CN113970640B - 用于ich预后评估的生物标记物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本公开提供一种用于ICH预后评估的生物标记物及其应用。具体来说，本公开提供一种检测至少一种外周血浆或外泌体蛋白，或至少一种外泌体micro RNA的试剂在制备用于预测、诊断或监测短暂性脑缺血发作的试剂或试剂盒中的应用。本公开提供的技术方案，形成新的生物标记物组，有助于更好地了解ICH的病理生理，将为诊断和预后提供新的机会，从而改善ICH患者的临床服务。

Description

用于ICH预后评估的生物标记物及其应用
技术领域
本公开涉及医学生物领域。具体来说，本公开涉及生物标记，及它们在诊断脑损伤或脑部相关损伤中的应用，尤其是在诊断脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)中的应用，并且涉及生物标记在个体中用于检测、预测或监测脑出血的方法。
背景技术
脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)是指非外伤性脑实质内血管破裂引起的出血，占全部脑卒中的20％～30％，急性期病死率为30％～40％。发生的原因主要与脑血管的病变有关，即与高血脂、糖尿病、高血压、血管的老化、吸烟等密切相关。脑出血的患者往往由于情绪激动、费劲用力时突然发病，早期死亡率很高，幸存者中多数留有不同程度的运动障碍、认知障碍、言语吞咽障碍、偏瘫等后遗症。ICH后血肿分解释放多种活性物质对脑组织具有损害作用，包括局部脑血流和代谢的变化、脑水肿、血脑屏障的损害及对脑细胞的毒性损伤等。目前临床上尚无有效干预脑血肿或者脑水肿的手术或药物。
在ICH急性期，出血作为一个迅速扩大的颅内团块直接破坏神经元的结构和直接压缩周围的组织造成伤害，这个时期进行及时处理非常关键，可以阻止组织的进一步损害，而找到预示病情变化的标志物也成了关键点。目前对ICH标志物的研究进行了很多，但是仍没有确定的、被临床认可的标记物。因此，寻找预测ICH预后和复发的生物标志物已成为ICH管理的一个主要挑战。
单一组学数据分析通常用来解释某种特征性的生化指标与某些疾病之间的关联，但无法说明其中复杂的因果关系。技术的进步催生了“组学时代”，这使得我们能够在不同的分子水平上收集和整合数据和信息。这些多组学数据的整合意味着可以同时研究成千上万的蛋白质(蛋白质组学)、基因(基因组学)、RNA(转录组学)和代谢物(代谢组学)。人工智能将提供对复杂生物系统的新见解，并揭示所有分子水平之间的相互作用网络。这种方法将多个分子水平的实验数据与计算模型相结合，并将系统作为一个整体进行处理，以利于进行诊断、预后或治疗价值的数据识别。
生物标记物可提示ICH病理生理过程，对ICH的早期卒中复发风险具有预测价值，为临床诊断及治疗提供依据。但是至今尚无公认的对ICH预后预测价值高的生物标记物，无法满足临床需求。因此，寻找快速准确的ICH预后的生物学标记物具有重要的临床应用前景。与此同时，通过组学技术获得的数据信息与临床信息整合将有助于更好地了解ICH病理机制、并发现新的生物标记物，从而改善ICH患者的管理。
发明内容
发明要解决的问题
本公开通过包括多组学在内的多维度分析，认识ICH患者的预后影响因素，早期评估和识别高危患者，筛选新的生物标记物检测组合(biomarker panel)，用于指示ICH的良好预后，进而寻找新的干预靶点。
用于解决问题的方案
本公开提供了如下技术方案。
(1)检测至少一种外周血浆或外泌体蛋白，或至少一种外泌体micro RNA的试剂在制备用于预测、诊断或监测脑出血的试剂或试剂盒中的应用，
