CN111440792A - 一种piRNA及用于检测和/或预测男性生殖功能障碍的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及RNA检测领域，具体的涉及一种piRNA及用于检测和/或预测男性生殖功能障碍的试剂盒。所述piRNA的逆转录引物的序列为5’‑GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACNNNNNNNN‑3’，其中：序列NNNNNNNN为piRNA3’端反向互补的6‑8个碱基。用于检测和/或预测男性生殖功能障碍的试剂盒，包括秀丽隐杆线虫cel‑miR‑39‑3p以及SYBR Green Real‑timePCR法检测piR‑32678和cel‑miR‑39‑3p的引物，其中：秀丽隐杆线虫cel‑miR‑39‑3p的序列为5′UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG‑3′。本发明中的piRNA的逆转录引物可以对RNA进行定量检测，从而反应生殖系统的睾丸储备功能的健康状况，进而有助判断男性的无精子症与少精子症的病因。

Description

一种piRNA及用于检测和/或预测男性生殖功能障碍的试剂盒

技术领域

本发明属于RNA检测领域，具体的涉及一种piRNA及用于检测和/或预测男性生殖功能障碍的试剂盒。

背景技术

不孕不育已成为影响人类发展与社会和谐的一个全球性医学和社会学问题，给家庭幸福及社会和谐带来沉重负担。据2012年《中国不孕不育现状调研报告》显示，我国育龄人群中不孕不育率已经高达12.5％，尤其是在经济发达的地区，不孕不育的发病率甚至已经超过15％。男性不育约占不孕不育的50％左右，其中又以精子发生障碍为主要病因。精子发生障碍是指曲细精管内精子发生不良，临床表现为少、弱、畸形精子症或非梗阻性无精子症(non-obstructive azoospermia，NOA)等，目前半数以上的生精障碍病因不明。睾丸储备功能是指睾丸可持续生成精子的数量和质量，以及分泌雄激素的潜能，共分0级～IV级，可以全面反映睾丸的功能。评估睾丸储备功能需结合病史、体格检查、实验室检查及特殊检查等多角度、多方法全面进行，可指导男性不育的诊治、疗效评价及预后预测等，已成为男性生殖健康防病管理中重要环节。

常规的男科实验室检查，以精液常规分析及内分泌检测应用最为广泛。但是精液常规分析结果波动性大，且仅能提供精液的理化特征及动力学参数，无法反映精子功能及精子发生障碍病因。睾丸病理活检及遗传学检测等检测项目均有助病因诊断。尽管睾丸病理活检最能反映睾丸储备功能，但因有创而大大限制其应用。《男性生殖遗传学检查专家共识》中，明确染色体核型分析、Y染色体微缺失等常规检查以及基因突变检测等特殊检查在男性生殖疾病诊疗中起重要作用。

非编码的小分子RNA(non-coding small RNA,ncRNA)，特别是微小RNA(microRNA,miRNA)和piRNA(piwi-interacting RNA)，对生殖细胞发育、正常精子发生及男性生育是必要的，其表达异常或功能异常可能导致男性不育。ncRNA研究成果的临床应用，将进一步丰富男性生殖遗传学检查内容，为临床诊断和治疗提供参考。miRNA在精浆中稳定存在，且不育症、少精子症、弱精子症、畸形精子症或NOA人群的精浆miRNA表达谱，与正常健康男性间存在显著差异。但miRNA在各种组织中几乎都表达；而piRNA有显著的细胞特异性，主要在生殖细胞中大量表达。故piRNA较miRNA能更好地反映生殖系统。

现有技术中缺少一种利用piRNA可以对RNA进行定量检测从而反应生殖系统的睾丸储备功能。

发明内容

本发明为了解决上述背景技术中现有技术中缺少一种利用piRNA可以对RNA进行定量检测，从而反应生殖系统的睾丸储备功能的技术问题，提供一种piRNA及用于检测和/或预测男性生殖功能障碍的试剂盒。

