KR101614758B1

KR101614758B1 - 류마티스관절염과 골관절염의 감별 진단을 위한 대사체

Info

Publication number: KR101614758B1
Application number: KR1020140086128A
Authority: KR
Inventors: 정병화; 이수현; 주지현
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2014-07-09
Filing date: 2014-07-09
Publication date: 2016-04-22
Also published as: KR20160006484A

Abstract

본 발명은 류마티스 관절염 환자와 골관절염 환자를 감별진단할 수 있는 관절액 유래 대사체 및 이를 이용한 감별진단을 위한 정보 제공 방법에 대한 것이다. 상기 방법은 구체적으로 측정한 2 이상의 대사체들의 함량비율을 도출하는 단계를 더 포함함으로써 간편하면서도 정확한 감별진단을 위한 정보를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 류마티스 관절염 환자와 골관절염 환자를 감별진단할 수 있는 관절액 유래 대사체의 함량 측정부를 포함하는 감별진단용 키트를 제공하고자 한다.

Description

류마티스관절염과 골관절염의 감별 진단을 위한 대사체{Metabolites for differential diagnosis of rheumatoid arthritis and degenerative arthritis}

본 명세서에 기재된 내용은 류마티스관절염과 골관절염을 감별진단하는데 활용가능한 관절액 유래 대사체에 관한 것이다.

"류마티스관절염(RO)"과 "골관절염(OA)"은 관절염으로 통칭되는 대표적인 관절 질환으로, 발병 원인과 증상, 치료법에서 차이가 있기 때문에 분명한 구분이 필요하다. 류마티스관절염은 관절의 염증과 통증을 보이는 대표적인 전신성 만성 자가면역질환으로 관절내 활막 조직의 염증을 시작으로 주변의 연골, 뼈 등의 모든 관절 구조를 손상시켜 변형과 장애를 유발한다. 관절 이외 타 장기도 침범하여 류마티스결절, 심막염, 폐섬유화, 신경염 등 관절 외 증상을 초래할 수 있다. 골관절염은 관절의 연골과 주위골에 퇴행 변화가 나타나서 생기는 관절염으로, 치료를 하지 않으면 관절의 변형까지 초래한다.

류마티스관절염의 진단은 임상적인 증상과 류마티스인자(rheumatoid factor; RF) 또는 항 CCP항체(Anti-CCP antibody)와 같은 자가항체, 염증 마커인 적혈구침강계수(Erythrocyte sedimentation rate; ESR), C-반응성 단백질(C-reactive protein; CRP) 등을 종합하여 판단한다. 골관절염도 마찬가지로 초기진단 시에는 류마티스 관절염과 동일한 검사를 시행하고 종합적으로 평가해 진단을 내리게 된다. 혈청 검사상 류마티스 인자는 골관절염에서도 나타날 수 있으나, 나타나더라도 그 수치가 낮으며, 염증을 시사하는 수치인 적혈구침강계수(Erythrocyte sedimentation rate; ESR), C-반응성 단백질(C-reactive protein; CRP) 등의 수치가 정상범위에 있어 두 병을 감별할 수 있다. 하지만 염증 소견이 비교적 심한 경우에는 류마티스 관절염과 완전히 감별이 어렵다.

류마티스관절염와 골관절염의 감별진단에 사용되는 혈청학적 진단검사는 이미 관절의 파괴가 상당히 진행된 후 진단이 내려지게 되는 한계가 있다. 류마티스 인자(Rheumatoid factor; RF)는 류마티스 관절염의 전통적인 혈청학적 표지자로서 국제적 진단 기준인 미국류마티스학회(American College of Rheumatology, ACR)의 진단기준에 포함되어 있기는 하나, 류마티스 관절염 환자의 20%에서 병의 진행과정 내내 음성을 보여 민감도에 문제가 있으며, 다른 류마티스 질환이나 만성 염증, 악성종양, 심지어 일부 건강한 노인에게도 나타나 특이도가 낮다는 단점이 있다.

최근에는 시클릭 시트룰린화 펩티드에 대한 항체(항-CCP 항체)를 류마티스관절염 진단 지표로 사용하기 시작하였는데 진단의 민감도와 특이성이 류마티스인자에 비해 우수해 진단에 많은 도움을 주고 있다. 상기 시클릭 시트룰린화 펩티드에 대한 항체(항-CCP 항체)를 이용한 류마티스관절염 진단은 예를 들어, Schellekens et al.,Arthritis Rheum., 43:155-163 (2000); DiFranco et al., Rev. Rheum. Engl. Ed., 66(5):251-255 (1999); Rantapaa-Dahlqvist et al., Arthritis Rheum., 48:2741-2749 (2003); Li et al., Bioinformatics 22(12):1503-1507 (2006); Russell et al., J. Rheumatol., 33(7):1240-1242 (2006); Ota, Rinsho byori.Jap. J. Clin. Pathol., 54(8)861-868 (2006); 및 Avouac et al., Ann. Rheum. Dis., 65(7):845-851 (2006)에서 확인할 수 있으며, 상기 문헌들은 그 전체가 본 명세서에 참고로서 통합된다. 하지만 실제로 모든 류마티스관절염 환자들에게서 이들 항체가 발견되지는 않는다. 또한, 항-CCP 항체를 이용한 기존의 키트에 사용되는 2차 항체는 통상적으로 마우스의 항체를 인식하는 항-마우스 항체인데, 검체 시료 내 마우스의 비특이적인 항체가 있을 경우 이들을 모두 인식함으로써 오차율 (positive false)이 커지는 문제점이 있다. 그 이외에 급성 반응성 물질인 CRP (C-reactive protein), ESR (erythrocyte sedimentation rate) 등이 활동성 관절염 시 증가되어 질환활성도를 예측할 때 활용하고 있으나 이들은 질환 특이적이지는 않다는 한계가 있다.

