CN105525029A - 反映男性精子活力的精浆piRNA标志物或其组合及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种反映男性精子活力及判断生殖功能障碍的精浆piRNA标志物组合及其应用。所述piRNA标志物4个，包括DQ570956、DQ571813、DQ575659和DQ575661，该组合可用精子活力的检测以及预测因精子活力低引起的生殖功能障碍。在本发明中，精浆较易获得，无需其它组织，属于无创性检查；精浆piRNA可反映整个生精阶段的病理、生理情况，以其作为辅助检测指标可以提高检测的准确水平，在分子水平上反映整个生精过程中的病理和生理状况，并为男性生殖功能障碍的诊断和治疗提供了潜在靶点；危险系数数学计算方法给每个受试者计算了一个数值，通过该数值可以直接、直观的反映精子活力程度，避免了主观因素及经验欠缺等造成的干扰。

Description

反映男性精子活力的精浆piRNA标志物或其组合及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及反映男性精子活力的精浆piRNA标志物或其组合及应用。
背景技术
不孕不育已成为全世界范围内的生殖健康问题。据不完全统计，目前全世界约有1.86亿人被不孕不育问题困扰，其中由于男性因素造成的不育占据一半左右，且近几年呈上升趋势(1)。近75％的男性不育患者被诊断为先天性自发，然而造成男性不育的分子机制尚不清晰(2)。目前临床生殖实验室检查项目一般包括对精液的生化检查，酸性磷酸酶、乳酸脱氢酶-X等酶类检查以及精液免疫学检查，但这些技术都存在一定缺陷，不能直接反映睾丸的生精功能和全面评价精液质量，也无法解释造成男性不育的分子机制(3)。弱精症是男性不育疾病中的一种，弱精症是指精液参数中前向运动的精子(a和b级)小于50％或a级运动的精子小于25％的病症，弱精子症又称精子活力低下。然而临床上针对这种疾病的检测很难精确反映男性精子的活力程度，难以直接判定精子活力的低下程度及其导致的男性不育。由于精子活力在男性生殖中起到至关重要的作用，所以目前急需寻找一种比现有方法更精确的方法来直接反映精子活力。
piRNA是2006年在动物生精细胞中发现的一类新型小分子非编码RNA，因为它们特异性地与PIWI蛋白质相互作用，所以被命名为PIWI互作RNA(PIWI-interactingRNA)，简称piRNA(4-7)。piRNA与生殖密切相关，这不仅因为piRNA特异性的在生殖世系细胞中高表达，而且piRNA参与了精子的形成和调控，包括对精子成熟相关基因进行转录后调控以及对逆转录转座子进行抑制等等(4，8)。因此，piRNA突变失去功能后，常常会导致个体不育(9)。
因此，通过对这些piRNA进行研究，有望发现一些与男性生殖功能(如精子活力等)密切相关的piRNA，以其作为生物标志物将有望开发出反映男性精子活力的指标，从而应用于男性生殖功能障碍的临床诊断、预测和筛查。
发明内容
本发明的目的是筛查反映男性精子活力的精浆piRNA，通过测量精浆piRNA特异性变化，筛选出精子活力弱的生殖功能障碍的男性的精浆piRNA谱图，然后通过数学分析方法计算危险系数评分(RiskScore)以及区分标准(Cut-offValue)，从而给每个病人打分并评估其危险系数(高危险系数代表精子活力弱并伴随生殖功能障碍)，最终为精确定量男性精子活力程度及鉴别因精子活力低下导致的弱精症提供新的渠道和指标。精浆piRNA作为新的反映男性精子活力的生物标志物具有重要的指导意义，能显示出分子水平的遗传信息，有助于揭示男性精子活力降低的分子机制。
本发明的上述目的是采用以下技术方案来实现的：
一种与男性精子活力弱及生殖功能障碍相关的piRNA标志物或其组合，包括下列piRNA中的任意一种或几种：DQ570956、DQ571813、DQ575659和DQ575661。其中所述的男性生殖功能障碍选自弱精症。
piRNA 对应的核苷酸序列 序列编号
DQ570956 AGCAUUGGUGGUUCAGUGGUAGAAUUCUCGC SEQ ID NO.1
DQ571813 AUUGGUGGUUCAGUGGUAGAAUUCUCGCCUG SEQ ID NO.2
DQ575659 UCCCUGGUGGUCUAGUGGUUAGGAUUCGGCA SEQ ID NO.3
DQ575661 UCCCUGGUUCGAUCCCGGGUUUCGGCACC SEQ ID NO.4
本发明所述的与男性精子活力相关的piRNA标志物或其组合在制备检测男性精子活力的试剂中的应用。
本发明所述的与男性精子活力相关的piRNA标志物或其组合在制备弱精症诊断试剂中的应用。