其中，所述至少一种外周血浆或外泌体蛋白选自FGF-14,TSP4,GRB2,SKAP55-R,SNAP-23,NAP22,Fetuin,PEBP1,DEP-1,HSP27,ANG,SAA1,FKBP,Lectin,CD31,SFN,filamin,fibulin-1D,BAIAP2,CaM，haptoglobin alpha1S,BLMH,ENO1,TMSB4X或其任意组合；所述至少一种外泌体micro RNA选自hsa-miR-146a-5p,hsa-miR-320a-3p,hsa-miR-222-3p,hsa-miR-223-3p,hsa-miR-21-5p,hsa-miR-127-3p,hsa-miR-34a-5p,hsa-miR-27a-3p,hsa-miR-342-3p,hsa-miR-378a-3p,hsa-miR-197-3p,hsa-miR-3074-5p或其任意组合。
在一个具体的实施方式中，所述至少一种外周血浆或外泌体蛋白选自TMSB4X、ENO1、FLN-α、Grb2或其任意组合。
(2)一种用于确定受试者的脑出血风险的生物标记物组，所述生物标记物组选自至少一种外周血浆或外泌体蛋白，或至少一种外泌体micro RNA；其中，
所述至少一种外周血浆或外泌体蛋白选自FGF-14,TSP4,GRB2,SKAP55-R,SNAP-23,NAP22,Fetuin,PEBP1,DEP-1,HSP27,ANG,SAA1,FKBP,Lectin,CD31,SFN,filamin,fibulin-1D,BAIAP2,CaM，haptoglobin alpha1S,BLMH,ENO1,TMSB4X或其任意组合；所述至少一种外泌体micro RNA选自hsa-miR-146a-5p,hsa-miR-320a-3p,hsa-miR-222-3p,hsa-miR-223-3p,hsa-miR-21-5p,hsa-miR-127-3p,hsa-miR-34a-5p,hsa-miR-27a-3p,hsa-miR-342-3p,hsa-miR-378a-3p,hsa-miR-197-3p,hsa-miR-3074-5p或其任意组合。
在一个具体的实施方式中，所述至少一种外周血浆或外泌体蛋白选自TMSB4X、ENO1、FLN-α、Grb2或其任意组合。
(3)一种预测受试者脑出血的方法，所述方法包括：定量来自受试者的样品中的至少一种外周血浆或外泌体蛋白，或至少一种外泌体micro RNA的表达量，进而预测受试者是否具有脑出血的风险；其中，
所述至少一种外周血浆或外泌体蛋白选自FGF-14,TSP4,GRB2,SKAP55-R,SNAP-23,NAP22,Fetuin,PEBP1,DEP-1,HSP27,ANG,SAA1,FKBP,Lectin,CD31,SFN,filamin,fibulin-1D,BAIAP2,CaM，haptoglobin alpha1S,BLMH,ENO1,TMSB4X或其任意组合；所述至少一种外泌体micro RNA选自hsa-miR-146a-5p,hsa-miR-320a-3p,hsa-miR-222-3p,hsa-miR-223-3p,hsa-miR-21-5p,hsa-miR-127-3p,hsa-miR-34a-5p,hsa-miR-27a-3p,hsa-miR-342-3p,hsa-miR-378a-3p,hsa-miR-197-3p,hsa-miR-3074-5p或其任意组合。
在一个具体的实施方式中，所述至少一种外周血浆或外泌体蛋白选自TMSB4X、ENO1、FLN-α、Grb2或其任意组合。
(4)根据(3)所述的方法，其中，当受试者的样品中的所述至少一种外周血浆或外泌体蛋白或至少一种外泌体micro RNA的表达变化如表1所示时，表明所述受试者具有脑出血的风险。
(5)一种监测患者或受试者脑出血的方法，所述方法包括定量来自受试者的样品中的至少一种外周血浆或外泌体蛋白，或至少一种外泌体micro RNA的表达量，进而监测所述患者或受试者是否具有脑出血；其中，
所述至少一种外周血浆或外泌体蛋白选自FGF-14,TSP4,GRB2,SKAP55-R,SNAP-23,NAP22,Fetuin,PEBP1,DEP-1,HSP27,ANG,SAA1,FKBP,Lectin,CD31,SFN,filamin,fibulin-1D,BAIAP2,CaM，haptoglobin alpha1S,BLMH,ENO1,TMSB4X或其任意组合；所述至少一种外泌体micro RNA选自hsa-miR-146a-5p,hsa-miR-320a-3p,hsa-miR-222-3p,hsa-miR-223-3p,hsa-miR-21-5p,hsa-miR-127-3p,hsa-miR-34a-5p,hsa-miR-27a-3p,hsa-miR-342-3p,hsa-miR-378a-3p,hsa-miR-197-3p,hsa-miR-3074-5p或其任意组合。
