CN102109517A - 心脑血管疾病生物标志物的联合检测方法及诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种心脑血管疾病生物标志物的联合检测方法及其诊断试剂盒，联合并行检测方法的特征是能够一次性检测同一个样品中的多种生物标志物，即通过液相芯片的制备，形成“信号标记的检测抗体-心脑血管疾病生物标志物-捕获抗体-微球”的四联复合体，通过检测四联复合体中不同微球的标记信号，从而确定待检测样品中各种不同的心脑血管疾病生物标志物的存在及含量。本发明还公开了该诊断试剂盒的组成成分及该诊断试剂盒的应用。本发明所述的方法及试剂盒具有高通量性、高灵敏度和特异性、检测快速准确等突出优点，能够对心脑血管疾病的多种生物标志物同时进行定性和定量检测。

Description

心脑血管疾病生物标志物的联合检测方法及诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及一种体外诊断检测方法及其诊断试剂盒，特别是涉及心脑血管疾病生物标志物的液相芯片联合并行检测方法及其诊断试剂盒。

背景技术

心脑血管疾病是中国城市人口和西方发达国家的主要疾病和主要死亡原因之一，主要包括以冠心病、高血压等为代表的心血管疾病，以及缺血性脑血管病和出血性脑血管病。缺血性脑血管病，又称急性缺血性脑血管综合症(AICS)，包括脑梗死(CI)和短暂性脑缺血性发作(TIA)；出血性脑血管病包括脑出血和蛛网膜下腔出血。心脑血管疾病生物标志物的联合检测已成为心脑血管疾病的危险因素筛查或预测、早期诊断、疾病进程、疗效监测和预后判断的非常重要的指标，而多指标联合并行检测的高通量迅速性、准确性和稳定性就更加至关重要。

血清淀粉样蛋白A(SAA)是一种比较敏感的炎症标志物，是预测心血管疾病的独立指标。白介素-6(IL-6)是一种具有多种效能的细胞炎症因子，是心脑血管的重要的独立预测因子。近年来研究发现的与心脑血管疾病的发生发展相关的生物标志物还包括：可溶性E-选择素(sE-Selectin)，可溶性细胞间粘附分子(sICAM-1)，可溶性CD40L(sCD40L)，肿瘤坏死因子-α(TNFα)。

目前，对于心脑血管疾病生物标志物的测定已有多种检测方法，包括免疫比浊分析、酶联免疫分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、磁分离酶联免疫分析(EIMA)等。但是这些技术都存在着检测通量的局限性，且操作繁琐、灵敏度较差，不能真正满足临床诊断检测的需要。而固相生物芯片技术存在着可重复性差、灵敏度不够好以及操作繁琐的缺点。

液相芯片(xMAP)又称液态芯片，是一种可广泛应用于蛋白质、基因、受体/配体等多种生物反应的新一代生物芯片技术，主要包括颜色编码的微球(Color-coded Beads)、探针分子、被检测物和报告分子四种成分。在微球的制造过程当中，掺入了两种不同的红色分类荧光，根据这两种荧光的比例不同，把球形基质分为100种，可以标记上100种不同的探针分子，能同时对一个样品中多达100种不同的目标分子进行检测。反应过程中，探针和报告分子都分别与目标分子特异性结合。反应结束后，使单个的微球通过检测通道，使用红、绿双色激光同时对微球上的红色分类荧光和报告分子上的绿色报告荧光进行检测，可确定所结合的检测物的种类和数量。

本发明基于液相芯片技术的极高通量性、高灵敏度、高特异性、重复性好、操作简便、线性范围宽、检测迅速等突出优点，对心脑血管疾病相关的多种生物标志物进行并行检测，能够在临床检测上得到更好的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一是提供一种用于心脑血管疾病生物标志物的液相芯片联合并行检测方法；

