KR101664966B1

KR101664966B1 - 류마티스 관절염 활성도 평가용 바이오마커

Info

Publication number: KR101664966B1
Application number: KR1020140076050A
Authority: KR
Inventors: 김완욱; 황대희; 이유진; 강민정; 박윤정; 유성룡
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2013-06-21
Filing date: 2014-06-20
Publication date: 2016-10-11
Also published as: KR20140148345A; EP3012634A4; US20160274106A1; EP3012634A1; WO2014204274A1; KR20140148346A; EP3012634B1; KR101664964B1

Abstract

본 발명은 sCD14(soluble CD14), AGP1(a-1-acid glycoprotein 1) 및 AGP2(a-1-acid glycoprotein 2) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 농도를 측정하는 제제를 포함하는, 류마티스 관절염의 활성도 평가용 조성물에 관한 것이다. 또한, 상기 조성물을 이용한 키트, 단백질 칩 및 류마티스 관절염 활성도를 평가하기 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

Description

류마티스 관절염 활성도 평가용 바이오마커 {Biomarkers for assessing rheumatoid arthritis disease activity}

류마티스 관절염(RA: Rheumatoid Arthritis)은 관절 주위를 둘러싸고 있는 활막이라는 조직의 염증 때문에 일어나는 질환으로 우리나라 전체 인구 중 대략 1%가 환자군으로 추정되고 있는 대표적인 만성질환이다.

류마티스 관절염의 진단은 한 가지 확실한 임상적, 방사선학적, 또는 혈청학적 검사로 이루어지는 것이 아니라 특징적인 임상증상, 검사소견, 방사선학 소견 등을 종합하여 진단을 하게 된다. 현재 류마티스 관절염에 대한 진단은 1987년도에 미국류마티스학회에서 제정한 분류기준(classification criteria)에 따라 이루어지고 있다.

또한 류마티스 관절염을 치료하는 것은 조직 파괴, 연골 손실 및 관절 침식의 관점에서 질병의 진행을 늦추거나 막아야 한다는 기대에 기초한 것으로서, 류마티스 관절염의 진행은 병인과 관련된 인자들의 활성화에 기인한 것인 바, 질병의 진행과 활성의 관계를 잘 분석하는 것이 중요하다. 일예로, 질병 활성을 주기적으로 모니터링하는 경우 더 차도가 나타난다고 보고된 바 있다(YPM Goekoop-Ruiterman et al., Ann.Rheum. Dis. 2009(Epublication Jan.20,2009)).

종래 임상에서는 류마티스 관절염의 활성도를 측정하는 방법으로는 어깨, 팔꿈치, 손목, 무릎, 손가락 등 28개 관절 통증 정도, 압통과 종창을 보이는 관절 수, 적혈구침강속도(erythrocyte sedimentation rate, ESR) 혹은 C-반응성 단백질(C-reactive protein, CRP) 등의 염증 수치를 측정하는 방법이 사용되었다. 그러나, 상기 각각의 지표만으로는 질병의 전체적인 활성도를 정확하게 반영하기 어려워, 위의 지표들을 결합시켜 종합적으로 판단하는 질병 활성도 점수(Disease Activity Score; DAS)가 개발되었다.

그러나, DAS는 침습적 방법으로 측정되기 때문에 환자의 DAS를 도출하기 위해 필요한 신체 검사는 고통을 유발하게 되며, 많은 시간이 소요된다. 또한, 환자의 DAS를 정확히 결정하기 위해서는 넓은 오퍼레이터 변이성(operator variability)을 최소화 하기 위해 숙련된 평가자를 필요로 하게 되어, DAS의 활용이 제한적인 문제가 있다.

따라서, 환자의 치료를 위해 최적의 치료 요법을 선택하고, 환자가 해당 치료에 적절한 치료 반응을 보이는지 판단하기 위해 치료에 대한 반응을 반영하는 객관적인 질병 활성도 표지자가 필요하다. 또한, 비침습적이고 간단하고 쉽게 류마티스 관절염 질병 활성도를 평가할 수 있는 기술의 개발이 필요하다.

본 발명자들은 소변 시료를 이용하여 류마티스 관절염의 질병 활성을 정확하게 임상적으로 평가하기 위한 바이오마커를 개발하였으며, 이를 이용하여 개개의 환자들의 치료적 이익을 극대화하기 위하여 환자의 질병 활성을 특이적으로 정량, 평가하고, 질병 활성에 미치는 치료의 효과를 파악하여 보다 나은 치료효과를 낼 수 있도록 하였다.

이상원, 류마티스관절염 환자의 혈청 렙틴:질병 활성도의 예측인자, 연세대학교 석사학위논문, 2005

본 발명의 목적은 sCD14, AGP1 및 AGP2 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 농도를 측정하는 제제를 포함하는, 류마티스 관절염의 활성도 평가용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 류마티스 관절염의 활성도 평가용 조성물을 포함하는 류마티스 관절염 활성도 평가용 키트를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 류마티스 관절염의 활성도 평가용 조성물을 포함하는 류마티스 관절염 활성도 평가용 단백질 칩을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 검체 시료로부터 sCD14, AGP1 및 AGP2 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 류마티스 관절염 활성도를 평가하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 sCD14(soluble CD14), AGP1 및 AGP2 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 농도를 측정하는 제제를 포함하는, 류마티스 관절염의 활성도 평가용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서, "류마티스 관절염의 활성도" 또는 "류마티스 관절염의 질병 활성도"란, 류마티스 관절염 환자의 전반적인 염증 정도, 또는 류마티스 관절염의 진행 정도를 의미하며, 치료에 대한 반응 또는 관해 여부를 평가하는데 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에서, "류마티스 관절염 활성도의 평가"란 류마티스 관절염 환자의 전반적인 염증 정도, 또는 류마티스 관절염의 진행 정도를 평가하는 것을 말하고, 나아가 이를 토대로 하여 현재 실시하고 있는 치료가 환자에게 효과를 나타내는지 판단하는 것, 최적의 치료 요법(약물 요법 또는 수술 등)을 선택하는 것, 그리고 치료에 대한 반응성 및 완화 여부를 예측하는 것을 포함하는 개념이다.

종래 임상에서 류마티스 관절염의 활성도를 측정하는 대표적인 방법인 DAS(Disease Activity Score) 또는 이것의 변형된 형태인 DAS28(Disease Activity Score 28) 은 점수 계산 방식의 지수 평가 방법으로, 염증 표지자 검사나 방사선 소견 같은 일부 객관적 요소와 함께 환자 및 의사가 평가하는 주관적인 요소들을 함께 평가한다. DAS28은 환자의 28개 관절 중 압통을 느끼는 관절 수, 부종을 보이는 관절 수, 적혈구 침강속도, 환자의 전신적 평가로 구성된 종합 지수로서, 28개의 관절에는 양쪽 어깨 관절, 팔꿈치 및 손목 관절, 중수지 관절, 근수지 관절, 무릎 관절 등을 포함한다.

DAS28 로 조사된 류마티스 관절염 질병 활성도는 0점에서 최대 9.4점까지 계산될 수 있으며, 일반적으로 DAS28 점수가 2.6 미만이면 질병 활성이 거의 없는 상태(Remission, 관해), 2.6점 이상 3.2점 미만이면 낮은 질병활성(Low Disease Activity, 경증), 3.2점 이상 5.1 점 미만이면 중간 질병활성(Moderate Disease Activity, 중증도), 그리고 5.1점 이상이면 높은 질병활성(High Disease Activity, 중증)으로 정의하고 있다. 그러나, 상기 배경기술에서 언급한 바와 같이, DAS28 에 의한 종래의 질병 활성도 평가 방법은 침습적이어서, 환자에게 고통을 유발하고 많은 시간이 필요한 문제가 있다.

본 발명은 기존의 DAS28 과 같은 류마티스 관절염 활성도 평가에 의하지 않고도 비침습적으로 환자의 현재 질병 활성도를 확인할 수 있고, 이를 토대로 환자에 최적의 치료 요법을 선택하고 해당 치료에 적절한 치료 반응이 보이는지를 판단할 수 있는 객관적인 질병 활성도 표지자를 제공함을 특징으로 한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 류마티스 관절염의 질병 활성도 표지자로서 sCD14, AGP1 및/또는 AGP2 를 제공한다. 본 발명에서 상기 단백질들은 류마티스 관절염의 질병 상태를 반영하는 지표로, 류마티스 관절염 비활성군보다 활성군에서 높은 농도를 보이며, 현재 임상에서 질병 활성도 평가에 사용되는 DAS28 과 같은 종래의 질병 활성도 평가 수단들과 강한 양의 상관관계를 나타낼 뿐만 아니라, DAS28 평가시 중요한 염증활성 표지자로 사용되는 CRP 와 유의적인 상관관계를 나타낸다.

