、このような薬物で初期に処置されたＲＡ患者は、機能のより大きな保存、就労障害の減少、およびより低い早期死亡リスクを伴う、より良好な結果を有するからである。ＲＡの病態生理の解明における近年の進歩は、生体応答修飾物質と呼ばれる新たなＤＭＡＲＤｓの開発をもたらした。生物学的なＤＭＡＲＤｓは、ＲＡに関連した異常な免疫反応に関与する、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、Ｔ細胞、およびＢ細胞などの、特定の重要な細胞または分子の作用をターゲティングおよび遮断するように設計されている。伝統的なＤＭＡＲＤｓと比較して、生物学的薬剤ははるかにより急速に作用を開始し、そして効果的な長期におよぶ関節傷害の予防を伴う、より良好な臨床応答を与え得る（J.K.D. de Vries-Bouwstra et al., Rheum. Dis. Clin. North Am., 2005, 31: 745-762）。

不可逆的な関節破壊は、疾病の早期の段階での介入によって予防することができるので、ＲＡの早期診断が重要である。しかしながら、ＲＡの確定診断は困難であり得る。ＲＡの診断のために実施することのできる免疫学的試験としては、特に、リウマチ因子（ＲＦ）、および抗環状シトルリン化ペプチド（抗ＣＣＰ）抗体のレベルの測定が挙げられる。ＲＦのための血清学的試験は、中程度の感度および特異性、並びに他の慢性炎症性および感染性疾病において高い割合で陽性であることによって複雑化される（T. Dorner et al., Curr. Opin. Rheumatol, 2004, 16: 246-253）。抗ＣＣＰ抗体試験は、特に、高い特異性、疾病の過程の早期における陽性、および重度の疾病および不可逆的な傷害を有する可能性がある患者を同定する能力を有し、ＲＡの診断において有用である。しかしながら、抗ＣＣＰ抗体試験における陰性結果は、ＲＡを排除するものではない。

それ故、ＲＡの新たな生物学的マーカーが非常に必要とされる。特に、疾病の早期段階の信頼性のある診断およびモニタリングを可能とし、そして疼痛、関節破壊および長期障害を潜在的に予防するための早期介入を可能とするバイオマーカーが、非常に所望される。

発明の要約
本発明は、一般に、関節リウマチ（ＲＡ）の診断のための改良されたシステムおよび戦略に関する。特に、本発明は、ＲＡ患者の血清中に存在する自己抗体と特異的に反応するペプチドバイオマーカーに関する。より具体的には、本発明は、ヒトＰＡＤ４、ＢＲＡＦおよびカルパスタチンのアミノ酸配列、並びに、ＲＡの診断、特にＣＣＰ陰性患者におけるＲＡの診断においてこのような配列を使用するための方法に関する。

従って、１つの局面において、本発明は、被験体のＲＡをインビトロにおいて診断するための方法を提供し、前記方法は、被験体から得られた生物学的試料を、バイオマーカー−抗体の複合体の形成を可能とする時間の間および条件下において少なくとも１つのバイオマーカーと接触させる工程；および形成されたバイオマーカー−抗体の複合体を検出する工程を含む。

この診断法において、少なくとも１つのバイオマーカーは、
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、その類似体、およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなるアミノ酸配列を有するＰＡＤ４−ペプチド、
配列番号７、配列番号８、配列番号９、その類似体、およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなるアミノ酸配列を有するＢＲＡＦ−ペプチド、
配列番号１１、配列番号１２、その類似体、およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなるアミノ酸配列を有するカルパスタチン−ペプチド、並びに
その任意の組合せ
からなる群より選択される。

特定の態様において、少なくとも１つのバイオマーカーは、
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、その類似体、およびそのフラグメントからなる群より選択される配列からなるアミノ酸配列を有するＰＡＤ４−ペプチド、
配列番号７、配列番号８、配列番号９、その類似体、およびそのフラグメントからなる群より選択される配列からなるアミノ酸配列を有するＢＲＡＦ−ペプチド、
配列番号１１、配列番号１２、その類似体、およびそのフラグメントからなる群より選択される配列からなるアミノ酸配列を有するカルパスタチン−ペプチド、並びに
その任意の組合せ
からなる群より選択される。

特定の態様において、複数のペプチドバイオマーカー（すなわち２つまたは２つより多いペプチドバイオマーカー）を診断法において使用する。他の言葉で言えば、本発明の方法は、生物学的試料を、１つ以上のバイオマーカーと、生物学的試料中に存在する自己抗体との間でバイオマーカー−抗体の複合体が形成されることを可能とする時間の間および条件下において複数のバイオマーカーと接触させる工程；および形成された任意のバイオマーカー−抗体の複合体を検出する工程を含み得る。

特定の態様において、診断法は、本明細書において記載した３つのＰＡＤ４−ペプチド、３つのＢＲＡＦ−ペプチドおよび２つのカルパスタチン−ペプチドを含む、８つのペプチドバイオマーカーを使用して実施される。特定の好ましい態様において、３つのＰＡＤ−４ペプチドは配列番号２〜４からなり、３つのＢＲＡＦ−ペプチドは配列番号７〜９からなり、そして２つのカルパスタチン−ペプチドは配列番号１１〜１２からなる。

別の局面において、本発明は、生物学的試料中の抗ＰＡＤ４自己抗体の存在を検出するための方法を提供する。前記方法は、生物学的試料を、バイオマーカー−抗体の複合体の形成を可能とする時間の間および条件下において少なくとも１つのバイオマーカーと接触させる工程（ここで、少なくとも１つのバイオマーカーは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、その類似体、そのフラグメント、およびその任意の組合せからなる群より選択される配列を含むまたはからなるアミノ酸配列を有するＰＡＤ４ペプチドである）；および形成されたバイオマーカー−抗体の複合体を検出する工程を含む。バイオマーカー−抗体の複合体の検出は、生物学的試料中の抗ＰＡＤ４自己抗体の存在を示し、それ故、生物学的試料が得られた被験体におけるＲＡを示す。

本発明はまた、生物学的試料中の抗ＢＲＡＦ自己抗体の存在を検出するための方法も提供する。前記方法は、生物学的試料を、バイオマーカー−抗体の複合体の形成を可能とする時間の間および条件下において少なくとも１つのバイオマーカーと接触させる工程（ここで、少なくとも１つのバイオマーカーは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、その類似体、そのフラグメント、およびその任意の組合せからなる群より選択される配列を含むまたはからなるアミノ酸配列を有するＢＲＡＦ−ペプチドである）；および形成されたバイオマーカー−抗体の複合体を検出する工程を含む。バイオマーカー−抗体の複合体の検出は、生物学的試料中の抗ＢＲＡＦ自己抗体の存在を示し、それ故、生物学的試料が得られた被験体におけるＲＡを示す。

試験しようとする被験体から得られ、そして本発明の方法における使用のために適している、生物学的試料は、全血、血清、血漿、尿、および滑液からなる群より選択され得る。特定の好ましい態様において、生物学的試料は、血清学的試料、例えば血液試料である。被験者から得られ、そして本発明の診断法において使用するために適している、血液試料は、全血、血漿および血清からなる群より選択され得る。

特定の態様において、試験しようとする被験体はＣＣＰ陰性であるか、または試験しようとする生物学的試料はＣＣＰ陰性被験体から得られる。

本明細書において提供された診断法において、ペプチドバイオマーカーと、生物学的試料中に存在する自己抗体との間に形成されたバイオマーカー−抗体の複合体を検出する工程は、任意の適切な方法によって実施され得る。特定の態様において、検出はイムノアッセイによる。

特定の態様において、診断法において使用されるペプチドバイオマーカーまたはバイオマーカー群は、固体担体または支持体上に固定される。

特定の態様において、診断法は、被験体から得られた生物学的試料中において、Ｃ反応性タンパク質、血清アミロイドＡ、インターロイキン６、Ｓ１００タンパク質、オステオポンチン、リウマチ因子、マトリックスメタロプロテアーゼ１、マトリックスメタロプロテアーゼ３、ヒアルロン酸、ｓＣＤ１４、血管新生マーカー、および骨、軟骨および滑膜の代謝産物からなる群より選択される少なくとも１つのマーカーの濃度を測定することをさらに含み得る。

別の局面において、本発明は、被験体のＲＡのインビトロ（in vitro）における診断のためのキットを提供する。これらのキットは、本発明の少なくとも１つのペプチドバイオマーカー、およびペプチドバイオマーカーと、試験しようとする生物学的試料中に存在する自己抗体との間に形成されたバイオマーカー−抗体の複合体を検出するための少なくとも１つの試薬を含む。キットにおいては、少なくとも１つのペプチドバイオマーカーが固体担体または支持体上に固定されていても、あるいは代替的には、ペプチドバイオマーカーを固体担体または支持体上に固定するために使用することのできる試薬がキットに含まれていてもよい。キットはさらに、本発明に従って診断法を実施するための説明書を含み得る。特定の態様において、キットは、本明細書において記載した３つのＰＡＤ４−ペプチド、３つのＢＲＡＦ−ペプチドおよび２つのカルパスタチン−ペプチドを含む、少なくとも８つのバイオマーカーを含む。特定の好ましい態様において、３つのＰＡＤ４−ペプチドは配列番号２〜４からなり、３つのＢＲＡＦ−ペプチドは配列番号７〜９からなり、そして２つのカルパスタチン−ペプチドは配列番号１１〜１２からなる。

さらに別の局面において、本発明は、被験体のＲＡの診断のためのアレイを提供する。本発明によるアレイは、その表面に付着した、本発明の少なくとも１つのペプチドバイオマーカーを含む。特に、本発明は、ＣＣＰ陰性被験体のＲＡの診断のためのアレイを提供し、前記アレイは、その表面に付着した、本明細書において記載した３つのＰＡＤ４−ペプチド、３つのＢＲＡＦ−ペプチドおよび２つのカルパスタチン−ペプチドを含む、少なくとも８つのペプチドバイオマーカーを含む。特定の好ましい態様において、３つのＰＡＤ４−ペプチドは配列番号２〜４からなり、３つのＢＲＡＦ−ペプチドは配列番号７〜９からなり、そして２つのカルパスタチン−ペプチドは配列番号１１〜１２からなる。特定の態様において、本発明のアレイはさらに、その表面に付着した、抗核抗体および抗ＣＣＰ抗体などのＲＡ特異的自己抗体の存在を検出するための少なくとも１つの追加のＲＡバイオマーカーを含む。

さらに別の局面において、本発明は、好ましくは５０未満のアミノ酸残基を含む、関節リウマチのペプチドバイオマーカーを提供する。特に、本発明は、抗ＰＡＤ４自己抗体によって認識され、そして配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、その類似体およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなるアミノ酸配列を有する、５０未満のアミノ酸残基のペプチドバイオマーカーを提供する。本発明はさらに、抗ＢＲＡＦ自己抗体によって認識され、そして配列番号７、配列番号８、配列番号９、その類似体、およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなるアミノ酸配列を有する、５０未満のアミノ酸残基のペプチドバイオマーカーを提供する。本発明はまた、抗カルパスタチン自己抗体によって認識され、そして配列番号１１、配列番号１２、その類似体、およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなるアミノ酸配列を有する、５０未満のアミノ酸残基のペプチドバイオマーカーも提供し、前記バイオマーカーは、抗カルパスタチン自己抗体によって認識される。