本发明所要解决的技术问题之二是提供一种检测心脑血管疾病的多种生物标志物的诊断试剂盒；

本发明所要解决的技术问题之三是提供上述诊断试剂盒的应用。

为解决上述技术问题，本发明的一种心脑血管疾病生物标志物的液相芯片联合并行检测方法，包括以下步骤：

(1)将捕获抗体与不同编号的微球(Beads)偶联，形成“捕获抗体-微球”二联复合体，所述的每一种捕获抗体分别抗一种心脑血管疾病生物标志物，从而使待测样品中的心脑血管疾病生物标志物与捕获抗体形成“心脑血管疾病生物标志物-捕获抗体-微球”三联复合体；所述的心脑血管疾病生物标志物包含以下标志物的任意一种或任意多种或加上其它标志物的组合：SAA、sE-Selectin、sICAM-1、sCD40L、IL-6、TNFα；即所述的多种生物标志物可以是包含SAA、sE-Selectin、sICAM-1、sCD40L、IL-6、TNFδ中任意一种、任意两种、任意三种、任意四种、任意五种、任意六种或加上其它标志物的组合。

(2)将不同的检测抗体进行信号标记，其中所述的每一种检测抗体分别抗一种心脑血管疾病生物标志物且对应于捕获抗体，并与捕获抗体分别结合于该标志物的不同抗原表位；

(3)将步骤(1)形成的三联复合体与步骤(2)中带有信号标记的检测抗体混合，从而形成“信号标记的检测抗体-心脑血管疾病生物标志物-捕获抗体-微球”四联复合体；

(4)用液相芯片法(xMAP)检测出四联复合体中不同微球的标记信号，从而确定待检测样品中各种心脑血管疾病生物标志物的存在及含量。

步骤(4)中，所述确定待检测样品中各种心脑血管疾病生物标志物的含量，其具体方法为：将步骤(4)中测定的可检测标记信号与标准曲线进行比较，从而确定待检测样品中各种心脑血管疾病生物标志物的含量。

所述的微球的平均直径可以为5.6μm，该微球是结合了不同荧光染料的聚苯烯微球，即颜色编码微球(Color-coded Beads)。

所述信号标记指可采用生物素(Biotin)-链霉亲和素-藻红蛋白(Streptavidin-PE)的标记或其它本领域常规的免疫标记方法如荧光素、酶、化学发光剂等。

步骤(1)中所述的与捕获抗体偶联的微球，可以使用已经活化的微球(Activated Beads)，能够直接和捕获抗体共价偶联(如通过抗体表面的自由thoil基团)；如果使用羧基(-COOH)微球，必须先对微球进行活化，通常是采用EDC/S-NHS等化学物质活化，这样微球就能够被含有自由氨基团(Amino Group)的分子(如抗体等)共价结合。微球活化一般可采用如下方法：微球在由1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(S-NHS)溶液和活化缓冲液组成的3者混合液中进行活化，其中，3者混合液的用量比是：当微球数量为2.5×10⁶个时，需要50mg/mlEDC溶液10μl：50mg/mlS-NHS溶液10μl：100mM NaH2P04、pH6.3的活化缓冲液80μl，混合液的用量可以根据微球的数量进行相应的调整。

所述的捕获抗体和检测抗体是针对以下6种可以自由组合的心脑血管疾病生物标志物的捕获抗体和检测抗体：

SAA、sE-Selectin、sICAM-1、sCD40L、IL-6、TNFα。

检测方法中所述的步骤(4)中用液相芯片法(xMAP)进行检测，所述的可检测标记信号是荧光信号。

在本发明的另一方面，提供一种检测心脑血管疾病生物标志物的诊断试剂盒，主要包括以下组分：

(1)偶联抗体的微球：含有分别偶联了不同捕获抗体的微球，包含以下任意一种或任意多种微球：偶联了血清淀粉样蛋白A SAA捕获抗体的微球，偶联了可溶性E-选择素sE-Selectin捕获抗体的微球，偶联了可溶性细胞粘附分子sICAM-1捕获抗体的微球，偶联了可溶性CD40L sCD40L捕获抗体的微球，偶联了白介素-6IL-6捕获抗体的微球，偶联了肿瘤坏死因子αTNFα捕获抗体的微球；每种捕获抗体分别抗一种冠心病相关的蛋白标志物并且偶联于不同编号的微球，形成“抗体-微球”的二联复合体；

(2)信号标记的检测抗体：包含以下任意一种或任意多种带有信号标记的检测抗体：标记的SAA检测抗体，标记的sE-Selectin检测抗体，标记的sICAM-1检测抗体，标记的sCD40L检测抗体，标记的IL-6检测抗体，标记的TNFα检测抗体；其中所述的每一种检测抗体分别抗一种相应的心脑血管疾病生物标志物且对应于捕获抗体，并与捕获抗体分别结合于该蛋白标志物的不同抗原表位；