따라서, sCD14, AGP1 및/또는 AGP2 는 비침습적인 바이오마커로서, 그 자체로 환자의 염증활성 반응을 평가하고 치료 반응을 예측하는 데 유용하게 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, CRP, ESR 과 같은 염증활성 표지자가 류마티스 관절염 환자의 임상 양상과 상이한 결과를 보일 때 치료반응을 판단하기 위한 보조적인 표지자로서도 활용할 수 있다. 특히, 혈청 CRP 평가와 결합하여 사용할 경우 보다 나은 활성의 바이오마커로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명에서, "sCD14"란, CD14의 형태 중 하나인 가용성(soluble) CD14이다. CD14는 55kDa의 GPI와 연결된 막표면 단백질(glycophosphatidylinositol-linked membrane surface protein)로서, sCD14의 아미노산 서열은 공지된 유전자 데이터베이스에서 그 서열 정보를 확인할 수 있다. 예를 들어, 인간 sCD14 단백질의 아미노산 서열은 NCBI Genbank 등록번호 NP_000582.1 에서 확인할 수 있고, 이를 서열번호 1에 기재하였다.

본 발명에서, "AGP1(a-1-acid glycoprotein 1)", "AGP2(a-1-acid glycoprotein 2)"란, 각각 오로소뮤코이드(orosomucoid) 1, 2로 불리기도 하며, 감염과 같은 스트레스 상태에서 유도되며, 감염 및 염증과 같은 스트레스 조건 하에서 혈장으로 분비되는 단백질이다. 본 발명에서는 상기 단백질이 류마티스 관절염의 활성과 관련이 있음을 밝혀내었다. AGP1 및 AGP2의 아미노산 서열은 공지된 유전자 데이터베이스에서 그 서열 정보를 확인할 수 있다. 예를 들어, 인간 AGP1 단백질의 아미노산 서열은 NCBI Genbank 등록번호 NP_000598.2에서 확인할 수 있고, 인간 AGP2 단백질의 아미노산 서열은 NCBI Genbank 등록번호 NP_000599.1에서 확인할 수 있다. AGP1 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 2에 기재하였으며, AGP2 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 3에 기재하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, RA 환자들을 DAS28에 따른 질병 활성도 의해 상/중/하 세 그룹으로 분류했을 때, 소변 sCD14 농도는 DAS28에 비례하여 증가하였으므로(도 7), 소변 sCD14 레벨이 염증반응의 활성도에 대해 민감한 척도로 활용될 수 있음을 알 수 있었다. 또한, 높은 RA 활성(DAS28 >5.1)을 갖는 RA 환자들에서 소변 sCD14의 diagnostic power를 진단하기 위해 ROC 분석을 진행한 결과, 높은 RA 활성(DAS28 >5.1)을 예측하는데 있어 소변 sCD14가 CRP와 유사한 수준이며, 소변 sCD14이 80% 이상의 특이성을 나타내는 영역에서 CRP보다 높은 민감도를 나타내었으므로(도 11), 소변 sCD14를 단독으로 또는 CRP에 함께 측정할 경우 보다 보완적으로 질병 활성도를 예측할 수 있음을 확인할 수 있었다. 소변 sCD14는 RA 환자의 높은 질병 활성도를 예측하는 민감도 및 특이성이 각각 68.4%, 62.7%로 확인되어(cut-off를 0.06으로 했을 때) 바이오마커로서의 가능성이 입증되었다. AGP1, AGP2 역시 CRP와 상관관계를 나타내었고(도 12), 특히 소변 AGP2의 경우 RA 환자의 높은 질병 활성도를 예측하는 민감도 및 특이성이 각각 71.6%, 70.0%로 확인(cut-off를 0.3555로 했을 때)되어 바이오마커로서의 가능성이 입증되었다.

나아가, (i) sCD14, AGP1 및 AGP2 의 조합, (ii) sCD14 및 AGP2 의 조합, 또는 (iii) AGP1 및 AGP2 의 조합에 의한 RA 질병 활성도의 평가에서 모두 민감도와 특이도가 높게 나타나, 각 단백질의 상호 조합에 의한 바이오마커로서의 가능성이 입증되었다.

따라서, AGP1, AGP2, sCD14 는 RA 질병 활성도를 평가하기 위한 비침습적인 바이오마커로 사용될 수 있고, 이들 단백질의 상호 조합은 보다 나은 진단의 바이오마커로 활용될 수 있음이 확인되었다.

또 다른 바람직한 양태로서, 상기 단백질의 농도를 측정하는 제제는 sCD14, AGP1 및 AGP2에 특이적인 항체일 수 있다.

본 발명에서, "항체"란 항원성 부위에 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 마커 단백질인 sCD14, AGP1 및/또는 AGP2에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 단클론항체, 다클론항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

단클론항체는 당해 분야에 널리 공지된 하이브리도마 방법(Kohler 및 Milstein(1976)European journal og Immunology 6:511-519), 또는 파지 항체 라이브러리(Clarkson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol.,222:58, 1-597, 1991)기술을 이용하여 제조될 수 있다.

다클론항체는 상기한 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

또한, 본 발명의 항체에는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간항체 등의 특수항체도 포함된다.

나아가, 본 발명에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등을 예시할 수 있다.

이러한 항체를 이용하여 시료 내 sCD14, AGP1 및/또는 AGP2의 농도를 측정하기 위한 방법으로는, 시료에 상기 항체를 처리하여 항원-항체 복합체의 생성 정도를 확인할 수 있는 방법이라면 제한없이 사용할 수 있다. 상기 "항원-항체 복합체"란 sCD14, AGP1 및 AGP2 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

예를 들어, 웨스턴 블랏(Western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorecence Activated Cell Sorter, FACS), 또는 단백질 칩(protein chip) 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 류마티스 관절염의 활성도 평가용 조성물을 포함하는 류마티스 관절염의 활성도 평가용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 키트는 환자 시료 내 sCD14, AGP1 및/또는 AGP2 의 농도를 측정할 수 있는 제제 뿐만 아니라, 농도 분석에 적합한 한 종류 이상의 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 검출 라벨로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다.

구체적인 일례로, 상기 류마티스 관절염의 활성도 평가용 키트는 ELISA 키트, 샌드위치 ELISA등 다양한 ELISA 방법을 구현하기 위하여, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질들에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 sCD14, AGP1 및 AGP2 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론항체, 다클론항체 또는 재조합 항체일 수 있다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

이 외에도, 상기 키트는 웨스턴 블랏, 면역침전분석법, 보체 고정 분석법, 유세포분석, 또는 단백질 칩 등을 구현하기 위한 키트일 수 있으며, 각 분석 방법에 적합한 부가적인 구성을 추가로 포함할 수 있다. 이 분석 방법들을 통하여, 항원-항체 복합체 형성량을 비교함으로써 류마티스 관절염의 활성도를 평가할 수 있으며, 이에 맞추어 환자를 적절히 치료할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 류마티스 관절염의 활성도 평가용 조성물을 포함하는 류마티스 관절염의 활성도 평가용 단백질 칩에 관한 것이다.

단백질 칩은 sCD14, AGP1 및 AGP2 단백질에 대한 하나 이상의 항체가 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화 되어있는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 분석하는 방법은, 검체 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여 단백질의 발현 정도를 확인하여 류마티스 관절염의 활성도를 확인할 수 있다.

상기 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

상기 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 검체 시료로부터 sCD14, AGP1 및 AGP2 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 류마티스 관절염 활성도를 평가하기 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "검체 시료"란 마커 단백질인 sCD14, AGP1 및 AGP2의 발현 수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈장, 혈청, 혈액, 타액, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액 또는 소변과 같은 시료 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

보다 바람직한 양태로, 상기 검체 시료는 소변시료일 수 있다.

검체 시료에서 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, 단백질 수준은 앞서 언급한 다양한 항원-항체 복합체 측정 방법으로 측정할 수 있다.

보다 바람직한 양태로, 본 발명은 상기 단백질의 농도를 측정은 sCD14, AGP1 및 AGP2에 특이적인 항체를 이용하여 수행될 수 있다.

더욱 바람직한 양태로, 상기 항체는 sCD14, AGP1 및 AGP2에 특이적인 단클론항체 또는 다클론항체일 수 있으나, 나아가 항원결합활성을 보유하는 항체의 기능적 단편일 수 있다.

본 발명에서는 류마티스 관절염의 질병 활성도의 마커 단백질인 sCD14, AGP1 및/또는 AGP2의 농도를 항체를 이용하여 측정함으로써, 류마티스 관절염의 활성도를 평가하여 환자의 상태에 맞추어 최적의 치료 요법을 선택하고, 환자가 해당 치료에 적절한 치료 반응을 보이는지 판단할 수 있다.

본 발명은 sCD14, AGP1 및 AGP2 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 농도를 측정하는 제제를 이용하여, 류마티스 관절염의 활성도를 측정함으로써 환자의 상태에 맞춘 적합한 치료를 행할 수 있도록 한다.