Madsen RK, Lundstedt T, Gabrielsson J, Sennbro CJ, Alenius GM, Moritz T, Rantapaa-Dahlqvist S, Trygg J. Diagnostic properties of metabolic perturbations in rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther. 2011, 13(1):R19. Hugle T, Kovacs H, Heijnen IA, Daikeler T, Baisch U, Hicks JM, Valderrabano V. Synovial fluid metabolomics in different forms of arthritis assessed by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Clin Exp Rheumatol 2012, 30(2):240-245. Giera M, Ioan-Facsinay A, Toes R, Gao F, Dalli J, Deelder AM, Serhan CN, Mayboroda OA. Lipid and lipid mediator profiling of human synovial fluid in rheumatoid arthritis patients by means of LC-MS/MS. Biochim Biophys Acta. 2012, 1821(11):1415-24. Jonasdottir HS, Nicolardi S, Jonker W, Derks R, Palmblad M, Ioan-Facsinay A, Toes R, van der Burgt YE, Deelder AM, Mayboroda OA, Giera M. Detection and structural elucidation of esterified oxylipids in human synovial fluid by electrospray ionization-fourier transform ion-cyclotron mass spectrometry and liquid chromatography-ion trap-MS(3): detection of esterified hydroxylated docosapentaenoic acid containing phospholipids. Anal Chem. 2013, 85(12):6003-10. Schellekens et al., Arthritis Rheum., 43:155-163 (2000) DiFranco et al., Rev. Rheum. Engl. Ed., 66(5):251-255 (1999) Rantapaa-Dahlqvist et al., Arthritis Rheum., 48:2741-2749 (2003) Li et al., Bioinformatics 22(12):1503-1507 (2006) Russell et al., J. Rheumatol., 33(7):1240-1242 (2006) Ota, Rinsho byori.Jap. J. Clin. Pathol., 54(8)861-868 (2006) Avouac et al., Ann. Rheum. Dis., 65(7):845-851 (2006) Lai, L., et al., Methodological considerations in the development of HPLC-MS methods for the analysis of rodent plasma for metabonomic studies. Molecular bioSystems, 2010. 6(1): p. 108-20

