KR102585402B1

KR102585402B1 - 류마티스 관절염의 진단 또는 관해 평가를 위한 정보 제공 방법

Info

Publication number: KR102585402B1
Application number: KR1020210168029A
Authority: KR
Inventors: 전병화; 유인설; 주희경; 이유란
Original assignee: 충남대학교산학협력단; (주)메디레독스
Priority date: 2021-11-30
Filing date: 2021-11-30
Publication date: 2023-10-10
Also published as: KR20230080657A

Abstract

본 발명은 체액 중 지표 농도에 의해 관절염의 종류를 간단/신속하게 높은 신뢰도로 진단할 수 있고, 예후 예측과 관해 판단에 이용될 수 있는 골관절염에 대한 류마티스 관절염의 감별 진단, 류마티스 관절염의 예후 예측 또는 류마티스 관절염의 관해 판단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 검사 대상자 또는 치료 중인 류마티스 관절염 환자로부터 채취한 시료 중 APE1/Ref-1의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 골관절염에 대한 류마티스 관절염의 감별 진단, 류마티스 관절염의 예후 예측 또는 류마티스 관절염의 관해 판단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.

Description

류마티스 관절염의 진단 또는 관해 평가를 위한 정보 제공 방법{Method of Providing Information for Diagnosis or Remission-Assessment of Rheumatoid Arthritis}

본 발명은 체액 중 지표 농도에 의해 관절염의 종류를 간단/신속하게 높은 신뢰도로 진단할 수 있고, 예후 예측과 관해 판단에 이용될 수 있어 보다 효과적인 치료를 가능하게 하는 골관절염에 대한 류마티스 관절염의 감별 진단, 류마티스 관절염의 예후 예측 또는 류마티스 관절염의 관해 판단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.

관절은 뼈와 뼈 사이가 부드럽게 운동할 수 있도록 연골, 관절낭, 활막, 인대, 힘줄, 근육 등으로 구성되어 있으며, 움직임에 따라 발생하는 충격을 흡수하는 역할을 한다. 뼈끝을 감싼 관절 연골이 파괴되고 염증성 변화가 일어나면, 관절의 통증과 부종, 관절이 뻣뻣한 증상이 발현되며 이를 관절염이라 한다. 관절염에는 여러 종류가 있으며, 그 원인이 상이하다. 대표적인 관절염은 골관절염(퇴행성 관절염)과 류마티스 관절염이 있다. 골관절염은 노화, 관절에 생기는 상처나 감염 등이 원인이 되어 관절에 손상이 생기고, 그에 따라 염증이 발생하여 국소적인 퇴행성 변화가 나타나는 질환이다. 이에 반해 류마티스성 관절염은 관절 활막의 지속적인 염증 반응에 의해 점차 관절이 파괴되는 만성 염증성 전신 질환으로, 체내 면역체계의 오류에 의한 면역질환으로 이해되고 있다.

류마티스 관절염은 유전적-환경적 인자가 작용하여 전체 인구의 약 1~2%가 발병하며, 유전적 요인이 약 60% 정도 기여하고 흡연이나 치주염 등도 발병에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 류마티스 관절염은 수년 동안 지속되며 신체의 여러 관절을 침범하고, 결국에는 연골, 뼈, 힘줄, 인대 등에도 손상을 가져올 수 있다. 또한 관절 내 부위 또는 관절 주변 부위에만 영향을 미치는 다른 관절염들과는 달리, 피부, 혈관, 심장 등 관절 외 조직의 심각한 장기 손상으로 진행될 수 있다. 이와 같이 류마티스성 관절염과 골관절염은 원인부터 치료까지 상이한 질환이므로, 이를 잘 구별하고 정확히 진단하여 전신 증상으로 진행하기 전에 적절한 치료를 하는 것이 매우 중요하다. 그러나 류마티스 관절염은 초기 증상이 골관절염과 유사하여 조기 진단이 늦어지는 경우가 많다.

종래 기술에 의한 류마티스 관절염의 진단은 DAS28 점수(Disease Activity Score Calculator for Rheumatoid Arthritis)를 활용하는 방법과 류마티스 인자(RF), 항 CCP 항체(anti-CCP antibody), 적혈구 침강계수(ESR), CRP(c-reactive protein) 등을 종합하여 판단하는 방법이 사용된다.