(3)标准品：包含各种心脑血管疾病生物标志物(抗原)的标准品；

(4)质控品：包含阳性对照和阴性对照。

所述信号标记的检测抗体可以是采用生物素(Biotin)标记的检测抗体；如采用生物素标记检测抗体，该诊断试剂盒还包括链霉亲和素-藻红蛋白(Streptavidin-PE)，其中链霉亲和素可与生物素特异性结合，形成带藻红蛋白(PE)荧光素标记的检测抗体，通过液相芯片仪的绿色激光激发藻红蛋白进行荧光检测。

其中所述的捕获抗体和检测抗体是针对以下6种可以自由组合的心脑血管疾病生物标志物的捕获抗体和检测抗体：

SAA、sE-Selectin、sICAM-1、sCD40L、IL-6、TNFα。

在本发明的另一方面，还提供上述诊断试剂盒的应用。本发明的一种检测心脑血管疾病生物标志物的诊断试剂盒可用于检测体外样品中心脑血管疾病生物标志物的存在和含量，及用于心脑血管疾病的危险因素筛查或预测、诊断检测、疗效监测和预后判断，还可用于除心脑血管疾病以外的其它疾病的诊断检测或预测。

由于本发明利用了液相芯片技术，对心脑血管疾病的多种生物标志物进行联合并行检测，联合并行检测方法的特征是能够一次性检测同一个样品中的多种生物标志物，使检测方法及试剂盒具有高灵敏度、高特异性、高通量、稳定性好、检测迅速、准确等突出优点，能够对多种相关的蛋白标志物同时进行定性和定量检测，能在临床检测上得到更好的应用。

附图说明

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

图1是本发明实施例3中检测心脑血管患者与正常对照组中SAA的浓度分布图；

图2是本发明实施例3中检测心脑血管患者与正常对照组中sE-Selectin的浓度分布图；

图3是本发明实施例3中检测心脑血患者与正常对照组中sICAM-1的浓度分布图；

图4是本发明实施例3中检测心脑血管患者与正常对照组中sCD40L的浓度分布图；

图5是本发明实施例3中检测心脑血管患者与正常对照组中IL-6的浓度分布图；

图6是本发明实施例3中检测心脑血管患者与正常对照组中TNFα的浓度分布图。

具体实施方式

实验材料：

本发明所用的6种心脑血管疾病生物标志物SAA、sE-Selectin、sICAM-1、sCD40L、IL-6、TNFα(抗原)及相应抗体来源于Biodesign、Santa Cruz和Fitzgerald公司；

不同编号的羧基微球(表面羧基修饰)、链霉亲和素-藻红蛋白均购置于QIAGEN公司；

1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(S-NHS)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素(S-NHS-Biotin)购置于Pierce公司。

缓冲液配制：

活化缓冲液(Activation buffer)：100mM NaH₂P0₄，pH6.3；

偶联缓冲液(Coupling buffer)：50mM HEPES，pH7.4；

磷酸缓冲液(PBS)：10mM NaH₂P0₄，150mM NaCl，pH7.4。

实施例1：3种心脑血管疾病生物标志物的液相芯片联合并行检测方法

具体的检测方法包括如下步骤：

选择编号为15、37、40号的3种微球

1.所需微球的活化

1.1全速涡旋微球储存液至少3min，形成均一的微球悬液；

1.2分别称取10mg的EDC和S-NHS到两个离心管中；

1.3用去离子水溶解使其终浓度为50mg/ml；

1.4取1ml的微球悬液10000g离心3min，小心移除上清；

1.5加入80μl的活化缓冲液将微球重悬；

1.6分别加入10μl的EDC溶液(50mg/ml)和10μl的S-NHS溶液(50mg/ml)，混合均匀，室温(15-25℃)，避光，振荡孵育20min。

2.相应的捕获抗体与活化的微球偶联

2.1用偶联缓冲液将捕获抗体稀释成体积为500μl，浓度为0.1mg/ml的溶液；

(抗体溶液中不能含有外源蛋白，叠氮化物，氨基乙酸，Tris或其他任何含有氨基的试剂。如果含有这些试剂，通过透析或凝胶过滤层析除去。)

2.2将微球在10000g离心3min，小心移除上清；

2.3加入步骤2.1中已经稀释好的抗体溶液(500μl)；

2.4将活化的微球与抗体溶液，在室温(15-25℃)下，避光，振荡孵育2h；

(离心管必须用锡纸包裹避光)