定量检测本发明所述的与男性精子活力相关的piRNA标志物或其组合的试剂在制备检测男性精子活力的试剂中的应用；所述的定量检测本发明所述的与男性精子活力相关的piRNA标志物或其组合的试剂优选所述的与男性精子活力相关的piRNA标志物或其组合的TaqMan探针和引物。
定量检测本发明所述的与男性精子活力相关的piRNA标志物或其组合的试剂在制备弱精症诊断试剂中的应用；所述的定量检测本发明所述的与男性精子活力相关的piRNA标志物或其组合的试剂优选本发明所述的与男性精子活力相关的piRNA标志物或其组合的TaqMan探针和引物。
一种用于检测男性精子活力的试剂盒，包含TaqMan探针实时荧光定量PCR法检测DQ570956、DQ571813、DQ575659和DQ575661的探针和引物。
一种用于诊断男性弱精症的试剂盒，包含TaqMan探针实时荧光定量PCR法检测DQ570956、DQ571813、DQ575659和DQ575661的探针和引物。
一种预测弱精症的方法，包含以下步骤：
(1)收集精浆样本，包括精子活力正常的有生育能力的男性以及精子活力弱的生殖功能障碍的男性的精浆样本，并提取总RNA；
(2)逆转录成cDNA，采用TaqMan探针实时荧光定量PCR法对DQ570956、DQ571813、DQ575659和DQ575661四种piRNA进行检测，测算出精子活力低下患者与正常生育男性精浆中四种piRNA的绝对含量；
(3)经数学分析过程计算RiskScore从而评估精子活力与piRNA表达水平之间的关系，使用的公式如下：
RiskScorei＝∑n j＝1Wj·Sij
在以上公式中，每个piRNA的“s”是以正常对照组5％的下限为参考值，即低于正常5％下限记为1，否则为0。“sij”是piRNAj相对于samplei获得的数值，“Wj”是piRNAj的加权值。通过以上公式，即可以给病人i打分，获得其危险系数评分RiskScorei。然后根据ROC曲线找到一个合适的Cut-off值，然后使用该Cut-off值来评估男性不育与piRNA表达水平之间的关系，并评估每个受测试样本的危险性，从而评估男性精子活力，进而特异性检测或预测弱精症男性生殖功能障碍疾病。
该方法中，将计算得到的RiskScorei分值与Cut-off值比较，分值大于Cut-off值提示该样本危险系数高，精子活力不足，该样本来源的男子患有弱精症；分值小于Cut-off值提示该样本危险系数低，精子活力正常，该样本来源的男子未患弱精症。
本发明使用的检测方法选自：TaqMan探针实时荧光定量PCR法，包括以下步骤：
(1)使用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取精浆总RNA；
(2)通过RNA逆转录反应得到cDNA；
(3)根据人piRNA序列设计引物及TaqMan探针，进行PCR反应对piRNA进行精确定量检测；
(4)测算出精子活力低下患者与正常生育男性精浆中四种piRNA的绝对含量。
本发明所述的用于检测相应piRNA的TaqMan探针和引物是商业化购买。目前针对已知piRNA设计TaqMan探针和引物已是非常成熟的现有技术，凡是能够准确检测本发明所述的piRNA的TaqMan探针和引物均属于本发明的保护范围。
本发明精浆piRNA组合及危险系数数学计算方法可应用于男性精子活力评估和生殖功能障碍检测，例如为男性生殖功能障碍补充新的检测指标，用于病程监测、预后和药效评价等。
本发明具有以下几个方面的有益效果：
第一，精浆相对其它组织较易获得，与睾丸活检或者睾丸穿刺相比，属于无创性检查，极大地方便了医疗人员的使用，减轻了患者的痛苦；
第二，精浆中的piRNA反映的是整个生精过程中的病理和生理状况，其检测结果更具有临床指导意义；
第三，精浆piRNA检测能在分子水平上反映精子发生中的状态，提高了检测的准确水平，并为男性生殖功能障碍尤其是生精功能障碍的治疗提供了潜在靶点；
第四，危险系数数学计算方法给每个受试者计算了一个数值，通过该数值可以直接、直观的反映精子活力程度，避免了主观因素及经验欠缺等造成的干扰。
综上所述，检测精浆中的piRNA，简单易行且效果优越，从精浆piRNA的特异性变化这一新角度出发，发现精子活力评价标准并且区分男性生殖功能障碍，从而建立起一种检测生精功能障碍的新技术。本发明提供的特异性的piRNA组合与精子活力密切相关，通过其含量测算出的危险系数评分与精子活力负相关，能作为男性因精子活力弱导致生殖功能障碍的分子标志物，具有很高的特异性和灵敏性。该技术仅仅需要病人的精浆而不需要任何其它组织，通过简单的精浆piRNA组合及数学计算评估男性精子活力强弱及预测生殖功能障碍发生的可能性。由此可见，检测精浆piRNA水平能评估精子活力及由精子活力引起的男性生殖功能障碍，精浆piRNA的水平有望成为反映男性精子活力的重要标志分子，具有极重要的临床应用潜力和价值。
附图说明
图1.本发明的主要流程图。