本発明のこれらおよび他の目的、利点および特徴は、以下の好ましい態様の詳細な説明を読めば、当業者には明らかとなろう。

図１は、ＲＡ患者の血清中に存在するＰＡＤ４に対する自己抗体が、フィブリノーゲンのシトルリン化を阻害することを示すグラフである。試験を、実施例の章において記載された通りに実施した。ＯＤ（試験）／ＯＤ（対照）の比が１を超えることは、ＰＡＤ４によるフィブリノーゲンのシトルリン化の活性化を示し、一方で１未満の比は、ＰＡＤ４によるフィブリノーゲンのシトルリン化の阻害を示す。 図２は、ＲＡ患者、ＡＳ患者および健康対照由来の血清の各群について、ペプチド２２、ペプチド２８、ペプチド６１およびペプチド６３を認識する血清の比率を示したグラフである。陽性血清は、バックグラウンドの２倍を超えるＯＤ値が測定された血清として定義された（実験の詳細については実施例の章を参照されたい）。 図３は、フィブリノーゲンのシトルリン化を阻害する（ＲＡ１〜ＲＡ２０の患者）、フィブリノーゲンのシトルリン化を活性化する（ＲＡ２４〜ＲＡ２９の患者）、およびフィブリノーゲンのシトルリン化に全く影響を及ぼさない（ＲＡ２１〜ＲＡ２３の患者）、抗ＰＡＤ４自己抗体の各群について、Ｎ末端ペプチドのみ、Ｃ末端ペプチドのみ、またはＮ末端ペプチドおよびＣ末端ペプチドの両方を認識する自己抗体の比率を示したグラフである。 図４は、ペプチド２２、ペプチド２８、ペプチド６１およびペプチド６３を認識するＰＡＤ４に対する自己抗体の各群について、フィブリノーゲンのシトルリン化を阻害、活性化または全く影響を及ぼさない、自己抗体の比率を示したグラフである。 図５は、どのようにＰＡＤ４に対する自己抗体がＰＡＤ４を阻害し得るかを説明するモデルを提示したスキームである。（Ａ）カルシウム結合は、ＰＡＤ４の基質結合ドメインを開き得る。（Ｂ）その後、基質はＰＡＤ４に結合し、そしてシトルリン化され得る。（Ｃ）ＰＡＤ４に対する自己抗体は、コンフォメーション変化または基質結合に干渉し得る。 図６は、ＢＲＡＦに対する自己抗体への、ＢＲＡＦ−ペプチドの結合を示したグラフである。２１人のＲＡ患者、３３人のＳＰＡ患者および６０人の健康志願者の血清中のＢＲＡＦ−ペプチドであるＰ１０、Ｐ１６、Ｐ２５およびＰ３３を、ＥＬＩＳＡによって試験した。洗浄後、ペルオキシダーゼにコンジュゲートさせた抗ヒトＩｇＧを加え、そして４０５nmにおける吸光度を解読した。各血清を、ペプチドを含まないウェルに添加することによって、バックグラウンドＯＤを得た。陽性血清は、バックグラウンドＯＤの２倍より高いＯＤ値によって定義された。 図７は、ＢＲＡＦ−ペプチド（Ｐ１０、Ｐ１６およびＰ２５）が、ＣＣＰ陰性患者の５０％においてＲＡを同定したことを示す表である。灰色は、陽性ペプチドを示す（すなわち、ＣＣＰ陰性患者の血清中に存在するＢＲＡＦに対する自己抗体への結合を受けるＢＲＡＦペプチド）。結合を、実施例ＩＩに記載したようにＥＬＩＳＡによって決定した。 図８は、ＲＡ患者の血清中に存在するＢＲＡＦに対する自己抗体が、ＭＥＫ１のリン酸化を活性化することを示したグラフである。患者から精製された抗ＢＲＡＦ自己抗体を、ＢＲＡＦおよびＭＥＫ１と共にインキュベーションした。各患者について、１つの陽性対照（ＢＲＡＦおよびＭＥＫ１）および１つの陰性対照（ＢＲＡＦおよびＭＥＫ１およびＣ１対照抗体）が含まれた。ＭＥＫ１リン酸化の活性化または阻害を、試験ＯＤ／陽性対照ＯＤの比を測定することによって検出した。１を超える比は活性化を示し、１未満の比は阻害を示した。 図９は、ＲＡ患者の血清中に存在する自己抗体に対するＰＡＤ４−ペプチド、ＢＲＡＦ−ペプチドおよびカルパスタチン−ペプチドの結合を示したグラフである。ＰＡＤ４−ペプチド（ペプチド２２、６１および６３）、ＢＲＡＦ−ペプチド（Ｐ１０、Ｐ１６およびＰ２５）およびカルパスタチン−ペプチド（Ｐ’１６およびＰ’２８）を、１１８人のＲＡ患者の血清および１００人の対照血清と接触させた。結合を、実施例ＩＩに記載のように決定および評価した。 図１０は、ＰＡＤ−４ペプチド（ペプチド２２、６１および６３）、ＢＲＡＦ−ペプチド（Ｐ１０、Ｐ１６およびＰ２５）およびカルパスタチン−ペプチド（Ｐ’１６およびＰ’２８）が、ＣＣＰ陰性患者によって認識されることを示したグラフである。これらのペプチドを、８３人のＣＣＰ陰性ＲＡ患者および２９人のＣＣＰ陰性ＲＡ患者の血清と接触させた。結合を、実施例ＩＩに記載のように決定および評価した。

定義
本明細書全体を通して、以下の段落で定義したいくつかの用語を使用する。

本明細書において使用した「被験体」という用語は、ＲＡに罹患し得るが、疾病を有していてもまたは有していなくてもよい、ヒトまたは別の哺乳動物（例えば、霊長類、イヌ、ネコ、ヤギ、ウマ、ブタ、マウス、ラット、ウサギなど）を指す。本発明の多くの態様において、被験体はヒトである。このような態様において、被験体はしばしば「個体」と呼ばれる。「個体」という用語は特定の年齢を示さず、従って、小児、ティーンエイジャーおよび成人を包含する。

「ＲＡを有することが疑われる被験体」という用語は、ＲＡを示す１つ以上の症状（例えば、疼痛、こわばりまたは関節の腫脹）を提示するか、またはＲＡについてスクリーニングされる（例えば身体検査中）、被験体を指す。代替的にまたは追加的に、ＲＡを有することが疑われる被験体は、１つ以上のリスク因子を有し得る（例えば年齢、性別、家族歴、喫煙など）。この用語は、ＲＡについて試験されていない被験体、並びに初期の診断を受けた被験体を包含する。

「生物学的試料」という用語は、本明細書においてその最も広い意味で使用される。生物学的試料は、一般に、被験体から得られる。試料は任意の生物学的組織または液体であり得、これを用いて本発明のバイオマーカーをアッセイし得る。頻繁には、試料は「臨床試料」であり、すなわち、患者由来の試料である。このような試料は、細胞を含んでもまたは含んでいなくてもよい体液、例えば血液（例えば全血、血清または血漿）、尿、滑液、唾液、組織または細針生検試料、並びに既知の診断、処置および／または転帰歴を有する保存記録試料を含むがそれらに限定されない。生物学的試料はまた、組織学的目的のために採取した凍結切片などの組織切片を含み得る。「生物学的試料」という用語はまた、生物学的試料を処理することによって誘導された任意の材料を包含する。誘導された材料は、試料から単離された細胞（またはその子孫）、または試料から抽出されたタンパク質を含むがそれらに限定されない。生物学的試料の処理は、ろ過、蒸留、抽出、濃縮、干渉成分の不活性化、試薬の添加などの１つ以上を含み得る。本発明の特定の好ましい態様において、生物学的試料は血清学的試料であり、そして被験体から得られた全血、血清、または血漿である（またはそれから誘導される）。

「正常」および「健康」という用語は本明細書において同義語として使用される。それらは、ＲＡ症状を全く示さず、そしてＲＡまたは軟骨もしくは骨の損傷を有すると診断されていない、被験体を指す。好ましくは、正常な被験体は、ＲＡに罹患させる薬物投与を受けておらず、そして任意の他の疾病（特に自己免疫性炎症疾病）と診断されていない。特定の態様において、正常な被験体は、試験しようとする生物学的試料が得られた被験体と比較して、類似の性別、年齢、および／または肥満度指数を有し得る。「正常」という用語はまた、本明細書において、健康被験体から得られた試料を認定するために使用される。

本発明の脈絡において、「対照」という用語は、被験体を特徴付けるために使用された場合、健康である被験体、またはＲＡ以外の特定の疾病を有すると診断された患者を指す。「対照試料」という用語は、健康被験体から、またはＲＡ以外の疾病を有すると診断された患者から得られた１つ、または１つより多い試料を指す。

本明細書において使用する「自己抗体」という用語は、その当技術分野において理解されている意味を有し、そして被験体の免疫系によって産生され、そして被験体自身の１つ以上のタンパク質に対して作られた、抗体を指す。自己抗体は、生体自身の細胞、組織および／または器官を攻撃し得、炎症および傷害を引き起こし得る。

本明細書において使用した「自己抗原」という用語は、自己免疫反応などで、被験体の生体において自己抗体の産生を刺激する、内因性抗原またはその活性フラグメントを指す。この用語はまた、被験体中にまたは被験体から得られた生物学的試料中に存在する自己抗体と、抗原−抗体複合体を形成することのできる任意の物質を包含する。

「バイオマーカー」および「マーカー」という用語は本明細書において同義語として使用される。それらは、生物学的過程、生物学的事象および／または病的容態の明瞭な指示薬である物質を指す。本発明の脈絡において、「ＲＡのバイオマーカー」という用語は、ＲＡ患者の生物学的試料（例えば血液試料）中に存在する抗ＰＡＤ４自己抗体によって特異的に認識される、本明細書において提供されるＢＲＡＦ−ペプチド、ＰＡＤ４−ペプチドおよびカルパスタチン−ペプチドを包含する。特定の好ましい態様において、本発明のバイオマーカー（群）は、５０未満のアミノ酸のペプチド（群）である。

本明細書において使用した「ＲＡを示す」という用語は、過程または事象に適用された場合、ＲＡの診断となる過程または事象を指し、よって前記の過程または事象は、健康被験体および／またはＲＡ以外の疾病に罹患している被験体においてよりも、ＲＡを有する被験体において有意により多く見られる。

「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、本明細書において同義語として使用され、そしてその中性（非荷電）形でまたは塩としてのいずれかの、および修飾されていないかまたはグリコシル化、側鎖酸化、もしくはリン酸化によって修飾された、多種多様な長さのアミノ酸配列を指す。特定の態様において、アミノ酸配列は、全長の天然タンパク質である。他の態様において、アミノ酸配列は、全長タンパク質よりも小さいフラグメントである。さらに他の態様において、アミノ酸配列は、アミノ酸側鎖に付着した追加の置換基、例えばグリコシル単位、脂質、またはホスフェートなどの無機イオンによって、並びに、スルフヒドリル基の酸化などの鎖の化学的変換に関連した修飾によって修飾されている。従って、「タンパク質」という用語（またはその等価な用語）は、その特異的な特性を有意に変化させない修飾がなされた、全長の天然タンパク質のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むことを意図する。特に、「タンパク質」という用語は、タンパク質アイソフォーム、すなわち、同じ遺伝子によってコードされるが、そのｐＩもしくはＭＷまたはその両方において異なる、変異体を包含する。このようなアイソフォームはそのアミノ酸配列において異なり得（例えば選択的スプライシングまたは限定タンパク質分解の結果として）、または別の方法では、異なる翻訳後修飾（例えばグリコシル化、アシル化、リン酸化）から生じ得る。

「類似体」という用語は、タンパク質またはポリペプチドを言及して本明細書において使用する場合、タンパク質またはポリペプチドと類似したまたは同一の機能を有するが、タンパク質もしくはポリペプチドのアミノ酸配列と類似したもしくは同一であるアミノ酸配列、またはタンパク質もしくはポリペプチドのそれと類似したもしくは同一である構造を必ずしも含まない、ペプチドを指す。好ましくは、本発明の脈絡において、類似体は、タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。特定の好ましい態様において、本発明のペプチドバイオマーカーの類似体は、ペプチドバイオマーカーのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であるか、または少なくとも８５％同一である、アミノ酸配列を有する。

「フラグメント」という用語は、タンパク質またはポリペプチドを言及して本明細書において使用する場合、タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも５アミノ酸残基（好ましくは、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００または２５０アミノ酸残基）のアミノ酸配列を含むペプチドを指す。タンパク質またはポリペプチドのフラグメントは、タンパク質またはポリペプチドの機能的活性を有していてもいなくてもよい。本発明の特定の好ましい態様において、本発明のペプチドバイオマーカーのフラグメントは、ペプチドバイオマーカーのアミノ酸配列の少なくとも１０連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む。

本明細書において使用した「相同な」（または「相同性」）という用語は「同一性」という用語と同義であり、そして２つのポリペプチド分子間または２つの核酸分子間での配列類似性を指す。両方の比較した配列中の位置が、同じ塩基または同じアミノ酸残基によって占められる場合、それぞれの分子はその位置において相同である。２つの配列間の相同率は、２つの配列によって共有される一致または相同位置の数を、比較する位置の数で割り、それに１００をかけることに対応する。一般的には、最大の相同性が得られるように２つの配列をアラインさせて比較が行なわれる。相同アミノ酸配列は、同一または類似のアミノ酸配列を共有する。類似の残基は、参照配列中における対応するアミノ酸残基の保存的置換または「許容された点突然変異」である。参照配列中の残基の「保存的置換」は、対応する参照残基と物理的にまたは機能的に類似した、例えば、類似のサイズ、形状、電荷、化学的特性（共有結合または水素結合の形成能を含む）などを有する、置換である。特に好ましい保存的置換は、Dayhoff et al. ("Atlas of Protein Sequence and Structure", 1978, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, DC, Suppl. 3, 22: 354-352)による「認容される点突然変異」について定義された基準を満たすものである。

「標識された」、「検出可能な薬剤を用いて標識された」および「検出可能な部分を用いて標識された」という用語は、本明細書において同義語として使用される。これらの用語は、実体（例えばＰＡＤ４−ペプチド、ＢＲＡＦ−ペプチドまたはカルパスタチン−ペプチド）を、例えば、別の実体（例えば抗ＰＡＤ４自己抗体、抗ＢＲＡＦ自己抗体または抗カルパスタチン自己抗体）への結合後に可視化することができることを明記するために使用される。