DAS28 점수는 류마티스 관절염에서 가장 일반적으로 사용되는 질병 활성 평가 도구이다. ACR(American College of Rheumatology과 EULAR(European League Against Rheumatism)은 임상시험 및 임상 실습에서 DAS28점수의 사용을 공식적으로 권장하였다. DAS28 점수는 28개 관절에 대해 임상적으로 압통 관절의 수, 부종 관절의 수, 환자가 평가한 전반적 염증 활성도, 적혈구 침강 속도를 활용하여 계산한 점수이다. 복잡한 계산식을 가진 DAS28 점수에 비해 쉽게 평가할 수 있도록, 이의 변형으로 SDAI(Simplified Disease Activity Index) 또는 CDAI(Clinical Disease Activity Index)를 사용하기도 한다. 이들 방법은 평가에 사용된 변수에서 확인할 수 있듯이 DAS28 점수는 환자와 의료인의 감각에 의존하기 때문에 주관적인 판단이나, 경험, 개인차에 의해 동일한 병증의 환자에 대해서도 점수의 편차가 클 수 있어 객관적인 지표가 되기 어렵다.

류마티스 인자는 골관절염에서도 관측될 수 있으나 관측되더라도 그 수치가 낮으며, 염증을 시사하는 수치인 적혈구 침강계수나 CRP 등의 수치가 정상적인 범위에 있어 두 병을 감별할 수 있다. 그러나 염증 소견이 비교적 심한 경우에는 류마티스 관절염과 완전히 감별이 어렵다. 류마티스 관절염과 골관절염의 감별진단에 사용되는 혈청학적 진단검사는 이미 관절의 파괴가 상당히 진행된 후 진단이 내려지는 한계가 있다. 류마티스 관절염 인자는 류마티스 관절염 환자의 20% 정도에서 병의 진행과정 내내 음성을 나타내어 민감도에 문제가 있으며, 쇼그랜 증후군, 우육종증, B형 및 C형 간염, 결핵과 같은 다양한 염증 상태에서도 비특이적으로 검출되어 ESR, CRP와 마찬가지로 특이도가 낮다는 단점이 있다. 류마티스 인자의 위 양성율은 1~5% 사이이다. 항 CCP 항체는 시클릭 시트룰린화 펩티드에 대한 항체로 최근 류마티스 관절염의 진단 지표로 사용하기 시작하였으며, 진단의 민감도와 특이성이 류마티스인자에 비해 우수하다. 그러나 실제 모든 류마티스 관절염 환자에서 항 CCP 항체가 관측되는 것은 아니며, 통상 항 CCP 항체를 이용한 기존 키트에 사용되는 2차 항체인 항-마우스 항체는 검체 시료 내 마우스의 비특이적인 항체가 있는 경우 이들을 모두 인식하여 오차율이 크다는 문제가 있다.

임상적인 판단과 혈청학적 진단 검사를 보완하여 DAS28-CRP와 DAS28-ESR을 류마티스 관절염의 지표로 사용하기도 한다. 최근 연구에서는 이들 점수 사이에 높은 수준의 일치도가 보고되었으나, 높은 수준과 중간 수준의 질병 활동으로 분류하는 데에는 여전히 불일치가 보고되었다.

이에 등록특허 제10-1664964호(류마티스 관절염 진단용 바이오마커), 등록특허 제10-1614758호(류마티스관절염과 골관절염의 감별 진단을 위한 대사체), 공개특허 제10-2021-0055856호(류마티스 관절염의 판누스 진단용 바이오마커 및 이의 이용)를 비롯하여 류마티스 관절염의 조기 진단을 위한 연구들이 지속되고 있다.

APE1/Ref-1(Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1/redox factor-1)은 DNA의 손상 시 손상부위를 복구하는 엔도뉴클레아제 활성 및 AP-1, NF-kB와 같은 전사인자의 환원성 조절기능을 갖는 37 kDa 크기의 효소 단백질이다. 본 발명자들은 등록특허 제10-1300601호에서 APE1/Ref-1 단백질이 염증질환 및 패혈증의 진단에 사용될 수 있음을 보고한 바 있다. 그러나 동일한 염증성 질환인 골관절염과 류마티스 관절염을 구분하여 진단하고, 더 나아가 류마티스 관절염의 관해 여부를 평가하는 데 사용할 수 있다는 것은 아직까지 보고된 바 없다.

