CN117385009A - 基于滚环转录和CRISPR-Cas13a级联剪切检测piRNA的探针组及方法 - Google Patents

基于滚环转录和CRISPR-Cas13a级联剪切检测piRNA的探针组及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于滚环转录和CRISPR‑Cas13a级联剪切检测piRNA的探针组及方法，属于生物分析检测技术领域，利用T7 RNA聚合酶介导滚环转录扩增技术获得串联式引导链RNA序列，在此基础上通过CRISPR‑Cas13a的顺式切割和反式切割的级联剪切机制，切割荧光探针产生相关靶标的荧光报告信号，其中滚环DNA序列中各部分的组成及设计是构建高效CRISPR‑Cas13a串联式激活信号扩增体系的关键，可以替换不同男性不育高度相关piRNA序列实现多种piRNA的同时检测，以解决常规技术中多重检测反应体系复杂的问题，建立一种新型多重快速核酸检测平台技术。

Description

基于滚环转录和CRISPR-Cas13a级联剪切检测piRNA的探针组 及方法
技术领域
本发明涉及生物分析检测技术领域，具体涉及一种基于滚环转录和CRISPR-Cas13a级联剪切检测piRNA的探针组及方法。
背景技术
男性不育症的诊断主要基于世界卫生组织推荐的传统精液参数，包括精子浓度、活力和形态、精浆生化指标、血液中性激素水平、染色体核型和Y染色体微缺失等、精液量、pH值。精液是精子和精管、附睾和副腺的液体的粘稠混合物。由于精液可以相对容易地获得，因此寻找无创的精液生物标志物是合理的。然而，一些研究表明，常规精液分析不能准确区分有生育能力和不育的男性。更重要的是，传统的方法侧重于宏观和表面的检查，对病因无法解释，准确性有缺陷，尚不能精确诊断男性不育，忽略了男性不育的内在原因。因此，在精液中寻找对男性不育症具有高特异性和敏感性的新生物标志物，并为这种疾病的分子机制提供额外的信息是很重要的，选择临床价值更高的男性不育标志物并构建高性能检测技术迫在眉睫。
PIWI蛋白相互作用RNA（PIWI-interacting RNA，piRNA）是一类长度为18~31 nt的非编码小RNA，特异性表达于动物的生殖细胞中，与PIWI蛋白结合形成piRNA介导的沉默复合体(piRNA-induced silencing complexes，piRISC)，在配子发生过程中行使重要的功能。研究表明，精浆中的piRNA反映的是整个生精过程中的病理和生理状况，有望通过液体活检技术实现男性生殖障碍和不孕症的非侵入性诊断，其检测结果相对于传统诊断靶标更具有临床指导意义。
传统的piRNA检测方法有RNA印迹（Northern blotting）、PCR、qPCR和测序技术。RNA印迹是分析piRNAs表达最早尝试的方法，这种基于探针杂交技术的方法特异性和灵敏度不高，耗时且需要大量的RNA样本；聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）和实时荧光定量PCR（Real time quantitative PCR，qPCR）虽然具有技术成熟、价格低廉且灵敏度高等优点，且已成为某些疾病检测的金标准，但存在非特异扩增、设备昂贵、需要专门的PCR实验室和熟练的操作人员、检测成本高、检测时间长等局限，无法实现高灵敏度、高特异性、快速的便携式检测。而测序技术除了依赖测序仪器，还需要较长的时间。
目前对高灵敏度、快速、居家检测的需求尤为迫切，以解决专业人员短缺、检测结果等候时间长和检测可靠性低等问题。近年来，CRISPR为代表的基因编辑酶（Cas12/13）核酸检测技术，解决了核酸检测中的假阳性等问题，被誉为“下一代分子诊断技术”，然而该体系存在引导链RNA合成昂贵且易降解、多重检测反应体系复杂等诸多问题，限制了其临床应用。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出了一种基于滚环转录和CRISPR-Cas13a级联剪切检测piRNA的探针组及方法，利用T7 RNA聚合酶介导滚环转录扩增技术获得串联式引导链RNA序列，以解决引导链RNA合成昂贵的问题，在此基础上通过CRISPR-Cas13a的顺式切割和反式切割的级联剪切机制，切割荧光探针产生相关靶标的荧光报告信号，建立一种新型多重快速核酸检测技术，实现滚环转录扩增-激活-剪切“一管式”恒温反应，能够有效避免CRISPR检测的开盖步骤，有效控制了环境污染。