好ましくは、検出可能な薬剤または部分は、測定することができそしてその強度が結合した実体の量に関連しているシグナルを発生するように選択される。アレイに基づいた方法においては、検出可能な薬剤または部分はまた、好ましくは、局在化シグナルを発生し、これによりアレイ上の各スポットからのシグナルの空間的な分離が可能となるように選択される。タンパク質およびポリペプチドを標識するための方法は当技術分野において周知である。標識されたポリペプチドは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段、または任意の他の適切な手段によって直接的にまたは間接的に検出可能である標識の取り込みまたは標識へのコンジュゲーションによって調製することができる。適切な検出可能な薬剤としては、種々のリガンド、放射性核種、蛍光ダイ、化学発光剤、微粒子、酵素、比色標識、磁気標識、およびハプテンなどが挙げられるがそれらに限定されない。

「タンパク質アレイ」および「タンパク質チップ」という用語は、本明細書において同義語として使用される。それらは、基質表面を指し、この上に、種々のタンパク質またはポリペプチドが、秩序立った様式で、基質上の別個のスポットに固定されている。タンパク質アレイを使用して、タンパク質／タンパク質相互作用（例えば抗原／抗体相互作用）を同定し得るか、酵素の基質を同定し得るか、または生物学的に活性な小分子のターゲットを同定し得る。「マイクロアレイ」という用語は、より具体的には、目視による評価のための顕微鏡検査を必要とするように小型化されたアレイを指す。

「処置」という用語は本明細書において、（１）疾病または容態（例えばＲＡ）の発症を遅延または予防すること；（２）容態の症状の進行、悪化または増悪を減速または停止すること；（３）容態の症状の回復をもたらすこと；および／または（４）容態を治癒することを目的した方法を特徴付けるために使用される。処置は、予防的または防御的作用のために、疾病の発症前に投与され得る。それはまた、治療作用のために疾病の開始後に投与されてもよい。

特定の好ましい態様の詳細な説明
前記したように、本発明は、患者から得られた生物学的試料中のＲＡ特異的自己抗体の存在を検出するために使用することのできるバイオマーカーを提供する。これらのバイオマーカーは、ヒトＰＡＤ４上のエピトープに対応し、そしてＲＡ患者の血清中に存在する抗ＰＡＤ４自己抗体と特異的に反応する、ＰＡＤ４−ペプチドである。他のバイオマーカーは、自己抗原ＢＲＡＦ上のエピトープであるＢＲＡＦ−ペプチドである。さらに他のバイオマーカーはカルパスタチン−ペプチドである。好ましくは、バイオマーカーは、５０未満のアミノ酸のペプチドである。また、ＲＡの診断のためにこれらのバイオマーカーを使用するための方法も提供される。

Ｉ−ペプチドバイオマーカー
ＰＡＤ４−ペプチド
ＲＡにおける重要な抗体は、フィブリン、フィラグリンおよびビメンチンなどの種々のタンパク質上のシトルリン残基に対して作られる。シトルリンは、アルギニン残基の翻訳後の変換によって生成される。この過程は、一群のカルシウム依存性ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）によって触媒される。ＰＡＤ酵素の１つであるＰＡＤ４は、ＲＡの疾病発症および進行において原因的な役割を果たすと広く信じられている。なぜなら、ＰＡＤ４遺伝子におけるＲＡ関連突然変異が、多種多様な個体群において同定されているからである（A. Suzuki et al., Nat. Genet., 2003, 34(4): 395-402; T. Iwamoto et al., Rheumatology, 2006, 45: 804-807; S.M. Harney et al., Rheumatology, 2005, 44: 869-872; T; Cantaert et al., Ann. Rheum. Dis., 2005, 64: 1316-1320）。

ＰＡＤ４は、シトルリン化エピトープの生成において関与しているだけでなく、それはそれ自身がＲＡ特異的抗体のためのターゲットである。ＲＡ患者におけるＰＡＤ４に対する自己抗体はすでに記載されている（Y. Takizawa et al., Scand. J. Rheumatol., 2005, 3: 212-215; E.B. Roth et al., Clin. Exp. Rheumatol., 2006, 1: 12-18; E.H. Halvorsen et al., Ann. Rheumatol. Dis., 2008, 67: 414-417; J. Zhao et al., J. Rheumatol., 2008, 35: 969-974）。２００８年に、本出願人らは、タンパク質アレイおよびＥＬＩＳＡ分析を使用してＲＡ患者においてＰＡＤ４に対する自己抗体を同定した（I. Auger et al., Rheum. Dis., 2009, 68: 591-594; EP 08 305 167、その各々はその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。本出願人らは、１１６人の患者の２９％がＰＡＤ４に対して陽性であり、これに対して３３人の脊椎関節症（ＡＳ）患者の誰も陽性ではなく、そして６０人の健康対照の３％が陽性であった（カイ二乗検定によりｐ＝０、１１６人のＲＡ患者ｖｓ９３人の対照）。

以下の実施例１に記載したように、本出願人らは今回、ＲＡ患者の血清によって特異的に認識されるヒトＰＡＤ４上のエピトープを同定した。これらのエピトープは、ヒトＰＡＤ４の全配列（GenBank アクセッションナンバー: NP_036519.1;ローカスNM_012387;配列番号１）を包含する６５個の重複する２０ｍｅｒのペプチド（EP 09 305 266.1の表１参照）を使用して同定された。これらのペプチドを、ＰＡＤ４に対する自己抗体を含むことが知られる２９人のＲＡ患者および２人の対照の血清を用いてスクリーニングした。６５個のペプチドの中で、１８個が、試験した血清によって認識された。４つのペプチド（ペプチド２２、２８、６１および６３）が、抗ＰＡＤ４自己抗体を含むＲＡ患者および対照の血清によって優先的に認識された（表２参照）。これらの結果をさらに確認するために、出願人は、免疫吸着剤としてペプチド２２、２８、６１および６３を使用してＥＬＩＳＡによって３３人の脊椎関節症（ＡＳ）患者および３３人の健康個体の血清を試験した。ペプチド２２、６１および６３を認識する自己抗体が、対照（ＡＳ患者および健康個体）よりもＲＡ患者の血清中において有意により高い比率で見出された。これに対し、ペプチド２８を認識する自己抗体は、対照の血清中だけでなくＲＡ患者の血清中にも高い比率で見出された（図２参照）。

本明細書において記載のように同定されたペプチド２２は、ＰＡＤ４のＮ末端ドメインに位置し、そして以下のアミノ酸配列：
配列番号２ VRVFQATRGKLSSKCSVVLG、
を有し、これは、ヒトＰＡＤ４のアミノ酸残基２１１〜２３０に対応する。

本明細書において記載のように同定されたペプチド６１は、ＰＡＤ４のＣ末端ドメインに位置し、そして以下のアミノ酸配列：
配列番号３ PFGPVINGRCCLEEKVCSLL、
を有し、これは、ヒトＰＡＤ４のアミノ酸残基６０１〜６２０に対応する。

本明細書において記載のように同定されたペプチド６３は、ＰＡＤ４のＣ末端ドメインに位置し、そして以下のアミノ酸配列：
配列番号４ EPLGLQCTFINDFFTYHIRH、
を有し、これは、ヒトＰＡＤ４のアミノ酸残基６２１〜６４０に対応する。

従って、１つの局面において、本発明は、ＲＡ患者の血清中に存在する抗ＰＡＤ４自己抗体によって特異的に認識される、ＰＡＤ４−ペプチドを提供する。本発明のＰＡＤ４−ペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、その類似体、およびその相同体からなる群より選択される配列を含むまたなからなる、好ましくは５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列を有する。配列番号２〜４は前記した通りである。配列番号５は、以下のアミノ酸配列：
配列番号５ PFGPVINGRCCLEEKVCSLLEPLGLQCTFINDFFTYHIRH、
を有し、これは、ヒトＰＡＤ４のアミノ酸残基６０１〜６４０に対応する。

ＢＲＡＦ−ペプチド
ＢＲＡＦ（Ｂ−ｒａｆとも呼ばれる）は、ＲＡＦタンパク質ファミリーのセリン−トレオニンキナーゼタンパク質である。ヒトにおいては、ＢＲＡＦ遺伝子は、７６６アミノ酸残基のＢＲＡＦタンパク質をコードし（GenBankアクセッションナンバー: NP_004324.1）、その配列は配列番号６に定義されている。

本出願人らは以前に、ＢＲＡＦ触媒ドメイン（配列番号６における残基４５６〜７１２）が、ＲＡに罹患した患者の自己抗体のターゲットであり、そしてＲＡの特異的マーカーであることを示した（I. Auger et al., Rheum. Dis., 2009, 68: 591-594; EP 08 305 167）。出願人は今回、ＲＡ患者によってほぼ独特に認識されるＢＲＡＦ触媒ドメイン上の３つの線形ペプチドを同定した（実施例ＩＩ参照）。これらのＢＲＡＦ−ペプチドであるＰ１０、Ｐ１６およびＰ２５は、ＣＣＰ陰性患者の血清によって認識されることが示された。Ｐ１０、Ｐ１６およびＰ２５の併用は、ＣＣＰ陰性患者の５０％を同定する。

本明細書において記載のように同定されたペプチドＰ１０は、以下のアミノ酸配列：
配列番号７ rktrhvnillfmgystkpql、
を有し、これは、ヒトＢＲＡＦのアミノ酸残基５０６〜５２５に対応する。

本明細書において記載のように同定されたペプチドＰ１６は、以下のアミノ酸配列：
配列番号８ ylhaksiihrdlksnniflh、
を有し、これは、ヒトＢＲＡＦのアミノ酸残基５６６〜５８５に対応する。

本明細書において記載のように同定されたペプチドｐ２５は、以下のアミノ酸配列：
配列番号９ ysninnrdqiifmvgrgyls、
を有し、これは、ヒトＢＲＡＦのアミノ酸残基６５６〜６７５に対応する。

従って、１つの局面において、本発明は、ｒａ患者の血清中に存在する抗ｂｒａｆ自己抗体によって特異的に認識されるｂｒａｆ−ペプチドを提供する。本発明のｂｒａｆ−ペプチドは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、その類似体、およびその相同体からなる群より選択される配列を含むまたはからなる、好ましくは５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列を有する。配列番号７〜９は前記した通りである。

カルパスタチン−ペプチド
本出願人らは、ＲＡに罹患し、そしてＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０４に対してホモ接合性である患者の血清は、カルパスタチンとして同定された１００ｋＤの滑膜タンパク質を認識したことを観察した（Auger et al. Ann. Rheum. Dis., 2007, 66: 1588-1593）。カルパスタチンは、殆どの哺乳動物組織中に存在する、内因性カルパイン（カルシウム依存性システインプロテアーゼ）阻害剤である。カルパスタチンは、アミノ末端ドメインＬおよび４つの反復カルパイン阻害ドメイン（ドメイン１〜４）からなる（Menard et al., Immun. Today, 1996, 17: 545-547）。ヒトカルパスタチンアイソフォームＡのアミノ酸配列は配列番号１０に提供される（GenPeptアクセッションナンバー: NP_001035908）。

本出願人らは以前に、ＣＣＰ陰性患者の血清によって認識されるカルパスタチン上の２つの線形ペプチド：Ｐ’１６およびＰ’２８（これはローカスNP_001035908からの１５ｍｅｒのペプチドである）を同定した（実施例ＩＩＩ参照）。

本明細書において記載したように同定されたペプチドＰ’１６は、以下のアミノ酸配列：
配列番号１１ igpddaidalssdft、
を有し、これは、ヒトカルパスタチンアイソフォームＡのアミノ酸残基２２６〜２４０に対応し、そして反復カルパイン阻害ドメイン１に位置する。

本明細書において記載したように同定されたペプチドＰ’２８は、以下のアミノ酸配列：
配列番号１２ avcrtsmcsiqsapp、
を有し、これは、ヒトカルパスタチンアイソフォームＡのアミノ酸残基４０６〜４２０に対応し、そして反復カルパイン阻害ドメイン２に位置する。

従って、１つの局面において、本発明は、ＲＡ患者の血清中に存在する抗カルパスタチン自己抗体によって特異的に認識されるカルパスタチン−ペプチドを提供する。本発明のカルパスタチン−ペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、その類似体、およびその相同体からなる群より選択される配列を含むまたはからなる、好ましくは５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列を有する。配列番号１１〜１２は前記した通りである。