등록특허 제10-1664964호 등록특허 제10-1614758호 공개특허 제10-2021-0055856호 등록특허 제10-1300601호

본 발명은 류마티스 관절염을 골관절염과 감별하여 조기 진단하며, 활성 단계를 분석하여 객관적인 수치로 제공하는 것에 의해 효과적으로 치료할 수 있도록 이를 위한 정보를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 류마티스 관절염의 진단을 위한 조성물과 키트를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한 본 발명은 치료 중인 류마티스 관절염 환자의 예후를 예측하고, 관해 여부를 판단할 수 있는 정보를 제공하는 것을 목적으로 한다.

추가로 본 발명은 류마티스 관절염의 치료에 효과적인 약물을 스크리닝 하는 방법과, 더 나아가 개인화된 맞춤형 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 검사 대상자로부터 채취한 시료 중 APE1/Ref-1의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 골관절염에 대한 류마티스 관절염의 감별 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명에 대해 상세하게 설명한다. 다만 발명을 설명함에 있어서 발명과 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 발명의 요지를 오히려 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에 그 상세한 설명을 생략하기로 한다.

본 발명은 APE1/Ref-1이 류마티스 관절염을 골관절염에 대해 감별 진단할 수 있는 새로운 바이오마커로 사용될 수 있다는 것에 기반한 것이다. 본 발명에서 "감별 진단"이라 함은 단순히 류마티스 관절염을 골관절염으로부터 구분하여 진단하는 것에 그치지 않고, 류마티스 관절염의 활성 단계를 진단하는 것을 포함한다. APE1/Ref-1의 농도는 골관절염에 비해 류마티스 관절염 환자에서 채취한 시료에서 유의적으로 높았다. 91명을 대상으로 한 하기 실시예에서 활액에서 측정된 APE1/Ref-1의 농도는 컷오프 0.40 ng/㎖의 컷오프를 적용하였을 때 81%의 민감도와 83%의 특이도로 류마티스 관절염을 골관절염으로부터 감별하여 종래 다른 지표에 비해 우수한 민감도와 특이도를 나타내었다. 또한, 종래 DAS28-ESR 및 DAS28-CRP가 류마티스 관절염의 활성도에서 중간 수준과 높은 수준의 활성도를 진단하기 어려웠던 것에 비해 APE1/Ref-1은 질병 활성과 상관관계가 있음을 나타내었다. 실험 대상의 크기가 증가하면 보다 정확한 컷오프 설정이 가능해짐에 따라 민감도와 특이도 역시 더 증가할 수 있을 것으로 기대된다.

상기 생물학적 시료는 조직(tissue), 전혈, 혈청, 혈장, 활액을 포함한 체액, 소변, 세포, 세포 파쇄물 또는 세포 배양의 상등액일 수 있다. 하기 실시예에서는 혈청과 활액을 시료로 사용한 데이터만을 제시하였으나, 다른 시료 역시 감별 진단에 사용할 수 있음은 당연하다.