为达到上述目的，本方案首先提出了一种基于滚环转录和CRISPR-Cas13a级联剪切检测piRNA的探针组，其特征在于，包括环状双链DNA模板、T7 RNA聚合酶、Lbu Cas 13a酶和RNA荧光探针；所述环状双链DNA模板由线性单链DNA、T7启动子混合孵育形成双链DNA、再加入DNA连接酶反应形成，所述Lbu Cas 13a酶被靶标piRNA激活顺式切割和反式切割活性实现对靶标piRNA的检测；
所述线性单链DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述T7启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
作为优选，所述靶标piRNA的基因序列包括如SEQ ID NO.3所示。
作为优选，所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶。
基于一个总的发明构思，本方案还提出了一种探针组用于非诊疗目的检测piRNA的方法，包括以下步骤：
S1、探针序列预处理：将线性单链DNA探针、T7启动子冻干粉溶解后稀释，在缓冲液中孵育形成双链DNA；
S2、形成环状双链DNA：将S1制备的双链DNA与T4 DNA连接酶混合反应得到环状双链DNA；
S3、滚环转录：往S2步骤得到的体系中加入 T7 RNA 聚合酶、NTP 混合液在缓冲液中均匀混合反应；
S4、Cas13a-crRNA-Target三元复合物的形成和荧光检测：往S3步骤得到体系中加入Lbu Cas 13a，在缓冲液中反应，再加入待测样本反应，最后加入RNA荧光探针反应，荧光分光光度计进行检测。
作为优选，所述S1步骤中线性单链DNA与T7启动子稀释后摩尔比为1:1，所述缓冲液pH为7.8，包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、MgCl2、二硫苏糖醇和ATP，所述孵育温度为95℃，孵育时间为5 min。
作为优选，所述S2步骤中T4 DNA连接酶的浓度为0.5U/µL，反应温度为22℃，反应时间为30min。
作为优选，所述S3步骤中T7 RNA 聚合酶浓度为0.5U/µL ；所述NTP 混合液浓度为2.5mM；所述缓冲液pH为8.0，包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、MgCl2、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦盐酸盐和植物亚精胺。
作为优选，所述S4步骤Lbu Cas 13a与RNA荧光探针的浓度比为1:10；所述缓冲液pH为8.3，包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、MgCl2和KCl；所述缓冲液中反应温度为37℃，反应时间为20min；所述荧光分光光度计设定激发波长EX=490nm，发射波长EM=522nm。
本方案实现滚环转录扩增-激活-剪切“一管式”检测的原理为：
本方案利用T7 RNA聚合酶介导滚环转录技术直接合成串联式引导链RNA重复序列（pre-crRNA），一次滚环转录形成长链RNA（pre-crRNA），包含数以千计的crRNA重复单位，能够为Cas13a提供成百上千个串联式引导链RNA作为结合位点，构建CRISPR-Cas13a串联式激活信号扩增体系，其中滚环DNA序列中各部分的组成及设计是构建高效CRISPR-Cas13a串联式激活信号扩增体系的关键，具体检测原理为：首先通过线性单链DNA和T7启动子构建用于滚环转录的环状DNA，其中线性单链DNA是一种5 '磷酸化的单链DNA，被设计为包含：①连接5 '和3 '末端连接后形成与T7启动子互补序列的连接区（5 '端序列5 '-ATAGTGAGTCGTATTA-3 '和3 '端序列5 '-ATCCCT-3 '）；②转录出crRNA的引导区（5 '-GTACAGGTTGGACAGCAGCTCCGAGAAG-3 '）；③转录出crRNA的发夹侧翼序列（5 '-GTTTT-3 '、5'-GGTC-3 '）、转录出crRNA的发夹颈部序列（5 '-AGTCCCC-3 '、5 '-GGGGT-3 '）其中发夹颈部有2-nt的凸起的颈环、转录出crRNA的发夹头部序列（5 '-TTCATTTTT-3 '）。