图2.TaqMan探针实时荧光定量PCR法测定piRNA(DQ570956、DQ571813、DQ575659和DQ575661)在弱精患者与正常对照精浆样本中的浓度及差异性变化。如图所示DQ570956、DQ571813、DQ575659和DQ575661在弱精患者精浆中相对正常对照均出现显著降低，因此DQ570956、DQ571813、DQ575659和DQ575661是可以反映精子活力与区分正常对照和弱精症的特异性生物标志物piRNA。
图3.RiskScore分析。首先，对这四种piRNA在正常组和弱精组中表达差异作出ROC曲线，选择Cut-off值，算出RiskScore值，然后分析RiskScore与年龄、精子密度、精液体积、精子活力等临床信息的相关性。结果发现RiskScore与精子活力成反比例关系，和其他三种临床信息不成比例关系。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
本发明通过研究男性因精子活力而造成生殖功能障碍过程中精浆piRNA的特异变化，筛选出在疾病及正常生理状态下表达差异显著的一组精浆piRNA，将它们的探针应用于男性精子活力检测，以提高诊断男性精子活力的准确性。以下实施例中使用的检测相应piRNA的TaqMan探针和引物是由上海吉玛制药技术有限公司设计制定。试剂盒名称为Hairpin-itTMReal-TimePCR，订单号为探10122。但这些探针和引物仅是为了更好的说明本发明的技术方案，不能因此限制本发明的保护范围。凡是能够准确检测本发明所述的piRNA的TaqMan探针和引物均属于本发明的保护范围。
实施例1：TaqMan探针实时荧光定量PCR法测定piRNA在精浆中的绝对浓度
(1)研究对象为结婚后未采取任何避孕措施2年内不育者，以年龄匹配的已育不超过两年的男性为正常对照，所有受试者禁欲3～5天后留取精液，用WLJY-9000伟力彩色精子质量检测系统(北京伟力公司)进行精子质量和功能分析。分析标准均按世界卫生组织标准进行(WHO人类精液检查和处理实验室手册第5版)。待精液分析后将其1000g离心10min,收集上清，再12000g离心5min，收集上清精浆。
(2)收集弱精不育者共20例(无前列腺疾病、性功能障碍、精索静脉曲张、生殖道感染等病史，患者病程1～7年)，以年龄匹配的生育能力正常的男性16例作对照，组成初筛组。利用Trizol试剂(Invitrogen公司)分别提取100μL单个样本精浆中的总RNA。针对DQ570956、DQ571813、DQ575659和DQ575661这4个piRNA，进行单个样本的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测，从而确定piRNA在精浆中的绝对浓度，确定特异性变化的piRNA作为精子活力的生物标志物。具体步骤为：针对每一种piRNA，设计一个含相同茎环结构的特异性反向引物，利用piRNA特异性反向引物进行逆转录，得到含共同茎环结构但属于特定piRNA的cDNA。进行基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR反应，将每种piRNA扩增并记录荧光信号，仪器使用的是Roche480荧光定量PCR仪。数据处理方法为绝对定量法，即每次进行荧光定量PCR时，将所需检测的样本与标准曲线同时进行PCR扩增，扩增结束后根据扩增曲线设定统一的阈值，然后根据标准品的浓度及每个浓度对应的CT值绘制标准曲线，计算出该样本中piRNA的绝对含量。结果发现，四种piRNA(DQ570956、DQ571813、DQ575659和DQ575661)在患者组中表达量与对照组相比均有显著差异(见表1)。验证组选取男性弱精患者共74例(无前列腺疾病、性功能障碍、精索静脉曲张、生殖道感染等病史，患者病程1～7年)，以年龄匹配的生育能力正常的男性58例作对照。用TaqMan探针实时荧光定量PCR法对受试者精浆标本进行逐个检测，结果验证了这四种piRNA(DQ570956、DQ571813、DQ575659和DQ575661)在患者组中表达量与对照组相比有显著降低(见表1)。
表1.TaqMan探针实时荧光定量PCR法测定特异性变化的piRNA
数据以mean±SE表示.P值正常vs弱精
实施例2：RiskScore危险系数评分系统对每个样本进行计算估值
首先将初筛组的数据绘制ROC曲线，经数学分析过程计算RiskScore以及Cut-off值，算出Cut-off值实为3.57(见表2)。
然后使用如下的公式给病人i打分并评估其危险系数，RiskScorei得分高于Cut-off值的为高危险系数，代表病人i精子活力弱并伴随生殖功能障碍。得分低于Cut-off值的代表精子活力正常。
RiskScorei＝∑n j＝1Wj·Sij
