CN1863546A - 用可溶性ctla4分子治疗心血管疾病的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过给予受试者阻断内源B7分子与它们的配体的结合的可溶性CTLA4分子而治疗心血管系统疾病的组合物和方法。

Description

用可溶性CTLA4分子治疗心血管疾病的方法

在本申请中参考了许多出版物，在此引用这些出版物的全部公开内容作为参考，以便完善地描述本发明涉及领域的状况。

发明领域

本发明总体涉及心血管疾病领域。具体地，本发明涉及通过给予受试者单独的有效量的可溶性CTLA4分子，或者与其他治疗试剂联用药而用于治疗或预防心血管疾病的方法和组合物。

发明背景

大约有6200万美国人患有一种或多种类型的心血管疾病，同时，仅在美国，1700多万名病人深受冠心病(CHD)和发作综合征的困扰(见AmericanHeart Association.2002 Heart和Stroke Statistical Update.Dallas，Tex.：American Heart Association；2001)。尽管治疗方法很多，治疗技术也取得了长足的进步，但是这类疾病的发病率和死亡率极高；事实上，在美国，心血管疾病是导致死亡的头号病因，每5例死亡人数中就有2例。因此，需要采用新的方法治疗和预防心血管疾病。

有学说认为作为冠心病(CHD)头号致病原因的动脉硬化是是由于脂肪类物质在动脉壁上的被动累积，直至最终导致表现出有症状的心血管疾病，这一学说不再是不可动摇的(见Scientific American 2002(May)：46-55)。相反，这种假设正被另一种证据所替代，即心血管疾病代表是一种慢性炎症过程(见Circulation 2002；105：1135-43)。潜在的和当前的急性冠状血管和脑血管发病都是“脆弱的(vulnerable)”(或高风险的)动脉粥样硬化斑。炎症被认为是导致动脉粥样硬化斑不稳定和破裂的主要诱因，而这种不稳定和破裂又导致了不稳定心绞痛(unstable angina)(UA)和急性心肌梗塞(acute myocardialinfarction)(AMI)。已经表明脆弱的动脉粥样斑经常出现在解剖学上不同的位置，而不是仅仅分离存在于单独的病灶(见Circulation 2003；107：2072-2075)。在解剖学丛书及利用血管造影、血管内超频率音响(IVUS)、血管镜(angioscopic)、以及热敏成像法的研究中，记载了脆弱的动脉粥样斑的这种多焦点的特性。更进一步支持以上假设的临床终点(Clinical endpoint)数据(如死亡，心肌梗塞，发作综合征)来源于流行病学数据、产生假设的完整临床试验的回顾性分析、以及在临床试验中的预期评价(归纳见下文)。

来源于《医生健康研究》(Physician’s Health Study)的流行病学数据提供了引人注目的证据，这些证据表明炎症标志物(例如C反应蛋白[CRP]、纤维蛋白原、白细胞介素-6、可溶性细胞内粘连分子-1[sICAM-1])可预计未来发生的急性心肌梗塞(AMI)的风险(见Circulation 1999；100：1148-1150)。其次，超过12个以人群为基础的流行病学研究也报告了相似的发现(见Circulation 2002；105：1135-43)。CRP(和高敏感性的C反应蛋白[hs-CRP])在这些流行病学研究中已经成为最为广泛研究的炎症标志物。无论在一级预防和二级预防病人群体中，对于随后的心血管事件(AMI、死亡)，CRP都表现为一种独立的预测因子。

实验和临床数据都支持了这样一个概念，即炎症的减少可以减少临床事件。《医生健康研究》已表明，如CRP测定所示那样阿斯匹林与炎症减少有关，也与伴随而来的减少冠状血管病事件有关(见Circulation 1999；100：1148-1150)。在一群相对健康的男性群体中，上述发现中阿斯匹林的抗炎症效果/CRP减少相对于抗血小板效应的影响的程度未知。羟基-3-甲基辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂(“他汀类(statins)”，例如普伐他汀(pravastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、和洛伐他汀(lovastatin))就是现存具有抗炎特性的治疗的第二个例证。除了对血清脂质的作用外，他汀类也减少CRP(见Circulation 2002；105：1135-43)。在胆固醇和复发性事件(CARE)研究中，普伐他汀(pravastatin)提供了最初的临床证据，这些证据表明他汀类治疗以与低密度脂蛋白(LDL)或高密度脂蛋白(HDL)胆固醇无关的方式降低CRP。在该高胆固醇人群中，与那些没有炎症证据的受试者相比，同时具有炎症证据(例如，即CRP提高)的受试者随后出现心血管疾病的相对风险减低的强度要大得多(见Circulation 1999；100：230-235)。这一观察结论将在普伐他汀(pravastatin)炎症CRP评价(PRINCE)研究中证实，也在其他多种他汀试验的分析中报道(见Circulation 2002；105：1135-43)。

区分他汀治疗对高CRP病人与高胆固醇病人的证据来自于空军/德克萨斯冠状动脉硬化症预防研究(AFCAPS/TexCAPS；见New Engl J Med 2001；344：1959-1965)。这项研究是运用洛伐他汀(lovastatin)在低度到中度心血管风险人群中进行初步预防的研究。在这项研究中，由洛伐他汀提供的风险降低的强度，与安慰剂相比较，在低水平LDL/高水平CRP病人中与高水平LDL/低水平CRP病人中相差无几。

以上的发现说明炎症代表了一种新的风险种类，其不是目前临床实践指南中的标准治疗。由于大约半数的心脏疾病发作发生在正常水平胆固醇人群中，鉴别和调整新近确定的风险因素将是减少心血管发病率和死亡率的重要策略。据估计，符合低水平LDL/高水平CRP的群体大约有2500万美国人(见Circulation 2002；105：1135-43)。C反应蛋白水平的升高的发生与随后的心血管事件风险的分级方式一致。在10％的健康个体中发现升高的CRP(＞3mg/dL)，但是可以分别在＜20％的稳定性心绞痛、＞65％的不稳定性心绞痛(Braunwald级别IIIb)、以及＞90％的AMI病人中，发现升高的CRP(见Circulation 2002；105：1135-43)。因此，在心血管事件发生的风险人群中，炎症标志物体现了鉴别和药物介入的机会。

其他可能替代或增加CRP测定效用的炎症标志物正在出现。近来，新的炎症标志物，包括可溶性CD40配体(sCD40L)的增加和血清白细胞介素-10(IL-10)浓度的减少，与已经增加的心血管发病率和死亡率相关联。证据表明CD40配体(CD40L)在动脉粥样硬化斑去稳定化中十分重要。被受刺激淋巴细胞脱落的CD40L是导致炎症细胞因子和粘附分子上调的促炎反应。而且，CD40L通过诱使组织因子在巨噬细胞和内皮细胞中的表达来促进凝结，也活化糖蛋白IIb/IIIa(见Proc.Natl.Acad.Sci.1997；94：1931-1936；Nature 1998；394：200-203；Circulation 2002；106：896-899)。

源自《妇女健康研究》的流行病学证据证明：升高的血清sCD40L浓度与心血管风险分级的、持续的增加相关联(见Circulation 2001；104：2266-2268)。在具有最高的可溶性CD40配体(sCD40L)的妇女中，心血管风险增加几乎12倍。相似的发现也在顽固不稳定性心绞痛c7E3Fab抗血小板治疗(CAPTURE)研究中观测到(见NEJM 2003；348：1104-1111)。在这项研究中，基于sCD40L基线的五分之一，在安慰剂治疗的受试者中，注意到心血管风险(死亡和非致命心肌梗塞)分级的、持续的增加。无论在早期(24小时)或晚期(6个月)的终点测定中，心血管风险的差异都是显著的。来自于对抗炎症因子IL-10进行研究的CAPTURE试验的相似分析表明，具有高水平IL-10(即高水平抗炎症因子)的经安慰剂的治疗的病人，死亡风险有所降低(见Circulation 2003；107：2109-2114)。那些抗炎症因子IL-10血清浓度最高的四分之一的病人，与那些血清IL-10水平最低的四分之一的病人相比较，死亡率减少＞50％。而且，如果病人群体被医院划分成或高IL-10水平或低IL-10水平的两组群体时，在第6个月，会发现调整过的死亡率0.38即62％的相对风险降低)危险比率，其有利于具有高(抗炎症)IL-10水平的受试者。

总之，由于脂质沉积导致心血管疾病作为被动过程发生这一概念已经过时了。表明心血管疾病是慢性炎症过程的显现以及介入这一炎症会减少病人发病率和死亡率的实验和临床证据明显增加。但是目前，仅仅对这些过程中细胞和分子的介导物进行了阐明。适当的急性冠状整体征ACS)的临床前模型的缺乏阻碍了对这些过程的阐明。尽管缺乏对这些精确的基质的了解，他汀类药物抗炎症的效果显然验证了对具备高炎症标志物的病人进行药理学介入，会导致心血管发病率和死亡率降低。特别是，这些益处是由偶然发现的他汀类药物所具备的多效性抗炎症活性所给予的。对细胞和分子过程的更深层理解会带来特效药和更有效的抗炎症制剂的发展，以进一步减少这些病人的心血管发病率和死亡率。

一般来说，T细胞应答的强度由T细胞表面分子与其配体之间的相互作用引发的共刺激应答测定(Mueller，et al.，1989 Ann.Rev.Immunol.7：445-480)。关键的共刺激信号是由T细胞表面受体CD28和CTLA4，与抗原呈递细胞上的其配体，如B7相关分子CD80(即B7-1)和CD86(即B7-2)之间的相互作用提供(Linsley，P.和Ledbetter，J.1993 Ann.Rev.Immunol.11：191-212)。没有共刺激存在时T细胞的活化导致无反应性T细胞应答(Schwartz，R.H.，1992 Cell 71：1065-1068)，其中免疫系统变得对刺激无应答。

CD28和CTLA的可溶形式已经通过融合CD28和CTLA4的可变区(V)样细胞外结构域与免疫球蛋白(Ig)恒定区，得到CD28Ig和CTLA4Ig而构建。CTLA4Ig的核苷酸和氨基酸序列见图24，该蛋白从+1位的甲硫氨酸或从-1位的丙氨酸开始，以+357位的赖氨酸终止。CTLA4Ig相对于CD28Ig而言，前者与CD80阳性和CD86阳性细胞的结合更强(Linsley，P.，et al.，1994 Immunity 1：793-80)。已经发现许多T细胞依赖性的免疫应答被CTLA4Ig在体内和体外阻断。(Linsley，P.，et al.，1991b，supra；Linsley，P.，et al.，1992a Science 257：792-795；Linsley，P.，et al.，1992b J.Exp.Med.176：1595-1604；Lenschow，D.J.，et al.1992 Science 257：789-792；Tan，P.，et al.，1992 J.Exp.Med.177：165-173；Turka，L.A.，1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：11102-11105)。