본 발명은 류마티스 관절염 환자와 골관절염 환자의 관절액에 대한 대사체 분석을 진행하고 비교 분석하여 류마티스 관절염과 골관절염을 감별할 수 있는 대사체를 선정하고, 이를 류마티스 관절염과 골관절염의 감별진단에 활용할 수 있는 방법 및 이를 이용한 감별진단용 키트를 제공하고자 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 구현예들은 대상자로부터 채취한 관절액에서 N6,N6,N6-트리메틸-L-라이신(N6,N6,N6-Trimethyl-L-lysine), 5-L-글루타밀-타우린(5-L-Glutamyl-taurine), L-카르니틴(L-Carnitine), 3-히드록시만델릭 애씨드(3-Hydroxymandelic acid), 타우린(Taruine), (S)-우레이도글리콜릭 애씨드((S)-Ureidoglycolic acid), 메틸구아닌(Methylguanine), 키누레닌(Kynurenine), 인돌레락틱 애씨드(Indolelactic acid), 인돌레아세트알데히드(Indoleacetaldehyde), N'-포밀키누레닌(N'-Formylkynurenine), 페닐락틱 애씨드(Phenylactic acid), 13,14-디히드로-리폭신 A4(13,14-Dihydro-lipoxin A4), 12,20-디옥소-류코트리엔 B4 (12,20-Dioxo-leukotriene B4), 11베타-히드록시-3,20-디옥소프렌-4-엔-21-오익 애씨드(11beta-Hydroxy-3,20-dioxopregn-4-en-21-oic acid), 라이소PC(lysophosphatidylcholine)(18:1), CE(24:1(15Z)), 트리메틸트리데카노익 애씨드(Trimethyltridecanoic acid), 도코사펜타데노익 애씨드(Docosapentaenoic acid), 갈락토실세라마이드(Galactosylceramide)(d18:1/16:0) 및 글루코실세라마이드(Glucosylceramide)(d18:1/16:0) 중 하나 이상의 대사체의 함량을 측정하는 단계를 포함하는 골관절염 및 류마티스관절염을 감별하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 구현예들은 관절액에 포함된 N6,N6,N6-트리메틸-L-라이신(N6,N6,N6-Trimethyl-L-lysine), 5-L-글루타밀-타우린(5-L-Glutamyl-taurine), L-카르니틴(L-Carnitine), 3-히드록시만델릭 애씨드(3-Hydroxymandelic acid), 타우린(Taruine), (S)-우레이도글리콜릭 애씨드((S)-Ureidoglycolic acid), 메틸구아닌(Methylguanine), 키누레닌(Kynurenine), 인돌레락틱 애씨드(Indolelactic acid), 인돌레아세트알데히드(Indoleacetaldehyde), N'-포밀키누레닌(N'-Formylkynurenine), 페닐락틱 애씨드(Phenylactic acid), 13,14-디히드로-리폭신 A4(13,14-Dihydro-lipoxin A4), 12,20-디옥소-류코트리엔 B4 (12,20-Dioxo-leukotriene B4), 11베타-히드록시-3,20-디옥소프렌-4-엔-21-오익 애씨드(11beta-Hydroxy-3,20-dioxopregn-4-en-21-oic acid), 라이소PC(lysophosphatidylcholine)(18:1), CE(24:1(15Z)), 트리메틸트리데카노익 애씨드(Trimethyltridecanoic acid), 도코사펜타데노익 애씨드(Docosapentaenoic acid), 갈락토실세라마이드(Galactosylceramide)(d18:1/16:0) 및 글루코실세라마이드(Glucosylceramide)(d18:1/16:0) 중 하나 이상의 대사체의 함량을 측정하는 대사체 측정부를 포함하는 골관절염 및 류마티스관절염 감별진단용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 관절액 유래 대사체를 이용하면 관절액내 대사체의 함량의 분석만으로 류마티스관절염과 골관절염을 간편하고 정확하게 감별진단할 수 있고, 대사체 기반 진단기술 개발에 활용이 가능하다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에서 분석법의 재현성 확인을 위하여 모든 QC 표본과 시료들의 피크변동값에 대해서 주성분 분석(principal component analysis; PCA)를 실시하여 작성한 그래프(score plot)이다. a는 포지티브 이온화 모드의 결과이며, b는 네가티브 이온화 모드의 결과이다. 초록색으로 표시된 것이 QC 표본이다. x축은 가장 중요한 주성분의 변동값을, y축은 두번째로 중요한 주성분의 변동값을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 얻어진 시료들의 피크 변동값에 대해서 직교부분최소자승판별 분석(OPLS-DA)를 실시하여 작성한 그래프(score plot)이다. A는 포지티브 이온화 모드의 결과이며, b는 네가티브이온화 모드의 결과이다. 빨간색 삼각형은 류마티스 관절염 환자군을 파란색 사각형은 골관절염환자군을 나타낸다. x축은 가장 중요한 주성분의 변동값을, y축은 두번째로 중요한 주성분의 변동값을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에 따른 직교부분최소자승판별 분석에서 류마티스 관절염과 골관절염에서 현저한 차이를 보이고 있는 관절액에 포함된 대사체를 나타내는 VIP (Variable importance plot) 차트이다.
도 4는 5-L-글루타밀-타우린과 13,14-디히드로-리폭신 A4의 함량비(5-L-글루타밀-타우린)/(13,14-디히드로-리폭신 A4)의 ROC 커브(receiver operating characteristic curve)를 확인한 것이다. a는 대사체 비율에 대한 점 히스토그램으로 절단값(cutoff value), 민감도(sensitivity), 특이도(specificity)을 포함하며, b는 ROC 커브의 AUC(area under curve)를 표시한다. 또한, OA는 골관절염 환자군, RA는 류마티스관절염 환자군을 의미한다.
도 5는 N6,N6,N6-트리메틸-L-라이신과 도코사펜타데노익 애씨드의 함량비(N6,N6,N6-트리메틸-L-라이신)/(도코사펜타데노익 애씨드)의 ROC 커브(receiver operating characteristic curve)를 확인한 것이다. a는 대사체 비율에 대한 점 히스토그램으로 절단값(cutoff value), 민감도(sensitivity), 특이도(specificity)을 포함하며, b는 ROC 커브의 AUC(area under curve)를 표시한다. 또한, OA는 골관절염 환자군, RA는 류마티스관절염 환자군을 의미한다.

본 명세서에서 "감별진단(differential diagnosis)"이라 함은, 증세가 유사한 특징이 있는 질병을 비교·검토하여 초진 때의 병명을 확인하는 진단을 의미하는 것으로, 구체적으로 증상, 검사 결과 등 환자에 대해서 얻은 모든 정보를 기초로 해서 거기에서 도출되는 질환 가운데에서 비교, 감별함으로써 가장 합리적으로 그 본태를 설명할 수 있는 질환을 감별하는 것을 의미한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 구현예들은 대상자로부터 채취한 관절액에서 N6,N6,N6-트리메틸-L-라이신(N6,N6,N6-Trimethyl-L-lysine), 5-L-글루타밀-타우린(5-L-Glutamyl-taurine), L-카르니틴(L-Carnitine), 3-히드록시만델릭 애씨드(3-Hydroxymandelic acid), 타우린(Taruine), (S)-우레이도글리콜릭 애씨드((S)-Ureidoglycolic acid), 메틸구아닌(Methylguanine), 키누레닌(Kynurenine), 인돌레락틱 애씨드(Indolelactic acid), 인돌레아세트알데히드(Indoleacetaldehyde), N'-포밀키누레닌(N'-Formylkynurenine), 페닐락틱 애씨드(Phenylactic acid), 13,14-디히드로-리폭신 A4(13,14-Dihydro-lipoxin A4), 12,20-디옥소-류코트리엔 B4 (12,20-Dioxo-leukotriene B4), 11베타-히드록시-3,20-디옥소프렌-4-엔-21-오익 애씨드(11beta-Hydroxy-3,20-dioxopregn-4-en-21-oic acid), 라이소PC(lysophosphatidylcholine)(18:1), CE(24:1(15Z)), 트리메틸트리데카노익 애씨드(Trimethyltridecanoic acid), 도코사펜타데노익 애씨드(Docosapentaenoic acid), 갈락토실세라마이드(Galactosylceramide)(d18:1/16:0) 및 글루코실세라마이드(Glucosylceramide)(d18:1/16:0) 중 하나 이상의 대사체의 함량을 측정하는 단계를 포함하는 골관절염 및 류마티스관절염을 감별하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