도 1은 류마티스 관절염(RA) 및 골관절염(OA) 환자에서 소변 단백질의 검출을 향상시키기 위해 각 소변 시료로부터 알부민을 제거한 후 SDS-PAGE젤을 이용하여 13개의 분획으로 분리한 것을 나타낸 것이다.
도 2의(A)는 RA 및 OA 환자 소변 시료에서 발현 차이를 나타내는 단백질을 발굴하기 위한 프로테오믹스적 접근 방법을 나타낸 것이며, (B)는 RA 및 OA 환자 소변 시료에서 분리된 단백질들을 기능에 따라 분류한 것이며, (C)는 RA 및 OA 환자 소변 시료에서 분리된 단백질들을 기원에 따라 분류한 것이다.
도 3은 ELISA를 이용하여 RA 환자에 특별히 높게 발현된 단백질들을 나타낸 것으로서, (A)는 Gelsolin(GSN), (B)는 a-1-acid glycoprotein 1(AGP1), (C)는 a-1-acid glycoprotein 2(AGP2), (D)는 sCD14에 대해 나타낸 것이다.
도 4는 RA, OA, 전신성 홍반성 낭창(SLE) 환자에서의 sCD14의 농도를 관찰한 것으로서, (A)는 환자군들 사이에서 단백뇨의 정도를 비교하여 나타낸 것이며, (B)는 웨스턴블로팅을 이용하여 GPI(glycophosphatidylinositol)-free sCD14(48 kDa) 또는 GPI-linked sCD14(56 kDa) 가 RA 소변 시료에서 검출되는지를 나타낸 것이다.(C)는 RA, OA, SLE 환자군들 사이에서의 소변 내 sCD14의 양을 비교한 것이며, (D)는 OA(Control) 와 RA 환자에서 당뇨(DM)와 고혈압(HBP)을 보정한 소변 내 sCD14의 양을 나타낸 것이다.
도 5는 RA와 OA 환자 간의 혈청 sCD14 농도를 비교하여 나타낸 것이다.
도 6은 소변 sCD14 와 혈청 sCD14 levels 의 임상변수들과의 관련성을 나타낸 것이다.
도 7은 DAS28에 의한 질병 활성도에 따른 소변 sCD14의 농도를 나타낸 것이다.
도 8은 소변 sCD14와 혈청 sCD14 사이의 관련성을 나타낸 것이다.
도 9는 혈청 sCD14 레벨(upper panel) 과 단백뇨 농도(lower panel)에 따라 고농도의 소변 sCD14이 나 올 확률을 나타낸 것이다.
도 10은 소변 sCD14 과 단백뇨 사이의 상관성을 보여주는 것이다.
도 11은 소변 sCD14, C-반응성 단백질(CRP), 헤모글로빈, 혈소판, 및 알부민 농도에 따른 높은 질병 활성도를 검정하기 위한 receiver operating characteristic(ROC) curves를 나타낸 것이다.
도 12는 RA 환자의 소변 시료에서 sCD14, AGP1, AGP2, sCD14, GSN 단백질과, 각각 ESR, CRP, DAS28, hemoglobin, 백혈구수(WBC), albumin 과의 관련성을 나타낸 것이다.
도 13은 대조군 환자의 소변 시료에서 sCD14, AGP1, AGP2, sCD14, GSN 단백질과, 각각 ESR, CRP, DAS28, hemoglobin, 백혈구수(WBC), albumin 과의 관련성을 나타낸 것이다.
도 14는 소변 AGP2 및 C-반응성 단백질(CRP)의 농도에 따른 높은 질병 활성도를 검정하기 위한 ROC curves를 나타낸 것이다.
도 15는 소변 sCD14, AGP1, AGP2 및 GSN의 농도에 따른 높은 질병 활성도를 검정하기 위한 ROC curves를 나타낸 것이다.
도 16은 소변 sCD14, AGP1 및 AGP2의 다양한 조합에 따른 높은 질병 활성도를 검정하기 위한 ROC curves를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험재료 및 실험방법

1-1. 대상 환자의 선정

1987년 American College of Rheumatology(ACR) 기준에 따라 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis: RA)로 진단된 환자들을 대상으로 하였다. 환자 의무기록에서 각각 나이, 성별, 키, 몸무게, 유병기간 등을 확인하였다. 환자들의 일반혈액검사(complete blood count, CBC), 혈당, 혈청 크레아티닌, 혈청 알부민, 적혈구 침강속도(erythrocyte sedimentation rate, ESR), C-반응성단백질(C-reactive protein, CRP), 류마티스 인자(rheumatoid factor, RF), 류마티스 관절염 진단 특이항체인 anti-CCP 항체들(anti-cyclic citrullinated protein antibodies)과 같은 clinical factor들을 평가하였다. 단, 현재 흡연자 및 심장혈관계 질병의 병력을 가진 환자, 조절되지 않는 고혈압 환자(>160/100 mmHg), 류마티스 혈관염, 아밀로 이드증, 당뇨병성 신증, 만성 신질환 환자(glomerular filtration rate <60 ml/min/1.732), 현성 또는 만성 감염 환자, 갑상선이나 간질환 환자, 임산부가 암환자들은 본 연구에서 제외되었다. 3개월 동안의 안정적인 치료도 본 연구를 위해 필요하였다. 고혈압약 중 angiotensin-converting enzyme inhibitors나 angiotensin receptor blockers을 복용하지 않는 환자들은 포함되었다. RA 환자들 양손발의 X-ray도 촬영되었고, 이들 자료는 전문의들이 각각의 환자들의 신분이나 상태를 모르는 상태에서 분석을 진행하였다. 골미란을 측정하고 Sharp/van der Heijde method에 의해 영상학적 중증도를 분석하였다. Study protocol은 Institutional Review Board of the Catholic Medical Center(XC09TIMI0070)에 의해 승인받았고, 모든 환자들로부터 이러한 study protocol에 대한 서류상의 동의를 모두 받은 실험을 진행하였다.

274명의 RA 환자와, 대조군으로 120명의 골관절염(osteoarthritis: OA) 환자 및 60명의 전신성 홍반성 낭창(osteoarthritis: SLE) 환자를 모집하였다. 대상 환자들의 특징은 하기 표 1에 나타내었다.

변수	RA (n = 274)	OA (n = 120)	SLE (n=60)
나이(年)	53.2±2.4	52.9±0.2	43.9±3.2
여성(%)	224 (81.8)	98 (81.8)	55 (91.7)
고혈압 (%)	71 (25.9)	34 (28.3)	16 (26.7)
당뇨(%)	29 (10.6)	14 (11.7)	4 (6.7)
크레아티닌 (mg/dl)	0.7±0.2	0.8 ±0.1	0.8±0.4
사구체여과율	99.5 [85.8-114.7]	97.5 [81.1-115.3]	93.2 [80.1-97.8]
적혈구침강속도 (mm/hr)	39.6±7.7	15.7±0.9	28.6±0.4
C-반응성 단백질 (mg/l)	12.8 [1.2-36.7]	0.8 [0.5-1.4]	0.9 [0.5-3.2]
백혈구 수 (/ml)	7772.6±279.7	6046.9±713.8	5171.6±246.3
헤모글로빈 (mg/dl)	12.6±1.3	13.1±1.1	11.6±1.6
혈소판 수 (/ml)	285.1±90.9	244.7±53.2	195.1±81.5
알부민 (mg/dl)	4.2±0.4	4.6±0.2	3.9±0.5
글로불린 (mg/dl)	3.2±0.5	2.8±0.4	3.4±0.1
유병 기간 (年)	5.0 [2.0-12.0]	2.0 [0.0-4.0]	4.0 [2.0-7.3]
비스테로이드성 항염증제 (%)	169 (61.7)	81 (67.5)	29 (48.3)
프레드니솔론 (%)	201 (73.4)	13 (10.8)	21 (35.0)

1-2. 소변 시료로부터 단백질 추출

환자의 일상 진단 시 소변 시료를 채취하였다. 소변에서 나오는 알부민과 크레아틴을 Hitachi7600-110 colorimetry를 사용하여 측정하였다. 채취된 소변 시료는 -80℃에 보관하였다. 20명의 류마티스 관절염(RA) 환자들과(총 100 ml) 19명의 골관절염(OA) 환자(총 95ml) 에게서 소변 시료를 얻었으며, 불필요한 잔해물들을 제거하기 위하여 2,000 g 에서 5분 동안 4℃의 조건에서 원심분리 하였다. 골관절염(OA) 환자의 시료는 류마티스 관절염에 대하여 정상 대조군으로서 사용하였다. 소변 시료를 메탄올과 1:9(v/v) 의 비율로 섞어주고, -20℃에서 14시간 동안 인큐베이트 한 후, 14,000 g에서 4℃, 30 분 조건에서 원심분리 하여 단백질을 추출하였다. 단백질 펠렛은 메탄올로 세척하고, 공기 중에 건조시킨 후 Tris buffer solution(5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 7.5) 에서 재현탁하였다. 단백질 양은 Micro BCA Protein Assay Kit(Thermo Scientific, Rockford, IL. USA)를 사용하여 측정하였다.