为了改变可溶性CTLA4Ig融合分子与天然配体，如B7的结合亲和力，通过该分子CTLA4部分中的氨基酸突变而修饰该分子。经突变后对B7配体的结合亲和力发生改变的CTLA4区域包括互补决定区1(CDR-1，描述于美国专利6,090,914，5,773,253，5,844,095；共同未决的美国专利申请60/214,065；以及Peach et al，1994.J.Exp.Med.，180：2049-2058)和互补决定区3(CDR-3)样区域(CDR-3是CTLA4的细胞外结构域的保守区，描述于美国专利6,090,914，5,773,253和5,844,095；共同未决的美国专利申请60/214,065；以及Peach，R.J.，et al JExp Med 1994 180：2049-2058；CDR-3样区域包括CD-3区和由一些氨基酸在CDR-3的上游和/或下游形成的延伸部分)。CDR-3样区域包括六肽基序MYPPPY，该序列在所有CD28和CTLA4家族成员中是高度保守的。在CTLA4中的整个六肽基序和在CD28Ig中的选定残基的丙氨酸扫描诱变使得与CD80的结合减少或消失(Peach，R.J.，et al JExp Med1994 180：2049-2058；美国专利号5,434,131；美国专利号6,090,914；美国专利号5,773,253)。

通过交换CTLA4和CD28的同源区对可溶性CTLA4Ig分子进行进一步修饰。鉴定出这些嵌合CTLA4/CD28同源突变分子具有CTLA4和CD28常见的MYPPPY六肽基序，以及CTLA4的CD-1和CD-3样区域中的某些非保守的氨基酸残基，这些区域使CTLA4与CD80的结合亲和力增加(Peach，R.J.，et al.，1994 J Exp Med 180：2049-2058)。

可溶性CTLA4分子，如CTLA4Ig，CTLA4突变分子或上述嵌合CTLA4/CD28同源突变体引入了一组新的治疗心血管疾病的治疗性药物。

发明概述

本发明提供了通过给予受试者分子而治疗心血管疾病的组合物和方法，该分子阻断B7与CTLA4和/或CD28的相互作用，从而抑制B7阳性细胞上的内源性B7分子与T细胞上的CTLA4和/或CD28结合。用于本发明方法的可溶性CTLA4分子包括CTLA4Ig和可溶性CTLA4突变分子L104EA29YIg。

本发明提供了通过给予受试者可溶性CTLA4分子而治疗心血管疾病的组合物和方法，该可溶性CTLA4分子与B7阳性细胞上的B7分子结合，从而抑制内源性B7分子与T细胞上的CTLA4和/或CD28结合。用于本发明方法的可溶性CTLA4分子包括CTLA4Ig和可溶性CTLA4突变分子L104EA29YIg。

本发明也提供了通过给予患有心血管疾病症状的受试者CTLA4Ig等可溶性性CTLA4分子和/或可溶性CTLA4突变分子L104EA29YIg和/或任何可溶CTLA分子的混合物而治疗(如其减轻症状)心血管疾病的方法。优选将例如图19所示的开始于+1位的甲硫氨酸或-1位的丙氨酸，终止于+357位的赖氨酸的CTLA4Ig和CTLA4突变分子L104EA29YIg用于本发明的方法。

本发明也提供一种用于治疗心血管疾病的药物组合物，包含可药用载体和生物有效试剂，如可溶性CTLA4分子，其单独使用或与其他治疗药物联用。

本发明也包括含有治疗心血管疾病的药物组合物的试剂盒。在一种实施方案中，用包含一种或多种本发明的药物组合物的试剂盒治疗心血管疾病。例如，该药物组合物包含有效量的、可与B7阳性细胞上的B7分子结合的可溶性CTLA4分子，从而阻断B7分子与T细胞上的CTLA4和/或CD28结合。此外，该试剂盒可以含有一种或多种与本发明的药物组合物联用的其他治剂。

附图简述

图1A：患者队列的人群统计数据。人群统计数据包括性别、种族和疾病持续时间，见下文实施例3的描述。

图1B：患者队列的人群统计数据。人群统计数据包括性别、年龄、体重和由患者和医生所评价的疾病活动度，见下文实施例外的描述。

图1C：患者队列的人群统计数据，见下文实施例3的描述。人群统计数据包括疾病活动度、红细胞沉降速度(ESR)、身体功能(由健康问卷评价的残疾)以及C反应蛋白(CRP)。

图1D：患者队列的人群统计数据，见下文实施例3的描述。人群统计数据包括关节肿胀、关节触痛、晨僵和疼痛。

图1E：患者队列的人群统计数据，见下文实施例3的描述。人群统计数据包括以前的治疗。

图2：第85天由于某种原因而停药的总结，描述于下文实施例3。

图3A：如下文实施例3所描述的第85天的ACR反应：ACR-20，-50，和-70反应。

图3B：如下文实施例3所描述的第85天的ACR-20反应，包括安慰剂反应：具有95％置信度的ACR-20反应。

图3C：如下文实施例3所描述的第85天的ACR-20反应：具有95％置信区间的ACR-20反应差异。

图4A：第85天时计为患者百分比的肿胀和关节触痛的基本(20％改善)临床反映，如下文实施例3的描述：基本临床反应，ACR-20。

图4B：第85天时计为患者百分比的肿胀和关节触痛的临床反应(改进百分比)，如下文实施例3的描述：以改进百分比表示的临床反应的改变。

图5A：第85天时以患者百分比表示的疼痛反应(通过Likert标准，自基线的平均单位改变)，如下文实施例3的描述：自基线的疼痛评分改变。

图5B：第85天时以患者百分比表示的患者评价的总体疾病改变(通过Likert标准，自基线的平均单位改变)，如下文实施例3的描述：患者评价的总体疾病活动度改变。

图5C：第85天时以患者百分比表示的医生评价的总体疾病改变(通过Likert标准，自基线的平均单位改变)，如下文实施例3的描述：医生评价的总体疾病活动度改变。

图5D：第85天时以患者百分比表示的疼痛(通过Likert标准，自基线的平均单位改变)，如下文实施例3的描述：自基线的疼痛改变。

图6A：第85天时患者对疾病活动度自基线改变的总体评估，范围为2个单位，如下文实施例3的描述：疾病活动度改进。

图6B：第85天时医生对疾病活动度自基线改变的总体评估，范围为2个单位，如下文实施例3的描述：疾病活动度改进。

图7A：第85天时C反应蛋白(CRP)水平减少的百分比，如下文实施例3的描述：自基线的CRP水平减少百分比。

图7B：第85天时C反应蛋白(CRP)水平减少的差异，如下文实施例3的描述：95％置信区间时CRP水平减少百分比差异。

图7C：第85天时C反应蛋白(CRP)水平的平均减少，如下文实施例3的描述：自基线的平均改变。

图8：第85天时可溶性IL-2水平的自基线的平均改变的减少，如下文实施例3的描述。

图9A：CTLA4Ig对关节触痛的影响随时间的变化，如下文实施例3的描述：自基线的平均差。

图9B：CTLA4Ig对关节触痛的影响随时间的变化，如下文实施例3的描述：自基线的平均差异。

图10A：随时间的CTLA4Ig对关节肿胀随时间的变化，如下文实施例3的描述：自基线的中值差异。

图10B：CTLA4Ig对关节肿胀的影响随时间的变化，如下文实施例3的描述：自基线的平均差异。

图11：CTLA4Ig对患者的疼痛评估的影响随时间的变化，如下文实施例3的描述：自基线的平均差异。

图12A：CTLA4Ig对患者的疾病活动度的评价的影响随时间的变化，如下文实施例3的描述：自基线的平均差异。

图12B：CTLA4Ig对医生的疾病活动度评价的影响随时间的变化，如下文实施例3的描述：自基线的平均差异。

图13A：L104EA29YIg对关节触痛的影响随时间的变化，如下文实施例3的描述：自基线的中值差异。

图13B：L104EA29YIg对关节触痛的影响随时间的变化，如下文实施例3的描述：自基线的平均改变。

图14A：L104EA29YIg对关节肿胀的影响随时间的变化，如下文实施例3的描述：自基线的中值差异。

图14B：L104EA29YIg对关节肿胀的影响随时间的变化，如下文实施例3的描述：自基线的平均改变。

图15：L104EA29YIg对疼痛评估的影响随时间的变化，如下文实施例3的描述：自基线的平均改变。

图16A：L104EA29YIg对疾病活动度患者评估的影响随时间的变化，如下文实施例3的描述：自基线的平均差异。

图16B：L104EA29YIg对疾病活动度医生评估的影响随时间的变化，如下文实施例3的描述：自基线的平均改变。

图17：在用健康评估问卷(HAQ)评估的情况下，与下文实施例外中描述的CTLA4Ig和L104EA29YIg治疗相比，在第85天时患者残疾(disability)的改进百分比。

图18：如下文实施例1中描述的L104EIg的核苷酸和氨基酸序列。

图19：如下文实施例1中描述的L104EA29YIg的核苷酸和氨基酸序列。

图20：如下文实施例1中描述的L104EA29LIg的核苷酸和氨基酸序列。

图21：如下文实施例1中描述的L104EA29TIg的核苷酸和氨基酸序列。

图22：如下文实施例1中描述的L104EA29WIg的核苷酸和氨基酸序列。

图23：CTLA4受体的核苷酸和氨基酸序列。

图24：CTLA4Ig的核苷酸和氨基酸序列。

图25：CTLA4Ig(第一道)，L104EIg(第二道)，和L104EA29YIg(第3A道)的SDS凝胶；以及CTLA4Ig(图25B)，和L104EA29YIg(图25C)的大小排阻层析。

图26(左图和右图)：由NMP光谱测定的由溶液结构产生的CTLA4细胞外IgV样折叠的带状图。由图26(右图)表示CDR-1(S25-R33)区和MYPPPY区的透视图，说明增强亲和力的突变L104和A29的位置及侧链方向。

图27A和图28B说明FACS分析的数据，显示L104EA29YIg，L104EIg和CTLA4Ig与人类CD80-或CD86-转染的CHO细胞的结合，见下文实施例2的描述。

图28A和28B描述CD80阳性和CD86阳性CHO细胞增殖的抑制，见下文实施例2的描述。

图29A和29B说明L104EA29YIg较CTLA4Ig对于抑制一次和二次同种异体刺激的T细胞的增生更为有效，见下文实施例2的描述。

图30A-C说明L104EA29YIg较CTLA4Ig对于抑制同种异体刺激的T细胞产生IL-2(图30A)，IL-4(图30B)和γ干扰素(图30C)细胞因子更为有效，见下文实施例2的描述。

图31说明L104EA29YIg较CTLA4Ig在抑制一次和二次同种异体植物凝集素(PHA)刺激的猴T细胞增殖中更为有效，见下文实施例2的描述。

图32说明L104EA29YIg，L104EIg和野生型CTLA4Ig与CD86Ig的平衡结合(equilibrium binding)分析。

图33A和33B：第85天时可溶性ICAM-1和E-选择蛋白选择蛋白水平的减少自基线的平均改变，见下文实施例3的描述。

图34：图示了在响应甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)的治疗中，到就诊日时ACR20反应的总结，见下实施例5的描述。

图35：在响应单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)的治疗中，就诊日获得ACR50反应总结，见下实施例5的描述。

图36：在响应单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)的治疗中，到就诊日时ACR70反应的总结，见下实施例5的描述。

图37：在响应单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)的治疗中，平均ACR-N与对应时间，见下实施例5的描述。

图38：柱状图说明第85天时在响应单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)的治疗中，有95％可信度的ACR反应，见下实施例5的描述。

图39：柱状图说明第85天时在响应单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)的治疗中，新活性关节的比例，见下实施例5的描述。

