发明内容
本发明的目的是通过筛查与男性精子活力密切相关的piRNA的特异性变化及piRNA生成相关蛋白的变化(如MitoPLD),筛选出因精子活力低导致的男性不育人群和正常健康生育人群中表达差异显著的精子piRNA及piRNA生成相关蛋白(如MitoPLD),通过检测这些piRNA和piRNA生成蛋白(如MitoPLD),为诊断男性精子活力提供新指标和方法。目前,本发明已发现精子中能够检测到高浓度的piRNA,并且发现特异性的piRNA组合与精子活力密切相关,能作为男性因精子活力低导致生殖功能障碍的分子标志物,具有很高的特异性和灵敏性。同时本发明发现MitoPLD蛋白在活力低下的精子中表达量下降,也能作为男性因精子活力低导致生殖功能障碍的分子标志物。精子piRNA和MitoPLD蛋白作为新的生物标志物,在检测男性精子活力方面具有重要的指导意义,能显示出分子水平的遗传信息,有助于揭示男性精子活力降低的分子机制。
本发明的上述目的是采用以下技术方案来实现的:
与男性生殖功能障碍相关的生物标志物,包含MitoPLD蛋白,该蛋白在NCBI数据库中的登录号为NM_178836.3;所述的男性生殖功能障碍为弱精症。
与男性生殖功能障碍相关的生物标志物还优选包括下列piRNA中的任意一种或多种:
piR-hsa-28131、piR-hsa-1207、piR-hsa-23317、piR-hsa-27493、piR-hsa-2107、piR-hsa-25783、 piR-hsa-2106、piR-hsa-25781、piR-hsa-18709、piR-hsa-25780。
piRNA |
对应的核苷酸序列 |
piR-hsa-28131 |
GGCAUUGGUGGUUCAGUGGUAGAAUUCUCGC(SEQ ID NO.1) |
piR-hsa-1207 |
AGCAUUGGUGGUUCAGUGGUAGAAUUCUCGC(SEQ ID NO.2) |
piR-hsa-23317 |
CCGCCUGGGAAUACCGGGUGCUGUAGGCUUA(SEQ ID NO.3) |
piR-hsa-27493 |
GCAUUGGUGGUUCAGUGGUAGAAUUCUCAC(SEQ ID NO.4) |
piR-hsa-2107 |
AUUGGUGGUUCAGUGGUAGAAUUCUCGCCUG(SEQ ID NO.5) |
piR-hsa-25783 |
UUGGUGGUUCAGUGGUAGAAUUCUCGCCUGCC(SEQ ID NO.6) |
piR-hsa-2106 |
AUUGGUGGUUCAGUGGUAGAAUUCUCGCC(SEQ ID NO.7) |
piR-hsa-25781 |
UUGGUGGUUCAGUGGUAGAAUUCUCGCCUG(SEQ ID NO.8) |
piR-hsa-18709 |
UGGUGGUUCAGUGGUAGAAUUCUCGCCUG(SEQ ID NO.9) |
piR-hsa-25780 |
UUGGUGGUUCAGUGGUAGAAUUCUCGCCU(SEQ ID NO.10) |
与男性生殖功能障碍相关的生物标志物进一步优选包括MitoPLD蛋白及piR-hsa-1207 和piR-hsa-2107。
一种用于检测和预测男性生殖功能障碍的试剂盒,包含Western blot法和ELISA法检测精子MitoPLD蛋白的试剂。
本发明所述的试剂盒,还优选包含使用TaqMan探针Real-time PCR法检测piR-hsa-1207 和piR-hsa-2107的探针和引物。
本发明所述的生物标志物在制备以精子为检测对象用于诊断和/或预测男性生殖功能障碍的检测试剂中的应用。
Western blot法和ELISA法检测精子MitoPLD蛋白的试剂在制备以精子为检测对象用于诊断和/或预测男性生殖功能障碍的检测试剂中的应用。
Western blot法和ELISA法检测精子MitoPLD蛋白的试剂以及检测piR-hsa-1207和 piR-hsa-2107的TaqMan探针和引物在制备以精子为检测对象用于诊断和/或预测男性生殖功能障碍的检测试剂中的应用。
上述piRNA组合的筛选方法包括以下步骤:
(1)收集精子样本,包括精子活力正常生育男性以及精子活力弱的生殖功能障碍男性的精子样本,并提取总RNA;
(2)采用高灵敏度、精确性和高重复性的高通量二代测序技术(high-throughputsequencing technology),对上述RNA进行检测,初步筛选出精子活力低下与正常生育男性精子中表达差异显著的一组piRNA(精子含量高且差异显著的前10个piRNA,筛选标准为精子中含量最高的前10个piRNA并且在弱精症中相对正常对照降低1.5倍以上);
(3)进一步使用实时荧光定量PCR方法验证(最终确定piR-hsa-1207和piR-hsa-2107 为最优化组合)。