대사체학 연구는 생리기능 유지에 필수적인 다양한 대사경로의 산물인 대사체의 농도변화를 추적하여 생리기능의 변화를 예측하는데 활용된다. 상기 대사체학 연구에 따른 선행연구들은 주로 류마티스 환자들의 혈액 또는 뇨를 대상으로 대사체 분석을 진행하여 정상인과의 차별성을 보이는 대사체 프로파일을 보고하여 왔다. 그러나 본 발명의 구현예들은 관절액을 대상으로 대사체를 분석하며, 관절액은 활막 및 관절 연골과 직접 접해 있기 때문에 관절에서의 생리학적 병리학적 변화를 가장 잘 반영하는 체액이다. 따라서 본 발명은 류마티스 관절염과 골관절염 환자의 관절액에 대한 대사체 분석을 수행함으로써 관절내 병리학적 변화에 따른 특이적인 대사체 프로파일을 제시할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로서 관절액 유래 대사체의 함량은 질량분석기를 사용하여 측정할 수 있으며, 구체적으로는 초고속 액체크로마토그피와 연결된 질량분석기를 이용하여 함량을 측정하고 대사체 프로파일 분석을 수행할 수 있다.

본 발명의 구현예들에 따른 상기 18가지 관절액 유래 대사체는 류마티스관절염 환자 및 골관절염 환자의 관절액에서 서로 상이한 함량으로 포함됨으로써 상기 대사체들의 함량을 측정하여 류마티스관절염과 골관절염을 감별진단할 수 있다. 상기 본 발명의 구현예들에 따른 대사체들은 기존의 류마티스 관절염 혈청학적 진단지표로 이용하고 있는 류마티스 인자, 항-CCP 항체(anti-citrullinated cyclic peptide), 적혈구 침강계수, C-반응성 단백질 등의 혈액 중 농도와의 유의적인 상관관계를 갖는다. 또한, 본 발명의 구현예들에 따른 상기 대사체들 사이에서도 서로 유의미한 상관관계를 나타낸다. 이에 상기 본 발명의 일 구현예에 따른 방법은 상기 대사체의 함량을 측정하는 단계 이후 상기 관절액 내 대사체 중 2 이상의 대사체들의 함량비율을 도출하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로서 상기 측정된 관절액내 대사체 중 2 이상의 대사체들의 함량비율을 도출하는 단계는 상기 측정된 대사체 중 13,14-디히드로-리폭신 A4에 대한 5-L-글루타밀-타우린의 함량비가 0.81 초과이면 관절염 중 류마티스관절염 질환이 있고, 0.81 미만이면 관절염 중 골관절염 질환이 있다고 진단하는 단계를 포함할 수 있다. 타우린 대사체인 상기 5-L-글루타밀-타우린과 아라키돈산 대사체인 13,14-디히드로-리폭신 A4는 두 질환군에서 모두 항-CCP 항체와 유의적인 상관관계를 보이며, 류마티스 관절염 환자군에서는 음의 상관관계를 골관절염에서는 양의 상관관계를 보인다. 두 대사체의 측정된 함량비 (5-L-글루타밀-타우린)/(13,14-디히드로-리폭신 A4)는 류마티스관절염 환자군에서는 1.34± 0.31, 골관절염 환자군에서는 0.69± 0.15를 나타내며, 상기 값은 변동계수(%Coefficient of variability; %CV) 25% 이하의 정밀성을 갖는다. 또한, 상기 두 대사체의 비율을 이용한 류마티스 관절염과 골관절염의 감별진단의 효율성을 판단하기 위한 ROC(Receiver-Operating Characteristic) 곡선의 AUC 수치는 0.98이다.

본 발명의 다른 일 구현예로서 상기 측정된 관절액내 대사체 중 2 이상의 대사체들의 함량비율을 도출하는 단계는 상기 측정된 대사체 중 도코사펜타데노익 애씨드에 대한 N6,N6,N6-트리메틸-L-라이신의 함량비가 0.17 미만이면 관절염 중 류마티스관절염 질환이 있고, 0.17 초과이면 관절염 중 골관절염 질환이 있다고 진단하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 도코사펜타데노익 애씨드 및 N6,N6,N6-트리메틸-L-라이신은 류마티스관절염 질환 및 골관절염 질환군에서 모두 항-CCP 항체와 유의적인 상관관계를 보이며, 류마티스 관절염 환자군에서는 음의 상관관계를 골관절염에서는 양의 상관관계를 보인다. 두 대사체의 측정된 함량비 (N6,N6,N6-트리메틸-L-라이신)/(도코사펜타데노익 애씨드)는 류마티스관절염 환자군에서는 0.19±0.02, 골관절염 환자군에서는 0.38±0.05를 나타내며, 상기 값은 변동계수(%Coefficient of variability; %CV) 28% 이하의 정밀성을 갖는다. 또한, 상기 두 대사체의 비율을 이용한 류마티스 관절염과 골관절염의 감별진단의 효율성을 판단하기 위한 ROC(Receiver-Operating Characteristic) 곡선의 AUC 수치는 0.84이다.