본 발명에서 APE1/Ref-1의 농도는 APE1/Ref-1 단백질 또는 APE1/Ref-1 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준에 의해 측정될 수 있으며, 단백질 또는 유전자의 발현 수준을 측정하기 위하여 당업계에서 사용되는 어떤 방법을 사용하여도 무방하다. 예를 들면, 상기 APE1/Ref-1 단백질의 발현 수준은 웨스턴블랏, 엘라이자(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay) 및 유세포분석(Flow cytometry) 등의 방법을 이용하여 측정할 수 있으며, 이에 한정되는 것이 아님은 당연하다. APE1/Ref-1 단백질을 암호화하는 유전자의 분석을 위해서는 종래기술에 의해 알려진 APE1/Ref-1 단백질을 암호화하는 유전자를 특이적으로 증폭시키는 프라이머나 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브를 사용할 수 있다. 유전자의 증폭을 위해서 종래 알려진 서열 이외에도 새로운 서열의 프라이머나 프로브를 디자인하는 것은 당업자에게 용이할 것이다. 유전자의 발현 수준은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, ChIP-Seq, ChIP-qPCR, ATAC-Seq, DNase-seq, FAIRE-seq 및 luciferase assay 등의 방법으로 측정할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또한 치료 중인 류마티스 관절염 환자로부터 채취한 시료 중 APE1/Ref-1의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염의 예후 예측 또는 관해 판단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다. 질병의 예후 예측은 질병이 시간이 지남에 따라 개선, 안정적 유지 또는 악화와 같은 경과나 결과를 예측하는 것으로, 본 발명에서 예후가 좋다는 것은 치료 효과가 좋아 관해에 도달할 것이 기대된다는 의미이다. 본 예후 예측 또는 관해 판단을 위한 정보 제공 방법에서 사용하는 시료나 APE1/Ref-1의 발현 수준 측정에 관한 사항은 상기 골관절염에 대한 류마티스 관절염의 감별 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 내용을 차용하여 동일하게, 혹은 적절하게 수정하여 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 APE1/Ref-1 단백질 또는 APE1/Ref-1 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 골관절염에 대한 류마티스 관절염의 감별 진단, 류마티스 관절염의 예후 예측 또는 류마티스 관절염의 관해 판단용, 조성물을 제공한다. 예를 들어 상기 APE1/Ref-1 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체, 펩타이드 또는 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 상기 APE1/Ref-1 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 APE1/Ref-1 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍 또는 프로브를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 APE1/Ref-1 단백질 또는 APE1/Ref-1 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 조성물을 포함하여 구성되는 골관절염에 대한 류마티스 관절염의 감별 진단, 류마티스 관절염의 예후 예측 또는 류마티스 관절염의 관해 판단용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 키트에는 APE1/Ref-1의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는 조성물 이외에도 분석 방법에 적합한 한 종류 이상의 다른 구성 성분을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트가 RT-PCR 키트라면, APE1/Ref-1 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍 이외에도 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드, Taq-폴리머라제, 역전사효소, DNase, RNase 억제제, 멸균수, 테스트 튜브 등을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 추가의 구성성분은 당업자라면 발현 수준을 측정하는 방법에 따라 적절하게 선택할 수 있을 것이다.

본 발명은 APE1/Ref-1의 발현이 류마티스 관절염 환자에게서 크게 증가하며, 활성단계와 발현 수준간에 유의한 상관 관계가 있으며, 관해 여부 판단에도 활용될 수 있다는 것에 기반한 것이다. 이는 APE1/Ref-1이 류마티스 관절염 치료에서 새로운 타겟으로 사용될 수 있음을 의미한다. 따라서 본 발명은 APE1/Ref-1을 이용한 류마티스 관절염 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 구체적으로는 예를 들면, (A) 류마티스 관절염 환자로부터 채취한 생체 시료에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (B) 후보 물질의 처리에 의한 시료 중 APE1/Ref-1의 발현 수준 변화를 측정하는 단계;를 포함하여 류마티스 관절염 치료제를 스크리닝할 수 있다. 상기 생체 시료로는 조직, 전혈, 혈청, 혈장, 활액을 포함한 체액, 소변, 세포, 세포 파쇄물 또는 세포 배양의 상등액 등을 사용할 수 있으며, 특히 혈청 또는 활액을 사용하는 것이 바람직하다.

류마티스 관절염을 치료하는 약물 요법으로는 비스테로이드 소염제, 호르몬의 일종인 스테로이드 제제와 같은 1차 약과, 인체의 면역체계에 영향을 주어 류마티스 관절염 자체를 억제하는 2차 약이 있다. 류마티스 관절염의 치료는 장기간의 약물 치료를 요하기 때문에, 그에 따른 부작용이 수반되는 것이 일반적이다. 따라서 각각의 환자에게 보다 우수한 효과를 나타낼 수 있는 맞춤형 치료제를 사용하여 치료한다면, 더욱 효과적일 수 있다. 이를 위하여 본 발명은 (A) 특정 류마티스 환자의 혈액 또는 활액 시료에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (B) 후보 물질의 처리에 의한 시료 중 APE1/Ref-1의 발현 수준 변화를 측정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 개인화된 맞춤형 류마티스 관절염 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 후보 물질은 류마티스 치료제에 사용되고 있는 약물 중 하나로, APE1/Ref-1의 발현을 더 효과적으로 낮출 수 있는 약을 개인화된 맞춤형 류마티스 관절염 치료제로 사용할 수 있다.

이상과 같이 본 발명에 의하면 APE1/Ref-1을 류마티스 관절염에 대한 새로운 바이오마커로 사용하여, 류마티스 관절염과 골관절염을 조기에 객관적인 수치로 감별하고, 활성 단계를 진단하며, 치료 과정 중 예후를 예측하고, 관해 여부를 판정할 수 있어 보다 효과적인 류마티스 관절염의 치료에 이용될 수 있다.