本发明采用的技术方案如下：

本发明一方面提供了一种piRNA的逆转录引物，所述piRNA的逆转录引物的序列为:

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACNNNNNNNN-3’，

其中：

序列NNNNNNNN为piRNA3’端反向互补的6-8个碱基。

本发明的有益效果是：piRNA是一类大小为24～31nt的ncRNA，于2006年在雄性小鼠睾丸中被首次发现。它与Argonaute蛋白家族中的PIWI蛋白特异性结合，形成piRNA沉默复合体。该通路在调控精子的发生和发育中发挥重要作用，主要包括：(1)抑制转座子；(2)介导泛素化降解；(3)调控mRNA的表达；(4)基因甲基化修饰；(5)染色质重塑。当piRNA在数量、功能及调控上出现异常时，则可能会导致男性不育。因此，寻找男性不育人群差异表达的piRNA，为男性不育的病因诊断及评估男性不育合适的治疗方式提供新的分子标记物，具有重要的临床应用价值和意义。piRNA大量地、特异地在粗线期精母细胞和圆形精子细胞中表达，但睾丸活检为有创手术，故临床上对男性不育人群进行睾丸组织piRNA检测的可行性较低。已有研究证实，精浆中含有大量外泌体，且piRNA主要以外泌体形式，亦有部分以游离的形式稳定地存在于精浆中。这说明精浆piRNA检测成为评价男性生育力的特异性非侵入性的新方法。本发明中的piRNA的逆转录引物可以对RNA进行定量检测从而反应生殖系统的睾丸储备功能的健康状况，进而判断男性的无精子症与少精子症的病因。生精障碍患者精浆中piRNA的差异表达可能有助于临床诊断。精浆piRNA的定量检测为临床诊治提供一种新的无创的分子标志物，为男性不育的病因诊断以及评估男性不育合适的治疗方式提供潜在工具，亦为精子发生障碍的分子机制研究奠定基础，具有重要的临床应用价值和意义。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述piRNA为piR-32678,所述piR-32678的逆转录引物的序列为:

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAAGTG-3’。

采用上述进一步方案的有益效果是，piR-32678在对RNA进行定量检测的过程中，通过荧光定量PCR检测，能够更加明显的判断出差异，从而更好的反应生殖系统的睾丸储备功能的健康状况，进而判断男性的无精子症与少精子症的病因。解决了目前现有技术中精液常规分析结果波动性大，且仅能提供精液的理化特征及动力学参数的技术问题。

本发明另一方面提供一种qPCR的通用引物，所述qPCR的通用引物的序列为5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGT。

本发明的有益效果是，上述qPCR的通用引物能够结合piRNA的逆转录产物在荧光定量PCR检测中对RNA进行定量分析，从而反应生殖系统的睾丸储备功能的健康状况，进而判断男性的无精子症与少精子症。

本发明另一方面提供一种piR-32678的qPCR的特异引物，所述qPCR的特异引物的序列为5’-AACAAGCATTGATCATCGACACTT-3’。

本发明的有益效果是，piR-32678的qPCR的特异引物能够结合piR-32678的逆转录产物在荧光定量PCR检测中对RNA进行定量分析，从而反应生殖系统的睾丸储备功能的健康状况。

本发明的另一方面提供了piR-32678在制备判断男性无精子症与少精子症的检测试剂中的应用。

本发明的另一方面提供了检测piR-32678的qPCR引物在制备判断男性无精子症与少精子症的检测试剂中的应用。

本发明的另一方面提供了一种用于检测和/或预测男性生殖功能障碍的试剂盒，包括秀丽隐杆线虫cel-miR-39-3p以及SYBR Green Real-timePCR法检测piR-32678的引物，其中：

秀丽隐杆线虫cel-miR-39-3p的序列为5′-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3′。