在以上公式中，每个piRNA的“s”是以正常对照组5％的下限为参考值，即低于正常5％下限记为1，否则为0。“sij”是piRNAj相对于samplei获得的数值，“Wj”是piRNAj的加权值。
结果显示初筛组20个弱精患者中18个得分大于3.57，因此被正确划分；16个正常对照中14个得分小于3.57，因此被正确划分。使用同样的Cut-off值，在验证组中重复以上计算，结果显示74个弱精患者中有53个得分大于3.57，因此被正确划分；58个正常对照得分均小于3.57，因此全部被正确划分。很明显，这四种piRNA对正常样本和弱精样本的诊断的准确性相当高，具有临床价值。由于测试的每个个体的精子活力已经数学量化，因此上述精浆piRNA标志物组合可以明确反映男性精子活力状况以及评估生殖功能障碍疾病。
表2.RiskScore分析
PPV：阳性预测值；NPV：阴性预测值
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Claims (8)

1.一种与男性精子活力相关的piRNA标志物或其组合，其特征在于包括下列piRNA中的任意一种或多种：DQ570956、DQ571813、DQ575659和DQ575661；其中，所述的男性精子活力选自弱精症；DQ570956核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，DQ571813核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，DQ575659核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，DQ575661核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。
2.权利要求1所述的与男性精子活力相关的piRNA标志物或其组合在制备检测男性精子活力的试剂中的应用。
3.权利要求1所述的与男性精子活力相关的piRNA标志物或其组合在制备弱精症诊断试剂中的应用。
4.定量检测权利要求1所述的与男性精子活力相关的piRNA标志物或其组合的试剂在制备检测男性精子活力的试剂中的应用；所述的定量检测权利要求1所述的与男性精子活力相关的piRNA标志物或其组合的试剂优选权利要求1所述的与男性精子活力相关的piRNA标志物或其组合的TaqMan探针和引物。
5.定量检测权利要求1所述的与男性精子活力相关的piRNA标志物或其组合的试剂在制备弱精症诊断试剂中的应用；所述的定量检测权利要求1所述的与男性精子活力相关的piRNA标志物或其组合的试剂优选权利要求1所述的与男性精子活力相关的piRNA标志物或其组合的TaqMan探针和引物。
6.一种用于检测男性精子活力的试剂盒，其特征在于包含TaqMan探针实时荧光定量PCR法检测DQ570956、DQ571813、DQ575659和DQ575661的探针和引物。
7.一种用于诊断男性弱精症的试剂盒，其特征在于包含TaqMan探针实时荧光定量PCR法检测DQ570956、DQ571813、DQ575659和DQ575661的探针和引物。
8.一种预测弱精症的方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)收集精浆样本，包括精子活力正常的有生育能力的男性以及精子活力弱的生殖功能障碍的男性的精浆样本，并提取总RNA；
(2)逆转录成cDNA，采用TaqMan探针实时荧光定量PCR法对DQ570956、DQ571813、DQ575659和DQ575661四种piRNA进行检测，测算出精子活力低下患者与正常生育男性精浆中四种piRNA的绝对含量；
(3)经数学分析过程计算RiskScore从而评估精子活力与piRNA表达水平之间的关系，使用的公式如下：
RiskScorei＝∑n j＝1Wj·Sij
在以上公式中，每个piRNA的“s”是以正常对照组5％的下限为参考值，即低于正常5％下限记为1，否则为0。“sij”是piRNAj相对于samplei获得的数值，“Wj”是piRNAj的加权值。通过以上公式，即可以给病人i打分，获得其危险系数评分RiskScorei。然后根据ROC曲线找到一个合适的Cut-off值，然后将计算得到的RiskScorei分值与Cut-off值比较，分值大于Cut-off值提示该样本危险系数高，精子活力不足，该样本来源的男子患有弱精症；分值小于Cut-off值提示该样本危险系数低，精子活力正常，该样本来源的男子未患弱精症。从而使用危险系数评分法，将建立男性不育与piRNA表达水平之间的联系，评估男性精子活力，评估受测试样本的危险性，进而特异性检测或预测弱精症男性生殖功能障碍疾病。
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