또한, 본 발명의 구현예들은 관절액에 포함된 N6,N6,N6-트리메틸-L-라이신(N6,N6,N6-Trimethyl-L-lysine), 5-L-글루타밀-타우린(5-L-Glutamyl-taurine), L-카르니틴(L-Carnitine), 3-히드록시만델릭 애씨드(3-Hydroxymandelic acid), 타우린(Taruine), (S)-우레이도글리콜릭 애씨드((S)-Ureidoglycolic acid), 메틸구아닌(Methylguanine), 키누레닌(Kynurenine), 인돌레락틱 애씨드(Indolelactic acid), 인돌레아세트알데히드(Indoleacetaldehyde), N'-포밀키누레닌(N'-Formylkynurenine), 13,14-디히드로-리폭신 A4(13,14-Dihydro-lipoxin A4), 11베타-히드록시-3,20-디옥소프렌-4-엔-21-오익 애씨드(11beta-Hydroxy-3,20-dioxopregn-4-en-21-oic acid), 라이소PC(lysophosphatidylcholine)(18:1), CE(24:1(15Z)), 트리메틸트리데카노익 애씨드(Trimethyltridecanoic acid), 도코사펜타데노익 애씨드(Docosapentaenoic acid) 및 글루코실세라마이드(Glucosylceramide)(d18:1/16:0) 중 하나 이상의 대사체의 함량을 측정하는 대사체 측정부를 포함하는 골관절염 및 류마티스관절염 감별진단용 키트를 제공한다. 이때, 골관절염 환자군 및 류마티스관절염 환자군의 관절액은 본 발명의 구현예들에 따른 상기 대사체를 서로 다른 함량으로 포함하므로, 상기 대사체의 함량을 측정함으로써 골관절염과 류마티스관절염을 감별진단할 수 있다.

본 발명의 구현예들에 따른 상기 키트는 골관절염 및 류마티스관절염의 감별방법을 포함하는 지시서를 포함할 수 있다. 예를 들면 상기 지시서는 상기 측정된 대사체 중 13,14-디히드로-리폭신 A4에 대한 5-L-글루타밀-타우린의 함량비가 0.81 초과이면 관절염 중 류마티스관절염 질환이 있고, 0.81 미만이면 관절염 중 골관절염 질환이 있다고 진단하는 감별방법을 포함할 수 있다. 또한, 상기 측정된 대사체 중 도코사펜타데노익 애씨드에 대한 N6,N6,N6-트리메틸-L-라이신의 함량비가 0.17 미만이면 관절염 중 류마티스관절염 질환이 있고, 0.17 초과이면 관절염 중 골관절염 질환이 있다고 진단하는 감별방법을 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예를 통하여 설명한다. 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 하기의 실시예의 범위로 제한되는 것은 아니다.

또한, 이 기술분야의 통상의 지식을 가진 자이면 누구나 이 발명의 기술 사상의 범주를 이탈하지 않고 첨부한 특허청구범위 내에서 다양한 변형 및 모방이 가능함은 명백한 사실이다.

[실시예 1]

본 발명의 구현예들에 따른 골관절염 및 류마티스관절염의 감별진단을 위한 대사체들을 하기의 방법으로 선별하였다.

실험대상 및 표본 기기분석

1) 실험대상 환자와 환자 정보

류마티스 관절염 및 골관절염 환자들은 대한민국 서울에 소재한 서울성모병원에서 모집하였다. 류마티스 관절염 환자군은 성인여성 10명을 포함하고, 골관절염 환자군은 성인여성 10명을 포함하였다. 류마티스 관절염은 미국 류마티스 학회의 1987년 개정기준을 적용하여 진단하였으며, 골관절염은 임상적 진단 기준과 방사선 검사 소견을 적용하여 진단하였다. 인구학적 검사 항목(demographic data)에는 나이, 질병(disease duration), 정밀체성분분석, 당뇨병력 등을 포함하였다. 이화학적 검사항목에는 적혈구침감계수(ESR), C-반응 단백질(CRP) 류마티스 지수(RF), 항-CCP 항체(anti-citrullinated cyclic peptide) 등이 포함하였다. 또한 관절액 내 백혈구 수치를 포함하였다. 혈청 지질성분으로는 총콜레스테롤, 중성지방, 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL-cholesterol) 등을 측정하였다. 단순 전후면 X레이(plain anteroposterior X-ray)를 진행하여 관절 파괴정도를 관찰하여 K-L 등급(Kellgren-Lawrence Grading Scale)으로 표시하였다. 구체적인 검사 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

상기 표 1를 참조하면, 이화학적 검사 항목 중 적혈구침강계수, C-반응성 단백질, 류마티스 지수, 항 CCP 항체 등의 수치가 류마티스 관절염 환자군과 골관절염 환자군에서 명확한 차이를 보임을 확인할 수 있었다. 이들은 현재 임상에서 사용하는 있는 류마티스 관절염 진단지표로써 류마티스 관절염과 골관절염 환자군 사이에 명확한 임상적인 구분이 있음을 의미한다.

2) 관절액 표본의 수집과 전처리

실험참가자로부터 관절액을 얻은 후, 총 백혈구수를 측정하였고 사용 이전까지 -70℃에 보관하였다.

관절액 대사체 분석을 위한 표본의 전처리 방법은 혈액 대사체 분석을 위한 표본의 전처리 방법을 변형한 메탄올 침전법를 사용하였으며, 상기 메탄올 침전법은 Lai, L., et al., Methodological considerations in the development of HPLC -MS methods for the analysis of rodent plasma for metabonomic studies . Molecular bioSystems, 2010. 6(1): p. 108-20.에서 확인할 수 있으며, 상기 문헌들은 그 전체가 본 명세서에 참고로서 통합된다. 이에 따라 상기 관절액 대사체 분석을 위한 표본의 전처리는 상온에서 녹인 관절액 표본에 3배 부피의 차가운 메탄올(ice-cold methanol)을 첨가하고 수분동안 완전히 섞어 준 후 원심분리를 시행하고 상층액 일정량을 수집한 다음, 동량 부피의 멸균수로 희석하여 -20℃에서 사용 전까지 보관함으로써 수행되었다.