在一个具体的实施方式中，所述至少一种外周血浆或外泌体蛋白选自TMSB4X、ENO1、FLN-α、Grb2或其任意组合。
(6)根据(5)所述的方法，其中，当受试者的样品中的所述至少一种外周血浆或外泌体蛋白或至少一种外泌体micro RNA的表达变化如表1所示时，表明所述受试者具有脑出血的风险。
在本公开一个技术方案中，筛选出的ICH复发和预后评估的生物标志物组如下：
外周血浆和外泌体蛋白组：
Panel 1ICH预后：FGF-14,TSP4,GRB2,SKAP55-R,SNAP-23,NAP22,Fetuin,PEBP1,DEP-1,HSP27,ANG,SAA1,FKBP,Lectin,CD31,SFN,filamin,fibulin-1D,BAIAP2,CaM
Panel 2复发预警：haptoglobin alpha1S,BLMH,ENO1,TMSB4X
外泌体micro RNA组：
Panel：hsa-miR-146a-5p,hsa-miR-320a-3p,hsa-miR-222-3p,hsa-miR-223-3p,hsa-miR-21-5p,hsa-miR-127-3p,hsa-miR-34a-5p,hsa-miR-27a-3p,hsa-miR-342-3p,hsa-miR-378a-3p,hsa-miR-197-3p,hsa-miR-3074-5p
发明的效果
在一个具体的实施方式中，本公开提供了一种检测至少一种外周血浆或外泌体蛋白，或至少一种外泌体micro RNA的试剂在制备用于预测、诊断或监测脑出血的试剂或试剂盒中的应用。
在一个具体的实施方式中，本公开提供了一种用于确定受试者的脑出血风险的生物标记物组。
在一个具体的实施方式中，本公开提供了一种预测受试者脑出血的方法。
在一个具体的实施方式中，本公开提供了一种监测患者或受试者脑出血的方法。
本公开提供的上述实施方式，形成新的生物标记物组，有助于更好地了解ICH的病理生理，将为诊断和预后提供新的机会，从而改善ICH患者的临床服务。
附图说明
图1示出了ICH病人中筛选出的差异表达蛋白和micro RNA结果。其中，图1中的A部分示出了外周血浆和外泌体蛋白质组学鉴定出20种上调蛋白和4种下调蛋白；图1中的B部分示出了外泌体micro RNA组学鉴定出12种上调micro RNA。
图2示出了通过ELISA对于差异表达蛋白进行验证的结果。
具体实施方式
定义
在本公开的权利要求和/或说明书中，词语“一(a)”或“一(an)”或“一(the)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。与此同时，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”也可以表示封闭式的，排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
在本公开中，术语“脑出血(ICH)”是指非外伤性脑实质内血管破裂引起的出血，占全部脑卒中的20％～30％，急性期病死率为30％～40％。
在本公开中，术语“生物标记物(Biomarker)”也被称为“生物标志物”，是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标。其可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性等用途。
在本公开中，术语“诊断”和类似术语是指特定疾病的鉴定。
在本公开中，受试者(例如患者)的“风险评估”、“风险分类”、“风险鉴定”或“风险分级”是指评价包括生物标记物的因子以预测包括疾病发作或疾病进展的未来事件发生的风险，以便可以在更加知情的基础上做出关于受试者的治疗决定。