ペプチドバイオマーカーの調製
本発明のペプチドバイオマーカーは、化学合成および組換え法を含む、任意の適切な方法によって調製され得る。

本発明のペプチドは、一般に十分に短く、標準的な方法を使用した化学合成が実行可能である。固相ペプチド合成は、最初にR.B. Merrifield（J. Am. Chem. Soc. 1963, 85: 2149-2154）によって記載されたが、これは既知の配列のペプチドおよび小さなペプチド分子を合成する迅速かつ容易なアプローチである。このような固相技術の編纂は、例えば、「Solid Phase Peptide Synthesis」（Methods in Enzymology, G.B. Fields (Ed.), 1997, Academic Press: San Diego, CA、これはその全体が本明細書に参照により組み入れられる）に見られ得る。これらの合成手順の大半は、１つ以上のアミノ酸残基または適切に保護されたアミノ酸残基を、成長しているペプチド鎖に連続的に付加することを含む。例えば、第１のアミノ酸のカルボキシ基を、不安定な結合を介して固体支持体に付着させ、そして第２のアミノ酸（そのアミノ基は、予め、自己縮合を回避するために化学的に保護されている）と反応させる。カップリング後、アミノ基を脱保護し、そして次のアミノ酸を用いて過程を繰り返す。一旦所望のペプチドが会合すると、それを固体支持体から切断除去し、沈降させ、そして得られた遊離ペプチドを分析および／または所望のように精製し得る。例えば「The Proteins」（Vol. II, 3^rd Ed., H. Neurath et al. (Eds.), 1976, Academic Press: New York, NY, pp. 105-237）に記載のような溶液法もまた本発明のバイオマーカーを合成するために使用し得る。

特定の態様において、本発明のペプチドバイオマーカーは、固体担体または支持体（例えばビーズまたはアレイ）上に固定されて提供される。固体表面上にポリペプチド分子を固定するための方法は当技術分野において公知である。ペプチドは、固体担体または支持体の表面に共有結合的にまたは受動的に結合のいずれかによって固定され得る。適切な担体または支持体の材料の例としては、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、デキストラン、セファデックス、セファロース、カルボキシメチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ろ紙、マグネタイト、イオン交換樹脂、ガラス、ポリアミン−メチル−ビニル−エーテル−マレイン酸コポリマー、アミノ酸コポリマー、エチレン−マレイン酸コポリマー、ナイロン、絹などが挙げられるがそれらに限定されない。固体担体または支持体の表面上へのペプチドバイオマーカーの固定は、当技術分野において周知の方法を使用した、架橋、共有結合または物理的吸着を含み得る。固体担体または支持体は、ビーズ、粒子、マイクロプレートのウェル、アレイ、キュベット、チューブ、メンブレンの形態、または本発明による診断法（例えばイムノアッセイを使用して）を実施するために適した任意の他の形状であり得る。

特に、本発明は、その表面に固定された、本発明の少なくとも１つのペプチドバイオマーカーを含む、ＲＡの診断のためのアレイまたはタンパク質アレイを提供する。好ましくは、アレイは、本発明の１つより多くのペプチドバイオマーカーを含む。アレイはさらに、ＲＡの少なくとも１つの追加のバイオマーカーを含み得る。ＲＡの適切なバイオマーカーは、抗核抗体および／またはＣＣＰ抗体の存在の検出を可能とするバイオマーカーを含む。

本発明はまた、ＲＡの診断のためのタンパク質ビーズ懸濁アレイを提供する。このビーズ懸濁アレイは、１つ以上の同定可能な明確に異なる粒子またはビーズの懸濁液を含み、各ビーズは、そのサイズ、色または蛍光サインに関連した暗号特徴を含み、そして各ビーズは、本発明のペプチドバイオマーカーでコーティングされている。ビーズ懸濁アレイの例としては、ｔｈｅｘＭＡＰ（登録商標）ビーズ懸濁アレイ（Luminex Corporation）が挙げられる。

ＩＩ−診断法
前記したように、本明細書において開示したペプチドバイオマーカーは、ＲＡ患者の血清によって、特にＣＣＰ陰性ＲＡ患者の血清によって特異的に認識される。

従って、本発明は、被験体のＲＡを診断するための方法を提供する。このような方法は、試験しようとする被験体から得られた生物学的試料を、バイオマーカー−抗体の複合体の形成を可能とする時間の間および条件下において少なくとも１つのバイオマーカーと接触させ；そして形成されたバイオマーカー−抗体を検出することを含む。

特定の態様において、少なくとも１つのバイオマーカーは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、その類似体およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなる、好ましくは５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列を有するＰＡＤ４−ペプチドである。これらの方法において、バイオマーカー−抗体の複合体の検出は、生物学的試料中の抗ＰＡＤ４自己抗体の存在を示し、それ故、それは被験体におけるＲＡを示す。これらの方法において１つよりも多くのＰＡＤ４−ペプチドを使用してもよい。

他の態様において、少なくとも１つのバイオマーカーは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、その類似体およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなる、好ましくは５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列を有するＢＲＡＦ−ペプチドである。これらの方法において、バイオマーカー−抗体の複合体の検出は、生物学的試料中の抗ＢＲＡＦ自己抗体の存在を示し、それ故、それは被験体におけるＲＡを示す。これらの方法において１つよりも多くのＢＲＡＦ−ペプチドを使用してもよい。

本発明はまた、被験体のＲＡを診断するための方法も提供する。このような方法は、試験しようとする被験体から得られた生物学的試料を、バイオマーカー−抗体の複合体の形成を可能とする時間の間および条件下において少なくとも２つのバイオマーカーと接触させ；そして形成されたバイオマーカー−抗体を検出することを含む。少なくとも２つのバイオマーカーは、以下：
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、その類似体およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなる、好ましくは５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列を有するＰＡＤ４−ペプチド；
配列番号７、配列番号８、配列番号９、その類似体およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなる、好ましくは５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列を有するＢＲＡＦ−ペプチド；
配列番号１１、配列番号１２、その類似体およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなる、好ましくは５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列を有するカルパスタチン−ペプチド；並びに
その任意の組合せ
から選択され得る。

この方法において、バイオマーカー−抗体の複合体の検出は、被験体におけるＲＡを示す。

他の態様において、２つより多くのペプチドバイオマーカー、例えば、３、４、５、６、７、または８つのペプチドバイオマーカーが使用される。特定の好ましい態様において、８つのペプチドバイオマーカーが使用され、すなわち３つのＰＡＤ４−ペプチド、３つのＢＲＡＦ−ペプチドおよび２つのカルパスタチン−ペプチドが使用される。特に好ましい態様において、３つのＰＡＤ４−ペプチドは配列番号２〜４からなり、３つのＢＲＡＦ−ペプチドは配列番号７〜９からなり、そして２つのカルパスタチン−ペプチドは配列番号１１〜１２からなる。

生物学的試料
本発明の診断法は、１つ以上の本発明のバイオマーカーのアッセイを可能とする、任意のタイプの生物学的試料の研究に適用され得る。適切な生物学的試料の例としては、尿、全血、血清、血漿、唾液および滑液が挙げられるがそれらに限定されない。本発明の実施に使用される生物学的試料は、被験体から回収した新鮮なまたは凍結した試料、あるいは既知の診断、処置および／または転帰歴を有する保存記録試料であり得る。生物学的試料は、任意の非侵襲的な手段によって、例えば被験体から採血することによって、または穿刺吸引もしくは針生検を使用して回収され得る。特定の態様において、生物学的試料は血清学的試料であり、そして全血、血清、血漿からなる群より選択される。

好ましい態様において、本発明の方法は、試料の処理を行なわずにまたは僅かな試料の処理を伴い、生物学的試料自体に行なわれる。

しかしながら、代替的には、本発明の方法は、生物学的試料から調製されたタンパク質抽出物に行なってもよい。この場合、タンパク質抽出物は、好ましくは、全タンパク質含有物を含む。タンパク質抽出法は当技術分野において周知である（例えば、"Protein Methods", D.M. Bollag et al., 2^nd Ed., 1996, Wiley-Liss; "Protein Purification Methods: A Practical Approach", E.L. Harris and S. Angal (Eds.), 1989; "Protein Purification Techniques: A Practical Approach", S. Roe, 2^nd Ed., 2001, Oxford University Press; "Principles and Reactions of Protein Extraction, Purification, and Characterization", H. Ahmed, 2005, CRC Press: Boca Raton, FLを参照されたい）。種々のキットを使用して、体液および組織からタンパク質を抽出することができる。このようなキットは、例えば、BioRad Laboratories (Hercules, CA)、BD Biosciences Clontech (Mountain View, CA)、Chemicon International, Inc. (Temecula, CA)、Calbiochem (San Diego, CA)、Pierce Biotechnology (Rockford, IL)、およびInvitrogen Corp. (Carlsbad, CA)から市販されている。追随すべきプロトコールを詳細に記載したユーザーガイドは通常、全てのこれらのキットに含まれる。感度、処理時間および費用は、キットによって異なり得る。当業者は、特定の状況のために最も適切なキット（群）を容易に選択することができる。

バイオマーカー−抗体の複合体の検出
本発明の診断法は、一般的に、ペプチドバイオマーカーと、試験する生物学的試料中に存在する自己抗体との間に形成されるバイオマーカー−抗原複合体の検出を含む。本発明の実施において、このような複合体の検出は任意の適切な方法によって実施され得る（例えば、E. Harlow and A. Lane, "Antibodies: A Laboratories Manual", 1988, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NYを参照されたい）。

例えば、バイオマーカー−抗体の複合体の検出は、イムノアッセイを使用して実施され得る。ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、および免疫蛍光、免疫沈降を含む、多種多様なイムノアッセイ技術が利用可能である。イムノアッセイは当技術分野において周知である。このようなアッセイ並びに実践的な適用および手順を実施するための方法はテキストブックに要約されている。このようなテキストブックの例としては、P. Tijssen, In: Practice and theory of enzyme immunoassays, eds. R.H. Burdon and v. P.H. Knippenberg, Elsevier, Amsterdam (1990), pp. 221-278、および免疫学的検出法を扱うMethods in Enzymology, Eds. S.P. Colowick et al., Academic Pressの種々の巻、特に７０、７３、７４、８４、９２および９１巻が挙げられる。イムノアッセイは競合的または非競合的であり得る。

例えば、多くのバリエーションのサンドイッチアッセイ技術の中のいずれかを使用してイムノアッセイを実施し得る。簡潔に言うと、例えば、本発明による抗ＰＡＤ４自己抗体の検出に適用される典型的なサンドイッチアッセイにおいては、標識されていないＰＡＤ４−ペプチドバイオマーカーを固体表面に固定し（前記したように）、そして試験しようとする生物学的試料を、バイオマーカー−抗体の複合体の形成を可能とする時間の間および条件下において結合させたバイオマーカーと接触させる。インキュベーション後、検出可能な部分で標識され、そして試験した種に由来する抗体を特異的に認識する抗体（例えばヒト被験者については抗ヒトＩｇＧ）を加え、そして任意のバイオマーカー−結合した自己抗体と標識された抗体との間の３元複合体の形成を可能とする条件下においてインキュベーションする。あらゆる非結合材料を洗浄除去し、そして試料中の抗ＰＡＤ４自己抗体の存在を、検出可能な部分によって直接的にまたは間接的に産生されたシグナルの観察／検出によって決定する。このアッセイのバリエーションは、生物学的試料および標識抗体の両方が、固定されたＰＡＤ４−ペプチドバイオマーカーに同時に加えられるアッセイを含む。

二次抗体（すなわち、前記したようなサンドイッチアッセイに加えられた抗体）を、任意の適切な検出可能な部分、すなわち、その化学的性質によって、３元複合体の検出、結果としてバイオマーカー−抗体の複合体の検出を可能とする、分析的に同定可能なシグナルを提供する任意の実体を用いて標識し得る。

検出は、定性的または定量的のいずれかであり得る。抗体などの生物学的分子を標識するための方法は当技術分野において周知である（例えば、"Affinity Techniques. Enzyme Purification: Part B", Methods in Enzymol., 1974, Vol. 34, W.B. Jakoby and M. Wilneck (Eds.), Academic Press: New York, NY; and M. Wilchek and E.A. Bayer, Anal. Biochem., 1988, 171: 1-32を参照されたい）。

イムノアッセイにおいて最も頻繁に使用される検出可能な部分は、酵素およびフルオロフォアである。酵素イムノアッセイ（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）の場合、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素を、二次抗体に、一般的にはグルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸を用いてコンジュゲートさせる。特異的酵素と共に使用しようとする基質は、一般的に、対応する酵素の加水分解時に検出可能な色の変化を発生させるために選択される。免疫蛍光の場合、二次抗体は、その結合能の変化を伴うことなく、蛍光部分に化学的にカップリングされる。バイオマーカー−抗体の複合体に蛍光標識抗体が結合し、あらゆる非結合材料を除去した後、蛍光部分によって発生した蛍光シグナルを検出し、場合により定量する。あるいは、二次抗体を、放射性同位体、化学発光部分または生物発光部分を用いて標識してもよい。

ＲＡ診断
本発明の方法において、バイオマーカー−抗体の複合体の検出は、試験する生物学的試料中の抗ＰＡＤ４自己抗体、抗ＢＲＡＦ自己抗体または抗カルパスタチン自己抗体の存在を示し、それ故、生物学的試料が得られた被験体におけるＲＡを示す。従って、本発明の方法を、患者におけるＲＡの診断のために使用し得る。特に、本発明の方法を、ＲＡを有することが疑われる被験体を試験するために使用し得る。