또한 본 발명은 류마티스 관절염 치료에 있어, APE1/Ref-1를 새로운 타겟으로 한 신약의 개발에 유용하게 이용될 수 있으며, 더 나아가 각각의 환자에게 개인화된 맞춤 치료제를 선별하여 치료에 사용하는 것에 의해 환자의 고통을 경감시키고 빠른 치료를 가능하게 할 수 있다.

도 1은 류마티스 관절염 환자와 골관절염 환자 및 대조군의 혈청과 활액에서 APE1/Ref-1의 농도 차이를 보여주는 그래프.
도 2는 APE1/Ref-1가 류마티스 관절염과 골관절염의 마커로 사용될 수 있음을 보여주는 그래프.
도 3은 APE1/Ref-1와 종래 류마티스 관절염 관련 지표의 피어슨 상관계수를 보여주는 그래프.
도 4는 류마티스 관절염의 관해군과 비관해군에서 APE1/Ref-1의 농도 차이를 보여주는 그래프.
도 5는 류마티스 관절염의 질병 활성도에 따른 APE1/Ref-1 농도 차이를 보여주는 그래프.

이하 첨부된 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 도면과 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다.

[실시예]

실시예 1 : 환자의 분류

본 연구 프로토콜은 충남대학교병원 기관심사위원회(2014-08-043)의 검토 및 승인을 받았으며 헬싱키 선언에 따라 수행되었다. 모든 피험자는 참여 전에 사전 서면 동의를 제공하였다.

충남대학교 병원을 방문한 91명의 환자를 대상으로 류마티스 관절염군(RA군)과 골관절염군(OA군)으로 분류하였다. 관절염 진단을 받지 않은 건강한 성인 30명을 대조군으로 하였다. 환자군 및 대조군에서 수집된 데이터는 연령, 성별, 체질량 지수(BMI), 환자 종합 평가(PtGA), 압통 관절 수(TJC), 부종 관절 수(SJC), C-반응성 단백질(CRP), 적혈구 침강 속도(ESR), 항고리 시트룰린화 펩티드 항체(ACPA), 류마티스 인자(RF) 및 현재 약물에 대한 것이다. 류마티스 관절염 환자의 질병 활성은 PtGA, TJC, SJC, ESR 및 CRP(DAS28-ESR/DAS28-CRP)를 사용한 DAS 28 점수를 사용하여 세분하여 평가하였다; 질병 활성도 낮음(DAS28 ≤ 3.2), 중간(3.2 < DAS28 ≤ 5.1), 높음(DAS28 > 5.1). 관해 기준은 DAS28 < 2.6을 적용하였다. 분류된 류마티스 관절염 환자는 1987년 ACR 분류 기준 또는 2010년 ACR/EULAR 분류 기준을 충족하였다.

분류 결과 91명의 환자 중 46명이 류마티스 관절염(RA), 45명이 골관절염 환자(OA)였으며, 류마티스 관절염 환자와 골관절염 환자 사이의 연령 또는 성별의 인구 통계학적 특성과 체질량지수(BMI)에는 통계적인 차이가 없었다. 12명의 환자가 연구 당시 류마티스 관절염으로 처음 진단되었으며, 9명의 환자가 관해를 달성하였다(DAS28 < 2.6). 환자의 임상적 특징은 하기 표 1과 같다.

실시예 2 : 혈청 및 활액에서 APE1/Ref-1의 정량

치료 과정동안 혈액 및 활액 시료를 진공 튜브로 흡입하였다. 45명의 골관절염 환자로부터 30개의 혈청 시료와 30개의 활액 시료(동일한 환자로부터는 16 쌍)를 얻었고, 46명의 류마티스 관절염 환자로부터 29개의 혈청 시료와 31개의 활액 시료(동일한 환자로부터는 13 쌍)를 얻었다. 대조군 혈청 시료는 30명의 건강한 피험자로부터 무작위로 선택하였다. 하기 실시예에서 샘플 크기는 임상 연구에서 통계 전문가의 예비 파일럿 연구와 추천에 의해 결정되었다. student t-test 또는 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 그룹 간의 APE1/Ref-1 수준을 비교하였으며, 임상적 특징과 APE1/Ref-1 수치의 상관관계는 Pearson의 상관분석으로 분석하였다. OA 및 RA의 검출 시 APE1/Ref-1의 민감도 및 특이성 계산은 ROC(Receiver operating characteristic) 곡선 분석을 사용하였다. 데이터는 Windows용 SPSS(IBM SPSS Statistics) 버전 20.0(SPSS Inc., Chicago, IL)으로 분석하였다.