2.5将微球在10000g离心3min，小心移除上清；

2.6加入500μl PBS将微球重悬，10000g离心3min，小心移除上清；

2.7加入1ml PBS/1％BSA(BSA：牛血清白蛋白)将微球重悬；

2.8通过血小板计数器对微球计数；

3.生物素标记检测抗体

3.1将生物素试剂(S-NHS-Biotin)从冰箱的冷藏室中取出，在室温下平衡，使其恢复到室温；

3.2依据检测抗体的浓度，用PBS将抗体稀释到1mg/ml；

如果抗体溶解在含有氨基的溶液中，应先除去氨基，置换成没有氨基的缓冲液；3.3用超纯水配置10mM的生物素溶液；

3.4按摩尔比1∶20(抗体：生物素)，计算生物素所需要的量，加入到浓度为1mg/ml的抗体溶液中；

计算公式：

3.5将反应液在冰上孵育2h，或是在室温孵育30min；

3.6将反应液转移到透析盒，除去其中未反应的S-NHS-Biotin。

4.抗原标准品的配置

IL-6和TNFα按312.5，62.5，12.5，2.5，0.5，0.1，0pg/ml的浓度进行配制，sE-Selectin按3125，625，125，25，5，1，0ng/ml的浓度进行配制，标志物混合液分别标记为STD6，STD5，STD4，STD3，STD2，STD1，STD0。

5.偶联捕获抗体的微球混合液(I混合液)的配制

分别取偶联了3种心脑血管疾病标志物的捕获抗体的微球，如下列：IL-6捕获抗体微球37，TNFα捕获抗体微球40，sE-Selectin捕获抗体微球15，等比例混合，使每种微球的终浓度分别为200个/μl，4℃避光保存。

6.含生物素标记的检测抗体混合液(II混合液)的配制

分别取进行了生物素标记的IL-6检测抗体，TNFα检测抗体，sE-Selectin检测抗体，加入pH7.4的PBS，使每种检测抗体的终浓度分别为10μg/ml。

7.质控品

质控品包括阳性对照和阴性对照。

8.血清样品中3种心脑血管疾病生物标志物的含量检测

8.1血清样品包括正常人血清样本15份(正常对照组1-15号样本)，心脑血管疾病患者血清样本15份(心脑血管疾病组1-5号为冠心病患者、6-8号为高血压患者、9-12号为缺血性脑血管病患者、13-15号为出血性脑血管病患者的样本)。

8.2分别加入偶联捕获抗体的微球混合液(I混合液)于96孔酶标板，25μl/孔；

8.3加入标准品(STD0、STD1、STD2、STD3、STD4、STD5、STD6)、质控品(阳性对照和阴性对照)、病人血清样本1-15号、正常人血清样本1-15号，25μl/孔；

8.4用排枪温柔的上下混匀混合物，盖上盖子，在室温下避光孵育30min；

8.5加入含生物素标记的检测抗体混合液(II混合液)，25μl/孔；用排枪温柔的上下混匀混合物，盖上盖子，在室温下避光孵育30min；

8.6用PBS/1％BSA将链霉亲和素-藻红蛋白稀释成浓度为200ug/ml的溶液，加稀释好的链霉亲和素藻红蛋白25μl到每个孔中，用排枪温柔的上下混匀混合物，盖上盖子，在室温下避光孵育15-30min；

8.7在液相芯片仪(LiquiChip 200，QIAGEN公司)上，对反应的混合物进行分析，可自动绘制标准曲线，并根据标准曲线计算出检测样品中3种心脑血管疾病标志物的含量。

8.8检测结果及分析

具体参见表1-3。

表1心脑血管疾病组生物标志物的浓度值

表2正常对照组生物标志物的浓度值

表3心脑血管疾病患者与正常组的生物标志物平均值对比

以上结果表明，用本发明方法可以同时对3种心脑血管疾病生物标志物进行联合并行检测，从表1-3中3种标志物的浓度平均值可以看出，心脑血管疾病患者的这3种生物标志物，IL-6组高出正常对照组4.6倍，TNF-α组高出正常对照组2.9倍，E-Selectin组高出正常对照组2.1倍，具有显著差异，可以作为心脑血管疾病临床诊断检测或预测的重要指标。