ＲＡの診断を、本明細書において提供された方法によって得られた結果だけで行なうことができることが当業者によって理解されるだろう。あるいは、医師は、ＲＡを診断する既存の方法に使用される他の臨床的または病理学的パラメーターも考慮してもよい。従って、本発明の方法を使用して得られた結果を、ＲＡの診断のために実施された他の試験、アッセイまたは手順からの結果と比較および／または組合せ得る。このような比較および／または組合せは、より正確な診断を提供するのを助け得る。

例えば、本発明のＲＡ診断法を、ＡＲＡ基準と組み合わせて使用し得る（すなわち、F.C. Arnett et al., Arthritis Rheum., 1988, 31: 315-324に記載のＲＡの分類のための、１９８７年に改訂された米国リウマチ学会の基準）。ＡＲＡ基準によれば、患者は、７つの以下の基準のうち少なくとも４つを示す場合にＲＡを有すると言われる：１）少なくとも１時間の朝のこわばり；２）３箇所以上の関節領域の関節炎；３）手関節の関節炎；４）対称的な関節炎；５）リウマトイド結節；６）血清リウマチ因子（ＲＦ）；および７）Ｘ線撮影写真の変化（ここで、１〜４の基準は少なくとも６ヶ月間存在していなければならない）。

代替的にまたは追加的に、本発明のＲＡ診断法からの結果を、他のＲＡバイオマーカーを使用する１つ以上のアッセイからの結果と組み合わせて使用し得る。従って、特定の態様において、ＲＡの診断は、本発明の方法からの結果および異なるＲＡバイオマーカーを使用した１つ以上の追加のアッセイからの結果に基づき得る。例えば、ＲＡバイオマーカーのパネルを、例えばチップまたはビーズに基づいたアレイ技術を使用して個々にまたは同時のいずれかで試験し得る。

適切なＲＡバイオマーカー例としては、ＣＣＰ、Ｃ反応性タンパク質、血清アミロイドＡ、インターロイキン６（ＩＬ６）、Ｓ１００タンパク質、オステオポンチン、リウマチ因子、マトリックスメタロプロテアーゼ１（ＭＭＰ−１）、マトリックスメタロプロテアーゼ３（ＭＭＰ−３）、ヒアルロン酸、ｓＣＤ１４、血管新生マーカー（例えば血管内皮増殖因子またはＶＥＧＦ）、および骨、軟骨または滑膜の代謝産物（例えば、ピリジノリンまたはそのグリコシル化形；デオキシ−ピリジノリン；架橋テロペプチド；コラーゲンネオエピトープ；ＣＳ８４６；軟骨オリゴマー基質タンパク質；軟骨中間層タンパク質；マトリリン、コンドロモジュリン、オステオカルシンなど）が挙げられるがそれらに限定されない。

特定の態様において、本発明の方法は、ＣＣＰ陰性患者におけるＲＡの診断のために使用される。実際に、本明細書の実施例の章において報告したように、出願人は、特に、８つのペプチドバイオマーカーの組合せ（３つのＰＡＤ４−ペプチド、３つのＢＲＡＦ−ペプチド、および２つのカルパスタチン−ペプチド）を使用した本発明の方法は、ＣＣＰ陰性被験体の７０％超においてＲＡの診断を可能とすることを示した。「ＣＣＰ陰性患者」および「ＣＣＰ陰性被験体」という用語は、同義語として使用される。それらは、血清が、シトルリン化タンパク質に対して作られる抗体を全く含まない（または少なくとも検出可能な抗体を全く含まない）被験体を指す。

ＩＩＩ−キット
別の局面において、本発明は、本発明による診断法を実施するために有用である材料を含むキットを提供する。本明細書において提供される診断手順は、診断研究所、実験研究所または施術者によって実施され得る。本発明は、これらの異なる環境で使用することのできるキットを提供する。

生物学的試料中の抗ＰＡＤ４自己抗体、抗ＢＲＡＦ自己抗体および／または抗カルパスタチン自己抗体を検出するためのおよび／または本発明により被験体におけるＲＡを診断するための材料および試薬は、キット中に一緒に合わせられ得る。本発明の各キットは、好ましくは生物学的試料中の自己抗体の検出のために適した量の、少なくとも１つの本発明のペプチドバイオマーカーを含む。

従って、特定の態様において、本発明のキットは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、その類似体およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなる、好ましくは５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列を有する、少なくとも１つのＰＡＤ４−ペプチドを含む。

他の態様において、本発明のキットは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、その類似体およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなる、好ましくは５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列を有する、少なくとも１つのＢＲＡＦ−ペプチドを含む。

さらに他の態様において、本発明のキットは、以下：
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、その類似体およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなる、好ましくは５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列を有するＰＡＤ４−ペプチド；
配列番号７、配列番号８、配列番号９、その類似体およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなる、好ましくは５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列を有するＢＲＡＦ−ペプチド、
配列番号１１、配列番号１２、その類似体およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなる、好ましくは５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列を有するカルパスタチン−ペプチド、並びに
その任意の組合せ
からなる群より選択される少なくとも２つのバイオマーカーを含む。

特定の好ましい態様において、キットは、前記したように、少なくとも８つのバイオマーカー（３つのＰＡＤ４−ペプチド、３つのＢＲＡＦ−ペプチドおよび２つのカルパスタチン−ペプチド）を含む。好ましくは、３つのＰＡＤ４−ペプチドは配列番号２〜４からなり、３つのＢＲＡＦ−ペプチドは配列番号７〜９からなり、そして２つのカルパスタチン−ペプチドは配列番号１１〜１２からなる。

キットに含まれるペプチドバイオマーカー（群）は、基質表面（例えばビーズ、アレイなど）上に固定されていてもいなくてもよい。従って、特定の態様において、本発明のキットは、本明細書において提供されるＲＡを診断するためのアレイを含み得る。あるいは、基質表面は、ペプチドバイオマーカーの固定のために本発明のキットに含まれ得る。

本発明のキットは、一般的に、キットに含まれるペプチドバイオマーカーと、生物学的試料中に存在する自己抗体との間に形成されるバイオマーカー−抗体の複合体の検出のための少なくとも１つの試薬も含む。このような試薬は、例えば、前記したように、試験した種に由来する抗体を特異的に認識する標識された抗体（例えばヒト被験者については抗ヒトＩｇＧ）であり得る。

手順に応じて、キットはさらに、抽出緩衝液および／または試薬、遮断緩衝液および／または試薬、免疫検出緩衝液および／または試薬、標識緩衝液および／または試薬、並びに検出手段の１つ以上を含み得る。手順の種々の工程を実施するためのこれらの緩衝液および試薬を使用するためのプロトコールはキットに含まれ得る。

本発明のキットに含まれる種々の試薬は固体形（例えば凍結乾燥）または液体形で供給され得る。本発明のキットは場合により、各々の個々の緩衝液および／または試薬のための種々の容器（例えばバイアル、アンプル、試験チューブ、フラスコまたはボトル）を含み得る。各成分は、一般的に、そのそれぞれの容器に分注されるかまたは濃縮形で提供されるのに適している。開示された方法の特定の工程を実施するために適した他の容器も提供され得る。キットの個々の容器は好ましくは市販のために密閉されて維持される。

特定の態様において、キットは、本発明の方法による被験体のＲＡの診断のためにその成分を使用するための説明書を含む。本発明の方法に従ってキットを使用するための説明書は、被験体から得られた生物学的試料を処理するためのおよび／または試験を実施するための説明書、および／または結果を解釈するための説明書を含み得る。キットはまた、医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府当局によって規定された形式の注意書きを含み得る。

ＩＶ−ＲＡのための新たな治療薬の開発
出願人によって同定されたＰＡＤ４および／またはＢＲＡＦエピトープは、ＲＡを処置またはＲＡの進行を予防するのに潜在的に有用な化合物または物質の同定のための魅力的なターゲットを構成し得る。

すでに前記したように、ＰＡＤ４は、ＲＡ特異的抗体のためのターゲットであるだけでなく、それはまた、シトルリン化エピトープの生成にも関与している。本出願人らは、抗ＰＡＤ４自己抗体が、ＰＡＤ４によるフィブリノーゲンのシトルリン化を阻害することを示した（実施例の章を参照）。出願人はまた、抗ＰＡＤ４自己抗体が、ＰＡＤ４上の３つのエピトープを特異的に認識し、その２つ（ペプチド６１および６３）は、ＰＡＤ４の基質結合ドメイン内に位置していることを示した。これらのＰＡＤ４エピトープへの抗ＰＡＤ４自己抗体の結合を妨げることは、自己抗体の阻害作用を逆転し得、そしてＰＡＤ４酵素活性を回復し得る。

ＢＲＡＦは、自己抗体のための興味深いターゲットである。ＢＲＡＦは、細胞膜から核への細胞分裂促進シグナルの伝達に関与するセリン−トレオニンキナーゼである。ＢＲＡＦは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫｓ）のシグナル伝達カスケードを調節する。ＭＡＰＫｓは、Ｂ細胞抗原レセプター、Ｔ細胞レセプター、Ｔｏｌｌ様レセプター並びにＩＬ−１、ＩＬ−１７およびＴＮＦαレセプターを介したシグナル伝達に関与する。ＭＡＰＫｓはまた炎症誘発サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−６）の産生においても役割を果たす。ＢＲＡＦに対する自己抗体が、キナーゼとしてＢＲＡＦ活性に影響を及ぼし得るかどうかを試験するために、出願人は、ＢＲＡＦ、ＭＥＫ１（その主要な基質）およびＲＡ患者の血清から精製したＢＲＡＦに対する自己抗体を使用したリン酸化アッセイを開発し；そして、抗ＢＲＡＦ自己抗体の８０％が、インビトロにおいてＢＲＡＦによるＭＥＫ１のリン酸化を活性化することを見出した。この結果は、抗ＢＲＡＦ自己抗体が、ＢＲＡＦを通してＭＡＰキナーゼ経路を活性化し得、これにより、炎症誘発性サイトカインの産生および関節の炎症がもたらされ得ることを示唆する。出願人はまた、抗ＢＲＡＦ自己抗体が、ＢＲＡＦ上の３つのエピトープ（ペプチドＰ１０、Ｐ１６およびＰ２５）を特異的に認識することを示した。それ故、抗ＢＲＡＦ抗体は、ＲＡにおける炎症の制御のためのターゲットを構成し得る。

従って、ＰＡＤ４エピトープ、特にペプチド６１および／またはペプチド６３への抗ＰＡＤ４自己抗体の結合を妨げる化合物または基質を同定するためのスクリーンを開発し得る。同じように、ＢＲＡＦエピトープ、特にペプチドＰ１０、Ｐ１６および／またはＰ２５への抗ＢＲＡＦ自己抗体の結合を妨げる化合物または物質を同定するためのスクリーンを開発し得る。

このようなスクリーンは、生物学的液体または単離細胞などの任意の適切な生物学的な系において実施され得る。一般的には、スクリーンは、標準的な組織培養容器中で増殖させることのできる細胞を使用して実施される。適切な細胞としては、任意の認められた入手源から得られた適切な正常細胞および形質転換細胞が挙げられる。好ましくは、細胞は、哺乳動物（ヒトまたは動物、例えばげっ歯類またはサル）起源である。より好ましくは、細胞はヒト起源である。哺乳動物細胞は、細胞がＰＡＤ４および／またはＰＡＤ４を発現する限り、任意の器官または組織の起源（例えば骨、軟骨または滑膜）および任意の細胞型であり得る。本発明の方法の実施に使用しようとする細胞は、初代細胞、二次細胞、または不死化細胞（例えば樹立細胞株）であり得る。それらは、当技術分野において周知の技術によって調製され得るか（例えば、細胞は、骨、軟骨または滑膜から単離され得る）、または免疫学的および微生物学的な市販の入手源（例えば、American Type Culture Collection, Manassas, VAから）から購入され得る。代替的にまたは追加的に、細胞は、例えば、対象の遺伝子を含むように遺伝子操作され得る。一次薬物スクリーニング（すなわち初回のスクリーニング）のために開発されたアッセイは、好ましくは、市販されておりそして通常比較的容易に増殖する樹立細胞株を使用して実施されるが、薬物開発過程で後に使用しようとするアッセイは、好ましくは初代細胞および二次細胞を使用して実施され、これらは、不死化細胞よりも入手、維持および／または増殖が一般的により困難であるが、in vivoの状況のためのより良好な実験モデルを示す。スクリーニング法を、マルチウェルアッセイプレートの複数のウェル中に含まれる細胞を使用して実施し得る。

当業者によって理解されているように、任意の種類の化合物または薬剤をスクリーニングすることができる。候補化合物は合成または天然の化合物であり得；それは、単一分子、または異なる分子の混合物もしくは複合体であり得る。候補化合物を個々にスクリーニングし得る。あるいは、コレクションまたはライブラリーに含まれる化合物を同時にスクリーニングしてもよい。