각 혈청 및 활액 시료에서 APE1/Ref-1의 농도는 인간 APE1/Ref-1 ELISA 키트(Mediredox, Daejeon, Korea)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 정량적으로 분석하였다. 구체적으로 혈청 시료, 활액 시료 또는 표준물질을 각각 포획 항체가 있는 코팅된 96-웰 마이크로플레이트에 첨가하고, 희석제를 블랭크에 첨가하였다. 흡광도는 자동 마이크로플레이트 판독기(Glomax, Promega, Madison, Wisconsin, USA)를 사용하여 450 nm에서 측정하였다. 각 시료의 흡광도는 반복 측정하고 평균값을 결정하였다. 재조합 인간 APE1/Ref-1 단백질(rhAPE1/Ref-1, MediRedox, 대전, 한국)을 사용하여 얻어진 표준 곡선으로부터 시료 내 APE1/Ref-1 단백질의 농도를 계산하고 그 결과를 도 1에 도시하였다. 도 1의 a와 b는 각각 각 실험군의 혈청 및 활액 시료에서 APE1/Ref-1 단백질의 농도를 나타낸 그래프이다. 도 1의 a에서 대조군과 OA군의 혈청 내 APE1/Ref-1의 농도는 통계적으로 유의한 차이가 없었으며 (0.19 ± 0.14 ng/㎖ vs 0.19 ± 0.11 ng/㎖), 혈청 내 APE1/Ref-1의 농도는 RA군에서 대조군 및 OA군에 비해 유의하게 증가하였다(0.44 ± 0.39 ng/㎖ vs 0.19 ± 0.14 ng/㎖, p <0.001 vs 0.19 ± 0.11 ng/㎖, p<0.001). 활액에서 역시 RA군은 OA군보다 유의하게 더 높은 APE1/Ref-1 수준을 나타내었다(0.68 ± 0.31 ng/㎖ vs 0.31 ± 0.12 ng/㎖, p<0.001) (도 1의 b).

도 2는 RA군과 OA군의 시료에서 APE1/Ref-1 검출에 대한 특이도와 민감도를 나타낸 그래프이다. OA군 및 RA군의 혈청 시료에서 얻은 ROC 곡선은 곡선 아래 면적(AUC)이 0.73(95% 신뢰 구간, 0.591~0.864)이었다. 이를 기반으로 0.24 ng/㎖(혈청)의 컷오프 값을 사용하면, 65%의 민감도와 67%의 특이도가 민감도와 특이도의 최적 조합으로 도출되었다 (도 2의 a). 또한 대조군과 RA군의 혈청 샘플에서 ROC 곡선을 분석한 결과, AUC는 0.74(95% 신뢰 구간, 0.608~0.867)였으며, 0.232 ng/㎖의 컷오프, 66%의 민감도, 70%의 특이도 조합이 도출되었다(도 2의 a). OA 및 RA 환자의 활액 시료에서 얻은 ROC 곡선은 AUC가 0.92(95% 신뢰 구간, 0.847~0.983)로, 0.40 ng/㎖의 컷오프, 민감도 81% 및 특이도 83%의 최적 조합을 얻었다(도 2의 b).

APE1/Ref-1의 농도와 종래 지표의 관련성을 확인하기 위하여 APE1/Ref-1과 ESR, CRP, DAS28-ESR, DAS28-CRP의 상관관계 분석을 수행하고 그 결과를 도 3에 도시하였다. 하기 표 2는 각 지표들과 APE1/Ref-1의 활액 농도간의 피어슨 상관계수 및 유의성을 나타낸 것이다. 도 3과 표 2에서 확인할 수 있듯이 APE1/Ref-1의 활액 내 농도는 종래의 지표들과 상관관계를 나타내었다. 특히, 활액에서 APE1/Ref-1농도와 DAS28-CRP의 상관계수가 높았다.