本发明的有益效果是，精浆ncRNA的RT-qPCR定量检测，涉及内参的选择。U6在不同组织细胞中表达较一致，被广泛用作组织细胞中miRNA RT-qPCR相对定量的内参。不少精浆piRNA RT-qPCR研究也以U6为内参。但已有研究证实，血浆等体液样本不宜选择U6作为piRNA相对定量的内参。我们既往实验结果亦显示U6在不同的精浆样本间差异大。这可能是因为体液中的miRNA或piRNA大多存在微囊结构中或与蛋白质等构成复合物存在，因而能良好地抗RNA酶降解，浓度不受长期保存的影响；而U6为核小RNA，短期保存后不稳定。目前，倾向使用表达稳定的循环miRNA作为体液样本的内参，但主要是在血清/血浆样本中应用较为成熟。不同的体液样本有各自的特殊性，暂无统一的内参适用于所有循环miRNA和piRNA的RT-qPCR。故选择适合精浆ncRNA RT-qPCR检测的参照，是保障精浆小分子RNA实现准确定量检测的关键核心之一。秀丽隐杆线虫cel-miR-39-3p序列在已知的人类miRNA及piRNA库中均无同源片段，故选择化学合成cel-miR-39-3p单链用作目的piRNA相对定量实验的参照。cel-miR-39-3p逆转录引物：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAAGCT-3’。cel-miR-39-3p通用引物与piR-32678通用引物相同。

cel-miR-39-3p特异性引物：5’-AACAGTGTCACCGGGTGTAAA-3’。

本发明可以利用上述piR-32678的逆转录引物、piRNA qPCR的通用引物和piR-32678的qPCR的特异引物对精浆中piRNA进行的检测方法，包括如下步骤：

S1、取精液样品高速离心后取上清液至存储管中，接着将所述存储管再次离心后取上清液，得到精浆；

S2、取序列为5′-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3′的干粉状秀丽隐杆线虫cel-miR-39-3p，用无RNA酶水配制成200nmol的工作液；

S3、将步骤S1中的精浆于35～40℃下复融后加入RNA提取试剂混匀,然后静置3～6min,接着加入步骤S2中的所述工作液，混匀后静置5～10min得到混合液；

S4、向步骤S3中的混合液中加入氯仿，充分振荡混匀，室温下静置2～3min后离心，取离心后上层水相至存储管内，接着向存储管内加入异丙醇，混匀后在室温下静置8～12min,再接着离心后弃掉上清液，得到呈胶冻状的沉淀；

S5、将步骤S4中的沉淀中加入75％乙醇重悬沉淀，振荡后离心，离心后弃掉上清液取沉淀，接着将沉淀在真空或空气中晾干5～10min，再接着加入无RNA酶水重悬，得到精浆总RNA；

S6、用无RNA酶水配置piR-32678及cel-miR-39-3p的逆转录引物的工作液，按照每个样本的PCR反应管数为目的小分子RNA个数+1的原则依次通过变性、加样、逆转录反应和稀释完成逆转录；

S7、通过荧光定量PCR检测，然后对结果进行2^-△△Ct法分析，从而得到是否有生殖功能障碍。

附图说明

图1为本发明熔解曲线图；

图2为本发明扩增曲线图；

图3为本发明精浆piR-32678诊断生精障碍的ROC曲线图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1、

一种精浆中RNA进行定量检测的方法，包括如下步骤：

S1、精浆标本的留取，步骤如下：

男性禁欲2～7天，用手淫法留取全部精液于清洁广口无毒的塑料容器内。标本置于37℃孵育，待充分液化。标本取样2h内，常温1500g离心5min，分离精子和精浆。吸取上清至新的Eppendorf管，4℃12000g离心5min，去除细胞及碎片，吸取上清精浆至新的Eppendorf管并-80℃冻存备用。

S2、相对定量参照的选择，步骤如下：

(1)化学合成：合成的秀丽隐杆线虫cel-miR-39-3p的序列为

5′-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3′。合成成品为干粉状态，-20℃以下可稳定保存一年。