1-3. 알부민 제거 및 투석

소변 단백질의 검출을 향상시키기 위해 Affinity Removal Spin Cartridge, Human Albumin(Agilent Technologies, Wilmington, DE. USA)을 이용하여 알부민을 제거하였다. 제조자의 프로토콜에 따라, 소변 단백질 시료를 depletion buffer A(Agilent Technologies)로 3배 희석시킨 후 0.22μm 스핀 필터(Agilent Technologies)로 여과하였다. 희석된 소변 시료를 Spin Cartridge 에 로딩한 후 1.5분간 100g 로 원심분리하였다. Flow-through fraction을 채취하고, depletion buffer A와 함께 2.5분간 100g 로 원심분리하여 cartridge를 세척하였다. 모든 flow-through fraction을 혼합하였다. 알부민이 제거된 소변 시료를 Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes(Thermo Scientific, 3.5kDa 분자량 cur-off) 를 사용하여 투석하여 염을 제거하였다. 투석된 시료의 부피를 감소시키기 위해 고속 건조(speed-vac dry)하였다. 단백질 양은 Micro BCA Protein Assay Kit(Thermo Scientific, Rockford, IL. USA)를 사용하여 측정하였다.

1-4. SDS - PAGE 및 in - gel digestion

알부민이 제거된 단백질 시료를 LDS sample buffer(Invitrogen, Carlsbad, CA) 에서 데우고, 4~12% Bis-Tris NuPAGE gel(Invitrogen)에서 분획하고, Coomassie Brilliant Blue(Sigma-Aldrich)로 염색하였다. 전체 젤 레인을 13 조각으로 자르고 일반적인 프로토콜에 따라 in-gel tryptic digestion 을 실시하였다. 간략히 설명하면, 절단된 단백질 밴드를 acetonitrile(ACN) 및 100 mM ammonium bicarbonate(NH₄HCO₃) 으로 15분간 탈색하였다. 젤 안의 단백질을 20 mM dithiothreitol 로 줄이고 55 mM iodoacetamide 및 100mM NH₄HCO₃ 로 알킬화하였다. ACN 을 탈수시킨 후, 37℃ 에서 밤새 13 ng/μL sequencing grade modified porcine trypsin(Promega, Madison, WI. USA) in 50 mM NH₄HCO₃ 로 단백질을 분해하였다. 50% v/v ACN in 0.1% formic acid 로 젤 조각으로부터 펩타이드를 추출하고 진공 건조한 후 -20℃ 에 보관하였다.

1-5. 질량 분석기 분석( Mass spectrometry analysis )

건조된 펩타이드 시료를 100 μL 의 0.1% formic acid, 2% ACN in water 에 용해시켰다. in-gel digestion 에 의해 추출된 펩타이드 시료를 LTQ-velos(ThermoFinnigan, San Jose, CA)를 이용하여 LC-MS/MS 분석하였고, nano-HPLC system(Easy nLC, Thermo Fisher Scientific)으로 온-라인 커플링 후, reversed-phase microcapillary electrospray ionization system 에 장착하였다. 5 μL 펩타이드 혼합물을 in-house packed Magic^TMC₁₈ column(10 cm length, 75 μm inner diameter) 과 결합된 HPLC 상에 로딩하였다. 펩타이드는 순차적으로 2-38% 농도구배의 Buffer B(ACN:water:formic acid, 97·9:2:0·1 [v/v/v]) in Buffer A(water:ACN:formic acid, 97·9:2:0·1 [v/v/v])를 사용하여 300 nL/min의 유속으로 HPLC column으로부터 용출하였다. 용출된 펩타이드들은 모세관 컬럼 상단에서부터 LTQ-velos 로 직접 분무되어 질량분석기 분석을 실시하였다. 분무 전압은 1.9kV 로 설정하였고, 모세관의 온도는 200℃ 로 설정하였으며, normalized collision energy 를 35%로 하였다. LTQ는 data-dependent mode로 작동시켰고 기기로 400~1400(mass-to-charge ratios) 질량 범위에서 모든 펩타이드 이온의 강도(intensity)를 측정하였다. 상위 5종의 intense ion을 분리하여 충돌유발분리(collision-induced dissociation)하였다.

1-6. 소변 프로테옴 데이터 분석

IPI human protein(version 3.86)에 대해 MS/MS 스펙트럼을 서치하고, using SEQUEST of BioworksBrowser rev 3.1 을 사용하여 decoy database를 순서 전환하였다. SEQUEST 서치 결과는 PeptideProphet and ProteinProphet program in Trans Proteomic Pipeline(TPP) v4.5를 이용하여 추가적으로 분석하였다. FDR=0.01 또는 PeptideProphet probability=0.9 인 펩타이드들을 선택하였다. 다음으로, ProteinProphet probability 가 ≥0.95 인 단백질들을 확인하였다. 이들 단백질 중에서, RA 나 OA 시료에서 각각 52개의 프로파일데이터 중 두 번 이상 발견되거나 sibling peptides가 2개 이상 존재하는 단백질을 high confidence protein 로 선별하였다.

APEX Quantitative Proteomics Tool을 사용하여 소변 단백질들을 상대적 정량하였다. 각 소변 시료에서, probabilities=0.95 및 normalization factor=1 조건에서 가장 양이 많은 50개 단백질은 training dataset으로 생성한 후, training set 르로부터 소변 단백질의 predicted peptide count(Oi)를 계산하여, 최종적으로 protXML file 및 소변 단백질 Oi 값을 사용하여 소변 단백질의 APEX abundances를 계산하였다. RA 및 OA 환자 소변 시료에서 상대적 APEX abundances를 quantile normalization method를 사용하여 표준화하였다. 표준화된 APEX abundances를 사용하여, 발현차이를 나타내는 단백질들을 분리하였다. 각 단백질에 대하여, t-test 및 log₂-median-ratio test를 각 abundances에 적용하였고 4회 반복하였다. 각 결과를 치환하여 두 테스트에서 empirical null distributions를 추산하였다. 각 단백질에 대한 distribution을 사용하여 두 테스트에서 보정된 P 값을 계산하였고, 두 테스트로부터의 P 값을 종합하여 Stouffer's method를 사용하여 전체 P 값을 계산하였다. 마지막으로, Storey's method 를 사용하여 전체 p값에 대한 FDR 을 계산하였다. FDR <0.05 및 fold-change≥1.5 를 모두 만족하는 단백질을 발현 차이를 나타내는 단백질(differentially expressed proteins, DEPs)로 선별하였다.

소변 high confidence protein 의 세포 프로세스 또는 세포 내 위치를 알아보기 위하여, DAVID software로 계산된 P 값이 0.05이하인 GO biological process 및 cellular component를 확인하였다. 134 DEP의 세포 프로세스를 확인할 때, DAVID software 의 KEGG pathway 및 GO biological process 에서 functional annotation clustering을 사용하였다.

1-7. 전사체 데이터 분석 및 인간 혈청 프로테옴의 수집

활액 조직(synovial tissue) 에서 수집된 유전자 발현 데이터(GSE12021, GSE1919, GSE7307) 및 말초혈액단핵세포(PBMC)에서 수집된 유전자 발현 데이터(GSE11827, GSE15573)를 Gene Expression Omnibus에서 얻었다. Quantile normalization method를 사용하여 분석의 강도를 표준화하였다. 표준화된 강도(normalized intensities)를 사용하여, OA 와 RA 시료 간의 DEGs 를 결정하였다. DEGs 는 FDR <0.05 및 fold-change ≥1.5 인 유전자들을 선별하였다. HPPP Data Central at PeptideAtlas 로부터, Human Plasma Proteome Project(HPPP) Phase I and II data를 포함하는 91개 실험으로부터 확인된 1929 단백질의 high confidence(FDR ≤0.01) list를 다운로드하였다.

1-8. ELISA( enzyme - linked immunosorbent assay )

혈청 및 소변에서 sCD14 의 정량을 위해 CD14 ELISA assay(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 ELISA 를 수행하였다. 소변 내 GSN, AGP1, AGP2의 농도를 측정할 때에도 ELISA(USCN Life Science Inc., Missouri City, TX, USA)를 사용하였다.