APE1/Ref-1가 류마티스 관절염의 관해를 판정하는 마커로 사용될 수 있는 지 확인하기 위하여 관해 그룹 (DAS28 < 2.6, n=6)과 비관해 그룹(DAS28 > 2.6, n=25)에서 혈청 및 활액 중 APE1/Ref-1의 수준을 평가하였다. 도 4에 도시한 바와 같이, 관해군에서 APE1/Ref-1의 혈청 및 활액 내 농도는 비관해군(DAS28 > 2.6)보다 유의하게 낮았다(혈청 : 관해군 0.15 ± 0.13 ng/㎖ vs 비관해군 0.51 ± 0.40 ng/㎖, p=0.001; 활액 : APE1/Ref-1: 관해군 0.41 ± 0.12 ng/㎖ vs 비관해군 0.75 ± 0.30 ng/㎖, p<0.001). 이로부터 혈청 또는 활액 내 APE1/Ref-1 농도를 관해 여부 판단의 마커로 사용할 수 있음을 확인할 수 있다.

류마티스 관절염 환자의 질병 활성도에 따라 환자군을 낮음(DAS28-CRP ≤3.2), 중간(3.2 < DAS28-CRP ≤ 5.1), 높음(DAS28-CRP > 5.1) 범주로 분류하고, 혈청과 활액에서 APE1/Ref-1의 농도를 비교하였다. 혈청 농도와 질병 활성 범주 간에는 유의한 상관관계가 확인되지 않았으나(데이터 미도시), 활액에서의 APE1/Ref-1의 농도는 낮은 질병 활성 그룹보다 높은 질병 활성 그룹에서 더 유의하게 증가하였다(도 5).

Claims

검사 대상자로부터 채취한 시료 중 APE1/Ref-1의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 골관절염에 대한 류마티스 관절염의 감별 진단을 위한 정보 제공 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 감별 진단은 류마티스 관절염의 활성 단계에 대한 진단을 포함하는 것을 특징으로 하는 골관절염에 대한 류마티스 관절염의 감별 진단을 위한 정보 제공 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 시료는 혈액 또는 활액인 것을 특징으로 하는 골관절염에 대한 류마티스 관절염의 감별 진단을 위한 정보 제공 방법.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
APE1/Ref-1의 농도는 APE1/Ref-1 단백질 또는 APE1/Ref-1 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 골관절염에 대한 류마티스 관절염의 감별 진단을 위한 정보 제공 방법.
청구항 4에 있어서,
단백질 발현 수준의 측정은 웨스턴 블랏, 엘라이자, 방사선면역분석, 방사 면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법 및 유세포분석으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 골관절염에 대한 류마티스 관절염의 감별 진단을 위한 정보 제공 방법.
청구항 4에 있어서,
상기 유전자 발현 수준의 측정은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, ChIP-Seq, ChIP-qPCR, ATAC-Seq, DNase-seq, FAIRE-seq 및 luciferase assay로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 골관절염에 대한 류마티스 관절염의 감별 진단을 위한 정보 제공 방법.
치료 중인 류마티스 관절염 환자로부터 채취한 시료 중 APE1/Ref-1의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염의 예후 예측 또는 관해 판단을 위한 정보 제공 방법.
APE1/Ref-1 단백질 또는 APE1/Ref-1 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 골관절염에 대한 류마티스 관절염의 감별 진단, 류마티스 관절염의 예후 예측 또는 류마티스 관절염의 관해 판단용, 조성물.
청구항 8에 있어서,
단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체, 펩타이드 또는 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 8에 있어서,
상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 APE1/Ref-1 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍 또는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 8 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 의한 조성물을 포함하는 골관절염에 대한 류마티스 관절염의 감별진단, 류마티스 관절염의 예후 예측 또는 관해 판단용 키트.
(A) 류마티스 관절염 환자로부터 채취한 생체 시료에 후보 물질을 처리하는 단계; 및
(B) 후보 물질의 처리에 의한 시료 중 APE1/Ref-1의 발현 수준 변화를 측정하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 치료제의 스크리닝 방법.
(A) 특정 류마티스 환자의 혈액 또는 활액 시료에 후보 물질을 처리하는 단계; 및
(B) 후보 물질의 처리에 의한 시료 중 APE1/Ref-1의 발현 수준 변화를 측정하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 개인화된 맞춤형 류마티스 관절염 치료제의 스크리닝 방법.