图40：说明第180天时经过单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)的治疗，ACR的反应，见下实施例5的描述。

图41：说明经过单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)的治疗，关节触痛改善百分比-自基线的平均改善百分比，见下实施例5的描述。

图42：图示说明经过单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)的治疗，肿胀关节改善百分比-自基线的平均改善百分比，见下实施例5的描述。

图43：图示说明经过单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)的治疗，关节疼痛改善百分比-自基线的平均改善百分比，见下实施例5的描述。

图44：图示说明经过单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)的治疗，受试者报道的疾病活动性改善百分比-自基线的平均改善百分比，见下实施例5的描述。

图45：图示说明经过单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)的治疗，医生报道的疾病活动性改善百分比-自基线的平均改善百分比，见下实施例5的描述。

图46：图示说明经过单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)的治疗，身体(physical)功能改善百分比-对比用HAQ测量的基线的平均改善比例，见下实施例5的描述。

图47：图示说明经过单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)的治疗，CRP水平功能改善百分比-自基线的平均改善百分比，见下实施例5的描述。

图48：图示说明经过单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)的治疗，CRP水平功能改善百分比-对比基线的中值改善比例，见下实施例5的描述。

图49：图示说明在第180天，在用CTLA4Ig(2或10mg/kg)治疗的两个组与仅用甲氨蝶呤治疗的组的比较(95％的可信度)中，比较ACR反应率的差异，见下实施例5的描述。

图50：图示说明在第180天，在用CTLA4Ig(2或10mg/kg)治疗的两个组与仅用甲氨蝶呤治疗的组的比较(95％的可信度)中，SF-36身体健康因素自基线的改变，见下实施例5的描述。

图51：图示说明在第180天，在用CTLA4Ig(2或10mg/kg)治疗的组与仅用甲氨蝶呤治疗的组的比较(95％的可信度)中，SF-36精神健康因素自基线的改变，见下实施例5的描述。

图52：以柱状图说明第180天时经过单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)治疗，CRP水平的变化，见下实施例5的描述。

图53：以柱状图说明第180天时经过单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)治疗，类风湿因子水平的变化，见下实施例5的描述。

图54：以柱状图说明第180天时经过单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)治疗，IL-2r因子水平的变化，见下实施例5的描述。

图55：以柱状图说明第180天时经过单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)治疗，IL-6因子水平的变化，见下实施例5的描述。

图56：以柱状图说明第180天时经过单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)治疗，TNFα因子水平的变化，见下实施例5的描述。

图57：图示说明治疗组BMS 10的筛选/入组甲氨蝶呤剂量单变量表-用10mg/kg体重CTLA4Ig治疗，见下实施例5的描述。

图58：图示说明治疗组BMS 2的筛选/入组甲氨蝶呤剂量单变量表-用2mg/kg体重CTLA4Ig治疗，见下实施例5的描述。

图59：图示说明安慰剂组的筛选和入组的甲氨蝶呤剂量单变量表，见下实施例5的描述。

图60：图示说明持续到且包括研究的第180天，针对治疗组BMS 10--10mg/kg体重CTLA4Ig治疗的甲氨蝶呤剂量单变量表，见下实施例5的描述。

图61：说明持续到且包括研究的第180天，针对治疗组BMS 2--2mg/kg体重CTLA4Ig治疗的甲氨蝶呤剂量单变量表，见下实施例5的描述。

图62：说明持续到且包括研究的第180天，针对安慰剂组的甲氨蝶呤剂量单变量表，见下实施例5的描述。

图63：柱状图说明在第180天，比较单独用依那西普(25mg每周两次)和与CTLA4Ig(2mg/kg)联用治疗，两组在修订后ACR响应率中的差异，见下实施例6的描述。

图64A-C：比较单独用依那西普(25mg每周两次)和与CTLA4Ig(2mg/kg)联用治疗后，每天随访评估的修订后ACR个别指标的改进百分比，见下实施例6的描述。A：压痛关节数；B：中长关节数；C：疼痛指数

图65A：说明在第180天，经过单独用依那西普(25mg每周两次)和与CTLA4Ig(2mg/kg)两组治疗后，SF-36身体健康因素自基线的变化，见下实施例6的描述。B：说明在第180天，经过单独的依那西普(25mg每周两次)或与CTLA4Ig(2mg/kg)联用治疗的两组中，SF-36精神健康因素自基线的变化，见下实施例6的描述。

图66：CTLA4Ig的核酸序列，编码信号肽，以及开始在+1位置的蛋氨酸到124位置的天冬氨酸，或者开始在-1位置的丙氨酸位置到124位置的天冬氨酸的CTLA4Ig胞外结构域的野生氨基酸序列，及Ig区域(SEQ ID NO.：21)。

图67：CTLA4Ig的氨基酸序列，编码信号肽，以及开始在+1位置的蛋氨酸到124位置的天冬氨酸，或者开始在-1位置的丙氨酸位置到124位置的天冬氨酸的CTLA4Ig胞外结构域的野生氨基酸序列，及Ig区域(SEQ IDNO.：22)。

图68：图示说明分成三个队列的受试者特征，见下实施例7的描述。

图69：在研究首的个12月期间，无论任何理由中止治疗受试者的积累比例的Kaplan-Meier图，见下实施例7的描述。

图70：在研究的首个12月期间，由于缺少疗效中断治疗受试者的积累比例的Kaplan-Meier图，见下实施例7的描述。

图71A：说明给药单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)，第180天时病人的ACR响应，见下实施例7的描述。

图71B：说明给药单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)，第180天时病人的ACR响应的95％的差异可信度，见下实施例7的描述。

图72A：说明给单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)，第360天时病人的ACR响应，见下实施例7的描述。

图72B：说明给药单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)，第360天时病人的ACR响应的95％的差异可信度，见下实施例7的描述。

图73A：总结说明给单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)，一年期间随访获得病人的ACR20响应，见下实施例7的描述。

图73B：总结说明给单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)，一年期间就诊(visit)获得病人的ACR50响应，见下实施例7的描述。

图73C：总结说明给单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)，一年期间就诊获得病人的ACR70响应，见下实施例7的描述。

图74：说明给药单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)，一年期间病人的平均ACR-N响应，见下实施例7的描述。

图75：说明给药单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)，第180天时病人的新法活动性关节的比例，见下实施例7的描述。

图76A：说明给药单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)，第180天时病人的个体新发压痛关节的频率，见下实施例7的描述。

图76B：说明给药单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)，第360天时病人的个体新发压痛关节的频率，见下实施例7的描述。

图77A：说明给药单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)，第180天时病人的个体新发肿胀关节的频率，见下实施例7的描述。

图77B：说明给药单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)，第360天时病人的个体新发肿胀关节的频率，见下实施例7的描述。

图78：说明给药单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)，第360天时病人的新发活动性关节的比例，见下实施例7的描述。

图79：说明给药单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)，第180天时A)身体健康功能中自基线的改变，B)精神健康功能中自基线的改变，见下实施例7的描述。

图80：说明给药单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)，第360天时A)身体健康功能中自基线的改变，B)精神健康功能中自基线的改变，见下实施例7的描述。

图81：说明给药单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)，第180天和360天时，可溶性IL-2r的基线水平，见下实施例7的描述。

图82：说明给药单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)，第180天和360天时，类风湿因子的基线水平，见下实施例7的描述。

图83：说明给药单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)，第180天和360天时，ICAM-1的基线水平，见下实施例7的描述。

图84：说明给药单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)，第180天和360天时，e-选择蛋白的基线水平，见下实施例7的描述。

图85：说明给药单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)，第180天和360天时，血清IL-6的基线水平，见下实施例7的描述。

图86A：说明给药单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)，第180天和360天时，CRP的基线水平，见下实施例7的描述。

图86B：说明给药单独的甲氨蝶呤，或者甲氨蝶呤和CTLA4Ig(2或10mg/kg)，第180天和360天时，TNFα的基线水平，见下实施例7的描述。

图87：动脉粥样硬化切除术样品中活性T细胞的比例。

发明详述

定义

除非特别定义，本申请中使用的所有科学和技术属于具有本领域常用的意义。本申请在此使用的以下词或短语有指定的意义。

在此使用的“配体”指特异性识别并结合另一种分子的分子，例如，CTLA4的配体是B7分子。在以后的例子中，B7分子是CTLA4和/或CD28分子的配体。一个分子与其配体的相互作用可以由本发明的组合物来调节。例如，CTLA4与其配体B7的相互作用可以通过给予CTLA4Ig分子阻断。此外，肿瘤坏死因子(TNF)这种配体，与它的受体-肿瘤坏死因子受体(TNFR)相互作用，并且可以通过给予依那西普或其他TNF/TNFR阻断分子而被阻断。

在此使用的“野生型CTLA4”或“非突变CTLA4”具有图23所示的天然存在的全长CTLA4的氨基酸序列(也描述于美国专利5,434,131，5,844,095，和5,851,795，在此引用作为参考)，或其任意部分或衍生物，它们识别和结合B7并/或干扰B7，从而阻断B7与CD28和或CTLA4(如内源性CD28和/或CTLA4)结合。在特定实施方案中，野生型CTLA4的细胞外结构域，如图23所示，以+1位的甲硫氨酸起始，以+124位的天冬氨酸终止；或以-1位的丙氨酸起始，以124位的天冬氨酸终止。野生型CTLA4是一种细胞表面蛋白，含有N末端细胞外结构域、跨膜结构域和C末端细胞质结构域。细胞外结构域结合靶分子，例如B7。细胞中天然存在的野生型CTLA4蛋白翻译为包含N末端信号肽的未成熟多肽。该未成熟多肽进行翻译后处理，包括剪切和去除信号肽而产生CTLA4剪切产物，它具有不同于未成熟形式N末端的新生N末端。本领域技术人员可以理解，可能发生额外翻译后处理，它从CTLA4剪切产物的新生N末端去除一个或更多氨基酸。另外，信号肽不能完全被去除，产生从常见起始氨基酸甲硫氨酸前开始的分子。因此，成熟CTLA4蛋白可以从+1位的甲硫氨酸或-1位的丙氨酸起始。CTLA4分子的成熟形式包括CTLA4的细胞外结构域，或其结合B7的任意部分。

在此使用的“CTLA4突变分子”表示有一或多处突变(优选在野生型CTLA4的细胞外结构域)的图23所示野生型CTLA4或其任何部分或衍生物。CTLA4突变分子有与野生型CTLA4分子相似但不完全相同的序列，其仍与B7结合。该突变可以包括一个或多个用具有保守的(例如用异亮氨酸取代亮氨酸)或非保守的(例如用色氨酸取代甘氨酸)结构或化学特性的氨基酸取代的氨基酸、氨基酸缺失、添加、移码或截短。突变CLTA4分子可以包括位于其中的或与其附着的非CTLA4分子。突变分子可以是可溶性的(即循环的)或结合于细胞表面。其它的CTLA4分子描述于美国专利申请09/865,321、60/214,065和60/287,576；美国专利6,090,914、5,844,095和5,773,253以及Peach，R.J.，et al.，J Exp Med 180：2049-2058(1994)。CTLA4分子可以合成或重组制备。