1-9. 통계 분석

모든 변수들에 대한 분포(distribution)를 조사하였다. 정규분포를 나타내는 변수들은 평균±표준편차(SD)로 나타내고, 비정규분포를 나타내는 변수들은 중앙값 [interquartile range; IQR]으로 표시하였다. 세 환자군 간의 비교는 post hoc test로서 Bonferroni correction와 one-way analysis of variance(ANOVA) 로 수행하였다. Categorical data를 위하여, chi-square test 또는 Fisher's exact test 에 의해 difference in prevalence를 평가하였다. 단변량 분석(univariate analysis)에서, Spearman correlation coefficient를 사용하여 소변 sCD14 및 관심 변수들 간의 관련성을 표시하였다. 두 그룹 간의 cross-sectional comparison를 위하여, Mann-Whitney U test를 사용하였다. 혈청 sCD14 및 단백뇨의 기준치 정도가 다른 환자들에서 높은 소변 sCD14 의 수준을 표시하기 위하여 Cumulative probability plot을 사용하였다. 질병 활성도 중증(high disease activity)의 예측을 위하여 소변 sCD14, CRP, 헤모글로빈, 혈소판 및 알부민 수준에 대한 ROC 곡선을 비교하였다.

High urinary sCD14 란 urinary sCD14 의 top tertile를 의미한다. ROC 분석은 ESR, CRP, GFR, creatinine, 소변 sCD14, 및 혈청 CRP 대 소변 sCD14의 비율에 대한 최적의 cut-off 수준을 결정하여 높음과 낮음 사이를 식별하기 위하여 사용하였다. 높은 ESR, 높은 CRP, 손상된 무증상 신기능(impaired subclinical renal function)은, 혈청 ESR 정도가 =28 mm/hr, 혈청 CRP 정도가 =0.5 mg/dl, GFR <90 ml/min/1.73², 및 Cr =0.7 mg/dl 일 때를 기준으로 한다.

모든 보고된 P 값은 양측 검정(two-tailed)이며, p값 0.05는 통계적으로 유의함을 나타낸다. 양측 P 값이 <0.05 일 때 유의한 것으로 보았다. R software, version 2.14.1를 사용하여 분석하였다.

실시예 2. 소변 시료 단백질 분석

환자의 일상 진단 시 소변 시료를 채취하였고, 소변 단백질의 검출을 향상시키기 위해 Affinity Removal Spin Cartridge, Human Albumin(Agilent Technologies, Wilmington, DE. USA)을 이용하여 알부민을 제거한 후 SDS-PAGE gel을 이용하여 13개의 분획으로 분리하였다(도 1). 그 후 일반적인 in-gel tryptic digestion을 따랐으며, 각 분획에 대해 LC-MS/MS 분석을 수행하여 각 RA와 OA 시료에 총 52개 프로테옴 프로파일을 만들었다. 결과로 나온 MS/MS spectra를 이용하여 단백질 분석을 하였으며, SEQUEST의 IPI human version 3.86 과 sequence-reversed decoy databases 를 이용하였다. 총 696개의 소변 단백질(OA 에서 586개 단백질, RA 에서 556개 단백질)에 대해 FDR peptide identification 0.01, Protein Prophet probability 0.95의 조건으로 확정하였다. RA와 OA에 있는 단백질의 양은 absolute protein expression(APEX) method(see methods for details)를 이용하여 정하였다. 신뢰성 있는 소변 단백질 바이오마커 후보군을 정하기 위해 RA 나 OA 시료에서 각각 52개의 프로파일데이터 중 두 번 이상 발견되거나 sibling peptides가 2개 이상 존재하는 296개의 단백질에 집중하여 살펴보았다(도 2A). 발견된 소변 단백질의 기능과 분포 정도를 깊게 이해하기 위해 먼저 세포 내 활동을 대변하고 신뢰할 수 있는 296개 단백질을 DAVID 소프트웨어를 이용하여 살펴보았다. 이 단백질들은 세포 유착, 면역반응(상처, 방어, 염증과 응고 반응), 단백질 분해에 연관되어있다(도 2B). 그 다음 세포 내 요소들을 대변하는 단백질이 세포 밖이나 매트릭스, 막과 관련된 요소들로부터 온다는 것을 살펴보았다. 이로써 소변 단백질이 소변 시료로부터 잘 분리되었음을 확인하였다(도 1C).

신뢰성이 높은 296개의 단백질 중에서 integrative statistical method 를 사용하여 OA 환자에 비하여 RA 환자의 소변 시료에서 특이적으로 발현된 134개의 단백질을 확인하였고(DEPs; FDR <0.05 및 fold change of APEX abundance >1.5), 이 중 특히 유의적인 발현 차이를 나타내는 12개의 단백질을 선별하였다(표 2).

단백질	IPI Human database	P 값	발현 차이(RA/OA)
IGHM	IPI00896380.1	0.008925	1.076735
GSN	IPI00026314.1	0.005315	1.267885
AGP1	IPI00022429.3	0.001132	1.907385
SERPINA3	IPI00550991.3	0.002952	1.794114
AGP2	IPI00020091.1	0.002113	1.636583
CD14	IPI00029260.2	0.030701	0.792891
AZGP1	IPI00166729.4	0.031514	0.596275
COTL1	IPI00017704.3	0.003831	1.417044
HPR	IPI00478493.3	0.012258	0.96827
SERPINA7	IPI00292946.1	0.029417	0.950555
CTSA	IPI00021794.8	0.039159	0.788813
GNS	IPI00012102.1	0.007266	1.475078

ELISA를 이용하여 확인한 결과, 상기 선별된 12개의 바이오마커 단백질 중,GSN, AGP1, AGP2 및 sCD14 단백질 양이 OA 환자보다 RA 환자에서 두드러지게 높게 나타났다(P<0.01, 도 3). 이 단백질들이 프로테옴 프로파일의 변화가 일정하기 때문에 RA 진단을 위한 소변 단백질 바이오 마커라고 입증되었다.

이후, sCD14 에 대해 더 깊게 조명하기 위해 더 큰 집단인 274명의 RA 환자와 120명의 OA, 60명의 전신성 홍반성 낭창(SLE) 환자들을 포함하는 180명의 대조군을 이용하여 실험하였다.

실시예 3. RA , OA , SLE 환자에서의 sCD14 농도 측정

RA 환자들에게는 subclinical 신병변(renal damage)이 비교적 흔하고, 미소단백뇨와 신세뇨관 장애가 나타난다. 따라서, RA 환자군에서 소변 sCD14를 측정하기 전에 신기능 및 단백뇨(proteinuria)정도를 우선적으로 테스트하였다. 소변 크레아티닌은 보정 후의 proteinuria 레벨은 OA 환자(n=120)나 신질환이 없는 SLE환자(n=60)들보다 RA 환자(n=274)들에게서 매우 높게 나타났다(도 4A). 이는 subclinical renal damage(proteinuria <150 mg/day)가 RA 환자들에게서 자주 나타남을 의미한다.

또한, 프레드니솔론(prednisolone), 비스테로 이드성 항염증제(nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs), disease-modifying anti-rheumatic drugs(DMARDs), TNF 억제제의 처방 유무에 따라 단백뇨 레벨은 큰 차이를 보이지 않았다(표 3).

CD14는 55 kDa glycophosphatidylinositol(GPI)-linked membrane surface protein(mCD14)이다. GPI-free sCD14 form(by proteolytic cleavage)과 GPI-linked sCD14 form(by protease-mediated shedding) 모두 혈청에서 발견된다. 본 발명자들은 GPI-free 또는 GPI-linked sCD14가 urine에서 나타나는지 조사하였다. 웨스턴블라팅을 이용하여 분석하였으며, 두 가지 형태의 GPI-linked(56 kDa) 및 GPI-free(48 kDa) sCD14가 RA 및 OA 환자들의 urine에서 모두 확인할 수 있었다(도 4B). 두 가지 형태의 소변 sCD14와 결합하는 항체를 이용하여, 소변 sCD14 레벨의 증가가 RA 환자에게서만 나타나는 것인지 아니면 다른 형태의 관절염 및 자가면역질환에서도 보이는 일반적인 현상인지 조사하기 위해, RA(n=274), OA(n=120), 신침범이 없는 SLE(n=60) 환자들로부터 sCD14 농도를 ELISA 방법으로 측정하였다. 소변 크레아티닌 보정 후의 소변 sCD14 농도는 SLE 및 OA 환자들보다 RA 환자들에게서 더 높게 나타났다(도 4C). 또한, RA 환자에서의 약제(prednisolone, NSAIDs, DMARDs, and TNF-α inhibitors)의 유무에 따른 소변 sCD14 레벨의 차이는 나타나지 않았다(표 3).

당뇨(DM)와 고혈압(hypertension)은 소변으로의 단백질 분비(소변 protein excretion)에 영향을 미칠 수 있는바, 당뇨 또는 고혈압의 발현에 따른 분석을 진행하였다. 결과에 따르면, RA 환자들이 당뇨 또는 고혈압에 상관없이 OA 환자들보다더 높은 레벨의 소변 sCD14를 가지고 있었다(도 4D). 특히, RA 환자들의 하위집단에서는 당뇨를 가진 RA 환자가 가장 높은 소변 sCD14을 나타내었으며, 그 다음은 고혈압을 가진 RA 환자였다(도 4D).