实施例2：5种心脑血管疾病生物标志物的液相芯片联合检测方法

具体的检测方法包括如下步骤：

选择编号为15、21、33、37、40号的5种微球

1-3步骤同实施例1。

4.抗原标准品的配置

IL-6、TNFα按312.5，62.5，12.5，2.5，0.5，0.1，0pg/ml的浓度进行配制，sICAM1和sE-Selectin按3125，625，125，25，5，1，0ng/ml的浓度进行配制，sCD40L按31.25，6.25，1.25，0.25，0.05，0.01，0ng/ml的浓度进行配制，标志物混合液分别标记为STD6，STD5，STD4，STD3，STD2，STD1，STD0。

5.偶联捕获抗体的微球混合液(I混合液)的配制

分别取包被了5种心脑血管生物标志物的捕获抗体的微球，如下列：sE-selectin捕获抗体微球15，sICAM-1捕获抗体微球21，sCD40L捕获抗体微球33，IL-6捕获抗体微球37，TNFα捕获抗体微球40，等比例混合，使每种微球的终浓度分别为200个/μl，4℃避光保存。

6.含生物素标记的检测抗体混合液(II混合液)的配制

分别取进行了生物素标记的IL-6检测抗体，TNFα检测抗体，sICAM-1检测抗体，sE-Selectin检测抗体，sCD40L检测抗体，加入pH7.4的PBS，使每种检测抗体的终浓度分别为10μg/ml。

7.质控品

质控品包括阳性对照和阴性对照。

8.血清样品中5种心脑血管疾病生物标志物的含量检测

8.1血清样品包括正常人血清样本15份(正常对照组1-15号样本)，心脑血管疾病患者血清样本15份(心脑血管疾病组1-5号为冠心病患者、6-8号为高血压伴高血脂患者、9-12号为缺血性脑血管病患者、13-15号为出血性脑血管病患者的样本)。

8.2分别加入偶联捕获抗体的微球混合液(I混合液)于96孔酶标板，25μl/孔；

8.3加入标准品(STD0、STD1、STD2、STD3、STD4、STD5、STD6)、质控品(阳性对照和阴性对照)、病人血清样本1-15号、正常人血清样本1-15号，25μl/孔；

8.4用排枪温柔的上下混匀混合物，盖上盖子，在室温下避光孵育30min；

8.5加入含生物素标记的检测抗体混合液(II混合液)，25μl/孔；用排枪温柔的上下混匀混合物，盖上盖子，在室温下避光孵育30min；

8.6用PBS/1％BSA将链霉亲和素-藻红蛋白稀释成浓度为200μg/ml的溶液，加稀释好的链霉亲和素藻红蛋白25μl到每个孔中，用排枪温柔的上下混匀混合物，盖上盖子，在室温下避光孵育15-30min；

8.7在液相芯片仪(LiquiChip 200，QIAGEN公司)上，对反应的混合物进行分析，可自动绘制标准曲线，并根据标准曲线计算出检测样品中5种心脑血管疾病生物标志物的含量。

8.8检测结果及分析

参见表4-6。

表4心脑血管疾病组生物标志物浓度值

表5正常对照组生物标志物浓度值

表6心脑血管疾病患者与正常组的心脑血管疾病生物标志物平均值对比

以上结果表明，用本发明方法可以同时对5种心脑血管疾病生物标志物进行联合并行检测，而且还可以根据实际需求对5种心脑血管疾病生物标志物进行不同组合的联合检测。从表4-6中5种标志物的浓度平均值可以看出，心脑血管疾病患者的这5种生物标志物，其中IL-6组高出正常对照组3.7倍，TNFα、sE-Selectin均高出正常对照组的2.3倍，sICAM1、sCD40L组均高出正常对照组的2.4倍，具有显著差异，可以作为心脑血管疾病临床诊断检测或预测的重要指标。

实施例3：6种心脑血管疾病生物标志物的液相芯片联合检测方法

具体的检测方法包括如下步骤：

选择编号为11、15、21、33、37、40号的6种微球

1-3步骤同实施例1。

4.抗原标准品的配置

SAA按312.5，62.5，12.5，2.5，0.5，0.1，0ug/ml的浓度进行配制，IL-6和TNFα按312.5，62.5，12.5，2.5，0.5，0.1，0pg/ml的浓度进行配制，sICAM和sE-Selectin按3125，625，125，25，5，1，0ng/ml的浓度进行配制，sCD40L按31.25，6.25，1.25，0.25，0.05，0.01，0ng/ml的浓度进行配制，标志物混合液分别标记为STD6，STD5，STD4，STD3，STD2，STD1，STD0。