“CTLA4Ig”是可溶性融合蛋白，包含野生型CTLA4细胞外结构域，该细胞外结构域结合B7或B7一部分，并与免疫球蛋白(Ig)恒定区或恒定区一部分链接。特定实施方案中包括以+1位的甲硫氨酸起始，以+124位的天冬氨酸终止；或以-1位的丙氨酸起始，以+124位的天冬氨酸终止的野生型CTLA4的细胞外结构域(图23所示)；+125位的连接氨基酸残基谷氨酰胺；包含+126位谷氨酸至+357位赖氨酸的免疫球蛋白部分(编码CTLA4Ig的DNA于1991年5月31日根据布达佩斯条约保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209，保藏号为ATCC 68629；Linsley，P.，et al.，1994 Immunity 1：793-80)。CTLA4Ig-24，一种表达CTLA4Ig的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，于1991年5月1日保藏在ATTC，保藏号为CRL-10762。本发明的方法和/或试剂盒所使用的可溶性CTLA4Ig分子可以包括或不包括信号(前导)肽序列。一般地，在本发明的方法和/或试剂盒中，这些分子不包括信号序列。

“L104EA29YIg”是一种融合蛋白，它是一种可溶性CTLA4突变分子，包含野生型CTLA4的细胞外结构域，其中具有氨基酸改变A29Y(第29位的丙氨酸被酪氨酸残基取代)和L104E(第104位的亮氨酸被谷氨酸残基取代)，或其结合B7分子的部分，其与Ig尾连接(包括于图19；编码L104EA29YIg的DNA于2000年6月20日以ATCC保藏号PTA-2104保藏；见共同未决的美国专利申请09/579,927，60/287,576和60/214,065，在此引入作为参考)。本发明的方法和/或试剂盒所使用的可溶性L104EA29YIg分子可以包括或不包括信号(前导)肽序列。一般地，在本发明的方法和/或试剂盒中，这些分子不包括信号肽序列。

在此使用的“可溶性”指不结合或附着细胞，即循环的任何分子，或其片段和衍生物。例如，CTLA4、B7或CD28可以通过把免疫球蛋白(Ig)部分分别附着于CTLA4、B7或CD28的细胞外结构域而产生可溶性。此外，CTLA4等分子可以通过去除其跨膜结构域而可溶。一般地，本发明方法、组合物和/或试剂盒中使用的可溶性分子，并不包含信号(或前导)序列。

在此使用的“可溶性CTLA4分子”表示非细胞表面结合的(即循环的)CTLA4分子或与B7结合的CTLA4分子的任意功能部分，包括但并不仅限于：CTLA4融合蛋白(如以ATCC保藏号68629保藏的DNA所编码的蛋白)，其中CTLA4的细胞外结构域融合于免疫球蛋白(Ig)部分如IgCγ1(IgCgamma1)，IgCγ2(IgCgamma2)，IgCγ3(IgCgamma3)，IgCγ4(IgCgamma4)，IgCμ(IgCmu)，IgCα1(IgCalpha1)，IgCα2(IgCalpha2)，IgCδ(IgCdelta)or IgCε(IgCepsilon)，产生可溶性融合分子或其片段和衍生物；CTLA4的细胞外结构域，其融合或连接于有生物活性或化学活性蛋白的一部分，诸如乳头瘤病毒E7基因产物(CTLA4-E7)、黑色素瘤相关抗原p97(CTLA4-p97)或HIV env蛋白(CTLA4-env gp120)(描述于美国专利5,844,095，在此引入作为参考)，或其片段和衍生物；杂合(嵌合)融合蛋白如CD28/CTLA4Ig(描述于美国专利5,434,131，在此引入作为参考)，或其片段和衍生物；去除跨膜结构域而产生蛋白的可溶性CTLA4分子(Oaks，M.K.，et al.，2000 Cellular Immunology 201：144-153，在此引入作为参考)，或其片段和衍生物。“可溶性CTLA4分子”也包括其片段、部分或衍生物，以及可溶性CTLA4突变分子，它们具有CTLA4结合活性。本发明方法中使用的可溶性CTLA4分子可以包括或不包括信号(或前导)肽序列。一般地，本发明方法、组合物和/或试剂盒中使用的可溶性分子，并不包含信号肽序列。

在此使用的“CTLA4细胞外结构域”是识别并结合B7分子等CTLA4配体的CTLA4的部分。例如，CTLA4的细胞外结构域包括+1位的甲硫氨酸至+124位天冬氨酸(图23)。可选择的CTLA4细胞外结构域包括-1位的丙氨酸至+124位天冬氨酸(图23)。细胞外结构域包括结合于B7的CTLA4片段或衍生物。图23所示的CTLA4细胞外结构域也可以包含改变CTLA4分子与B7分子的结合亲和力的突变。

在此使用的“突变”表示野生型分子的核苷酸或氨基酸中的改变，例如，野生型CTLA4细胞外结构域的DNA和/或氨基酸序列中的改变。DNA的突变可以改变一个密码子，从而导致氨基酸序列的改变。DNA的改变可以包括取代、缺失、插入、添加、截短、或蛋白的加工或切割错误。另外，核苷酸序列的突变可以导致本领域公知的氨基酸序列的沉默突变。在这一点上，某些核苷酸密码子编码相同的氨基酸。其例子包括核苷酸密码子CGU、CGG、CCC和CGA，其编码精氨酸(R)；密码子GAU和GAC，其编码天冬氨酸(D)。因此，由具体核苷酸序列不同的一种或多种核酸分子编码的蛋白分子有相同的序列。氨基酸编码序列如下：

氨基酸	符号	单字母符号	密码子
				丙氨酸	Ala	A	GCU，GCC，GCA，GCG
半胱氨酸	Cys	C	UGU，UGC
				天冬氨酸	Asp	D	GAU，GAC
谷氨酸	Glu	E	GAA，GAG
				苯丙氨酸	Phe	F	UUU，UUC
甘氨酸	Gly	G	GGU，GGC，GGA，GGG
				组氨酸	His	H	CAU，CAC
异亮氨酸	Ile	I	AUU，AUC，AUA
				赖氨酸	Lys	K	AAA，AAG
亮氨酸	Leu	L	UUA，UUG，CUU，CUC，CUA，CUG
				甲硫氨酸	Met	M	AUG
天冬酰胺	Asn	N	AAU，AAC
				脯氨酸	Pro	P	CCU，CCC，CCA，CCG
谷氨酰胺	Gln	Q	CAA，CAG
				精氨酸	Arg	R	CGU，CGC，CGA，CGG，AGA，AGG

氨基酸	符号	单字母符号	密码子
				丝氨酸	Ser	S	UCU，UCC，UCA，UCG，AGU，AGC
苏氨酸	Thr	T	ACU，ACC，ACA，ACG
				颉氨酸	Val	V	GUU，GUC，GUA，GUG
色氨酸	Trp	W	UGG
				酪氨酸	Tyr	Y	UAU，UAC

突变分子可以具有一个或多个突变。

这里使用的“非CTLA4蛋白序列”或“非CTLA4分子”表示任一不与B7结合并且不干扰CTLA4与其靶点结合的蛋白分子。附着于CTLA4分子细胞外结构域的非CTLA4分子可以改变CTLA4分子的可溶性或亲和力。例子包括，但不限于，免疫球蛋白(Ig)恒定区或其部分。优选地，Ig恒定区为人或猴Ig恒定区，如人C(γ)1，包括铰链区，CH2和CH3区。Ig恒定区可以经突变而减弱其效应子功能(美国专利5,637,481，5,844,095和5,434,131)。

在此使用的“片段”或“部分”表示是CTLA4或CD28分子的任意部分或节段，优选CTLA4或CD28的细胞外结构域或其部分或节段，这个部分或节段识别并结合其靶例如B7。

在此使用的“B7”指B7家族的分子，包括，但不限于B7-1(CD80)(Freeman et al，1989，J Immunol.143：2714-2722，在此引入作为参考)、B7-2(CD86)(Freeman et al，1993，Science 262：909-911，在此引入作为参考；Azuma et al，1993，Nature 366：76-79，在此引入作为参考)，其识别并结合CD28和/或CTLA4。一个B7分子可以在活化的B细胞上表达。

在此使用的“CD28”指识别并结合B7的分子，描述于美国专利5,580,756和5,521,288(在此引入作为参考)。

在此使用的“B7阳性细胞”是细胞表面表达一种或多种类型的B7分子的任意细胞。

在此使用的“衍生物”是具有其亲代分子的序列相似性和活性的分子。例如，CTLA4的衍生物包括可溶性CTLA4分子，前者的氨基酸序列与野生型CTLA4的细胞外结构域有至少70％相似性，并且其识别并结合B7，如CTLA4Ig或可溶性CTLA4突变分子L104EA29YIg。衍生物表示对氨基酸序列和/或氨基酸化学特性如氨基酸类似物的任何变化。

在此使用的“调节”免疫应答指活化、刺激、上调、抑制、阻断、下调或改变免疫应答。在此描述的心血管疾病可以通过调节免疫应答进行治疗，如通过调节功能性CTLA4-和/或CD28阳性细胞与B7阳性细胞的相互作用。例如，调节免疫应答的方法包括将B7阳性细胞与本发明的可溶性CTLA4分子接触，以便形成可溶性CTLA4/B7复合物，可溶性CTLA4分子干扰内源性CTLA4和/或CD28分子与所述B7分子的反应。

在此使用的“阻断”或“抑制”受体、信号或分子表示通过本领域认可的试验检测到的那样，干扰受体、信号或分子的活化。例如，细胞介导的免疫应答的阻断可以通过测定免疫疾病相关症状的减少而检测。阻断或抑制可以是部分或全部的。

在此使用的“阻断B7相互作用”表示干扰B7与其配体，如CD28和/或CTLA4结合，从而阻断T细胞和B7阳性细胞相互作用。阻断B7与CTLA4和/或CD28相互作用的分子实例包括，但不限于以下分子，识别并与CTLA4、CD28或B7分子(如B7-1、B7-2)的任一种结合的抗体(或其部分或衍生物)；这些分子的可溶形式(或其部分或衍生物)，如可溶性CTLA4；设计为通过CTLA4/CD28/B7介导的相互作用而干扰细胞信号的肽片段或其他小分子。在一个优选实施方案中，阻断剂是可溶性CTLA4分子，诸如CTLA4Ig(ATCC 68629)或L104EA29YIg(ATCC PTA-2104)、可溶性CD28分子，诸如CD28Ig(ATCC 68628)，可溶性B7分子，诸如B7Ig(ATCC 68627)、抗B7单克隆抗体(例如ATCC HB-253，ATCC CRL-2223，ATCC CRL-2226，ATCC HB-301，ATCC HB-11341和erson等在美国专利6,113,898或Yokochiet al.，1982.J.Immun.，128(2)823-827中描述的单克隆抗体)、抗CTLA4单克隆抗体(例如ATCC HB-304，和参考文献82-83中描述的单克隆抗体)和/或抗CD28单克隆抗体(例如ATCC HB 11944和Hansen(Hansen et al.，1980.Immunogenetics 10：247-260)或Martin(Martin et al.，1984.J.Clin.Immun.，4(1)：18-22)描述的mAb 9.3)。也包含阻断B7与CTLA4和/或CD28相互作用的小分子。B7相互作用的阻断可以通过本领域认可的测试而检测，如测定免疫疾病(如心血管疾病)或炎症疾病相关症状的减少、测定T细胞/B7细胞相互作用的减少或测定B7与CTLA4和/或CD28相互作用的减少。阻断可以是部分或全部的。