	단백뇨 ( mg / day )		P value	소변 sCD14 ( ng / ml )		P value
	사용자	비사용자	P value	사용자	비사용자	P value
프레드니솔론 (prednisolone)	92.8 (23.9- 144.8)	81.0 (21.8- 162.4)	0.795	179.9 (39.6- 239.8)	213.9 (49.8- 313.0)	0.322
비스테로이드성 항염증제(NSAIDs)	94.4 (23.4- 159.2)	92.8 (25.2- 98.1)	0.790	188.4 (50.5- 245.5)	171.5 (40.2- 218.7)	0.611
메토트렉세이트 (Methotrexate)	73.3 (23.5- 133.1)	118.7 (24.6- 160.1)	0.195	179.3 (39.4- 235.6)	198.4 (54.4- 291.4)	0.470
설파살라진 (Sulfasalazine)	86.4 (26.8- 149.3)	93.6 (23.2- 211.5)	0.850	198.7 (45.9- 286.0)	179.6 (39.2- 238.9)	0.501
하이드록시클로로퀸 (Hydroxychloroquine)	89.7 (25.7- 150.1)	96.2 (19.3- 173.3)	0.876	134.5 (44.8- 278.7)	199.0 (78.7- 370.9)	0.037
류마이드 (Leflunomide)	98.3 (23.6- 149.8)	77.1 (22.3- 159.6)	0.556	194.4 (47.1- 253.5)	170.2 (38.2- 228.3)	0.342
아자티오프린 (Azathioprine)	68.7 (19.9- 108.9)	95.0 (25.1- 157.2)	0.604	185.5 (87.8- 283.8)	186.1 (39.3- 239.5)	0.987
부시라민 (Bucillamine)	77.4 (23.0- 120.6)	110.9 (24.7- 171.8)	0.351	187.7 (43.0- 220.6)	181.0 (47.8- 235.8)	0.802
TNFαblocker	81.5 (23.0- 308.9)	92.4 (24.3- 145.5)	0.864	196.8 (22.5- 406.3)	187.2 (43.7- 239.7)	0.858

실시예 4. 소변 sCD14 농도와 RA 질병 활성도와의 상관관계 측정

RA에서의 소변 sCD14의 임상적 중요성을 평가하기 위해, 적혈구 침강속도(ESR), C-반응성단백질(CRP), 혈청 sCD14, 및 DAS28을 포함한 RA의 염증성 지표를 이용하여 소변 sCD14 레벨과 관련되어 있는지 여부를 분석하였다.

질병활성도(Disease activity status)는 “Disease Activity Score 28-joint assessment (DAS28) score”에 의해 정의되었다. DAS28 score <3.2이면 낮은 질병활성, 3.2=DAS28 score<5.1이면 중간 질병활성, 그리고 DAS28 score=5.1이면 높은 질병활성으로 정의하였다. DAS28 점수는 적혈구 침강속도(ESR)를 포함한 관계식으로부터 계산하였다.

우선, 혈청 sCD14 농도가 OA 환자(n=120)보다 RA 환자(n=274)에서 더 높음을 확인하였으며(mean value [range]: 1991.0 [1732.1-2251.0] versus 1794.2 [1486.3-1999.1] ng/ml, P<0.001)(도 5), 분석 결과, 소변 및 혈청 sCD14 레벨은 ESR, CRP 및 DAS28과는 강한 양의 상관관계를 보였고, 혈청 알부민과는 음의 상관관계를 보였다(도 6). RA 환자들을 DAS28에 따른 질병 활성도 의해 상/중/하 세 그룹으로 분류했을 때, 소변 sCD14 레벨은 DAS28에 비례하여 증가하였다(도 7). 또한 소변 sCD14은 혈청 CD14과 양의 상관 관계를 보였으며(도 8), 이로부터 소변 sCD14 레벨이 염증반응의 활성도에 대해 민감한 척도로 활용될 수 있음을 알 수 있었다. ESR 과 CRP에 의한 층화 분석에 따르면, 혈청 sCD14은 높은 ESR을 갖는 RA 환자 하위그룹에서 소변 sCD14 레벨이 증가할 가능성을 높이게 된다(도 9, 상위 패널). 또한 소변 sCD14이 증가할 확률은 낮은 ESR/CRP을 가진 환자들보다 높은 ESR/CRP을 가진 환자들에서의 혈청 sCD14 레벨과 비례하여 증가하였다. 이는 소변 sCD14 레벨의 증가가 전신의 염증이 심한 경우 체순환으로부터 신장시스템으로 진행된 것에 의한 것임을 나타낸 것이다.

본 발명자들은 단백뇨가 RA 환자들에서 나타남을 확인하고, 단백뇨 정도에 따른 소변 sCD14과의 관련성을 조사하였으며, 소변 sCD14 레벨은 혈청 sCD14과는 달리 단백뇨 정도와 강한 양의 상관관계를 나타내는 것을 관찰하였다(r=0.259, P<0.001)(도 10). 이는 소변 sCD14가 RA 환자의 신장 이상기능과 관련되어 있음을 의미한다. 이와 관련하여, 본 발명자들은 신기능이 감소한 RA 환자들이 보통의 신기능을 갖는 RA 환자들보다 소변 sCD14 레벨이 증가할 확률이 더 높음을 관찰하였다(도 9, 하부 패널); OR=1.379 [1.059-1.944] per one SD increase in proteinuria for cases with GFR <90 ml/min/1.732, P=0.031; OR=1.417 [1.083-1.853] per one SD increase in proteinuria for cases with serum creatinine(Cr)³ 0.7 mg/dl, P=0.010.

실시예 5. RA 활성을 예측하는 마커로서의 소변 sCD14

높은 RA 활성(DAS28 >5.1)을 갖는 RA 환자들에서 소변 sCD14의 diagnostic power를 진단하기 위해 ROC 분석을 진행하였다(도 11). 이 분석에서 DAS28와 깊이 연관되어 있는 RA의 질병활성을 예측하기 위한 유용한 파라미터로써 CRP를 이용하였다. 혈청 CRP은 0.74 [0.67-0.81, P<0.001]의 혈장중농도곡선하면적(AUC, a measure of diagnostic power)을 나타내었으며, 소변 sCD14은 유사한 AUC 수준의 0.71 [0.63-0.79, P<0.001]를 나타내었는데, 이는 높은 RA 활성(DAS28 >5.1)을 예측하는데 있어 소변 sCD14가 CRP와 유사한 수준임을 알 수 있었다. 또한 ROC 분석에서 소변 sCD14이 80% 이상의 특이성을 나타내는 영역에서 CRP보다 높은 민감도를 나타내었으며, 소변 sCD14가 CRP에 함께 측정할 경우 보다 보완적으로 질병 활성도를 예측할 수 있음을 의미하였다.

이러한 결과를 기반으로 하여 본 발명자들은 소변 sCD14에 대한 혈청 CRP의 비율을 새로운 CRP과 sCD14의 복합 평가기준으로 사용하였으며, ROC에서 가양성과 부정적 에러의 합을 최소화하는 평가 기준의 cutoff 값(0.06)을 또한 정하였다. 복합 측정 시, (cut-off를 0.06으로 했을 때) RA 환자가 질병 활성도가 높음으로 판명될 민감도, 특이성, 양성예측치(positive predictive value, PPV), 음성예측치(negative predictive value, NPV)는 각각 77.2, 68.9, 44.4, 90.4%에 해당된다. 이러한 값들은 CRP나 소변 sCD14이 단독으로 사용될 때의 경우보다 더 큼을 알 수 있었다(표 4).

	CRP(95% CI)	sCD14(95% CI)	CRP/sCD14 (95% CI)
민감도	70.8% (64.9-76.1)	68.4% (62.0-74.3)	77.2% (71.2-82.3)
특이도	66.8% (60.8-72.4)	62.7% (56.1-68.9)	68.9% (62.5-74.7)
PPV	40.4% (34.5-46.5)	37.1% (31.0-43.7)	44.4% (38.0-51.1)
NPV	87.8% (83.2-91.4)	86.0% (80.8-90.1)	90.4% (85.7-93.8)
Cut-off	6ng/ml	102ng/ml	0.06

이상의 결과들을 종합해 볼 때, 소변 sCD14 자체는 비침습적인 바이오마커로서, 혈청 CRP과 동등 수준의 진단력을 갖고 있고, 혈청 CRP과 결합하면 보다 나은 활성의 바이오마커로 활용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 6. 소변 AGP1 , AGP2 , sCD14 농도와 RA 질병 활성도와의 상관관계 연구

RA에서의 소변 AGP1, AGP2, sCD14가 질병 활성도를 반영해 줄 수 있는 염증성 마커로서의 가능성을 평가해 보기 위해, ESR, CRP, DAS28, hemoglobin, 백혈구수(WBC), albumin 과의 관련성을 분석하였다. RA 환자와(도 12) 대조군 환자를(도 13) 각각 나누어 상관 분석을 하였고, 두 군에서 모두 AGP2와 sCD14는 염증성 마커들과 유의한 상관관계를 보였다. 특히 AGP2의 경우 혈청 CRP와 매우 강한 상관관계(전체 환자에서 r=0.664, P<0.001, RA에서 r=0.602, P<0.001, 대조군 환자에서 r=0.985, P<0.001)를 나타내었다.