在本公开中，术语“预测”和相关术语是指特定病症(例如短暂性脑缺血发作)的可能结果的描述。
本公开的实施方式包括“监测”可能有患短暂性脑缺血发作风险的受试者。该受试者可以是未被诊断为有短暂性脑缺血发作的患者，但由于各种临床或医学评估，可能有患短暂性脑缺血发作的风险。
在本公开中，“样品”、“生物样品”，“测试样品”、“样本”、“来自受试者的样品”和“患者样品”可以互换使用，并且可以是血液、组织、尿液、血清、血浆、羊水、脑脊液、胎盘细胞或组织、内皮细胞、白细胞或单核细胞的样品。以本文所讨论的某种方式或本领域已知的其它方式可以用于直接从患者获得样品，或者可以(例如通过过滤、蒸馏、提取、浓缩、离心，干扰组分的灭活和添加试剂等)预处理样品以改变样品的特性。
在本公开中，“标记”和“可检测标记”通常是指直接或间接连接到分析物结合分子(例如其抗体或分析物反应性片段)或分析物以使分析物结合分子(例如其抗体或分析物反应性片段、核酸探针等)与分析物之间发生反应的可检测部分，并且如此标记的分析物结合分子(例如其抗体或分析物反应性片段)或分析物被称为“可检测标记的”。标记可以(例如通过视觉或仪器手段)产生可检测的信号。在一些方面，标记可以是任何产生信号的部分，并且有时在本文中称为报告基团。如本文所用，标记(或信号产生部分)产生可测量的信号，该信号可通过外部手段检测(例如通过测量电磁辐射)，并且依赖于所采用的系统，信号水平可以变化到标记在固体支持物(例如电极、微粒或珠子)环境中的程度。
在本公开中，检测生物标记物的水平的方法包括Western印迹分析，蛋白/肽功能测定，免疫组织化学分析，ELISA分析，DNA芯片分析，或通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、竞争性RT-PCR、实时RT-PCR、数字PCR、RNA酶保护测定(RPA)、下一代RNA测序和Northern印迹中的一种或多种的mRNA分析中的一种或多种。示例性的，上述方法可以用于检测蛋白或microRNA。
在本公开中，通过外周血浆和外泌体蛋白质组学鉴定出的，可以用于诊断ICH的20种上调蛋白和4种下调蛋白都是现有技术中已知的蛋白。具体来说，“SAA1”代表的是“血清淀粉样蛋白A1”，“BLMH”代表的是“博来霉素水解酶”，“BAIAP2”代表的是“脑特异性血管生成抑制剂相关蛋白2”，“ENO1”代表的是“烯醇酶1”；“TMSB4X”代表的是“胸腺素β4”；“lectin”代表的是“凝集素”；“PEBP1”代表的是“磷脂酰乙醇胺结合蛋白1”；“SNAP-23”代表的是“磷酸化突触体相关蛋白23”；“SKAP55-R”代表的是“Src激酶相关的磷酸化蛋白55-相关蛋白”；“fialamin”代表的是“肌动蛋白结合蛋白”；“SFN”代表的是“分层蛋白”；“CD31”代表的是“血小板内皮细胞黏附分子”；“NAP-22”代表的是“神经元轴突膜蛋白-22”；“DEP-1”代表的是“密度增强型磷酸酶-1”；“ANG”代表的是“血管生长素”；“CaM”代表的是“钙调蛋白”；“GRB2”代表的是“生长因子受体结合蛋白2”；“haptoglobin alpha1S”代表的是“结合珠蛋白α1S”；“Fetuin”代表的是“胎球蛋白”；“fibulin-1D”代表的是“腓骨蛋白-1D”；“FGF-14”代表的是“成纤维细胞生长因子蛋白-14”；“TSP4”代表的是“血小板反应蛋白4”。
在本公开中，可以用于诊断ICH的20种上调蛋白和4种下调蛋白都是现有技术中已知的蛋白均可以通过现有技术中已知的检测蛋白的方法，例如通过制备相应的抗体，进而进行检测。