在此使用的分子“有效量”指定义为阻断分子与其配体相互作用的数量。例如，阻断B7与CTLA4和/或CD28相互作用的分子有效量可以定义为当与B7阳性细胞上的B7分子结合时，抑制B7分子与内源性配体，如CTLA4和/或CD28结合的分子有效量。另外，阻断B7与CTLA4和CD28相互作用的分子有效量可以定义为当与T细胞上的CTLA4和/或CD28分子结合时，抑制B7分子与内源性配体，诸如CTLA4和CD28结合的分子有效量。抑制或阻断可以是部分或全部的。

在此使用的“治疗”疾病表示通过医学的或其他的治疗来控制疾病。疾病的治疗可以改善或减轻疾病症状，降低疾病的严重性，改变或阻止疾病进展过程，预防疾病发生，和/或改善或减轻或治愈基本疾病问题。心血管疾病的症状包括，但不限于：心律不齐；胸痛；心肌缺血；心绞痛；运动耐量减少；疲惫；劳力性呼吸困难；夜间阵发性呼吸困难；间歇性跛行；短暂性缺血发作和生活质量。例如，治疗心血管疾病可以通过调节免疫应答来完成，例如通过调节功能性CTLA4-和/或CD28-阳性细胞与B7阳性细胞的相互作用。此外，治疗心血管疾病可以通过使用在此描述的组合物以预防疾病的发生和进展来完成。

在此使用的“心血管疾病”具有在本领域通常使用的意义，并且包括，但不限于以下疾病或病症：血栓栓塞性疾病(thromboembolic disorder)，包含动脉心血管血栓栓塞性疾病(arterial cardiovascular thromboembolic disorder)；静脉心血管血栓栓塞性疾病(venous cardiovascular thromboembolicdisorders)；心室血栓栓塞性疾病(thromboembolic disorders in the chambers ofthe heart)；动脉粥样硬化(atherosclerosis)；再狭窄病变(restensosis)；外周动脉疾病(peripheral arterial disease)；冠状动脉旁路移植术(coronary bypassgrafting surgery)；颈动脉疾病(carotid artery disease)；动脉炎(arteritis)；心肌炎(myocarditis)；心血管炎症(cardiovascular inflammation)；脉管炎症(vascularinflammation)；冠心病(CHD)(coronary heart disease)；不稳定性心绞痛(UA)(unstable angina)；顽固性不稳定性心绞痛(unstable refractory angina)；稳定性心绞痛(SA)(stable angina)；慢性稳定性心绞痛(chronic stable angina)；急性冠状动脉综合征(ACS)(acute coronary syndrome)；首发或复发性心肌梗塞(first or recurrent myocardial infarction)；急性心肌梗塞(AMI)(acutemyocardial infarction)；心肌梗塞(myocardial infarction)；非Q波心肌梗塞(non-Q wave myocardial infarction)；非ST段抬高性心肌梗塞(non-STEmyocardial infarction)；冠状动脉疾病(coronary artery disease)；心肌缺血(cardiac ischemia)；缺血(ischemia)；缺血性突然死亡(ischemic sudden death)；短暂性缺血发作(transient ischemic attack)；发作综合征(stroke)；动脉粥样硬化；周围动脉硬化闭塞性疾病(peripheral occlusive arterial disease)；静脉血栓形成(venous thrombosis)；深静脉血栓形成(deep vein thrombosis)；血栓性静脉炎(thrombophlebitis)；动脉栓塞(arterial embolism)；冠状动脉血栓形成(coronary arterial thrombosis)；脑动脉血栓形成(cerebral arterial thrombosis)；脑栓塞(cerebral embolism)；肾栓塞(kidney embolism)；肺栓塞(pulmonaryembolism)；由以下情况导致的血栓形成(a)人工瓣膜或其他移植物(prostheticvalves or other implant)(b)留置导管(indwelling catheter)(c)支架(d)心肺分流术(cardiopulmonary bypass)(e)血液透析(hemodialysis)或(f)其中血液被暴露到促进血栓形成的人工表面的其它过程(other procedures in which blood isexposed to an artificial surface that promotes thrombosis)；由动脉粥样硬化(atherosclerosis)、外科手术或外科手术并发症(surgery or surgicalcomplications)、延时的固定(prolonged immobilization)、心房纤颤(arterialfibrillation)、先天性血栓形成倾向(thrombophilia)、癌症(cancer)、糖尿病(diabetes)、药物或激素的影响(effects of medications or hormones)，和妊娠并发症(complications of pregnancy)的血栓形成()；包含室上性心律不齐(supraventricular arrhythmias)、房性心律不齐(artrial arrbythmias)、心房扑动(atrial flutter)、心房纤颤(atrial fibrillation)的心律失常，列在《Heart Disease》：一本心血管医学的教材，2 Volume Set，6th Edition，2001，Eugene Braunwald，Douglas P.Zipes，Peter Libby，Douglas D.Zipes中的其它疾病。

优选的心血管疾病是：动脉粥样硬化、冠心病(CHD)、再狭窄病变、外周动脉疾病、冠状动脉旁路移植术、颈动脉疾病、动脉炎症、心肌炎、心血管炎症、脉管感染、不稳定性心绞痛(UA)、顽固性不稳定性心绞痛、稳定性心绞痛(SA)、慢性稳定性心绞痛、急性冠状动脉综合征(ACS)、心肌梗塞、急性心肌梗塞(AMI)，包括首发或复发性心肌梗塞、非Q波心肌梗塞、非ST段抬高性心肌梗塞和ST段抬高性心肌梗塞。

更优选的心血管疾病是：动脉粥样硬化、冠心病(CHD)、不稳定性心绞痛(UA)、顽固性不稳定性心绞痛、稳定性心绞痛(SA)、慢性稳定性心绞痛、急性冠状动脉综合征(ACS)、心肌梗塞、急性心肌梗塞(AMI)，包括首发或复发性心肌梗塞、非Q波心肌梗塞、非ST段抬高性心肌梗塞和ST段抬高性心肌梗塞。

在此使用的“基因治疗”是通过基因操作治疗疾病的过程。基因治疗包含将核酸分子导入细胞中，该细胞可表达由这个核酸分子编码的基因产物。例如，如本领域技术人员熟知的，将核酸分子导入细胞可以通过在体内或体外，通过多种方法把包含感兴趣核酸分子的表达载体导入细胞中来进行，这些方法包括磷酸钙沉淀、二乙基氨基乙基葡聚糖、聚乙二醇(PEG)、电穿孔、直接注入、脂质转染或病毒感染(Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Labora到ry Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)；Kriegler M.Gene Transfer ad Expression：A Labora到ry Manual(W.H.Freeman和Co，New York，N.Y.，1993)和Wu，Methods in Enzymology(Academic Press，NewYork，1993)，每一个文献在此引入作为参考)。此外，感兴趣的核酸序列也可以通过多种载体和方法在体内导入细胞，包括例如直接把核酸给予受试者(Williams et al，1991 PNAS 88：2726-2730)或在病毒载体中插入该核酸分子，产生重组病毒或病毒颗粒，并用该重组病毒感染受试者(Battleman et al，1993 J Neurosci 13：94-951；Carroll et al，1993 J Cell Biochem 17E：241；Lebkowski et al，美国专利5,354,678；Davison和Elliott，Molecular Virology：A Practical Approach(IRL Press，New York，1993))。其它体内转移方法包括使用脂质体包裹核酸，将脂质体或结合血凝型仙台病毒的脂质体直接导入受试者(美国专利5,824,655，在此引入作为参考)。被转染或感染的细胞表达由所述核酸编码的蛋白产物，以便改善疾病或缓解其症状。

在此使用的“缓解”指一种或多种疾病症状减轻或严重度降低，诸如一种或多种心血管疾病症状，包括，但不限于：心律不齐；胸痛；心肌缺血；心绞痛；运动耐量下降；疲劳；劳力性呼吸困难；夜间阵发性呼吸困难；间歇性跛行；短暂性缺血发作和生活质量。

为了使在此描述的本发明能够被更充分地理解，列出以上说明。

本发明的组合物和方法

本发明提供了通过给予受试者有效量的阻断B7与CTLA4和/或CD28相互作用的分子来治疗心血管疾病的组合物和方法。例如，这些配体包括：可溶性CTLA4分子(如CTLA4Ig，CTLA4-E7，CTLA4-p97，CTLA4-envgp120，和突变CTLA4分子如，CTLA4/CD28Ig，L104EA29YIg，L104EA29LIg，L104EA29TIg和/或L104EA29WIg)，可溶性CD28分子，可溶性B7-1分子，可溶性B7-2分子，和识别并结合B7，CD28和/或CTLA4的单克隆抗体(例如，抗CTLA4单克隆抗体，抗CD28单克隆抗体，抗B7-1单克隆抗体或抗B7-2单克隆抗体)。

阻断B7与CTLA4和/或CD28相互作用的分子有效量可以定义为当与B7阳性细胞上的B7分子结合时，抑制B7分子与内源性配体(如CTLA4和/或CD28)结合的抗B7单克隆抗体、可溶性CTLA4和/或CD28分子的量。抑制或阻断可以是部分或全部的。

另外，阻断B7与CTLA4和/或CD28相互作用的分子有效量可以定义为当与T细胞上的CTLA4和/或CD28分子结合时，抑制B7分子与内源性配体(如CTLA4和CD28)结合的抗CTLA4单克隆抗体，抗CD28单克隆抗体或可溶性B7(B7-1或B7-2)分子的量。抑制或阻断可以是部分或全部的。

阻断B7与CTLA4和/或CD28相互作用的分子有效量是大约0.1到100mg/kg受试者体重。在另外的实施方案中，有效量是大约0.5到100mg/kg受试者体重，0.5到5mg/kg受试者体重，0.1到5mg/kg受试者体重，大约5到10mg/kg受试者体重，大约10到15mg/kg受试者体重，大约15到20mg/kg受试者体重，大约20到25mg/kg受试者体重，大约25到30mg/kg受试者体重，大约30到35mg/kg受试者体重，大约35到40mg/kg受试者体重，大约40到45mg/kg of a subject，大约45到50mg/kg受试者体重，大约50到55mg/kg受试者体重，大约55到60mg/kg受试者体重，大约60到65mg/kg受试者体重，大约65到70mg/kg受试者体重，大约70到75mg/kg受试者体重，大约75到80mg/kg受试者体重，大约80到85mg/kg受试者体重，大约85到90mg/kg受试者体重，大约90到95mg/kg受试者体重，或大约95到100mg/kg受试者体重。

在一种实施方案中，阻断B7与CTLA4和/或CD28相互作用的分子有效量是大约2mg/kg到大约10mg/kg受试者体重。优选的有效量是10mg/kg受试者体重。在另一种实施方案中，有效量是大约0.1到4mg/kg受试者体重。在另一种实施方案中，有效量是大约0.1到0.5mg/kg受试者体重，大约0.5到1.0mg/kg受试者体重，大约1.0到1.5mg/kg受试者体重，大约1.5到2.0mg/kg受试者体重，大约2.0到2.5mg/kg受试者体重，大约2.5到3.0mg/kg受试者体重，大约3.0到3.5mg/kg受试者体重，大约3.5到4.0mg/kg受试者体重，大约4.0到4.5mg/kg受试者体重，大约4.5到5.0mg/kg受试者体重，大约5.0到5.5mg/kg受试者体重，大约5.5到6.0mg/kg受试者体重，大约6.0到6.5mg/kg受试者体重，大约6.5到7.0mg/kg受试者体重，大约7.0到7.5mg/kg受试者体重，大约7.5到8.0mg/kg受试者体重，大约8.0到8.5mg/kg受试者体重，大约8.5到9.0mg/kg受试者体重，大约9.0到9.5mg/kg受试者体重，大约9.5到10.0mg/kg受试者体重。

在另一种实施方案中，有效量是大约0.1到20mg/kg受试者体重.在另一种实施方案中，有效量是大约0.1到2mg/kg受试者体重，大约2到4mg/kg受试者体重，大约4到6mg/kg受试者体重，大约6到8mg/kg受试者体重，大约8到10mg/kg受试者体重，大约10到12mg/kg受试者体重，大约12到14mg/kg受试者体重，大约14到16mg/kg受试者体重，大约16到18mg/kg受试者体重或大约18到20mg/kg受试者体重。

在另一种实施方案中，有效量是大约2mg/kg受试者体重.在又一种实施方案中，有效量是大约10mg/kg受试者体重.