細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態の天然化合物のコレクションは、例えば、Pan Laboratories (Bothell, WA)またはMycoSearch (Durham, NC)から入手することができる。合成化合物ライブラリーは、Comgenex (Princeton, NJ)、Brandon Associates (Merrimack, NH)、Microsource (New Milford, CT)およびAldrich (Milwaukee, WI)から市販されている。候補化合物のライブラリーもまた、例えば、Merck、Glaxo Welcome、Bristol-Meyers-Squibb、Novartis、Monsanto/SearleおよびPharmacia UpJohnを含む大きな化学会社によって開発されているか、またはそれらから市販されている。さらに、天然コレクション、合成的に生成したライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的な手段を通して容易に修飾される。化学ライブラリーは、伝統的な自動合成、ＰＣＲ、クローニングまたは特許権を有する合成法によって調製することが比較的容易である（例えば、S.H. DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993, 90:6909-6913; R.N. Zuckermann et al., J. Med. Chem. 1994, 37: 2678-2685; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1994, 33: 2059-2060; P.L. Myers, Curr. Opin. Biotechnol. 1997, 8: 701-707を参照されたい）。

ＰＡＤ４のペプチド６１および／またはペプチド６３、あるいはＢＲＡＦのペプチドＰ１０、ペプチドＰ１６および／またはペプチドＰ２５をターゲット（群）として使用して、ＲＡの処置のための有用な薬剤を、多種多様なクラスの化学物質のいずれかに見い出し得る。

実施例
以下の実施例は、本発明を製造および実施するための好ましい形態のいくつかを説明する。しかしながら、実施例は説明の目的のみのためであり、本発明の範囲を制限する意味はないことを理解すべきである。さらに、実施例の記載は過去形で提示されていなければ、本文は、明細書の残りと同様に、実験が実際に実施されたまたはデータが実際に獲得されたことを示唆するものではない。

以下に提示した結果のいくつかは、科学文献（Auger et al., Ann. Rheum. Dis., 2009, 68: 591-594）（これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）において本出願人らによって報告されている。

実施例Ｉ：ＲＡ診断のためのＰＡＤ４−ペプチド
患者および方法
ＲＡ患者および対照
ＲＡ患者を、フランス、マルセイユのHospital La Conceptionのリウマチ病棟から選択した。これらの患者は、ＲＡのための１９８７年の米国リウマチ学会の基準を満たしていた（F.C. Arnett et al., Arthritis Rheum., 1988, 31: 315-324）。脊椎関節症（ＡＳ）患者は、マルセイユのHospital La Conceptionのリウマチ病棟からであった。実験スタッフおよびマルセイユ血液輸血センタースタッフからの志願者は、正常対照としての役目を果たした。全ての参加者がインフォームドコンセントを与えた。

ＰＡＤ４に対する自己抗体の精製
ＥＬＩＳＡプレートに、組換えＰＡＤ４タンパク質（Abnova Corporation, H0023569P01）を使用して、４℃で一晩かけて１ウェルあたり１μgのＰＡＤ４をコーティングした。ＰＡＤ４に対する自己抗体を含む２９人のＲＡ患者および２人の対照からの血清を選択した（I. Auger et al., Ann. Rheum. Dis.、２００８年１０月２８日）。血清をＰＢＳ中で１：２に希釈し、そして３時間インキュベーションした。洗浄後、ＰＡＤ４に対する自己抗体をＰＢＳ（ｐＨ２）中で精製し、１Ｍトリス緩衝液中で中和し、そして定量した。抗ＰＡＤ４自己抗体の存在をドットブロットによって確認した。

社内シトルリン化アッセイ
１０mg/mLの最終濃度のヒトフィブリノーゲン（Sigma）を、１μgのＰＡＤ４（Abonova Corporation）と共に、作業緩衝液（１００mMトリスＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ_２、５mM ＤＴＴ、ｐＨ７．５）中、ＰＡＤ４に対する精製自己抗体１μgの存在下、４時間５５℃でインキュベーションした。各患者のために、１つの陽性対照が含まれた（１μgの対照自己抗体抗Ｃ１またはＣ２の存在下の作業緩衝液中においてＰＡＤ４と共にフィブリノーゲンのインキュベーション）。各反応混合物を、プロテインＡセファロースビーズと共に２回インキュベーションして抗体を排除した。

その後、各反応混合物を２枚のＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、そして５％乳汁を含むＰＢＳで遮断した。フィブリノーゲンのシトルリン化を検出するために、シトルリン化フィブリノーゲンに対する自己抗体は含むがＰＡＤ４に対する自己抗体は全く含まない血清を使用した。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、ペルオキシダーゼにコンジュゲートさせた抗ヒトＩｇＧ（Sigma, France）を加えた。４０５nmでの吸光度（ＯＤ）を解読した。ＰＡＤ４によるシトルリン化の活性化または阻害を、試験試料について測定したＯＤと、陽性対照について測定したＯＤの比を測定することによって決定した。１を超える比は活性化を示し、１未満の比は阻害を示した。

合成ペプチド
ペプチド（Neosystem, Strasbourg, France）を、固相系を使用して合成し、そして精製した。ＰＡＤ４（ローカスNM_012387）残基１〜６６３に由来する１０アミノ酸上で重複している合計で６５個の２０ｍｅｒペプチド。

ＰＡＤ４におけるペプチドのマッピング
プレートに、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中で希釈された１０μg/ウェルのＰＡＤ４ペプチドを一晩かけてコーティングした。プレートを、５％乳汁を含むＰＢＳを用いて遮断した。ＰＢＳ中で１：１００に希釈された血清を２時間インキュベーションした。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて洗浄した後、ペルオキシダーゼにコンジュゲートさせた抗ヒトＩｇＧ（Sigma, France）を加えた。４０５nmでの吸光度（ＯＤ）を解読した。各血清を、ペプチドを含まないウェルに加えることによってバックグラウンドＯＤを得た。陽性血清は、バックグラウンドＯＤの２倍を超えるＯＤ値として定義された（I Auger et al., Ann. Rheum. Dis., 2007, 66: 1588-1593）。

統計学的分析
Ｐ値をカイ二乗検定を使用して計算した。

結果
ＰＡＤ４に対する自己抗体によるフィブリノーゲンのシトルリン化の阻害
ＰＡＤ４に対して作られた自己抗体がＰＡＤ４の活性に干渉するかどうかを試験するために、フィブリノーゲンのシトルリン化を、２９人の患者および２人の健康対照から精製された抗ＰＡＤ４自己抗体の存在下において分析した。その後、シトルリン化の検出をＥＬＩＳＡによって定量した。

フィブリノーゲンのシトルリン化の阻害が、ＰＡＤ４に対する精製された自己抗体の３１個中２２個について観察され；フィブリノーゲンのシトルリン化の活性化は、ＰＡＤ４に対する精製された自己抗体の３１個中６個について観察され；そしてＰＡＤ４に対する精製された自己抗体の３１個中３個が、フィブリノーゲンのシトルリン化に対して全く影響を及ぼさないことが判明した（図１）。

ＰＡＤ４における４つの線形エピトープが、ＰＡＤ４に対する自己抗体によって認識される
ＰＡＤ４におけるＢ細胞エピトープを同定するために、ヒトＰＡＤ４の全配列を包含する６５個の重複している２０ｍｅｒのペプチドを合成した。これらのペプチドを、抗ＰＡＤ４自己抗体を含むことが知られる２９人のＲＡ患者および２人の対照の血清を用いてスクリーニングした。

６５個のペプチドの中で、１８個のペプチドが、試験した血清によって認識された。これらの中の１０個のペプチドがＮ末端ドメインに位置し、そして他の８個のペプチドがＣ末端ドメインに位置する。４つのペプチド（２２、２８、６１および６３）が、ＲＡ患者および対照の血清によって優先的に認識された（表１）。実際にＲＡ患者からの３１個中１５個の血清が、ペプチド２２に対して陽性であり、３１個中２５個がペプチド２８に対して陽性であり、３１個中８個がペプチド６１に対して陽性であり、そして３１個中１６個がペプチド６３に対して陽性であった。ペプチド２２および２８はＰＡＤ４のＮ末端ドメインに位置し、一方でペプチド６１および６３はＰＡＤ４のＣ末端ドメインに位置する。

ＰＡＤ４における３つの線形エピトープが、ＲＡ患者に関連する
観察された反応性を確認するために、３３人の脊椎関節症（ＡＳ）患者および３３人の健康個体の血清を、ＥＬＩＳＡによって、免疫吸着剤としてペプチド２２、２８、６１および６３を使用して試験した。

ペプチド２２、ペプチド６１およびペプチド６３に対する自己抗体が、対照よりも多くのＲＡ患者において見出された（図２）。実際に、２９人中１５人のＲＡ患者がペプチド２２に対して陽性であり、これに対して６６人中７人の対照が陽性であった（カイ二乗検定によりｐ＝０）。同様に、２９人中８人のＲＡ患者がペプチド６１に対して陽性であり、これに対して６６人中０人の対照が陽性であった（カイ二乗検定によりｐ＝０）。最後に、２９人中１５人の患者がペプチド６３に対して陽性であり、これに対して６６人中６人の対照が陽性であった（カイ二乗検定によりｐ＝０）。

ペプチド２８に対する自己抗体は、対照において高い比率で見られた。実際に、２９人中２４人の患者が陽性であり、これに対して３３人中２０人のＡＳ患者および３３人中１０人の健康個体が陽性であった（カイ二乗検定によりｐ＝０．００２、２９人の患者ｖｓ６６人の対照）。

ＰＡＤ４に対する自己抗体によるペプチド認識およびＰＡＤ４によるシトルリン化の阻害
ＰＡＤ４によるシトルリン化を阻害（ＲＡ１〜ＲＡ２０の患者）、活性化（ＲＡ２４〜ＲＡ２９の患者）またはそれに対して全く影響を及ぼさない（ＲＡ２１〜ＲＡ２３の患者）ＰＡＤ４に対する自己抗体のペプチドパターンを分析した。

ＰＡＤ４を阻害または活性化することが知られる自己抗体によって認識されるペプチドの数の差異は全く観察されなかった（表２）。その作用（活性化または阻害）に関係なく、ＰＡＤ４に対する殆どの自己抗体が、Ｎ末端ドメインおよびＣ末端ドメインに位置するペプチドを認識した。ＰＡＤ４を阻害するＰＡＤ４に対する自己抗体の中で、２０個中５個が、Ｎ末端ドメインに位置するペプチドを排他的に認識し、２０個中１個がＣ末端ドメインに位置するペプチドを排他的に認識し、そして２０個中１４個がＮ末端ドメインおよびＣ末端ドメインに位置するペプチドを認識した（図３）。

ＰＡＤ４によるシトルリン化に対して全く影響を及ぼさないＰＡＤ４に対する自己抗体の中で、３個中３個が、Ｎ末端ドメインおよびＣ末端ドメインに位置するペプチドを認識した。

ＰＡＤ４を活性化するＰＡＤ４に対する自己抗体の中で、６個中１個が、Ｎ末端ドメインに位置するペプチドを排他的に認識し、６個中０個がＣ末端ドメインに位置するペプチドを認識し、そして６個中３個がＮ末端ドメインおよびＣ末端ドメインに位置するペプチドを認識した。

ペプチド２２および６１は、ＰＡＤ４を阻害するＰＡＤ４に対する自己抗体によって優先的に認識された（図４）。実際に、ＰＡＤ４を阻害するＰＡＤ４に対する自己抗体２０個中１２個が、ペプチド２２に対して陽性であり、これに対してＰＡＤ４を活性化したＰＡＤ４に対する自己抗体６個中２個が陽性であった。さらに、ペプチド６１は、ＰＡＤ４を阻害するＰＡＤ４に対する自己抗体２０個中６個によって認識され、これに対して、ＰＡＤ４を活性化するＰＡＤ４に対する自己抗体６個中０個が認識された。しかしながら、ＰＡＤ４のシトルリン化に対して全く影響を及ぼさないことが判明したＰＡＤ４に対する自己抗体の中で、３個中２個がペプチド６１を認識した。

考察
本出願人らは以前に、タンパク質アレイおよびＥＬＩＳＡアレイを使用して、ＰＡＤ４が、ＲＡ患者における特異的な自己抗原であることを見出した。ＲＡにおけるＰＡＤ４に対する自己抗体はすでに記載されている。ＰＡＤ４は、シトルリン化エピトープの生成に関与する。シトルリン化エピトープに対する自己抗体は、ＲＡに対して非常に特異的である。ＲＡの発症前のこれらの自己抗体の存在は、疾病の病態生理における潜在的な役割を示唆する。