DNA长链与T7启动子序列经过退火形成未完全封闭的环状双链DNA，环状双链DNA将被T4 DNA连接酶连接，形成完整的环状DNA模板，在T7 RNA聚合酶的驱动下，对环状DNA模板进行滚动循环转录，转录出具有重复发夹结构的pre-crRNA链；Lbu Cas 13a识别并结合转录出的pre-crRNA，切割有重复发夹结构的RNA链形成成熟的crRNA，Lbu Cas 13a与crRNA形成Cas 13a-crRNA二元体复合物，二元复合物与靶标RNA结合形成三元复合物，激活Lbu Cas 13a的顺式切割活性切割靶标RNA，完成后激活Lbu Cas 13a的反式切割活性，切割三元复合物附近游离的单链RNA荧光探针，产生荧光信号，顺势切割靶标是激活反式切割活性所必需的，靶标被部分切割后激活其反式切割活性，从而可以切割荧光探针。仅需替换不同男性不育高度相关piRNA序列，即可实现多种piRNA的同时检测，以解决常规技术中多重检测反应体系复杂的问题。
Cas13a的级联切割包括Cas13a酶切pre-crRNA与后面的Cas13a顺势切割和反式切割三者的级联。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本方案解决现有CRISPR技术中引导链RNA合成昂贵且易降解、多重检测反应体系复杂等诸多问题，创新性的利用T7 RNA聚合酶介导滚环转录技术直接合成串联式引导链RNA重复序列，能够为Cas13a提供成百上千个串联式引导链RNA作为结合位点，构建CRISPR-Cas13a串联式激活信号扩增体系。
（2）本方案巧妙的设计了滚动循环转录的环状双链DNA模板，其中线性单链DNA包含T7启动子互补序列的连接区，可以转录出靶标链互补的crRNA引导区、crRNA发夹侧翼和发夹颈部的序列。
（3）本方案提供的检测体系充分利用 CRISPR-Cas13a的顺式切割和反式切割的级联剪切机制和滚环转录扩增技术有效结合起来，开发基于精浆的“一管式”男性不育特异性piRNA精准定量检测技术，它具有快速、准确、经济、不依赖昂贵设备等优势，可实现男性不育标志物piRNA的高效、精准及快速的检测。
（4）具有较强的通用性及宽的应用领域，可针对不同疾病特异性piRNA设计特定的滚环DNA，即可利用构建的T7 RNA聚合酶介导滚环转录扩增和CRISPR-Cas13a串联式激活信号扩增系统实现该疾病相关piRNA的高灵敏检测，该技术体系通用性强、应用领域宽，可有效解决常规技术中多重检测反应体系复杂的问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1探针检测实验原理示意图；
图2为实验1探针组对靶标RNA的特异性选择分析；
图3为实验2探针组检测体系的可行性分析；
图4为实验3探针组检测不同浓度piR-hsa-14荧光强度曲线图；
图5为实验3探针组检测不同浓度piR-hsa-14的荧光强度趋势图；
图6为实验3探针组检测不同浓度piR-has-14响应校准曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
本发明涉及到的百分号“%”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100 mL溶液中含有溶质的克数。
本发明所述重量份可以是μg、mg、g、kg等本领域公知的重量单位，也可以是其倍数，如1/10、1/100、10倍、100倍等。
本发明涉及到的探针均购自上海生工生物工程股份有限公司，以下实施例和实验例中所使用的探针序列如表1所示：
其中，pre-crRNA序列中下划线部分为切割位点。
实施例1
基于T7 RNA聚合酶介导滚环转录和CRISPR-Cas13a级联剪切检测piRNA的步骤如下：
S1、探针序列预处理：用DEPC水分别将线性单链DNA、T7启动子靶标RNA冻干粉配置成100 µM溶液。分别移取10nM 线性单链DNA和T7启动子按摩尔比1：1，混匀在200 µL的离心管中，在缓冲液（pH 7.8，40mM Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐），10mM MgCl2，10mMDTT（二硫苏糖醇），0.5mM ATP）中，95℃孵育5 min，经过2小时缓慢冷却至室温，充分形成DNA双链结构，4℃保存备用。