RA 환자 중의 일부는 낮은 CRP 농도에서도 높은 질환의 활성도를 보이는 경우가 있어 이런 환자들에서 질병 활성도(DAS28)를 대표해 줄 수 있는 새로운 염증질병 활성도 마커의 필요성이 대두되어 왔다. 본 발명에서 RA 환자들을 정상 CRP농도를 갖는 환자군과 아닌 환자군으로 나누어 층화 분석을 해본 결과, sCD14은 정상 CRP군에서 DAS28과 좋은 상관관계를 보였다(표 5). 한편, AGP2는 정상 CRP군과 증가된 CRP군 모두에서 CRP와 강한 상관관계를 나타내었다(표 6). 이상의 결과는 sCD14의 경우 혈청 CRP의 보완적인 측면에서 DAS28을 반영해 줄 수 있음을 나타낸다. 또한, AGP2의 경우는 혈청 CRP의 매우 좋은 반영인자로서, 혈액 시료 채취 없이도 소변 검사만으로 질병 활성도 평가가 가능할 수 있음을 나타낸다.

	ESR	CRP	DAS28	WBC	헤모글로빈	알부민
Unadjusted
AGP1	-0.093	-0.039	0.001	-0.004	0.043	-0.016
AGP2	0.077	0.480	0.022	0.110	-0.093	-0.244
GSN	0.098	0.136	-0.100	0.070	0.113	-0.184
CD14	0.351	0.048	0.390	0.150	0.007	-0.424
Ucr-adjusted
AGP1	-0.019	0.022	-0.019	-0.045	-0.122	-0.235
AGP2	0.142	0.094	0.047	0.159	-0.244	-0.139
GSN	0.207	0.136	-0.025	0.189	-0.000	-0.189
CD14	0.368	0.005	0.267	0.244	-0.214	-0.309
Spearman's correlation coefficient was used to determine r value

	ESR	CRP	DAS28	WBC	헤모글로빈	알부민
Unadjusted
AGP1	-0.093	-0.039	0.001	-0.004	0.043	-0.016
AGP2	0.230	0.613	0.118	0.123	-0.229	-0.405
GSN	-0.129	-0.036	-0.121	-0.125	0.045	-0.106
CD14	0.158	0.344	0.134	0.030	-0.065	-0.384
Ucr-adjusted
AGP1	-0.006	0.024	0.155	0.092	0.035	-0.102
AGP2	0.015	0.244	-0.015	-0.076	-0.021	-0.377
GSN	-0.142	-0.021	-0.081	-0.110	0.068	-0.240
CD14	0.157	0.155	0.117	0.118	-0.094	-0.254
Spearman's correlation coefficient was used to determine r value

RA 환자에서 소변 AGP2가 질병 활성도를 반영해주는 마커로서의 power를 검정하기 위해 DAS28=5.1 군을 높은 질환활성도 군으로 정의하였고, ROC 분석을 시행하였다(도 14). 이 분석에서 AGP2는 AUC=0.645 [0.685-0.822, P<0.001]로서 혈청 CRP AUC=0.659 [0.680-0.803, P<0.001]에 근접하는 결과를 나타내었다(표 7). APG2의 cut-off value를 0.3555ng/ml로 설정하였을 때 높은 질병 활성도 환자군을 감별해 낼 수 있는 민감도가 71.6%, 특이도가 70.0%로 매우 좋은 지표로서의 가능성을 보여주었다(표 8).

	AUC	P	95% CI
CRP	0.659	<0.001	0.680-0.803
AGP2	0.645	<0.001	0.685-0.822

Cut-Off	민감도	특이도
0.3555	71.6	70.0

실시예 7. RA 진단을 예측하는 마커로서의 소변 AGP1 , AGP2 , sCD14

관절염 환자들에서 RA 감별진단이 가능한 지 알아보기 위해 환자들에서 소변 sCD14, AGP1, AGP2, GSN의 diagnostic power-ROC 분석을 시행하였다(도 15). 향후 소변만으로 RA를 감별진단이 가능한 진단 도구를 개발함이 목표이기 때문에, 신기능 관련 정보가 없다는 가정하에(즉, 신기능보정 없이) 분석을 진행하였다. 이 분석에서 AGP2는 0.713 [0.659-0.767, P<0.001]로서 가장 좋은 AUC 값을 보여주었으며, sCD14는 0.616 [0.555-0.678, P<0.001]였다(표 9).

AGP2의 경우, cut-off value를 0.3285 ng/ml로 잡았을 때, 질환진단 민감도는 61.0%, 특이도는 76.1%이었고, sCD14의 경우는 cut-off를 116.944 ng/ml로 했을 때, 민감도 55.2% 특이도는 66.3%였다(표 10). 이는 기존에 알려진 진단 관련 항체인 류마티스 인자(rheumatoid factor) 또는 항CCP항체(anti-cyclic citruliinated antibody)의 diagnostic power(민감도 48~63%, 특이도 88~96%)보다 우월한 민감도를 보이면서, 비교적 높은 수준의 특이도를 보이고 있어 수준으로 소변으로 RA 진단 스크리닝의 도구로서 매우 유망한 가능성을 제시해 주었다.

	AUC	P	95% CI
AGP1	0.550	0.102	0.493-0.620
AGP2	0.713	<0.001	0.659-0.767
GSN	0.541	0.235	0.474-0.608
CD14	0.616	0.001	0.555-0.678

	Cut-Off	민감도	특이도
AGP1(ng/ml)	0.3670	45.4	74.1
AGP2(ng/ml)	0.3285	61.0	76.1
GSN(ng/ml)	1.4881	44.3	66.4
CD14(ng/ml)	116.9440	55.2	66.3

또한 ROC 분석에서 소변 AGP1, AGP2, sCD14는 상호 관련성을 보여주고 있어서, 이 단백체들의 조합이 더 높은 diagnostic yield를 제시해 줄 수 있다고 판단하여 여러 가지 조합으로 diagnostic power-ROC 분석을 시행하였다(도 16).

	조합 **괄호 안의 숫자는 cut-off 값(ng/ml)을 나타낸다
모델 1	AGP1(0.367) + AGP2(0.231) + GSN(15.3288) + CD14(139.95)
모델 2	AGP1(0.360) + AGP2(0.20074) + CD14(116.944)
모델 3	AGP1(0.4066) + AGP2(0.3528) + CD14(228.2)
모델 4	AGP1(0.4328) + AGP2(0.6612) + CD14(621.25)
모델 5	AGP2(0.20074) + CD14(116.944)
모델 6	AGP2(0.231) + CD14(139.95)
모델 7	AGP1(0.3175) + AGP2(0.337)

여러 가지 조합 모델 중에서 세가지 소변 단백질, 즉 AGP1, AGP2 및 CD14를 조합한 모델 3의 경우, AUC가 0.727 [0.671-0.783, P<0.001]로서 가장 좋았다(표 12). 모델 3은, 각 단백질의 cut-off를 AGP1은 0.4066 ng/ml, AGP2는 0.3528 ng/ml, sCD는 228.2 ng/ml로 설정 후 cut-off 이상이면 1, 미만이면 0으로 점수화시켜 총합으로 구성하였다.

또한, 비용대비 경제적 효과를 고려한 두 가지 단백질로만 구성된 모델 5[AGP2(cut-off=0.20074 ng/ml)과 sCD14(cut-off=116.944 ng/ml) 로 구성]와 모델 6[AGP2(cut-off=0.231 ng/ml)과 sCD14(cut-off=139.95 ng/ml)로 구성] 역시 각각의 AUC가 0.712 [0.650-0.774, P<0.001] 과 0.718 [0.657-0.778, P<0.001]로서 좋은 diagnostic power를 보여주었다(표 12). 모델 6의 cut-off를 기준으로 두 가지 AGP2와 sCD14가 모두 양성일 경우는 RA진단의 민감도가 84.8%, 특이도가 61.1%로 나타났다. 또한, AGP1과 AGP2 의 조합에서 모두 양성일 경우 RA진단의 민감도가 91.7%, 특이도가 70.0%로 나타났다.(표 13).