本明細書において提示した研究は、ＰＡＤ４に対する自己抗体がＰＡＤ４の活性に干渉するかどうかを試験するために行なわれた。出願人は、ＰＡＤ４、フィブリノーゲン、およびＲＡ患者の血清から精製したＰＡＤ４に対する自己抗体を用いての社内シトルリン化アッセイを開発した。一般的な原則として、ＰＡＤ４に対する自己抗体は、ＰＡＤ４によるフィブリノーゲンのシトルリン化を阻害することが観察された。実際に、ＰＡＤ４に対する精製された自己抗体の３１個中２２個が、ＰＡＤ４によるフィブリノーゲンのシトルリン化を阻害することが判明した。

ＰＡＤ４に対する自己抗体によって認識されるエピトープを同定するために、ＰＡＤ４の全配列を包含する６５個の２０ｍｅｒペプチドを、直接的なＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用した。ＰＡＤ４に対する自己抗体は、以下の４つの主要なエピトープを認識することが判明した：ペプチド２２（ヒトＰＡＤ４のアミノ酸残基２１１〜２３０に対応）；ペプチド２８（アミノ酸残基２７１〜２９０）；ペプチド６１（アミノ酸残基６０１〜６２０）；およびペプチド６３（アミノ酸残基６２１〜６４０）。ペプチド２２および２８はＰＡＤ４のＮ末端ドメインに位置し（アミノ酸残基１〜３００を包含する）、一方ペプチド６１および６３はＰＡＤ４のＣ末端ドメインに位置する（アミノ酸残基３０１〜６６３を包含する）。ペプチド２２、６１および６３を認識する自己抗体は、対照と比較してＲＡ患者において高い比率で見られた。

５つのＣａ^２＋結合モチーフがＰＡＤ４において同定され、３つはＮ末端ドメインにあり、２つはＣ末端ドメインにある（K Arita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, 10: 5291-5296; K Arita et al., Natl. Struct. Mol. Biol., 2004, 11: 777-783）。Ｎ末端ドメインは、Ｃａ^２＋によって媒介されるコンフォメーション変化に関与するようである。Ｃａ^２＋への結合後、コンフォメーション変化は活性な間隙を生成し、そして基質がＰＡＤ４に結合する。Ｎ末端ドメインはまた、ＰＡＤ４の酵素活性にも影響を及ぼし得る。実際に、ＰＡＤＩ４遺伝子は２つの主要なハプロタイプを提示する。いくつかの個体群において、１つはＲＡ感受性であり、他方はＲＡ感受性ではない。これらの２つのハプロタイプは、Ｎ末端ドメインのエキソンにおいて４つの単一のヌクレオチド多形（ＳＮＰ）を含む（５５位、８２位、１１２位および１１７位）。Ｃ末端ドメインは、基質結合ドメインおよび触媒ドメインを含む。

２００８年に、Harris et al.は、ＰＡＤ４に対する自己抗体を用いての、インビトロで翻訳されたＰＡＤ４短縮形の免疫沈降によって、ＰＡＤ４中のエピトープをマッピングした（M.L. Harris et al., Arthritis Rheum., 2008, 58(7): 1958-1967）。２種類の血清が同定された。Ｉ型血清は、完全長ＰＡＤ４（１〜６６３）を排他的に認識することが判明し、そしてＩＩ型血清は完全長（１〜６６３）および短縮形のＰＡＤ４（１〜５２３）の両方を認識することが判明した。ＰＡＤ４に対するＩＩ型自己抗体は、ＰＡＤ４のＮ末端ドメイン（１〜１１９）の寄与を排他的に必要とする。しかしながら、ＰＡＤ４に対するＩ型自己抗体は、ＰＡＤ４のＮ末端ドメイン（１〜１１９）およびＣ末端ドメイン（５２３〜６６３）の寄与を必要とする。

本出願人らによって実施されたタンパク質アレイおよびＥＬＩＳＡアレイにおいて、ＰＡＤ４に対するどの自己抗体も、完全長ＰＡＤ４（１〜６６３）を認識した（I Auger et al., Ann. Rheum. Dis., 2008 Oct. 28）。ＲＡ患者からのＰＡＤ４に対する自己抗体の中で、２９個中３個だけが短縮形のＰＡＤ４（残基１〜１１１）を認識した（データは示さず）。詳細なペプチドアッセイにおいて、ＰＡＤ４に対する自己抗体の２９個中７個が、ＰＡＤ４のＮ末端ドメイン（２１１〜２９０）に位置するペプチドを排他的に認識した。ＰＡＤ４に対する自己抗体の２９個中１個が、Ｃ末端ドメイン（６１１〜６３０）に位置するペプチドを排他的に認識した。最後に、ＰＡＤ４に対する自己抗体の２９個中１９個が、Ｎ末端ドメイン（２１１〜２９０）およびＣ末端ドメイン（６０１〜６５０）に位置するペプチドを認識することが判明した。

ＰＡＤ４に対する自己抗体の大半は、ＰＡＤ４によるフィブリノーゲンのシトルリン化を阻害することが判明した。大半の自己抗体は、Ｎ末端ドメイン（主にペプチド２２またはペプチド２８）およびＣ末端ドメイン（主にペプチド６１またはペプチド６３）に位置するペプチドを認識する。理論に拘りたくはないが、出願人は、ＰＡＤ４に対する自己抗体がどのように、シトルリン化を阻害するか（図５）：自己抗体と、ペプチド２２またはペプチド２８との相互作用は、Ｃａ^２＋結合によって媒介されるコンフォメーション変化に干渉し得るかを説明するための以下のモデルを提案する。カルシウム結合および基質結合は、ＰＡＤ４において活性部位を発生させるのに重要である（K Arita et al., Nat. Struct. Mol. Biol., 2004, 11: 777-783）。ＰＡＤ４に対する自己抗体は、ＰＡＤ４のＣ末端ドメイン内の４０アミノ酸に結合するので、ＰＡＤ４とその基質との相互作用を遮断することも可能である。これは、ＰＡＤ４に対する自己抗体がなぜＰＡＤ４によって媒介されるシトルリン化を阻害するかを説明し得る。

この阻害が、どのようにＲＡ患者における抗シトルリン免疫化の発達に影響を及ぼし得るかは依然として解明されていない。出願人はこの疑問を研究中の過程にある。

実施例ＩＩ：ＣＣＰ陰性におけるＲＡ診断のためのＢＲＡＦ−ペプチド
患者および方法
ＲＡ患者および対照
１１８人のＲＡ患者を、フランス、マルセイユのHospital La Conceptionのリウマチ病棟から選択した。これらの患者は、ＲＡのための１９８７年の米国リウマチ学会の基準を満たしていた。全ての患者について、ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子型判定および抗ＣＣＰ滴定を得た。１１８人中８９人のＲＡ患者がＣＣＰ陽性であり、そして２９人のＲＡ患者がＣＣＰ陰性であった。マルセイユの同じ病院からの脊椎関節症（ＡＳ）患者（３３人）、並びにＩＮＳＥＲＭ ＵＭＲ６３９およびマルセイユ血液輸血センターのスタッフからの健康志願者（６０人）を対照として使用した。

合成ペプチド
ＢＲＡＦ（ローカスNP_004324.1）からの残基４１６〜７６６を包含する４０個の２０ｍｅｒペプチドを、固相系を使用して合成し、そして精製した（Neosystem, Strasbourg, France）。ペプチド合成のために使用したＢＲＡＦ配列は、ヒト癌において観察されそしてキナーゼ活性の上昇に関連した突然変異である、５９９位（Ｖ５９９Ｅ、バリンがグルタメートで置換されている）における多形を示した。

ＥＬＩＳＡによる自己抗体の検出
プレートに、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中で希釈した１０μg/ウェルのペプチドを一晩かけてコーティングした。プレートを５％乳汁を含むＰＢＳを用いて遮断した。ＰＢＳ中で１：１００に希釈した血清を２時間インキュベーションした。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて洗浄した後、ペルオキシダーゼにコンジュゲートさせた抗ヒトＩｇＧ（Sigma, France）を加えた。４０５nmにおける吸光度（ＯＤ）を解読した。各血清を、タンパク質の非存在下のウェルに加えることによってバックグラウンドＯＤを得た。陽性血清は、バックグラウンドＯＤの２倍を超えるＯＤ値を提示する血清として定義された。

統計学的分析
ｐ値を、カイ二乗検定を使用して計算した。

結果
ＢＲＡＦに対する自己抗体は、ＢＲＡＦ中の４つの線形エピトープを認識する
ＢＲＡＦ上のＢ細胞エピトープを同定するために、ＢＲＡＦの触媒ドメインを包含する４０個の２０ｍｅｒペプチドを合成した。これらの４０個のペプチドを、ＢＲＡＦに対する自己抗体を含むことが知られる２１人のＲＡ患者の血清を用いてスクリーニングした。４０個のペプチドの中で、１４個が、試験した血清によって認識された。４つのペプチド、すなわちＰ１０（配列番号７、ヒトＢＲＡＦの５０６〜５２５位）、Ｐ１６（配列番号８、ヒトＢＲＡＦの５６６〜５８５位）、Ｐ２５（配列番号９、ヒトＢＲＡＦの６５６〜６７５位）、およびＰ３３（配列番号１３）が、ＲＡ患者の血清によって優先的に認識された。実際に、２１個中１８個がＰ１０を認識し、８個がＰ１６を認識し、１５個がＰ２５を認識し、そして６個がＰ３３を認識した（表２参照）。

ＢＲＡＦ上の３つの線形エピトープが、ＲＡ患者によって認識される
観察された反応性を確認するために、本発明者らは、ＥＬＩＳＡによって３３人の脊椎関節症（ＡＳ）患者の血清を試験し、そして６０人の健康個体の血清を、ＥＬＩＳＡによってＰ１０、Ｐ１６、Ｐ２５およびＰ３３の存在下において試験した。Ｐ１０、Ｐ１６およびＰ２５に対する自己抗体は、対照よりもＲＡ患者においてより多く見られた（図６参照）。実際に、２１人中１８人のＲＡ患者の血清がＰ１０を認識し、これに対して９３人中１０人の対照がＰ１０を認識した（カイ二乗検定によりｐ＜１０^−７）。同様に、２１人中８人のＲＡ患者の血清がＰ１６を認識し、これに対して９３人中１人の対照がＰ１６を認識した（カイ二乗検定によりｐ＜１０^−７）。最後に、２１人中１５人のＲＡ患者の血清がＰ２５を認識し、これに対し９３人中０人の対照がＰ２５を認識した（カイ二乗検定によりｐ＜１０^−７）。Ｐ３３に対する抗体はＲＡに対してより特異性が低かった。２１人中６人のＲＡ患者、しかしまた３３人中６人のＡＳ患者および６０人中１３人の健康個体も、抗Ｐ３３抗体を有していた（カイ二乗検定によりｐ＝０．５２３、２１人のＲＡ患者ｖｓ９３人の対照）。

Ｐ１０、Ｐ１６およびＰ２５ペプチドは、ＣＣＰ陰性患者の５０％においてＲＡを同定する
ＣＣＰ陽性患者およびＣＣＰ陰性患者における陽性血清の頻度を、ＥＬＩＳＡによって、Ｐ１０、Ｐ１６およびＰ２５ペプチドを免疫吸着剤として使用して計算した。ＣＣＰ陽性患者の中で、８９人中２９人がＰ１０を認識し、８９人中７人がＰ１６を認識し、そして８９人中１７人がＰ２５を認識した。ＣＣＰ陰性患者の中で、２９人中１３人がＰ１０を認識し、２９人中１人がＰ１６を認識し、そして２９人中８人がＰ２５を認識した。組み合わせると、Ｐ１０、Ｐ１６およびＰ２５は、ＣＣＰ陰性患者の５０％を同定する（図７）。

結論
ＲＡ患者によってほぼ独特に認識されるＢＲＡＦ上の３つの線形ペプチドが同定された。Ｐ１０（配列番号７）、Ｐ１６（配列番号８）およびＰ２５（配列番号９）ペプチドは、ＢＲＡＦの触媒ドメインに位置する。これらのペプチドはまた、ＣＣＰ陰性患者の血清によっても認識された。ＢＲＡＦのＰ１０、Ｐ１６およびＰ２５の組合せは、ＣＣＰ陰性患者の５０％を同定する。

実施例ＩＩＩ：ＣＣＰ陰性患者におけるＲＡ診断のためのバイオマーカー
患者および方法
ＲＡ患者および対照
１００人を超える（１１８人）ＲＡ患者を、前記したように、フランス、マルセイユのHospital La Conceptionのリウマチ病棟から選択した。１００人の対照（マルセイユのHospital La Conceptionのリウマチ病棟からの脊椎関節症（ＡＳ）患者、およびＩＮＳＥＲＭ ＵＭＲ６３９およびマルセイユ血液輸血センターのスタッフからの志願者）も試験した。

合成ペプチド
野生型ＰＡＤ４（NM_012387）からの残基１〜６６３を包含する６５個の２０ｍｅｒペプチド、ＢＲＡＦ（NP_004324.1）からの残基４１６〜７６６を包含する４０個の２０ｍｅｒペプチドを、固相系を使用して合成し、そして精製した（Neosystem, Strasbourg, France）。カルパスタチンアイソフォームＡ（ローカスNP_001035908）残基１〜７０８に由来する９４個の１５アミノ酸ペプチドを使用した。