5.偶联捕获抗体的微球混合液(I混合液)的配制

分别取包被了6种心脑血管疾病标志物的捕获抗体的微球，如下列：SAA捕获抗体微球11，sE-Selectin捕获抗体微球15，sICAM-1捕获抗体微球21，sCD40L捕获抗体微球33，IL-6捕获抗体微球37，TNFα捕获抗体微球40，等比例混合，使每种微球的终浓度分别为200个/μl，4℃避光保存。

6.含生物素标记的检测抗体混合液(II混合液)的配制

分别取进行了生物素标记的SAA检测抗体，IL-6检测抗体，TNFα检测抗体，sICAM1检测抗体，sE-Selectin检测抗体，sCD40L检测抗体，加入pH7.4的PBS，使每种检测抗体的终浓度分别为10μg/ml。

7.质控品

质控品包括阳性对照和阴性对照。

8.血清样品中6种心脑血管疾病生物标志物的含量检测

8.1血清样品包括正常人血清样本15份(正常对照组1-15号样本)，心脑血管疾病患者血清样本15份(心脑血管疾病组1-15号为冠心病患者的样本)。

8.2分别加入偶联捕获抗体的微球混合液(I混合液)于96孔酶标板，25μl/孔；

8.3加入标准品(STD0、STD1、STD2、STD3、STD4、STD5、STD6)、质控品(阳性对照和阴性对照)、病人血清样本1-15号、正常人血清样本1-15号，25μl/孔；

8.4用排枪温柔的上下混匀混合物，盖上盖子，在室温下避光孵育30min；

8.5加入含生物素标记的检测抗体混合液(II混合液)，25μl/孔；用排枪温柔的上下混匀混合物，盖上盖子，在室温下避光孵育30min；

8.6用PBS/1％BSA将链霉亲和素-藻红蛋白稀释成浓度为200μg/ml的溶液，加稀释好的链霉亲和素藻红蛋白25μl到每个孔中，用排枪温柔的上下混匀混合物，盖上盖子，在室温下避光孵育15-30min；

8.7在液相芯片仪(LiquiChip 200，QIAGEN公司)上，对反应的混合物进行分析，可自动绘制标准曲线，并根据标准曲线计算出检测样品中6种心脑血管疾病生物标志物的含量。

8.8检测结果及分析

参见表7-9和图1-6。

表7心脑血管疾病组生物标志物浓度值

表8正常对照组生物标志物浓度值

表9心脑血管疾病患者与正常组的心肌损伤标志物平均值对比

从表7-9和图1-图6显示的以上结果表明，用本发明方法可以同时对6种心脑血管疾病生物标志物进行联合并行检测，而且还可以根据实际需求对6种心脑血管疾病生物标志物进行不同组合的联合检测。从表7-9中6种标志物的浓度平均值可以看出，心脑血管疾病患者的这6种生物标志物，SAA组高出正常对照组6.6倍，IL-6组高出正常对照组5.7倍，TNFα组高出正常对照组3.1倍，sICAM1组高出正常对照组的3.3倍，sE-Selectin、sCD40L组分别高出正常对照组的2.8倍和2.6倍，具有显著差异，可以作为心脑血管疾病临床诊断检测或预测的重要指标。

在阅读了以上关于本发明的陈述内容之后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改或变化，这些等价形式同样归属于本申请所附权利要求书中所限定的范围。

Claims (9)

1.一种心脑血管疾病生物标志物的联合并行检测方法，其特征在于，包括以下主要步骤：

(1)将捕获抗体与不同编号的微球Beads偶联，形成“捕获抗体-微球”二联复合体，所述的每一种捕获抗体分别抗一种心脑血管疾病生物标志物，从而使待测样品中的心脑血管疾病生物标志物与捕获抗体形成“心脑血管疾病生物标志物-捕获抗体-微球”三联复合体；所述的心脑血管疾病生物标志物包含以下标志物的任意一种或任意多种或加上其它标志物的组合：血清淀粉样蛋白A SAA、可溶性E-选择素sE-Selectin、可溶性细胞间粘附分子sICAM-1、可溶性CD40L sCD40L、白介素-6IL-6、肿瘤坏死因子-αTNFα；