S2、滚环转录的环状DNA的形成：取退火后的双链DNA与0.5U/µL的T4 DNA连接酶均匀混合，反应总体积10 µL，在22℃反应30min，使有缺口的环状双链DNA充分闭合。
S3、滚环转录：向S2步骤得到体系中加入0.5U/µL T7 RNA聚合酶、2.5mM NTP 混合液在缓冲液 （pH 8.0，40 mM Tris-HCl，20mM MgCl2，10 mM DTT，2.5mM TCEP（三(2-羧乙基)膦盐酸盐），2 mM spermidine（植物亚精胺））中均匀混合，反应总体积15µL，37℃反应1h，转录出具有重复发夹结构的RNA链。
S4、Cas13a-crRNA-Target三元复合物的形成和荧光检测：向S3步骤得到体系中加入100 nM Lbu Cas 13a，在缓冲液（pH 8.3，40mM Tris-HCl，1.5mM MgCl2，50mM KCl）中37℃反应20min，Cas 13a与转录出的pre-crRNA发夹结构结合切割后形成成熟的crRNA结合形成Cas13a-crRNA二元体复合物。加入不同浓度的靶标RNA，37℃下反应20min，Cas 13a-crRNA二元复合物与靶标RNA结合形成三元复合物，激活反式切割活性，然后在1µM RNA荧光探针浓度下，37℃反应20min，于RF-6000荧光分光光度计进行检测，设定激发波长EX=490nm，在发射波长EM=522nm处有最大荧光信号。
图1为本实施例检测piRNA的原理图。
实验1
该探针组检测体系对靶标RNA的特异性分析
为了考察本方案检测男性不育相关piRNA中 piR-hsa-14的特异性，选取了c-myc、GaINAc-T、k-ras、survlvin 4条mRNA序列，与piR-hsa-14进行对照，各浓度为100pM，以此验证以CRISPR/Cas13a为核心的识别元件的特异性。在同一最优条件下，分别在EM=522处测得各自信号值，5次平行实验。
结果如图2所示，加入100pM 靶标RNA反应完成后的荧光强度明显高于等浓度的其他序列，实验表明，该技术对男性不育相关piRNA具有较高的特异性选择。
实验2
该探针组检测体系的可行性分析
为了考察本方法对男性不育相关piRNA检测原理的可行性，设计了8组实验进行验证，对关键影响因素进行分析。设置第1组为不加入T4 DNA连接酶、T7 RNA聚合酶和Cas13a，第2组不加入T4 DNA连接酶，第3组不加入T7 RNA聚合酶，第4组不加入Cas13a，第5组为不加入Target的空白对照，第6组不加入荧光链，第7组为单独的荧光链的荧光信号背景，第8组为正常实验组，变量均采用加入与其等体积缓冲溶液作为替代。可行性实验组别的靶标浓度均为100nM。
结果如图3所示，1~6组未说明的条件都与实验组保持一致。第1，3，4组均不能形成crRNA，第5组不能激活Cas13a的反式切割活性，第6组因没有荧光链检测不到荧光信号，第7组为单独的荧光链的荧光信号背景。第8组为正常实验组正常识别靶标，通过形成Cas13a-crRNA-Target三元复合物激活Cas13a的反式切割活性，切割附近游离的单链RNA荧光探针，产生很强的荧光信号。第2组不加T4 DNA连接酶的情况下荧光信号的产生是因为虽然DNA长链没有形成闭合圆环但在T7 RNA聚合酶的作用下T7启动子仍能进行转录扩增但其效率较低不能连续转录，因此其荧光强度明显不如加入了T4 DNA连接酶的荧光强度。该实验结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致，进一步验证实验原理的可行性。该结果证明只有当靶标RNA存在时，有很高的荧光信号，该体系可用于男性不育相关piRNA的检测。
实验3
piRNA标准样品的定量检测
为考察该检测方法在实际样品检测中的检测性能，采用实施例1的检测方法对0、100fM、200fM、500fM、1pM、10pM、50pM、100pM、500pM、1nM、10nM的piR-has-14在不同的波长处进行检测，平行重复7次实验，并绘制荧光强度曲线。
结果如图4-6所示，图4为不同浓度piR-hsa-14荧光强度曲线图，荧光强度随着靶标RNA的浓度增加而增加，并且在发射波长522nm处有最大荧光信号。