在特定的实施方案中，阻断B7与CTLA4和/或CD28相互作用的分子是可溶性CTLA4分子。有效量的可溶性CTLA4分子是大约2mg/kg受试者体重。在另一种特定实施方案中，有效量的可溶性CTLA4分子是大约10mg/kg受试者体重。在又一种特定实施方案中，有效量的可溶性CTLA4是：对于体重低于60kg的受试者，500mg；体重介于60-100kg的受试者，750mg；体重超过100kg的受试者，1000mg。

阻断B7与CTLA4和/或CD28相互作用的分子是可溶性CTLA4分子，有效量的可溶性CTLA4分子可以按照每日、每周、每月和/或每年对受试者给药，根据需要每小时/日/周/月/年给予一次或多次。例如，在一种实施方案中，起初的一个月里，按每两周一次给药，以后每月一次。

在优选实施方案中，心血管疾病是：动脉粥样硬化，冠心病(CHD)、不稳定性心绞痛(UA)、顽固性不稳定性心绞痛、稳定性心绞痛(SA)、慢性稳定性心绞痛、急性冠状动脉综合征(ACS)、首发或复发性心肌梗塞、急性心肌梗塞(AMI)、心肌梗塞、非Q波心肌梗塞或非ST段抬高性心肌梗塞。

在此(实施例3-7)提出临床数据，这些临床数据支持阻断CD28-B7相互作用的分子在预防和治疗心血管疾病中的使用。在对RA的临床研究中，CTLA4Ig降低CRP，IL-6，和TNF-α，以及所有与心血管疾病相联系的炎症指标。这些发现说明性的作用机理-阻断CD28-B7通路--对于治疗心血管疾病是有作用的。更进一步的研究在实施例8和9种讨论。我们提出通过给予受试者有效剂量的可阻断B7与CTLA4和/或CD28相互作用的分子治疗心血管疾病作为我们的发明方法。

虽然在此讨论的支持这一治疗心血管疾病新方法的数据来自于已发表的医学文献，但无损我们的发明。免疫学/炎症在心血管疾病中扮演重要角色这一概念是相对较新的，并且不完整的观念转变。涵盖心脏病学、免疫学和传染病学研究的广度是实质性的，因此在一个领域的发现不能将这些学科的分隔整体起来。相反地，一旦有了新的发现，这一发现对于治疗和完整作用机制的推论，对于调研者/科学家并不是立即清晰的。而且，一项研究已报告，美国病人的是主要T细胞群是CD4⁺CD28^空细胞(Circulation2000；102：2883-2888)。这一发现说明对CD28-B7介体信号的干扰在美国病人中有效。

抑制CD28-B7相互作用，例如通过CTLA4Ig或L104EA29YIg，减少心血管疾病发病率和死亡率，或改善心血管功能和生活质量是全新的。这些药剂跨心血管疾病谱的使用由以下项目支持：(1)类风湿性关节炎和动脉粥样硬化/不稳定性心绞痛病人之间细胞和生物化学的相似性；(2)CTLA4Ig和L104EA29YIg的作用机理看似适于心血管疾病的干预；(3)在本发明的动物模型和临床中表现出的CTLA4Ig和/或L104EA29YIg的抗炎症效果；(4)近期报告的关于CD28-B7相互作用对于动脉粥样硬化重要性的发现。大量的数据存在于完全不同的临床使用前的研究中(细胞和动物模式)，同样也存在于在此提出的临床研究中，并总结于下。

(1)类风湿性关节炎和动脉粥样硬化/不稳定性心绞痛病人之间细胞和生物化学的相似性

在这两种病理过程中存在生物化学和细胞的相似性(表1)。而且，近期发现RA病人的夭折(premature death)已与急性冠状动脉整体征相关联(Refs：J Rheumatology 1999；26：2562-2571；Rheumatology 1999；38：668-674)。

表1

风湿性关节炎和动脉硬化症/不稳定性心绞痛之间细胞和生物化学的相似性

	动脉粥样硬化/不稳定性心绞痛	类风湿性关节炎
			生物化学相似性
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)	↑	↑
			金属蛋白酶表达	↑	↑
白介素-6(IL-6)	↑	↑
			C反应蛋白(CRP)	↑	↑↑
粘附分子(VCAM-1，ICAM-1，E-选择蛋白，P-选择蛋白)	↑	↑
			内皮素	↑	↑
细胞的相似性
			肥大细胞活化	↑	↑
T细胞活化	↑	↑
			B细胞活化	0或↑	0或↑
可能的抗原
			热休克蛋白(HSPs)	报道的	报道的
感染性物质	报道的	报道的
			氧化的-LDL	报道的
胶原II		报道的
			软骨抗原		报道的

备注：改编自Paceri和Teh，(Ref：Circulation 1999；100：2124-2126)。符号0表示对照人群的参数无可明显的增加或减少。↑表示对照人群的参数的增加。报道的表示在医学文献中可得到支持证据。

这些相似性表示在每一种这些疾病中，存在共同的病理生理过程。

(2)CTLA4Ig和L104EA29YIg的作用机理看似适于心血管疾病的干预

T细胞出现在早期动脉粥样化和脆弱/破裂的斑块中

有不少证据支持从动脉粥样硬化到急性斑块破裂的心血管疾病谱中，T细胞活化十分重要这一理论。T细胞是出现在人类动脉粥样硬化病变中最常见的细胞之一(Ref：New Engl J Med 1999；340：115-126)，既出现在早期病变中，也出现在脆弱或破裂的斑块中。脆弱或破裂的粥样硬化斑的病理研究表明T细胞(主要CD4⁺)存在和位于动脉粥样化病变的凸缘区(shoulderregion)——组织侵蚀最可能的位置(Refs：Am.J.Cardiol.1991；68：36B-50B.Circulation 1994；89：36-44)。

由T细胞形成的细胞因子被平衡以促进炎症和斑块破裂

已知T细胞分泌炎症细胞因子包括干扰素γ(IFN-γ)、TNFα、以及白介素2(IL-2)(Refs：Atherosclerosis 1986；6：131-138.J Clin Invest 1985；76：125-131)。T细胞在动脉粥样硬化斑中的作用被认为是2倍。首先，T细胞可调节巨噬细胞的作用，巨噬细胞被认为可释放消化酶，破坏所覆盖的基质和平滑肌层，并且促进斑块破裂。其次，通过对脉管平滑肌细胞分泌IFN-γ，T细胞直接导致粥样斑纤维帽中胶原合成的减少。总之，T细胞活动被认为能体现促进动脉粥样化斑块不稳定和破裂的协同过程。

在粥样斑中，T细胞被原位激活到与临床症状平行的程度

T细胞不仅体现在粥样斑中，而且也有证据表明他们在这些病变中的原位激活。在一项有关T细胞块在冠状动脉粥样斑中活化的研究中，van derWal et.al.从动脉粥样化斑切除术的样品中发现，当T细胞被活化并以IL-2受体(IL-2r)表达和IL-2分泌作为证据(Ref：Heart 1998；80：14-18)。在这一研究中，T细胞中IL-2r表达的增加与接受动脉粥样化斑块切除术的病人临床症状的严重程度成比例。图87表明在动脉粥样化斑块切除术样品中活化的T细胞的比例。

HSP60和其他抗原能直接促进心血管炎症

研究表明在感染因子和心血管疾病的确立之间可能有联系。已表明许多传染病包括肺炎衣原体(chlamydia pneumoniae)(CP)、幽门螺旋杆菌、巨细胞病毒(CMV)、腺病毒、克沙奇病毒(coxsackievirus)、几种疱疹病毒(Herpesviridae)和多种牙齿感染与CHD相关联。证实这些因子与冠状动脉硬化之间的因果关系的证据差异很大。发现衣原体肺炎(一种人类呼吸病原体)经常与CHD相关。

CRP持续性提升、衣原体肺炎抗体或人类HSP60(hu-HSP60)的存在已经通过Helsinki Heart Study的嵌套式(nested)病例对照研究进行研究(Ref：Circulation 2003；107：2566-2570)。这一研究，是有希望的双盲安慰剂对照初步预防试验，它随机排列4081名受试者并在8年半的随访时间里观察到241件冠心病事件(冠心病死亡或非致命性MI)。研究了持续性血清阳性(由在基线和标志性(index)冠心病事件之前3-6个月，CRP、Cp血清抗体或hu-HSP60血清抗体升高所确定的那样)对预测日后的冠心病事件的重要性进行了研究(表2)。

表2

在Helsinki心脏研究中伴随持续风险因子的冠心病死亡或非致命性MI发生的几率(OR)

	未经调整几率(95％CI)	经调整的几率(95％CI)
			CRP-
Cp-	1	1
			Cp+	1.55(0.852.80)	1.62(0.873.00)
CRP+
			Cp-	2.36(1.164.79)	1.96(0.924.18)
Cp+	5.38(2.3212.46)	4.47(1.8410.83)

	未经调整几率(95％CI)	经调整的几率(95％CI)
			CRP-
hu-HSP60-	1	1
			hu-HSP60+	0.92(0.461.85)	0.87(0.421.80)
CRP+
			hu-HSP60-	2.07(1.044.14)	1.78(0.853.74)
hu-HSP60+	6.06(2.2316.47)	4.36(1.5312.39)

这些数据表明，在不患有已知的冠心病的中年男性群体中，Cp或hu-HSP60持续提升的血清阳性在伴随升高的CRP时，预示了日后的冠心病事件(表2)。需注意的是，持续CRP+，Cp+，和hu-HSP60+的病人，对于冠心病日后事件的发生，具有调整的16.87(2.06-137.9)的几率。在所有的3项指标中，只有1/138的对照病人符合3种标志物均持续性升高的条件，而标志性病例中有17个被确定。这些发现表明存在新的抗血管生成危险因子用于预期性鉴定有发生心血管事件危险的个体。