(2)将不同的检测抗体进行信号标记，其中所述的每一种检测抗体分别抗一种心脑血管疾病生物标志物且对应于捕获抗体，并与捕获抗体分别结合于该生物标志物的不同抗原表位；

(3)将步骤(1)形成的三联复合体与步骤(2)中的带有信号标记的检测抗体混合，从而形成“信号标记的检测抗体-心脑血管疾病生物标志物-捕获抗体-微球”四联复合体；

(4)用液相芯片法xMAP检测出四联复合体中不同微球的标记信号，从而确定待检测样品中各种心脑血管疾病生物标志物的存在及含量。

2.如权利要求1所述的心脑血管疾病生物标志物的联合并行检测方法，其特征在于，步骤(4)中，所述确定待检测样品中各种心脑血管疾病生物标志物的含量，其具体方法为：将步骤(4)中测定的标记信号与标准曲线进行比较，从而确定待检测样品中各种心脑血管疾病生物标志物的含量。

3.如权利要求1所述的心脑血管疾病生物标志物的联合并行检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的微球是一种颜色编码微球Color-coded Beads，且结合了不同荧光染料的聚苯烯微球。

4.如权利要求1所述的心脑血管疾病生物标志物的联合并行检测方法，其特征在于，所述的捕获抗体和检测抗体是针对以下6种标志物自由组合的心脑血管疾病生物标志物的捕获抗体和检测抗体：

血清淀粉样蛋白A SAA、可溶性E-选择素sE-Selectin、可溶性细胞间粘附分子sICAM-1、可溶性CD40L sCD40L、白介素-6IL-6、肿瘤坏死因子-αTNFα。

5.如权利要求1所述的心脑血管疾病生物标志物的联合并行检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中用液相芯片法xMAP进行检测，可检测的标记信号是荧光信号。

6.一种检测心脑血管疾病生物标志物的诊断试剂盒，其特征在于，包括以下主要组成成分：

(1)偶联抗体的微球：含有分别偶联了不同捕获抗体的微球，包含以下任意一种或任意多种微球：偶联了血清淀粉样蛋白A SAA捕获抗体的微球，偶联了可溶性E-选择素sE-Selectin捕获抗体的微球，偶联了可溶性细胞粘附分子sICAM-1捕获抗体的微球，偶联了可溶性CD40L sCD40L捕获抗体的微球，偶联了白介素-6IL-6捕获抗体的微球，偶联了肿瘤坏死因子αTNFα捕获抗体的微球；每种捕获抗体分别抗一种心脑血管疾病生物标志物并且偶联于不同编号的微球，形成“抗体-微球”的二联复合体；

(2)信号标记的检测抗体：包含以下任意一种或任意多种带有信号标记的检测抗体：标记的血清淀粉样蛋白A SAA检测抗体，标记的可溶性E-选择素sE-Selectin检测抗体，标记的可溶性细胞粘附分子sICAM-1检测抗体，标记的可溶性CD40L sCD40L检测抗体，标记的白介素-6IL-6检测抗体，标记的肿瘤坏死因子αTNFα检测抗体；其中所述的每一种检测抗体分别抗一种相应的心脑血管疾病生物标志物且对应于捕获抗体，并与捕获抗体分别结合于该生物标志物的不同抗原表位；

(3)标准品：包含各种心脑血管疾病生物标志物的标准品；

(4)质控品：包含阳性对照和阴性对照。

7.如权利要求6所述的检测心脑血管疾病生物标志物的诊断试剂盒，其特征在于，所述的捕获抗体和检测抗体是包含针对以下6种自由组合的心脑血管疾病生物标志物的捕获抗体和检测抗体：

血清淀粉样蛋白A SAA、可溶性E-选择素sE-Selectin、可溶性细胞间粘附分子sICAM-1、可溶性CD40L sCD40L、白介素-6IL-6、肿瘤坏死因子-αTNFα。

8.一种如权利要求6或7所述的诊断试剂盒是在检测体外样品中心脑血管疾病生物标志物的存在和含量中的应用，以及在心脑血管疾病的危险因素筛查或预测、诊断检测、疗效监测和预后判断中的应用。

9.一种如权利要求6或7所述的诊断试剂盒在除心脑血管疾病以外的其他疾病的诊断检测或预测、疗效监测和预后判断中的应用。

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