(2)储存液的配制：瞬时离心，加入适量的无RNA酶水，振荡以充分溶解，配制成终浓度为20μM储存液，适量分装，-20℃保存，避免反复冻融。

(3)工作液的配制：将适量的储存液用无RNA酶水稀释100倍，配制成终浓度为200nM的工作液。-20℃保存，避免反复冻融。

S3、精浆总RNA提取，步骤如下：

(1)复温：取出-80℃冻存的精浆样本，于37℃水浴迅速复融，振荡以充分混匀。

(2)裂解：在新的Eppendorf管中加入0.75ml的适用于液体样本的酚和硫氰酸胍总RNA提取试剂TRIzol LS Reagent及0.25ml精浆样本。用移液器上下吹吸多次混匀。室温放置5min。

(3)加参照：加入200nM cel-miR-39-3p工作液5μl，充分混匀，室温静置5～10min。

(4)萃取：加入氯仿0.2ml，振荡15sec，室温放置2～3min。12000×g4℃离心15min。离心后形成底层的酚-氯仿相、中间的交界相及上层的无色水相。

(5)沉淀：转移上层水相至新的Eppendorf管中，加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀多次后，室温放置10min。12000×g 4℃离心10min。总RNA呈胶冻状沉淀于管底，弃上清。

(6)洗涤：用1ml 75％乙醇重悬沉淀。瞬时振荡，7500×g 4℃离心5min。弃上清。真空或空气中晾干RNA沉淀5～10min。

(7)溶解：加入50μl的无RNA酶水重悬RNA沉淀，60℃孵育15min得到精浆总RNA。

S4、引物设计，步骤如下：

采用茎环法设计合成piR-32678的逆转录引物的序列为:5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAAGTG-3’。

采用茎环法设计合成qPCR的通用引物的序列为：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGT。

采用茎环法设计合成piR-32678的qPCR特异引物的序列为:

5’-AACAAGCATTGATCATCGACACTT-3’；

cel-miR-39-3p的qPCR特异性引物的序列为：

5’-AACAGTGTCACCGGGTGTAAA-3’。

将上述piR-32678及cel-miR-39-3p的逆转录引物、qPCR的通用引物和qPCR的特异引物分别用无RNA酶水配制成100μM的储存液及10μM的工作液，得到piR-32678及cel-miR-39-3p的逆转录引物工作液、qPCR的通用引物工作液和qPCR的特异引物工作液。

S5、逆转录采用逆转录试剂盒FSQ-101ReverTra Ace qPCR RT Kit(Toyobo，日本)进行逆转录，步骤如下：

(1)变性：在每个0.2ml的PCR反应管中加入步骤S3中的1μl总RNA。每个样本的PCR反应管数＝目的小分子RNA个数+1(用于检测的cel-miR-39-3p参照)。65℃下反应5min，立刻放置冰上冷却。

(2)加样：piR-32678管加入0.5μl 10μM的步骤S4中的piR-32678的逆转录引物的工作液、2μl 5×逆转录缓冲液(RT Buffer)、0.5μl逆转录酶混合物(RT Enzyme Mix)、6μl无核酸酶水(Nuclease-free Water)。cel-miR-39-3p管加入0.5μl 10μM的步骤S4中的cel-miR-39-3p的逆转录引物的工作液、2μl 5×逆转录缓冲液(RT Buffer)、0.5μl逆转录酶混合物(RT Enzyme Mix)、6μl无核酸酶水(Nuclease-free Water)。

(3)逆转录反应：37℃条件下进行15min逆转录反应。98℃条件下进行5min的酶灭活反应。反应结束后，4℃短时保存或者-20℃长期保存。

(4)稀释：每管加入90μl无核酸酶水(Nuclease-free Water)稀释10倍，振荡混匀。

S6、荧光定量PCR检测：采用试剂盒Applied Biosystems SYBR Select MasterMix(Life，美国)进行qPCR，步骤如下：

(1)配液/加样：每孔加入10μl 2×染料法主反应液[SYBR Select Master Mix(2×)]，10μM的步骤S4中的qPCR的通用引物和步骤S4中对应的qPCR的特异引物各0.4μl，4μl已稀释的cDNA模板，及5.2μl无RNA酶水。