在本公开中，术语“微小RNA”或“miRNA”描述小的非编码RNA分子，长度通常为约15至约50个核苷酸，优选17-23个核苷酸，其可通过例如称为RNA干扰(RNAi)的过程在调节基因表达中发挥作用。RNAi描述了通过与靶基因信使RNA(mRNA)中的序列互补或反义的RNA序列的存在导致靶基因表达的抑制的现象。miRNA是由约70个或更多个核苷酸的发夹前体(pre-miRNA)处理而成，该前体通过RNA酶Ⅲ的顺序切割衍生自初级转录物(pri-miRNA)。miRNA的具体含义，可以通过miRBase进行查询。miRBase是一个综合性的微小RNA数据库，位于www.miRBase.org。通常，miRNA基因被转录成前体或pre miRNA，然后被加工成成熟miRNA。pre-miRNA通常以发夹形式出现，其中该发夹包含5′臂(或侧)，该5′臂(或侧)连接到环，然后连接到3′臂(或侧)。前体miRNA的加工可导致miRNA的两种成熟形式的形成，该形式包括衍生自前体miRNA环的5′侧或臂的5p形式以及衍生自前体miRNA发夹的3′侧或臂的3p形式。
在本公开中，术语“非编码RNA”(ncRNA)通常是指在细胞中不翻译成蛋白质的内源性RNA分子。ncRNA的示例性类型包括转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、微小RNA(miRNA)、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scRNA和长ncRNA(诸如Xist和HOTAIR)。
本文公开的方法、试剂盒和系统可包括特异性地检测、谱分析或量化生物样品内的RNA。在一些情况下，可以从生物样品分离RNA(例如miRNA、ncRNA)。在一些情况下，可以从无细胞来源分离RNA(例如miRNA、ncRNA)。
通常通过检测衍生自miRNA或其他类型的ncRNA的cDNA水平来测量表达谱。还可以在RNA水平上测量表达谱；例如，通过RNA杂交或直接RNA测序。
在一些情况下，表达水平由所谓的“实时扩增”方法(也称为定量PCR(qPCR)或Taqman)确定。该方法的基础是使用对待检测模板区域具有特异性的寡核苷酸探针/寡核苷酸监测在使用模板的PCR反应期间形成的扩增产物的形成。在一些实施方案中，在对分离的RNA(例如，miRNA、ncRNA)执行逆转录酶反应后立即使用qPCR或Taqman，并且其可用于量化RNA的水平，和/或评估RNA(例如，miRNA、ncRNA)的差异表达水平。
在其他方法中，通过测序，诸如通过RNA测序或通过DNA测序(例如，从样品中的逆转录RNA、ncRNA或miRNA生成的cDNA的测序)确定表达水平。测序也可以是一般性的(例如，使用部分/完全简并的寡核苷酸引物进行扩增)或靶向性的(例如，使用针对待在后续步骤中进行分析的特定RNA(例如，miRNA、ncRNA)的寡核苷酸引物进行扩增)。测序可通过任何可用的方法或技术进行。
在其他方法中，通过基于杂交的方法，诸如Northern印迹、Southern印迹或微阵列杂交来确定生物标志物RNA(例如，miRNA、ncRNA)的表达水平。
本公开中采用的分子生物学方法，均可以参见“最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology，Wiley出版)”，“分子克隆实验指南(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，冷泉港实验室出版)”等公开出版物中记载的相应方法。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
实施例中采用的所有试剂，除非另有强调，否则均可以通过商业途径购买获得。
实施例1：ICH病人及健康对照组的临床资料收集
本研究纳入自2018年10月至2019年11月首都医科大学附属北京天坛医院住院患者以及多中心的中国国家卒中登记研究-Ⅲ(CNSR-3)中的患者。ICH患者入组标准：(1)发病年龄位于18-80之间；(2)根据患者临床及影像学资料明确诊断为急性脑出血患者；(3)本次发病病因为高血压性；(4)出血位置在基底节周围，未破入脑室，出血体积小于50ml。纳入临床信息包括：患者一般基本信息及临床特点，大动脉粥样硬化性高危因素(高血压、糖尿病、冠心病、高血脂等)，急性期治疗方案。随访资料包括：发病时、发病后3月、6月、1年NIHSS及MRS评分，复发时间，血常规及生化指标，以及影像学资料，临床终点疾病复发或死亡。