	AUC	P	95% CI
모델 1	0.698	<0.001	0.638-0.757
모델 2	0.721	<0.001	0.664-0.778
모델 3	0.727	<0.001	0.671-0.783
모델 4	0.699	<0.001	0.641-0.757
모델 5	0.712	<0.001	0.650-0.774
모델 6	0.718	<0.001	0.657-0.778
모델 7	0.693	<0.001	0.635-0.751

	Cut-Off	민감도	특이도
AGP2(ng/ml) CD14(ng/ml) 2 positive	0.213 139.95	84.8	61.1
AGP1(ng/ml) AGP2(ng/ml) 2 positive	0.3175 0.337	91.7	70.0

이상의 결과들을 종합해 볼 때, AGP1, AGP2, sCD14 는 비침습적인 바이오마커로서, 혈청 자가항체(RF 나 ACPA)와 동등 수준의 진단력을 갖고 있고, 이들 단백질의 상호 조합은 보다 나은 진단의 바이오마커로 활용될 수 있음을 알 수 있었다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Biomarkers for assessing rhematoid arthritis disease activity <130> DPP20142218KR <150> KR10-2013-0071739 <151> 2013-06-21 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 375 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(375) <223> sCD14 <400> 1 Met Glu Arg Ala Ser Cys Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Val His 1 5 10 15 Val Ser Ala Thr Thr Pro Glu Pro Cys Glu Leu Asp Asp Glu Asp Phe 20 25 30 Arg Cys Val Cys Asn Phe Ser Glu Pro Gln Pro Asp Trp Ser Glu Ala 35 40 45 Phe Gln Cys Val Ser Ala Val Glu Val Glu Ile His Ala Gly Gly Leu 50 55 60 Asn Leu Glu Pro Phe Leu Lys Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg 65 70 75 80 Gln Tyr Ala Asp Thr Val Lys Ala Leu Arg Val Arg Arg Leu Thr Val 85 90 95 Gly Ala Ala Gln Val Pro Ala Gln Leu Leu Val Gly Ala Leu Arg Val 100 105 110 Leu Ala Tyr Ser Arg Leu Lys Glu Leu Thr Leu Glu Asp Leu Lys Ile 115 120 125 Thr Gly Thr Met Pro Pro Leu Pro Leu Glu Ala Thr Gly Leu Ala Leu 130 135 140 Ser Ser Leu Arg Leu Arg Asn Val Ser Trp Ala Thr Gly Arg Ser Trp 145 150 155 160 Leu Ala Glu Leu Gln Gln Trp Leu Lys Pro Gly Leu Lys Val Leu Ser 165 170 175 Ile Ala Gln Ala His Ser Pro Ala Phe Ser Cys Glu Gln Val Arg Ala 180 185 190 Phe Pro Ala Leu Thr Ser Leu Asp Leu Ser Asp Asn Pro Gly Leu Gly 195 200 205 Glu Arg Gly Leu Met Ala Ala Leu Cys Pro His Lys Phe Pro Ala Ile 210 215 220 Gln Asn Leu Ala Leu Arg Asn Thr Gly Met Glu Thr Pro Thr Gly Val 225 230 235 240 Cys Ala Ala Leu Ala Ala Ala Gly Val Gln Pro His Ser Leu Asp Leu 245 250 255 Ser His Asn Ser Leu Arg Ala Thr Val Asn Pro Ser Ala Pro Arg Cys 260 265 270 Met Trp Ser Ser Ala Leu Asn Ser Leu Asn Leu Ser Phe Ala Gly Leu 275 280 285 Glu Gln Val Pro Lys Gly Leu Pro Ala Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu 290 295 300 Ser Cys Asn Arg Leu Asn Arg Ala Pro Gln Pro Asp Glu Leu Pro Glu 305 310 315 320 Val Asp Asn Leu Thr Leu Asp Gly Asn Pro Phe Leu Val Pro Gly Thr 325 330 335 Ala Leu Pro His Glu Gly Ser Met Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Cys 340 345 350 Ala Arg Ser Thr Leu Ser Val Gly Val Ser Gly Thr Leu Val Leu Leu 355 360 365 Gln Gly Ala Arg Gly Phe Ala 370 375 <210> 2 <211> 201 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(201) <223> AGP1 <400> 2 Met Ala Leu Ser Trp Val Leu Thr Val Leu Ser Leu Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15 Glu Ala Gln Ile Pro Leu Cys Ala Asn Leu Val Pro Val Pro Ile Thr 20 25 30 Asn Ala Thr Leu Asp Arg Ile Thr Gly Lys Trp Phe Tyr Ile Ala Ser 35 40 45 Ala Phe Arg Asn Glu Glu Tyr Asn Lys Ser Val Gln Glu Ile Gln Ala 50 55 60 Thr Phe Phe Tyr Phe Thr Pro Asn Lys Thr Glu Asp Thr Ile Phe Leu 65 70 75 80 Arg Glu Tyr Gln Thr Arg Gln Asp Gln Cys Ile Tyr Asn Thr Thr Tyr 85 90 95 Leu Asn Val Gln Arg Glu Asn Gly Thr Ile Ser Arg Tyr Val Gly Gly 100 105 110 Gln Glu His Phe Ala His Leu Leu Ile Leu Arg Asp Thr Lys Thr Tyr 115 120 125 Met Leu Ala Phe Asp Val Asn Asp Glu Lys Asn Trp Gly Leu Ser Val 130 135 140 Tyr Ala Asp Lys Pro Glu Thr Thr Lys Glu Gln Leu Gly Glu Phe Tyr 145 150 155 160 Glu Ala Leu Asp Cys Leu Arg Ile Pro Lys Ser Asp Val Val Tyr Thr 165 170 175 Asp Trp Lys Lys Asp Lys Cys Glu Pro Leu Glu Lys Gln His Glu Lys 180 185 190 Glu Arg Lys Gln Glu Glu Gly Glu Ser 195 200 <210> 3 <211> 201 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(201) <223> AGP2 <400> 3 Met Ala Leu Ser Trp Val Leu Thr Val Leu Ser Leu Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15 Glu Ala Gln Ile Pro Leu Cys Ala Asn Leu Val Pro Val Pro Ile Thr 20 25 30 Asn Ala Thr Leu Asp Arg Ile Thr Gly Lys Trp Phe Tyr Ile Ala Ser 35 40 45 Ala Phe Arg Asn Glu Glu Tyr Asn Lys Ser Val Gln Glu Ile Gln Ala 50 55 60 Thr Phe Phe Tyr Phe Thr Pro Asn Lys Thr Glu Asp Thr Ile Phe Leu 65 70 75 80 Arg Glu Tyr Gln Thr Arg Gln Asn Gln Cys Phe Tyr Asn Ser Ser Tyr 85 90 95 Leu Asn Val Gln Arg Glu Asn Gly Thr Val Ser Arg Tyr Glu Gly Gly 100 105 110 Arg Glu His Val Ala His Leu Leu Phe Leu Arg Asp Thr Lys Thr Leu 115 120 125 Met Phe Gly Ser Tyr Leu Asp Asp Glu Lys Asn Trp Gly Leu Ser Phe 130 135 140 Tyr Ala Asp Lys Pro Glu Thr Thr Lys Glu Gln Leu Gly Glu Phe Tyr 145 150 155 160 Glu Ala Leu Asp Cys Leu Cys Ile Pro Arg Ser Asp Val Met Tyr Thr 165 170 175 Asp Trp Lys Lys Asp Lys Cys Glu Pro Leu Glu Lys Gln His Glu Lys 180 185 190 Glu Arg Lys Gln Glu Glu Gly Glu Ser 195 200

Claims

sCD14(soluble CD14), AGP1(alpha-1-acid glycoprotein 1) 및 AGP2(alpha -1-acid glycoprotein 2)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 농도를 측정하는 제제를 포함하며, 상기 단백질은 소변시료 내 존재하는 것인, 류마티스 관절염의 활성도 평가용 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 단백질의 농도를 측정하는 제제는 sCD14, AGP1 및 AGP2로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상에 특이적인 항체인 조성물.
제3항에 있어서, 상기 항체는 단클론항체 또는 다클론항체인 조성물.
제1항에 있어서, (i) sCD14, AGP1 및 AGP2 단백질의 농도를 측정하는 제제, (ii) sCD14 및 AGP2 단백질의 농도를 측정하는 제제, 또는 (iii) AGP1 및 AGP2 단백질의 농도를 측정하는 제제를 포함하는 것인 조성물.
제1항의 조성물을 포함하는, 류마티스 관절염의 활성도 평가용 키트.
제1항의 조성물을 포함하는, 류마티스 관절염의 활성도 평가용 단백질 칩.
소변 시료로부터 sCD14, AGP1 및 AGP2 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는,
류마티스 관절염 활성도를 평가하기 위한 정보를 제공하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 단백질의 농도를 측정은 sCD14, AGP1 및 AGP2로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상에 특이적인 항체를 이용하여 수행되는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 항체는 단클론항체 또는 다클론항체인 방법.
제8항에 있어서, 상기 단백질의 농도 측정은 웨스턴 블랏(Western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorecence Activated Cell Sorter, FACS), 또는 단백질 칩(protein chip)을 이용하여 수행되는 것인 방법.
제8항에 있어서, (i) sCD14, AGP1 및 AGP2 단백질의 농도, (ii) sCD14 및 AGP2 단백질의 농도, 또는 (iii) AGP1 및 AGP2 단백질의 농도를 측정하는 것인 방법.