3) 전처리된 관절액 표본의 질량분석

상기 전처리된 관절액 표본을 초고성능 액체크로마토그램-질량분석기(Ultra Performance Liquid Chromatography-Quadruple-Time of Flight-Mass Spectrometry; UPLC-QTOF-MS)를 사용하여 분석을 진행하였다. 관절액 표본에 채집된 대사체들은 머무름 시간(retention time; RT)과 질량 대 전하 비율(mass-tocharge ratio; m/z)에 의해서 분류하였다.

분석기기는 ACQUITY UPLC 시스템(ACQUIRY UPLC^®;Waters, Milford, MA, USA)과 일렉트로스프레이 이온 소스(electrospray ion source)가 장착된 QTOF-MS인 SYNAPT^™ G2(Waters, Milford, MA, USA)를 사용하였다. 관절액 표본내 대사체들은 UPLC 시스템을 거치면서 머무름 시간에 따라 분리하였고, Synapt G2 시스템을 거치면서 질량 대 전하 비율로 검출하였다. 표본내 대사체들의 UPLC 시스템에서의 분리조건은 구체적으로 다음과 같다. 분석 컬럼은 입자크기 1.7μm, 내경 2.1mm, 길이 100mm인 Acquity UPLC BEH C18 컬럼을 사용하였다. 분석이 진행되는 동안 컬럼은 컬럼 오븐내에 장착하여 50℃를 유지하였다. 분석 이동상은 0.1% 포름산(formic acid)이 포함된 순수한 정제수 (이동상 A)와 0.1% 포름산이 포함된 메탄올(이동상 B)을 사용하였다. 용리(elution)은 두 이동상을 UPLC 시스템 내에서 분석시간에 따라 다른 비율로 혼합하여 흘려주는 그라디에트 일루션(gradient elution) 방법으로 진행하였다. 분석대상 표본은 오토샘플러(autosampler)내에서 4℃를 유지하였고, 무작위 순서로 주입하여 주입순서에 따라 경향성을 배제하였다. 표본내 대사체들의 Synapt G2 시스템내에서의 검출조건은 구체적으로 다음과 같다. 검출은 질량분석기의 포지티브 이온화(positive ionization)과 네가티브 이온화(negative ionization) 모드에서 각각 진행하였다. 캐필러리 전압(capillary voltage)은 3200V(포지티브 모드), 2500V(네거티브 모드)이었고, 콘 전압(cone voltage)은 40V이었으며, 탈용매 가스(desolvation gas)와 콘 가스(cone gas)의 흐름은 각각 600 L/h와 100 L/h이었다. 소스 온도(source temperature)는 120℃를 유지하였고 디솔루션 온도(dissolution temperature)는 350℃로 하였다. 류신 엔케팔린(leucine enkephalin)을 lockmass로 사용하여 검출된 질량값을 보정하였다. 질량 스펙트럼 데이터는 분리된 두 개의 채널에서 수집되었는데, 한 채널에서는 낮은 충돌에너지(collision energy)을 사용하여 모이온(parent ion)의 질량값이 수집되고, 다른 한 채널에서는 높은 충동에너지를 사용하여 조각이온(product ion)의 질량값이 수집되었다. 두 채널은 빠른 시간 동안 번갈아 가면서 질량값을 수집하여 한 파크에 대해서 모이온과 조각이온의 질량값을 동시에 확인할 수 있었다.

분석시스템의 안정화와 분석법의 재현성 확인

분석 시스템의 안정화를 위하여 컨디션닝(conditioning)은 QC(quality control)표본을 제작하여 진행하였다. 이전에 기술한 바와 같이 QC 표본은 각각의 관절액 시료에서 동일 부피를 취하여 혼합하여 제작하였다(Lai, L., et al., Methodological considerations in the development of HPLC - MS methods for the analysis of rodent plasma for metabonomic studies . Molecular bioSystems, 2010. 6(1): p. 108-20. 참조). QC 표본은 관절액 표본과 같은 방법으로 전처리하였고, 시료 분석보다는 짧은 분석 시간의 조건으로 시료 분석 시작하기 전에 15회 분석을 진행하였다. 이후 시료 분석과 동일한 조건으로 QC 표본을 3회 분석하였다.

분석법의 재현성 확인은 QC 표본과 테스트믹스(Testmix)를 사용하여 진행하였다. 테스트믹스는 포지티브 이온화 모드에서는 아세트아미노펜, 카페인, 레세르핀(reserpine) 등을 포함하는 QC 표본을, 네가티브 모드에서는 마뇨산(hippuric acid), 글리콜산(glycocholic acid), 아디프산(adipic acid) 등을 포함하는 QC 표본을 사용하였다. QC 표본은 10개의 시료표본마다 분석을 진행하였고, 테스트믹스는 시료분석 시작, 중간, 끝, 세 번 분석을 진행하였다. 모든 QC 표본과 시료들에서 얻은 피크 변동값에 대해서 주성분 분석(principal component analysis; PCA)을 실시하여 도출된 그래프(score plot)에서 모든 QC 표본의 위치를 확인하였다(도 1 참조). 주성분 분석의 그래프(score plot)에서 가까이 위치할수록 개체가 갖는 변동값이 유사함을 의미하기 때문에, 도 1의 주성분 분석 그래프(score plot)에서 모든 QC 표본이 매우 가까이 위치함은 모든 QC 표본의 피크 변동값이 유사하다는 것을 의미한다. 따라서 분석동안 분석방법의 재현성이 확보됨을 확인할 수 있었다. 그 다음, QC 표본과 테스트믹스에서 얻은 크로마토그램으로부터 특정한 추출 이온 크로마토그램(extracted ion chromatogram;XIC)을 얻고 이들의 이온 강도와 머무름 시간을 비교하여 %변동계수(Coeffecient of Variance; %CV)가 15%이내임을 확인하였다. 구체적인 재현성 확인 결과는 하기 표 2 및 표 3에 나타내었다.