实施例2：ICH病人及健康对照组的样本收集和储存
2.1血浆的收集---外周血收集于含抗凝剂EDTA或肝素的紫色管中，样本采集后30min内离心，3000rpm 10min，2-8℃。收集上层血浆，分批储存于-80℃。样本避免反复冻融。注意：样本应充分离心，避免溶血或颗粒存在。
2.2外周血浆中外泌体的提取
我们采用血清和血浆的ExoQuick细胞外囊泡分离试剂盒(货号：EQULTRA-20A-1)，一种在外泌体分离方面的具有专业知识的创新的试剂盒。
2.2.1提取
1)取出样本，3000g，15min离心取上清。
2)若仍有细胞碎片残留，将上清再次以位12，000g，10min离心，将上清转移到新的离心管中。
3)取得250μL样本加入67μL Exoquick，上下颠倒或轻弹混匀，静置30min。
4)3000g，10min离心，室温或4℃均可，离心后管底部米色或白色沉淀为细胞外囊泡(EVs)。
5)小心弃掉上清，留取底部沉淀。
7)加入200μL B液重悬，测量并且记录蛋白浓度。
2.2.2纯化
1)加入200μL A液重悬Evs。
2)取出纯化柱，松开螺帽，去底部封盖，将纯化柱放入收集管中，1,000g,30s离心除去储存液。
3)取出液体后将柱子重新放入收集管中。
4)取下盖子，加入500μL B液洗涤柱子，1000g，30s离心去掉液体，重复洗涤一次。
5)将底部封盖复位，加入100μL B液。
6)将步骤1中的所有内容物后加入到柱子中，并将螺帽复位，在室温旋转摇床旋转摇匀≤5min。
2.2.3样品洗脱
1)松开螺帽并卸掉底部封盖，立即转移至2ml eppendorf管中。
2)1000g，30seconds离心得到Evs，弃掉柱子。
2.2.4外泌体定量
1)NTA颗粒示踪(Nanosight)
2)TEM电镜观测形貌
3)Western blot检测外泌体特异性蛋白
2.3外泌体RNA的提取
1)向外泌体重悬液中加入700μL QIAzol，漩涡震荡10s，简短离心后在室温下孵育5min
2)加入140μL氯仿/异戊醇(24：1)，剧烈上下颠倒15s，在室温下孵育2～3min
3)4℃下12,000×g离心8min。吸取上清到新的管中，加入两倍上清体积的无水乙醇，混匀
4)将混合液全部过柱纯化
5)加入700μL RWT缓冲液洗一次，加入500μL RPE缓冲液洗两次，12,000×g离心2min以甩干膜，弃去收集管
6)将纯化柱移至新的收集管，加入20μL RNA-Free water。室温孵育1min，12,000×g离心2min以洗脱RNA。得到约15μL洗脱产物
7)洗脱RNA样本采用Agilent 2100进行检测。
实施例3：基因、蛋白组学技术分析，筛选出差异表达蛋白，得到复发、预后评估生 物标记物的检测组合
3.1本项目采用下一代非标记定量蛋白质组学技术完成分析，在数据非依赖型采集(Data independent acquisition，DIA)模式下，它能够提供无与伦比的蛋白质组覆盖，同时实现每个样本大量蛋白质的精确、高度可重复的定量。DIA流程提供一个理想的差异表达蛋白质组定性分析或海量样品的蛋白质组定量平台。DIA流程基于三个必要步骤：
1)构建谱图库：谱图库收集了样本所有可检测的非冗余的高质量肽段信息(MS/MS谱图)，作为后续数据分析的肽段鉴定模板。其中包含描述肽段谱峰特性的碎片离子强度和保留时间。谱图库利用对感兴趣的样品进行data dependent acquisition(DDA)检测采集的数据构建。
2)DIA模式下获取大量样本数据：Data independent acquisition(DIA，又称SWATH)模式利用最新的高分辨质谱实现在质量数和保留时间上同时采集肽段离子特性。与传统的提取单一离子进行碎裂分析的方法相比，DIA模式下质谱被设定为宽母离子窗口循环采集并同时碎裂多种肽段离子的分析方式。实现了将样品中所有可检测的蛋白质谱峰信息完整采集，从而能够高重复性的分析大量样本。
3)数据分析，在基于DIA的发现式的蛋白质组研究中，如何更好地进行蛋白质检测和定量目前依然是个巨大的挑战。采集肽段的信息虽然十分完整，但发现高度卷积。在这一步，我们用Spectronaut进行有效地去卷积，从而对数据进行精确地鉴定和定量分析。