具体来说,上述筛选方法包括以下步骤:(1)分别收集正常生育男性及精子活力弱的生殖功能障碍男性的精子,并提取总RNA;(2)根据piRNA database中已有的piRNA,对上述RNA进行高通量二代测序检测,检测范围为10~45个核苷酸的全部小RNA,初筛出正常男性与精子活力弱男性精子中表达差异明显的一组piRNA(精子含量高且差异显著的前10个piRNA,筛选标准为精子中含量最高的前10个piRNA并且在弱精症中相对正常对照降低1.5倍以上);(3)从个体精子中提取RNA,逆转录成cDNA,采用荧光定量PCR (TaqMan探针法)方法进一步对初筛出的piRNA进行验证,挑选出稳定、特异性变化的 piRNA作为检测精子活力的生物标志物(最终确定piR-hsa-1207和piR-hsa-2107为最优化组合),特异性检测和预测弱精症男性生殖功能障碍疾病。
一种与男性生殖功能障碍相关的piRNA生成相关蛋白MitoPLD;其中,所述的男性生殖功能障碍选自弱精症。
上述MitoPLD蛋白筛选方法包括以下步骤:
(1)收集精子样本,包括精子活力正常生育男性以及精子活力弱的生殖功能障碍男性的精子样本,并提取总蛋白;
(2)使用Western blot的方法检测MitoPLD蛋白表达差异,以β-actin作为内参;
(3)使用ELISA的方法检测MitoPLD蛋白表达差异。
本发明使用的piRNA检测方法可以选自:高通量二代测序技术(high-throughputsequencing technology)、Real-time PCR方法以及生物芯片方法中的一种或几种。例如,精子中piRNA分子的检测方法包括以下步骤:
(1)使用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取精子中总RNA;
(2)通过将RNA逆转录得生成cDNA;
(3)根据人piRNA序列设计引物及TaqMan探针,进行PCR反应对piRNA进行精确定量检测;
(4)比较精子活力低下男性精子相对于正常男性精子中piRNA的量的变化。
有益效果:
本发明所述的piRNA组合和单个piRNA及其对应的探针组合和MitoPLD蛋白可应用于男性生殖功能障碍的检测中,例如为男性生殖功能障碍补充新的检测指标、用于病程监测、预后和药效评价之中。本发明具有以下几个方面的有益效果:
第一,精子piRNA及精子MitoPLD蛋白检测方便易行,精子样本相对其它组织较易获得,与睾丸活检或者睾丸穿刺相比,属于无创性检查,极大地方便了医疗人员的使用,减轻了患者的痛苦;精子piRNA及精子MitoPLD蛋白的测试方法属于医院检验科常规技术,无特别高的技术门槛和应用障碍,利于推广;
第二,精子中的piRNA和MitoPLD蛋白反映的是整个生精过程中的病理和生理状况,其检测结果更具有临床指导意义;
第三,精子piRNA和MitoPLD蛋白检测能在分子水平上反映精子发生中的状态,提高了检测的准确水平,并为男性生殖功能障碍尤其是生精功能障碍的治疗提供了潜在靶点;
第四,piRNA的3’端被甲基化修饰,相对其它未被修饰过的RNA更加稳定,这为样本处理及检测提供了方便,即靶标分子受环境及外界因素影响较小,利于实际应用的展开;
第五,piRNA及MitoPLD蛋白组合检测精子的活力的优点,在于通过多个piRNA同时检测,同时偶联piRNA相关蛋白检测,通过核酸和蛋白二个生物层面上同时鉴定,显著提高了检测的准确性。
综上所述,检测精子中的piRNA和MitoPLD蛋白,简单易行且效果突出,从精子piRNA 的特异性变化和MitoPLD蛋白表达差异这一新角度出发,发现精子活力并且区分男性生殖功能障碍,从而建立起一种检测生精功能障碍的新技术。该技术仅仅需要病人的精子而不需要任何其它组织,通过简单的piRNA组合和单个piRNA及MitoPLD蛋白来预测男性精子活力强弱及预测生殖功能障碍发生的可能性。由此可见,检测精子piRNA水平和MitoPLD 蛋白水平能评估精子活力及由精子活力引起的男性生殖功能障碍,这些精子piRNA和 MitoPLD蛋白的表达水平有望成为诊断男性精子活力的重要标志分子,具有极重要的临床应用价值。
实施例4:Western blot法测定精浆子中MitoPLD的特异性表达差异作为精子活力的生物标志物
针对MitoPLD蛋白的检测,提取单个样本精子中总蛋白或提取混合精子的总蛋白,测定蛋白浓度后进行Western blot检测,以β-actin作为内参,然后根据结果使用灰度分析及统计数据。单个样本结果见图4A,混合样本(各10例样本)结果见图4B检测,可见MitoPLD蛋白在弱精症患者和正常人精子中差异表达,MitoPLD蛋白能够作为精子活力的生物标志物。
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<110> 南京优智源医药科技有限公司
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