一项近期的独立研究报告了衣原体热休克蛋白60(Cp-HSP60)与ACS有很强的联系(Ref：Biasucci，et.al.Circulation 2003；107：3015-3017)。与HelsinkiHeart Study中的无症状病人不同，这项研究调查处于CHD谱另一端的病人。在这项研究中，获准进入冠心病重症监护室(Coronary Care Unit)(CCU)的、患有UA(Braunwald Class IIIb)或AMI的219名病人与健康病人或患有稳定性心绞痛(SA)的病人进行比较。病人对Cp-HSP60(anti-Cp-HSP60)抗体应答的存在在100名对照受试者，40名患有SA的受试者，179名患有UA的受试者，以及40名患有AMI的受试者中进行测定(表3)。

表3

如Biasucci等报告的研究人群的血清学特性

	对照受试者(N＝100)	稳定性心绞痛病人(N＝40)	非稳定性心绞痛病人(N＝179)	AMI病人(N＝40)
					Cp血清阳性	30％	60％	68％	65％
HSP60血清阳性	0％	20％	98％	99％
					CRP＞3mg/dL	8％	25％	59％	62％
中值CRP，mg/dL	1.4	2.1	5.05	6.02

备注：在本研究中用于确定HSP60血清阳性的抗体没有区分Cp-HSP60和hu-HSP60。由于缺乏特异性，这些数据不能支持抗HSP60应答与感染之间的直接联系。

以上发现支持特异性抗原应答存在于UA和AMI病人中这一理论。这两项研究表现了在心血管疾病谱病人群体的极端。Helsinki Heart Study表明，根据CRP提升和对Cp或hu-HSP60的持续性抗体应答，无冠心病(或其他重大疾病)病史的病人可被确定为具有增强的冠心病死亡或非致命性MI的风险。但是，这些风险因子在健康初级预防人群中的流行率很低。Biasucci等进行的研究中的病人表明HSP60血清阳性在UA或AMI病人中几乎是普遍的。此外，在稳定性心绞痛病人中存在的20％HSP60血清阳性表明在HSP-60抗体的存在与心血管事件之间存在分级的联系。

对HSP60的抗原应答是通过CD28-B7的相互作用介导的

在动物模式中，在给予小鼠或hu-HSP60时，巨噬细胞(人类动脉粥样化中的常见细胞类型)已被确认为T细胞中IFN-γ的主要诱导物(Ref：Int.Immunol.2002；14：1247-1253)。这个过程看似通过包括CD28-B7通路的T细胞活化的经典的“双信号”模型发生。在该模型中，通过鼠或hu-HSP60的T细胞活化被CTLA4Ig给药阻断(Ref：Int.Immunol.2002；14：1247-1253)。在人、鼠、衣原体和细菌热休克蛋白之间有很高的序列同源性，这个发现在物种之间是保守的。实际上，正是传染因子的HSP和hu-HSP之间的这种高度同源性通过分子模拟促进自身免疫。

通过CD28-B7的HSP60信号为干预人类疾病提供机会

在围绕HSP6的临床前模型和前面提及的临床试验(Helsinki HeartStudy；Biasucci，et.al.)之间显示出有许多相似性。首先，在小鼠模型中，最强的自免疫反应(例如，对自身HSP60产生T细胞增殖和抗体)仅仅在同时给予小鼠自身的HSP60和Cp-HSP60时产生(Ref：Infection and Immunity1997；65：1669-1674)。在无关的动物模型中的这个临床前发现，与在Helsinki心脏研究中的最高风险组所观察到的结果非常相似。注意到有报道称Cp-HSP60和hu-HSP60都共同定位于人粥样斑块中(Refs：Circulation1998；98：300-307.J Infect Dis 1997：176：292-295)。在这些斑块中，HSP60s可以接着调节TNF-α、基质金属蛋白酶的表达和活化内皮细胞及平滑肌细胞(Ref：Circulation 2003；107：3015-3017)。此外，在该动物模型中联合给予小鼠HSP60和Cp-HSP60导致淋巴细胞IL-10的生成降低6倍，以及IFN-γ/IL-10生成的比例增加12倍。由于低血清IL-10浓度已经与AMI后死亡的浓度依赖性危险相关(Ref：Heeschen，et.al.Circulation 2003；107：2109-2114)，IL-10水平降低的巧合可能被翻译成有临床意义的观察。由于这些动物研究和临床研究的数据平行，通过使用CTLA4Ig或者L104EA29YIg抑制CD28-B7信号，可能代表一种特定机理的合理干预，来阻止和/或治疗心血管疾病。

使用CTLA4Ig或者L104EA29YIg来阻止和/或治疗心血管疾病可能不限制于HSP60

对CTLA4Ig或者L104EA29YIg阻止和/或治疗心血管疾病的机制性机理而言，HSP60是一个假设性的模型。然而，HSP60不代表可以被CTLA4Ig或L104EA29YIg治疗破坏的仅有的抗原性刺激。例如，来自于妇女的健康研究的近期流行病学证据(Ref：Circulation 2001；104：2266-2268)和CAPTURE研究的观察数据(Ref：NEJM 2003；348：1104-1111)已经独立的证明：基于血清CD40L水平，存在一个分级和连续的心血管风险的升高(死亡或者非致命性心肌梗塞)。因此，CD40-CD40L作用正在被认可为心血管疾病中炎症的重要介质。有证据表明在不稳定性心绞痛病人中CD28-B7途径与CD40-CD40L途径之间的相互作用。特别地，结果显示表达CD40L的(CD40L+)T细胞出现在粥样病灶中(Ref：Proc.Natl.Acad.Sci.1997；94：1931-1936)。动脉粥样化相关细胞上CD40的体外连接，已经显示增加促炎症细胞因子、基质金属蛋白酶、粘附分子和组织因子的产生(Ref：Nature1998；394：200-203)。在其他模型系统中，抗原提呈细胞(APC)上的CD40与CD40L之间的作用，增加B7-1(CD80)和B7-2(CD86)的表达-CD28介导的T细胞活化的刺激分子(J.Immunol.2000；165：3506-3518)。另外，用抗CD3和CD28刺激性抗体离体处理来自不稳定性心绞痛病人的T细胞刺激了sCD40L的释放(Ref：Circulation 1999；100：614-620)。总之，这些观察提示CD28-B7和CD40-CD40L信号途径可共同作用来促进易于发生动脉粥状硬化斑块的进展和破裂的条件。进一步，通过使用CTLA4Ig或者L104EA29YIg干预这个过程可能获得治疗益处。最后，其他尚未发现的CD28-B7-介导的过程(也许通过新的缺血相关的抗原，见下文)在心血管疾病中可能有重要的作用，在这些过程中使用CTLA4Ig或L104EA29YIg在临床上可能有用。

(3)在动物模型和临床研究中CTLA4Ig和/或L104EA29YIg的抗炎症效果

肾缺血的动物模型中抑制CD28-B7信号提示新的自身抗原在缺血中是重要的

大鼠模型中已经评估了CTLA4Ig对于抑制缺血/再灌注损伤的效果(Ref：J Clin Invest 1997；100：1199-1203)。在这个模型中，大鼠的一侧肾被切除，并使另一侧肾缺血45分钟。共同给予CTLA4Ig，但是不控制免疫球蛋白，很大程度上阻断了CD4+T细胞、巨噬细胞、和组织相容性(MHC)II细胞渗透到缺血的肾。与这个发现相巧合的是炎性“Th1”细胞因子(IL-2，IFN-γ，IL2r)、巨噬细胞相关细胞因子(TNF-α.、IL-6和可诱导性一氧化氮合成酶)以及化学引诱剂(chemoattractant)/生长因子(MCP-1，RANTES，TGFβ)的减少。除了这些发现，CTLA4Ig几乎完全消除了早期(例如血浆肌酸酐的升高)或晚期(例如尿蛋白测定)的肾功能障碍。这个发现特别惊人的地方是在缺乏同种异体抗原的模型中，CTLA4Ig抑制这个过程的能力。另一个解释，在肾缺血的非移植模型中，CD28-B7作用的抑制是由CTLA4Ig的给药提供的，提示在缺血损伤中，通过CD28-B7作用途径而发生作用的新的自身抗原是重要的。这个动物模型中的效力支持在可能有一些平行的生理特征的冠状动脉缺血模型中使用CTLA4Ig的作用。

CTLA4Ig和L104EA29YIg的抗炎症特征与它们在预防和/或治疗CV疾病中的用途相一致

相对应炎症标记的有利变化，这里采用的CTLA4Ig和L104EA29Ig在RA病人的临床开发数据(实施例3-7)是令人鼓舞的。值得注意的是RA病人与动脉粥状硬化或UA病人有大量的生化、细胞和抗原相似性(见上文，表1)。在RA的临床II期研究程序中，UA病人共有的数个炎症因子标志物(CRP，IL-6，TNF-α)被测定。180天时在RA病人中，与安慰剂组相比，给予2mg/kg或10mg/kg CTLA4Ig导致CRP，IL-6，TNF-α产生了剂量依赖的降低，见图52、55和56。这个效果是长期性的，显示在CTLA4Ig的整个360天的治疗期中持续。见图85，86A和86B。

实施例8和9中讨论了进一步的研究。

(4)B7-CD28在动脉粥状硬化中的重要性的新报道的发现

自从本发明的优先权专利申请递交，已经有两个科学文献报道强烈支持CD28-B7在动脉粥状病变的发生、进展和不稳定性中的作用。首先，Buono等(Circulation 2004；109：2009-2015)定性了在低密度脂蛋白受体(LDLR)缺陷(Ldlr^-/-)小鼠模型中动脉粥样硬化病变的发生和发展以及斑抗原特异性T细胞反应。当喂食富胆固醇食物时，Ldlr^-/-小鼠加速出现动脉粥样硬化。在这个研究中，Ldlr^-/-小鼠与B7-1^-/-B7-2^-/-小鼠杂交，杂交后代产生复合突变B7-1^-/-B7-2^-/-Ldlr^-/-系，其完全缺乏CD80和CD86。这个独特模型允许在易患动脉粥样硬化的动物模型中研究B7-CD28的作用。就象预期的一样，当这些动物被喂食富胆固醇食物时，相比喂食对照食物的Ldlr^-/-小鼠，Ldlr^-/-和B7-1^-/-B7-2^-/-Ldlr^-/-小鼠都有显著的胆固醇水平提高。然而重要的是，喂食富胆固醇食物的Ldlr^-/-小鼠与喂食富胆固醇食物的B7-1^-/-B7-2^-/-Ldlr^-/-小鼠相比，没有观察到胆固醇水平的差异。用计算机成像分析，量化三个组中每一组小鼠的主动脉弓和降主动脉的动脉粥样硬化病变。第8周时，接受对照食物的Ldlr^-/-小鼠中动脉粥样硬化最少，在接受富胆固醇食物的Ldlr^-/-小鼠的主动脉弓和降主动脉中动脉粥样硬化病变的却明显增加。相比而言，与接受富胆固醇食物的Ldlr^-/-小鼠相比，接受富胆固醇食物的B7-1^-/-B7-2^-/-Ldlr^-/-小鼠的动脉粥样硬化病变明显减少。20周后，所有三个处理组的动脉粥样硬化斑进展，观察到的Ldlr^-/-和B7-1^-/-B7-2^-/-Ldlr^-/-之间的差异的程度在一定程度上减小。然而，在Ldlr^-/-小鼠和B7-1^-/-B7-2^-/-Ldlr^-/-小鼠之间主动脉弓中的动脉粥样硬化的统计学显著的减少在20周中持续。