3.2筛选出的差异表达蛋白和micro RNA结果如下(表1)：
表1 ICH蛋白组和microRNA组检测结果
Figure BDA0003177698590000131
在ICH中，外周血浆和外泌体蛋白质组学鉴定出20种上调蛋白和4种下调蛋白，其倍数变化>2，P<0.05；外泌体质谱分析显示，大多数失调的蛋白质均参与肌动蛋白细胞骨架，粘附连接(上皮细胞间连接)，血清素能突触(5-HT神经递质)的调节；与对照相比，ICH促进了更强的急性损伤后反应，这是由新筛选出的蛋白质所呈现的；参与急性反应，免疫激活，血管生成的蛋白上调；抗凋亡，抗炎，神经元重塑相关蛋白也升高；抑制的信号传导包括抗炎，抗血管生成和中枢神经系统发育(图1A)。外泌体micro RNA组学鉴定出12种上调micro RNA，其倍数变化>2，P<0.05(图1B)。
实施例4：筛选出的差异表达蛋白进行质谱定量验证
我们应用质谱的多反应监测(Multiple Reaction Monitoring,MRM)技术这一高特异性、高灵敏度的质谱数据获取方式，替代传统的免疫分析如ELISA，用于大样本目标蛋白的验证。
从验证的结果来看，ICH病人相较于正常人，其通过外周血浆和外泌体蛋白质组学鉴定得到的上调/下调蛋白，以及通过外泌体micro RNA组学鉴定出的上调/下调microRNA，和实施例3中得到的结果相同。
实施例5：筛选出的差异表达蛋白进行ELISA验证
我们应用具有高特异性、高灵敏度的酶联免疫吸附(ELISA)技术对实施例3中发现的差异表达蛋白进行验证。
验证结果如图2所示。从验证的结果来看，ICH患者血浆中TMSB4X、ENO1、FLN-α、Grb2蛋白浓度显著高于健康对照血浆中蛋白浓度；ICH患者血浆外泌体中ENO1蛋白浓度显著低于健康对照血浆外泌体中蛋白浓度。其中，TMSB4X与细胞的粘附和迁移，血小板聚集相关；ENO1与糖酵解，血管内和细胞周围的纤溶系统相关；FLN-α与血小板形态，轴突生长有关；Grb2调整多种信号通路。
本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。

Claims (4)

1.检测至少一种外周血浆或外泌体蛋白在制备用于预测、诊断或监测脑出血的试剂或试剂盒中的应用，
其中，所述至少一种外周血浆或外泌体蛋白包括ENO1。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述至少一种外周血浆或外泌体蛋白还包括选自FGF-14,TSP4,GRB2,SKAP55-R,SNAP-23,NAP22,Fetuin,PEBP1,DEP-1,HSP27,ANG,SAA1,FKBP,Lectin,CD31,SFN,filamin,fibulin-1D,BAIAP2,CaM，haptoglobin alpha1S,BLMH,TMSB4X中的任意一种或其任意组合。
3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述至少一种外周血浆或外泌体蛋白还包括选自TMSB4X、FLN-α、Grb2中的任意一种或其任意组合。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其中，所述试剂或试剂盒还包括检测至少一种外泌体micro RNA的试剂，所述至少一种外泌体micro RNA选自hsa-miR-146a-5p,hsa-miR-320a-3p,hsa-miR-222-3p,hsa-miR-223-3p,hsa-miR-21-5p,hsa-miR-127-3p,hsa-miR-34a-5p,hsa-miR-27a-3p,hsa-miR-342-3p,hsa-miR-378a-3p,hsa-miR-197-3p,hsa-miR-3074-5p或其任意组合。
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