(2)扩增：50℃2min→95℃2min→(95℃15sec→60℃1min)×40cycles→熔解曲线。

(3)结果分析：得到如图1和图2所示的熔解曲线和扩增曲线，根据熔解曲线和扩增曲线判断扩增是否特异及有效。若熔解曲线为单峰，且出峰位置为靶基因对应峰位，表明为特异性扩增；若熔解曲线出现杂峰或单峰位置与靶基因峰位不吻合，表明为非特异扩增。有效的扩增曲线必须呈S型，且复孔间扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时对应的扩增循环数(Cycle Threshold，Ct)尽量一致，相差尽量不要超过0.5个Ct值(上限是1个Ct值)。对于特异有效的扩增，以2^-△△Ct分析靶基因的相对表达量。靶基因的相对表达量＝2^{-(实验组目的基因平均Ct值-实验组管家基因平均Ct值)-(对照组目的基因平均Ct值-对照组管家基因平均Ct值)}。

应用该体系检测可育男性及不育男性精浆piR-32678水平，qRT-PCR结果显示，与可育男性[1(0.83，1.42)]相比，少精子症组[3.22(2.55，6.34)，U＝23.50，P＜0.001]和非梗阻性无精子症组[2.31(1.65，3.02)，U＝24.00，P＝0.003]精浆中piR-32678的相对表达量显著上调；而梗阻性无精子症组精浆中piR-32678的相对表达量无统计学差异[0.92(0.54，2.55)，U＝142.00，P＝0.973]。如图3所示，ROC曲线分析piR-32678诊断生精障碍的曲线下面积为0.891(95％CI，0.812～0.970，P<0.001)。当piR-32678的相对表达量临界值(cut off value)设定为1.53时，该指标诊断生精障碍的灵敏度和特异性分别为0.960和0.757。

该准确的精浆ncRNA相对定量检测方法，为临床睾丸储备功能的评估提供一种新的无创的分子标志物，为男性不育的病因诊断以及评估男性不育合适的治疗方式提供潜在的工具，亦为精子发生障碍的分子机制研究奠定基础，具有重要的临床应用价值和意义。

在本说明书的描述中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“具体实施例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或实例。而且，描述的具体特征、结构、材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 深圳中山泌尿外科医院

<120> 一种piRNA及用于检测和或预测男性生殖功能障碍的试剂盒

<141> 2020-03-21

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 52

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacnnnnnn nn 52

<210> 2

<211> 50

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccaagtg 50

<210> 3

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gtcgtatcca gtgcagggt 19

<210> 4

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

aacaagcatt gatcatcgac actt 24

Claims (7)

1.一种piRNA的逆转录引物，其特征在于，所述piRNA的逆转录引物的序列为

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACNNNNNNNN-3’，其中：

序列NNNNNNNN为piRNA3’端反向互补的6-8个碱基。

2.根据权利要求1所述的piRNA的逆转录引物，其特征在于，所述piRNA为piR-32678,所述piR-32678的逆转录引物的序列为:

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAAGTG-3’。

3.一种qPCR的通用引物，其特征在于，所述qPCR的通用引物的序列为5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGT。

4.一种piR-32678的qPCR的特异引物，其特征在于，所述qPCR的特异引物的序列为5’-AACAAGCATTGATCATCGACACTT-3’。

5.piR-32678在制备判断男性无精子症与少精子症的检测试剂中的应用。

6.检测piR-32678的引物在制备判断男性无精子症与少精子症的检测试剂中的应用。

7.一种用于检测和/或预测男性生殖障碍的试剂盒，其特征在于，包括秀丽隐杆线虫cel-miR-39-3p以及SYBR Green Real-timePCR法检测piR-32678和cel-miR-39-3p的引物，其中：

秀丽隐杆线虫cel-miR-39-3p的序列为5′-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3′。

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