상기 표 2 및 표 3에 나타난 바와 같이, 분석이 진행되는 동안 머무름 시간과 이온강도가 유의적 차이를 보이지 않음을 확인할 수 있었다.

크로마토그래피 분석 결과를 통계학적 처리 가능한 수치로 변환

상기 모든 시료표본에서 얻어진 질량분석 데이터를 데이터 분석 프로그램(MarkerLynx XS 소프트웨)에 적용하여 시료표본의 모든 피크는 머무름 시간_질량 대 전하 비율(RT_m/z)로 표시하고, 각 피크의 이온 강도는 면적값으로 표시하였다. 시료표본마다 프로파일링된 모든 피크의 이온 강도의 합으로 개별 피크의 이온강도를 표준화하였다.

다변량 분석법으로 두 생체시료군의 차별성을 검증

상기 각 시료의 피크값을 통계프로그램(EZinfo software, Umetrics Inc., ume, Sweden)을 적용하여 직교부분최소자승판별 분석(orthogonal partial square discrimination analysis; OPLS-DA)을 진행하였다. 도 2에서 확인할 수 있듯이 두 군의 대사체 프로파일에 차이가 있음을 확인할 수 있었다.

류마티스관절염과 골관절염 차별화와 관련된 관절액 대사체 선별 및 확정

상기 OPLS-DA에서 VIP(variable importance plot) 차트는 모든 피크들을 관련성이 높은 순서대로 정렬하여 작성하고, S-plot은 피크들이 각 그룹에서의 신뢰도와 기여도에 따라서 좌표평면에 표시하여 작성하였다. 유의한 값으로 인정되는 피크는 1.5 이상의 VIP 값을 가지면서 각 그룹에서 신뢰도와 기여도가 높은 피크들로 선별하였다. 상기 VIP 값은 해당 OPLS-DA 모델에서 중요도를 표현하는 값이다. 1차 피크 선별에서 사용한 모델에서 제시되는 VIP 값을 기준으로 1.5 이상이 되는 피크들을 선별하고 값 피크에 해당되는 대사체들을 규명한 다음, 규명된 피크들에 대해서 OPLS-DA를 진행하여 도 3에서 보여지는 VIP 차트를 얻었다.

선별된 피크들은 모이온의 질량값을 이용하여 HMDB(Human metabolome database, lipidomap), KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 등 다양한 데이터 베이스(Human metabolome database)에서 해당 대사체들을 찾고 조각이온의 질량값을 비교(p-값)하여 대사체들을 확정하였다. 이들 대사체들에 대해서 유의적 차이는 스튜던트 t-test를 실시하여 검증하였다. 그 결과는 표 4에 나타내었다.

상기 표 4에서 트리메틸트리데카노익 애씨드는 대사체 검출시 질량분석기의 포지티브 이온화(positive ionization)와 네가티브 이온화(negative ionization) 모드에서 각각에서 모두 검출되었으며, 11.01_255.23[M-H]은 네가티브 이온화 모드에서, 11.03_279.24[M+Na]의 경우 포지티브 이온화 모드에서 검출되는 조건을 의미한다.

[실시예 2]선별된 대사체들과 류마티스관절염의 혈청학적 진단지표와의 상관관계 분석

류마티스관절염 진단지표로 활용하고 있는 적혈구침감계수(ESR), C-반응 단백질(CRP) 류마티스 지수(RF), 항-CCP(anti-citrullinated cyclic peptide) 항체 등과 선별된 대사체들과의 상관관계(Spearman correlation)를 분석하였다. 상관계수(r)는 -1≤r≤1의 값으로 표시되며, 음의 값은 음의 상관관계를 양의 값은 양의 상관관계를 표시하였다. 상관관계의 정도는 -1≤r<-0.7, 0.7<r≤1에서는 '강한 상관관계', -0.7≤r<-0.4, 0.4<r≤0.7에서는 '중간정도의 상관관계', -0.4≤r<0, 0< r≤0.4에서는 '약한 상관관계'로 해석할 수 있으며, p < 0.05인 경우 통계학적인 유의성이 있다고 판단하였다. p < 0.05인 대사체들에 대해서 그 결과를 하기 표 5 및 표 6에 나타내었다.

상기 표에서 알 수 있듯이, 두 질환군에서 류마티스관절염 진단지표인 항-CCP항체는 5-L-글루타밀-타우린과 13,14-디히드로-리폭신 A4와 명확한 상관관계를 보였다. 골관절염 환자군에서는 항-CCP 항체가 5-L-글루타밀-타우린 및 13,14-디히드로-리폭신 A4와 양의 상관관계를 보였으며, 류마티스관절염 환자군에서 항-CCP 항체와 5-L-글루타밀-타우린은 양의 상관관계를, 항-CCP와 13,14-디히드로-리폭신 A4는 음의 상관관계를 보였다.