图5为不同浓度piR-hsa-14的荧光强度趋势图，当piR-hsa-14低于1nM时，在EM=522处的吸收峰随着piR-hsa-14浓度的增加而增大，在1nM以后趋于饱和，达到最高吸收峰值，随后信号值略有波动，但总体趋于稳定。
图6为不同浓度piR-has-14响应校准曲线，表明piR-hsa-14的浓度在100 fM-50pM之间有较好的线性趋势，且曲线回归方程为y= 1723.7688C（piR-hsa-14)-3215.6574（y为实验组荧光强度-浓度为0时的荧光强度），线性相关系数R² = 0.9987，检出限为0.521fM(LOD=3σ/S )，该检测方法实现了piR-hsa-14超灵敏检测。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (6)

1.一种基于滚环转录和CRISPR-Cas13a级联剪切检测piRNA的探针组，其特征在于，包括环状双链DNA模板、T7 RNA聚合酶、Lbu Cas 13a酶和RNA荧光探针；所述环状双链DNA模板由线性单链DNA、T7启动子混合孵育形成双链DNA、再加入DNA连接酶反应形成，所述Lbu Cas13a酶被靶标piRNA激活顺式切割和反式切割活性实现对靶标piRNA的检测；
所述线性单链DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述T7启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述靶标piRNA的基因序列如SEQ ID NO.3所示；
所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶。
2.一种如权利要求1所述探针组用于非诊疗目的检测piRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、探针序列预处理：将线性单链DNA探针、T7启动子冻干粉溶解后稀释，在缓冲液中孵育形成双链DNA；
S2、形成环状双链DNA：将S1制备的双链DNA与T4 DNA连接酶混合反应得到环状双链DNA；
S3、滚环转录：往S2步骤得到的体系中加入 T7 RNA 聚合酶、NTP 混合液在缓冲液中均匀混合反应；
S4、Cas13a-crRNA-Target三元复合物的形成和荧光检测：往S3步骤得到体系中加入Lbu Cas 13a，在缓冲液中反应，再加入待测样本反应，最后加入RNA荧光探针反应，荧光分光光度计进行检测。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述S1步骤中线性单链DNA与T7启动子稀释后摩尔比为1:1，所述缓冲液pH为7.8，包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、MgCl2、二硫苏糖醇和ATP，所述孵育温度为95℃，孵育时间为5 min。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述S2步骤中T4 DNA连接酶的浓度为0.5U/µL，反应温度为22℃，反应时间为30min。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述S3步骤中T7 RNA 聚合酶浓度为0.5U/µL ；所述NTP 混合液浓度为2.5mM；所述缓冲液pH为8.0，包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、MgCl2、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦盐酸盐和植物亚精胺；所述反应温度均为37℃，反应时间为1h。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述S4步骤Lbu Cas 13a与RNA荧光探针的浓度比为1:10；所述缓冲液pH为8.3，包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、MgCl2和KCl；所述缓冲液中反应温度为37℃，反应时间为20min；所述荧光分光光度计设定激发波长EX=490nm，发射波长EM=522nm。
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