特に、ＰＡＤ４ペプチド：２２（配列番号２）、６１（配列番号３）および６３（配列番号４）は、ローカスNM_012387からの２０ｍｅｒペプチドである。ＢＲＡＦペプチドＰ１０（配列番号７）、Ｐ１６（配列番号８）およびＰ２５（配列番号９）は、ローカスNP_004324.1からの２０ｍｅｒペプチドである。カルパスタチンペプチドＰ’１６（配列番号１１）およびＰ’２８（配列番号１２）は、ローカスNP_001741からの１５ｍｅｒペプチドである。

ＥＬＩＳＡによる自己抗体の検出
使用した手順は、実施例ＩＩに記載のものと同一である。

統計学的分析
ｐ値を、カイ二乗検定を使用して計算した。

結果
８つのペプチド（３つのＰＡＤ４−ペプチド、３つのＢＲＡＦ−ペプチドおよび２つのカルパスタチン−ペプチド）がＲＡ患者によって認識される
出願人は、ＲＡ患者の血清によって優先的に認識されるＰＡＤ４上の３つの線形ペプチド：ペプチド２２、６１および６３；ほぼＲＡ患者によってしか認識されないＢＲＡＦ上の３つの線形ペプチド：Ｐ１０、Ｐ１６、Ｐ２５；並びに、ＲＡ患者と優先的に関連しているカルパスタチン上の２つの線形ペプチド：Ｐ’１６およびＰ’２８を同定した（図９参照）。

８つのペプチドが、ＣＣＰ陰性患者によって認識される
これらの８つのペプチドは、ＣＣＰ陰性患者の血清によって認識された（図１０参照）。最も効率的な結合剤は、ＢＲＡＦのＰ１０およびカルパスタチンのＰ’２８である。ＢＲＡＦのＰ１０は、ＣＣＰ陰性患者の４４％によって認識され、そしてカルパスタチンのＰ’２８はＣＣＰ陰性患者の３４％によって認識される。

ＰＡＤ４−ペプチド、ＢＲＡＦ−ペプチドおよびカルパスタチン−ペプチドの組合せは、ＣＣＰ陰性患者の７２％においてＲＡを認識する
１つの自己抗原にとっての、ＣＣＰ陰性患者を同定するための最善の組合せはＢＲＡＦペプチドである。ＢＲＡＦのＰ１０、Ｐ１６およびＰ２５の組合せは、ＣＣＰ陰性患者の５０％を同定する。２つの自己抗原にとっては、ＢＲＡＦペプチドおよびカルパスタチンペプチドの組合せが、ＣＣＰ陰性患者の６９％を同定する。最後に、ＰＡＤ４−ペプチド、ＢＲＡＦ−ペプチドおよびカルパスタチン−ペプチドの組合せは、ＣＣＰ陰性患者の７２％を同定する。

結論
本出願人らは、ＣＣＰ陰性患者の７２％の同定を可能とする８つのペプチド（ＰＡＤ４の３つのペプチド、ＢＲＡＦの３つのペプチド、およびカルパスタチンの２個のペプチド）を発見した。

他の態様
本発明の他の態様は、本明細書において開示した本発明の明細書または実施の考察から当業者には明らかとなろう。明細書および実施例は単に例示として捉えられ、本発明の真の範囲は以下の特許請求の範囲によって示されるものとする。

Claims (21)

1. 被験体の関節リウマチを診断するためのデータを提供するためのインビトロにおける方法であって、前記方法は、
   被験体から得られた生物学的試料を、バイオマーカー−抗体の複合体の形成を可能とする時間の間および条件下において少なくとも１つのバイオマーカーと接触させる工程、ここで、少なくとも１つのバイオマーカーは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、その類似体、およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなる５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列を有するＰＡＤ４−ペプチド；および
   形成されたバイオマーカー−抗体の複合体を検出する工程、ここで、バイオマーカー−抗体の複合体の検出は、被験体における関節リウマチを示す、
   を含む、前記方法。
2. 前記方法は、
   被験体から得られた生物学的試料を、バイオマーカー−抗体の複合体の形成を可能とする時間の間および条件下において少なくとも１つの他のバイオマーカーと接触させる工程、ここで、少なくとも１つの他のバイオマーカーは、
   配列番号７、配列番号８、配列番号９、その類似体、およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなるアミノ酸配列を有するＢＲＡＦ−ペプチド、配列番号１１、配列番号１２、その類似体、およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなるアミノ酸配列を有するカルパスタチン−ペプチド、並びに
   その組合せ
   からなる群より選択される；および
   形成されたバイオマーカー−抗体の複合体を検出する工程、ここで、バイオマーカー−抗体の複合体の検出は、被験体における関節リウマチを示す、
   をさらに含む、請求項１のインビトロにおける方法。
3. 少なくとも１つの他のバイオマーカーが、５０未満のアミノ酸のペプチドである、請求項２のインビトロにおける方法。
4. 前記方法は、３つのＰＡＤ４−ペプチド、３つのＢＲＡＦ−ペプチドおよび２つのカルパスタチン−ペプチドを用いて実施され、そして３つのＰＡＤ４−ペプチドが、配列番号２を含むまたはからなる５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列、配列番号３を含むまたはからなる５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列、および配列番号４を含むまたはからなる５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列を有し、３つのＢＲＡＦ−ペプチドが配列番号７、配列番号８および配列番号９を含むまたはからなり、そして２つのカルパスタチン−ペプチドが配列番号１１および配列番号１２を含むまたはからなる、請求項２のインビトロにおける方法。
5. ３つのＢＲＡＦ−ペプチドおよび２つのカルパスタチン−ペプチドのそれぞれが、５０未満のアミノ酸のペプチドである、請求項４のインビトロにおける方法。
6. 生物学的試料中の抗ＰＡＤ４自己抗体の存在をインビトロにおいて検出するための方法であって、前記方法は、
   生物学的試料を、バイオマーカー−抗体の複合体の形成を可能とする時間の間および条件下において少なくとも１つのバイオマーカーと接触させる工程、ここで、少なくとも１つのバイオマーカーは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、その類似体、そのフラグメント、およびその組合せからなる群より選択される配列を含むまたはからなる５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列を有するＰＡＤペプチドである；および
   形成されたバイオマーカー−抗体の複合体を検出する工程、ここで、バイオマーカー−抗体の複合体の検出は、生物学的試料中の抗ＰＡＤ４自己抗体の存在を示す、
   を含む、前記方法。
7. 被験体がＣＣＰ陰性であるか、または生物学的試料が、ＣＣＰ陰性被験体から得られる、請求項１〜６のいずれか１項のインビトロにおける方法。
8. 前記被験体から得られた生物学的試料中において、Ｃ反応性タンパク質、血清アミロイドＡ、インターロイキン６、Ｓ１００タンパク質、オステオポンチン、リウマチ因子、マトリックスメタロプロテアーゼ１、マトリックスメタロプロテアーゼ３、ヒアルロン酸、ｓＣＤ１４、血管新生マーカー、および骨、軟骨または滑膜の代謝産物からなる群より選択される少なくとも１つのマーカーの濃度を測定することをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項のインビトロにおける方法。
9. 被験体の関節リウマチのインビトロにおける診断のためのキットであって、前記キットは、
   配列番号２、配列番号３、配列番号４、その類似体、およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなる５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列を有するＰＡＤ４−ペプチドである１つのバイオマーカー；および
   ＰＡＤ４−ペプチドと、被験体から得られた生物学的試料中に存在する自己抗体との間に形成されるバイオマーカー−抗体の複合体を検出するための少なくとも１つの試薬、ここで、バイオマーカー−抗体の複合体の検出は、被験体における関節リウマチを示す、
   を含む、前記キット。
10. 配列番号７、配列番号８、配列番号９、その類似体、およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなるアミノ酸配列を有するＢＲＡＦ−ペプチド、
    配列番号１１、配列番号１２、その類似体、およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなるアミノ酸配列を有するカルパスタチン−ペプチド、並びに
    その組合せ
    からなる群より選択される少なくとも１つのバイオマーカー；および
    少なくとも１つのバイオマーカーと、被験体から得られた生物学的試料中に存在する自己抗体との間に形成されるバイオマーカー−抗体の複合体を検出するための少なくとも１つの試薬、ここで、バイオマーカー−抗体の複合体の検出は、被験体における関節リウマチを示す、
    をさらに含む、請求項９のキット。
11. 少なくとも１つの他のバイオマーカーが、５０未満のアミノ酸のペプチドである、請求項１０のキット。
12. ＣＣＰ陰性被験体の関節リウマチのインビトロにおける診断のためのキットであって、
    前記キットは、
    配列番号７、配列番号８、配列番号９、その類似体、およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなるアミノ酸配列を有するＢＲＡＦ−ペプチドからなる群より選択される３つのＢＲＡＦ−ペプチド、
    配列番号２を含むまたはからなる５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列、配列番号３を含むまたはからなる５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列、および配列番号４を含むまたはからなる５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列を有する３つのＰＡＤ４−ペプチド、
    並びに
    配列番号１１、配列番号１２、その類似体、およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなるアミノ酸配列を有するカルパスタチン−ペプチドからなる群より選択される２つのカルパスタチン−ペプチド
    を含む、少なくとも８つのバイオマーカー；および
    バイオマーカーと、被験体から得られた生物学的試料中に存在する自己抗体との間に形成されるバイオマーカー−抗体の複合体を検出するための少なくとも１つの試薬、ここで、バイオマーカー−抗体の複合体の検出は、ＣＣＰ陰性被験体における関節リウマチを示す、
    を含む、前記キット。
13. ３つのＢＲＡＦ−ペプチドおよび２つのカルパスタチン−ペプチドのそれぞれが、５０未満のアミノ酸のペプチドである、請求項１２のキット。
14. 生物学的試料中の抗ＰＡＤ４自己抗体の存在を検出するためのキットであって、前記キットは、
    少なくとも１つのバイオマーカー、ここで、少なくとも１つのバイオマーカーは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、その類似体、そのフラグメント、およびその組合せからなる群より選択される配列を含むまたはからなる５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列を有するＰＡＤ４−ペプチドである；および
    バイオマーカーと、生物学的試料中に存在する自己抗体との間に形成されるバイオマーカー−抗体の複合体を検出するための少なくとも１つの試薬、ここで、前記自己抗体は、関節リウマチを示す抗ＰＡＤ４自己抗体である、
    を含む、前記キット。
15. 被験体における関節リウマチを診断するためのアレイであって、前記アレイは、その表面に付着した少なくとも１つのバイオマーカーを含み、ここで、バイオマーカーは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、その類似体、およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなる５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列を有するＰＡＤ４−ペプチド
    である、前記アレイ。
16. 配列番号７、配列番号８、配列番号９、その類似体、およびそのフラグメントからな
    る群より選択される配列を含むまたはからなるアミノ酸配列を有するＢＲＡＦ−ペプチド、
    配列番号１１、配列番号１２、その類似体、およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなるアミノ酸配列を有するカルパスタチン−ペプチド、並びに
    その組合せ
    からなる群より選択される少なくとも１つのバイオマーカー
    をさらに含む、請求項１５のアレイ。
17. ＣＣＰ陰性被験体における関節リウマチを診断するためのアレイであって、前記アレイは、その表面に付着した少なくとも８つのバイオマーカーを含み、ここで、少なくとも８つのバイオマーカーは、
    配列番号７、配列番号８、配列番号９、その類似体、およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなるアミノ酸配列を有するＢＲＡＦ−ペプチドからなる群より選択される３つのＢＲＡＦ−ペプチド、
    配列番号２を含むまたはからなる５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列、配列番号３を含むまたはからなる５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列、および配列番号４を含むまたはからなる５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列を有する３つのＰＡＤ４−ペプチド、並びに
    配列番号１１、配列番号１２、その類似体、およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなるアミノ酸配列を有するカルパスタチン−ペプチドからなる群より選択される２つのカルパスタチン−ペプチド
    を含む、前記アレイ。
18. ＢＲＡＦ−ペプチドおよびカルパスタチン−ペプチドが、５０未満のアミノ酸のペプチドである、請求項１６または請求項１７記載のアレイ。
19. 表面に付着した、生物学的試料中のＲＡ特異的自己抗体の存在を検出するための少なくとも１つの追加のバイオマーカーをさらに含む、請求項１５〜１８のいずれか１項記載のアレイ。
20. 前記ＲＡ特異的自己抗体が抗核抗体および抗ＣＣＰ抗体である、請求項１９記載のアレイ。
21. バイオマーカーが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、その類似体、およびそのフラグメントからなる群より選択される配列を含むまたはからなる５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列を有するＰＡＤ４−ペプチドであり、そして前記バイオマーカーが抗ＰＡＤ４自己抗体によって認識される、関節リウマチのバイオマーカー。

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