[실시예 3]선별 대사체들 사이의 상관관계 분석

상기 각 질환군 내에서 선별한 대사체들 사이의 상관성 분석을 진행하고 상관관계를 확인하였다. 유의적으로 명확한 상관관계를 보이는 대사체 쌍에 대해선 두 대사체의 측정값에 대한 비율을 구하고, 이들의 변동계수(%CV)를 확인하여 정밀성을 확인하였다. 상관계수(r)에 대한 판단은 상기 [실시예 2]와 동일한 기준으로 하였다. 그 결과 타우린 대사체인 5-L-글루타밀-타우린과 아라키돈산 대사체인 13,14-디히드로-리폭신 A4 그리고 카르니틴(Carnitine) 합성 전구체인 N6,N6,N6-트리메틸-L-라이신과 도코사펜타데노익 애씨드는 류마티스 관절염 환자군에서는 음의 상관관계를, 골관절염에서는 양의 상관관계를 보였다. 이들 대사체 쌍의 측정값에 대한 비율을 구하고, 이들의 변동계수(%CV)를 확인한 결과, (5-L-글루타밀-타우린)/(13,14-디히드로-리폭신 A4)에서 25%이하의 정밀성, (N6,N6,N6-트리메틸-L-라이신)/(도코사펜타데노익 애씨드)에서는 28%이하의 정밀성 을 확보하였다. 이때 (5-L-글루타밀-타우린)/(13,14-디히드로-리폭신 A4)의 비율은 류마티스관절염 환자군에서는 1.34±0.31, 골관절염 환자군에서는 0.69±0.15이며, (N6,N6,N6-트리메틸-L-라이신)/(도코사펜타데노익 애씨드)는 류마티스관절염 환자군에서는 0.19±0.02, 골관절염 환자군에서는 0.38±0.05를 나타냈다. 그 결과를 하기 표 7 및 표 8에 정리하였다.

[실시예 4]류마티스관절염과 골관절염 감별진단에서 선별 대사체 비율의 효율성 확인

본 발명의 구현예들에 따른 대사체 함량비를 이용한 류마티스 관절염과 골관절염 감별의 효율성을 판단하기 위해서 ROC(Receiver-Operating Characteristic) 곡선을 확인하였다.

그 결과, 도 4 에 나타난 바와 같이 (5-L-글루타밀-타우린)/(13,14-디히드로-리폭신 A4)의 경우 AUC 수치는 0.98이였다. 이때 절단값(Cutoff value)은 0.81, 민감성(sensitivity)은 0.80, 특이성(specificity)은 1.00이었다. 또한, 도 5 에 나타난 바와 같이 (N6,N6,N6-트리메틸-L-라이신)/(도코사펜타데노익 애씨드)의 AUC 수치는 0.84였다. 이때 절단값(Cutoff value)은 0.17, 민감성(sensitivity)은 0.60, 특이성(specificity)은 1.00이었다.

이는 본 발명의 일 구현예에 따른 두 대사체의 비율 (5-L-글루타밀-타우린)/(13,14-디히드로-리폭신 A4) 및 (N6,N6,N6-트리메틸-L-라이신)/(도코사펜타데노익 애씨드)를 류마티스 관절염과 골관절염의 감별진단에 효율적으로 활용할 수 있음을 의미한다. 또한, (5-L-글루타밀-타우린)/(13,14-디히드로-리폭신 A4)이 AUC 수치가 0.98로서 1에 더 가까운 값을 가지므로, (N6,N6,N6-트리메틸-L-라이신)/(도코사펜타데노익 애씨드) 보다 더 우수한 감별진단 대사체로서 기능할 수 있음을 알 수 있다.

Claims

대상자로부터 채취한 관절액에서 5-L-글루타밀-타우린(5-L-Glutamyl-taurine) 및 13,14-디히드로-리폭신 A4(13,14-Dihydro-lipoxin A4) 대사체의 농도를 측정하는 단계; 및
상기 관절액내 대사체들의 농도비율을 도출하는 단계를 포함하는 골관절염 및 류마티스관절염을 감별하기 위한 정보를 제공하는 방법.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 측정된 관절액내 대사체들의 농도비율을 도출하는 단계는 상기 13,14-디히드로-리폭신 A4에 대한 5-L-글루타밀-타우린의 농도비가 0.81 초과이면 관절염 중 류마티스관절염 질환이 있고, 0.81 미만이면 관절염 중 골관절염 질환이 있다고 진단하는 단계를 포함하는 골관절염 및 류마티스관절염을 감별하기 위한 정보를 제공하는 방법.
삭제
관절액에 포함된 5-L-글루타밀-타우린(5-L-Glutamyl-taurine) 및 13,14-디히드로-리폭신 A4(13,14-Dihydro-lipoxin A4) 대사체의 농도를 측정하는 대사체 측정부 및 골관절염 및 류마티스관절염의 감별방법을 포함하는 지시서를 포함하고,
상기 지시서는 상기 13,14-디히드로-리폭신 A4에 대한 5-L-글루타밀-타우린의 농도비로부터 골관절염 또는 류마티스관절염 질환을 진단하는 감별방법을 포함하는 골관절염 및 류마티스관절염 감별진단용 키트.
제 5 항에 있어서, 골관절염 환자군 및 류마티스관절염 환자군의 관절액은 상기 대사체를 서로 다른 농도로 포함하는 골관절염 및 류마티스관절염 감별진단용 키트.
삭제
제 5 항에 있어서, 상기 지시서는 상기 13,14-디히드로-리폭신 A4에 대한 5-L-글루타밀-타우린의 농도비가 0.81 초과이면 관절염 중 류마티스관절염 질환이 있고, 0.81 미만이면 관절염 중 골관절염 질환이 있다고 진단하는 감별방법을 포함하는 골관절염 및 류마티스관절염 감별진단용 키트.
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