除了这些形态学观察，也有显示来自Ldlr^-/-和B7-1^-/-B7-2^-/-Ldlr^-/-小鼠的T细胞之间也存在功能性的差异。特别地，来自Ldlr^-/-小鼠和B7-1^-/-B7-2^-/-Ldlr^-/-小鼠的CD4+T细胞的体外测定证明：当用mHSP60刺激时。仅仅喂食接受富胆固醇食物的Ldlr^-/-小鼠产生大量(约高5倍的量)的IFN-γ。

在第二个公开文献中，Afek等.(Experimental and Molecular Pathology2004；76：219-223)用免疫组化方法定性载脂蛋白E敲除(ApoE^-/-)小鼠的粥样化病变中CD80和CD86的表达。根据他们的成熟年龄，ApoE^-/-小鼠出现了动脉粥样硬化。这些研究者评价了各个成熟阶段动脉粥样化病变中CD80和CD86的存在。在该模型中，CD80和CD86阳性免疫染色存在于早期和更晚期的粥样化病变中。此外，CD80与CD86染色与氧化的LDL共同定位，氧化的LDL是T细胞活化的推定的自身抗原。

总之，这些两篇文献报道支持和延伸了以前在优先权申请中出现的内容。第一，发现CD80和CD86和早期及晚期粥样化病变中共同定位支持了T细胞出现在粥样化病变且在原位活化的观点。第二，从B7-1^-/-B7-2^-/-Ldlr^-/-小鼠获得的数据明显并极好地证实，在被广泛接受的动脉粥样硬化模型中，中断B7-CD28信号影响动脉粥样硬化疾病的出现和进展。最后，mHSP60体外刺激CD4+T细胞产生大量IFN-γ的观察支持以前的假设：HSP60作为一个新的抗原通过B7-CD28依赖性过程，促进了心血管炎症和斑块不稳定性(即，通过IFN-γ对基质金属蛋白酶和胶原合成的作用)。

组合物

本发明提供了治疗心血管疾病的组合物，其中包含阻断B7与CTLA4和/或CD28相互作用的分子，诸如可溶性CTLA4分子。可溶性CTLA4的例子包括CTLA4Ig(图24)和可溶性CTLA4突变分子诸如L104EA29YIg(图19)，L104EA29LIg(图20)，L104EA29Tig(图21)，和L104EA29WIg(图22)。

可以通过去除CTLA4跨膜片段使具有突变或野生序列的CTLA4分子可溶(Oaks，M.K.，et al.，2000 Cellular Immunology 201：144-153)。

另外，具有突变或野生序列的可溶性CTLA4分子可以是融合蛋白，其中CTLA4分子与非CTLA4部分，如促使CTLA4分子可溶的免疫球蛋白(Ig)分子融合。例如CTLA4融合蛋白可以包括CTLA4Ig的细胞外结构域，这个CTLA4Ig细胞外结构域与免疫球蛋白恒定区融合，产生CTLA4Ig分子(图24)(Linsley，P.S.，et al.，1994 Immunity 1：793-80)。融合于CTLA4的免疫球蛋白结构域的例子包括，但不限于IgCγ1(IgCgamma1)，IgCγ2(IgCgamma2)，IgCγ3(IgCgamma3)，IgCγ4(IgCgamma4)，IgCμ(IgCmu)，IgCα1(IgCalpha1)，IgCα2(IgCalpha2)，IgCδ(IgCdelta)或IgCε(IgCepsilon)。

对于临床方案，免疫球蛋白部分优选不在受试者中引发有害免疫应答。优选的部分是免疫球蛋白恒定区，包括人或猴免疫球蛋白恒定区。适当的免疫球蛋白区的一个例子是人Cγ1，包括铰链区，CH2和CH3区，其可以介导效应子功能如与Fc受体结合、介导补体依赖型细胞毒性(CDC)或介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。免疫球蛋白部分可以具有一个或多个突变(如在CH2结构域中，以减弱效应子功能，如CDC或ADCC)，其中该突变通过增加或减弱免疫球蛋白与Fc受体的结合能力而调节免疫球蛋白与其配体的结合能力。例如，免疫球蛋白的突变可能包括铰链区中的任意或所有半胱氨酸残基的改变。例如+130，+136，和+139位的半胱氨酸残基被丝氨酸取代(图24)。免疫球蛋白中+148位的脯氨酸可以被丝氨酸取代，如图24所示。此外，免疫球蛋白部分的突变可以包括+144位的亮氨酸被苯丙氨酸取代，+145位的亮氨酸被谷氨酸取代，或+147位的甘氨酸被丙氨酸取代。

用于可溶性CTLA4分子或可溶性CTLA4突变分子的其他非CTLA4部分包括，但不限于，p97分子，env gp120分子，E7分子，和ova分子(Dash，B.et al.1994 J.Gen.Virol.75(Pt 6)：1389-97；Ikeda，T.，et al.1994 Gene138(1-2)：193-6；Falk，K.，et al.1993 Cell.Immunol.150(2)：447-52；Fujisaka，K.et al.1994 Virology 204(2)：789-93).其他分子也是可能的(Gerard，C.etal.1994 Neuroscience 62(3)：721；Byrn，R.et al.1989 63(10)：4370；Smith，D.et al.1987 Science 238：1704；Lasky，L.1996 Science 233：209)。

本发明的可溶性CTLA4分子可以包括与分子的CTLA4部分的细胞外结构域的N末端连接的信号肽序列。信号肽可以是任何允许该分子分泌的序列，包括制瘤素(oncostatin)M的信号肽M(Malik，et al.，(1989)Molec.Cell.Biol.9：2847-2853)，或CD5(Jones，N.H.et al.，(1986)Nature 323：346-349)，或任何细胞外蛋白的信号肽。本发明的CTLA4分子可以包括在CTLA4细胞外结构域的N末端连接的制瘤素M的信号肽，以及连接于CTLA4细胞外结构域(野生型或突变的)的C末端的人免疫球蛋白分子(如铰链区、CH2和CH3)。该分子包括制瘤素M信号肽，该肽包括具有-26位的甲硫氨酸至-1位的丙氨酸的氨基酸序列，包括具有+1位的甲硫氨酸至+124位的天冬氨酸的氨基酸序列的CTLA4部分，+125位的连接氨基酸残基谷氨酰胺，以及包含具有+126位的谷氨酸至+357位的亮氨酸的氨基酸序列的免疫球蛋白部分。

具体地，包含下面描述的突变CTLA4序列的本发明的可溶性CTLA4突变分子可以是融合分子，它包含与突变的CTLA4片段融合的人Ig，例如IgC(gamma)1(即IgCγ1)部分。

在一种实施方案中，可溶性CTLA4突变分子包含IgCγ1(IgCgamma1)，它与在细胞外结构域含有单位点突变的CTLA4的细胞外结构域融合。CTLA4的细胞外结构域包含+1位的甲硫氨酸至+124位的天冬氨酸(如图23)。CTLA4的细胞外结构域可以包含-1位的丙氨酸至+124位的天冬氨酸(如图23)。单位点突变的例子如下，其中+104位的亮氨酸改变为其他氨基酸：

单位点突变体	密码子改变
		L104EIg	谷氨酸GAG
L104SIg	丝氨酸AGT
		L104TIg	苏氨酸ACG
L104AIg	丙氨酸GCG
		L104WIg	色氨酸TGG
L104QIg	谷氨酰胺CAG
		L104KIg	赖氨酸AAG

单位点突变体	密码子改变
		L104RIg	精氨酸CGG
L104GIg	甘氨酸GGG

进一步，本发明提供了与Ig Cγ1(IgCgamma1)部分融合的突变分子，该分子具有CTLA4的细胞外结构域，其中具有两个突变。其例子包括如下，+104的亮氨酸改变为另一种氨基酸(如谷氨酸)，并且+105位的甘氨酸、+25位的丝氨酸、+30位的丙氨酸或+29位的丙氨酸改变为另一种氨基酸：

双位点突变体	密码子改变
		L104EG105FIg	苯丙氨酸TTC
L104EG105WIg	色氨酸TGG
		L104EG105LIg	亮氨酸CTT
L104ES25RIg	精氨酸CGG
		L104ET30GIg	甘氨酸GGG
L104ET30NIg	天冬酰胺AAT
		L104EA29YIg	酪氨酸TAT
L104EA29LIg	亮氨酸TTG
		L104EA29TIg	苏氨酸ACT
L104EA29WIg	色氨酸TGG

更进一步，本发明提供了与Ig Cγ1(IgCgamma1)部分融合的突变分子，该分子具有CTLA4的细胞外结构域，其中具有三个突变。其例子包括如下，+104位的亮氨酸改变为另一种氨基酸(如谷氨酸)，+29位的丙氨酸改变为另一种氨基酸(如酪氨酸)，并且+25位的丝氨酸改变为另一种氨基酸：

三位点突变体	密码子改变
		L104EA29YS25KIg	赖氨酸AAA
L104EA29YS25KIg	赖氨酸AAG

三位点突变体	密码子改变
		L104EA29YS25NIg	天冬酰胺AAC
L104EA29YS25RIg	精氨酸CGG

可溶性CTLA4突变分子可以具有位于该分子的CTLA4部分和Ig部分之间的连接氨基酸。连接氨基酸可以是任意氨基酸，包括谷氨酰胺。连接氨基酸可以由本领域公知的分子或化学合成引入。

本发明的可溶性CTLA4蛋白，及其片段，能由化学合成产生。多肽固相化学合成的原理是本领域公知的并且可以在涉及该领域的一般文字中发现(Dugas，H.和Penney，C.1981 Bioorganic Chemistry，pp 54-92，Springer-Verlag，New York)。可溶性CTLA4蛋白可由固相法合成，该方法使用Applied Biosystems的430A肽合成仪(Applied Biosystems，Foster City，Calif.)，以及由Applied Biosystems供给的合成循环。受保护的氨基酸，如叔丁氧羰基保护的氨基酸和其他试剂，可在商业上从很多化学供应机构得到。

本发明提供CTLA4突变分子，该分子包含与突变分子的CTLA4部分的细胞外结构域的N末端连接的信号肽序列。信号肽可以是任何允许该突变分子分泌的序列，包括制瘤素M的信号肽(Malik，et al.，1989 Molec.Cell.Biol.9：2847-2853)，或CD5(Jones，N.H.et al.，1986 Nature 323：346-349)，或任何细胞外蛋白的信号肽。

本发明提供可溶性CTLA4突变分子，该分子包含在CTLA4的细胞外结构域如L104EIg(如图18所包括的)或L104SIg中的单位点突变，其中L104EIg和L104SIg在它们的CTLA4序列中发生突变，从而使+104位的亮氨酸分别被谷氨酸或丝氨酸取代。该单位点突变分子进一步包含含有+1位的甲硫氨酸至+124位的天冬氨酸的CTLA4部分，+125位的连接氨基酸残基谷氨酰胺，以及包含+126位的谷氨酸至+357位的赖氨酸的免疫球蛋白部分。突变分子的免疫球蛋白部分可能也发生突变，使得+130，+136，和+139位的半胱氨酸被丝氨酸取代，+148位的脯氨酸被丝氨酸取代。另外，这些突变分子可以具有包含-1位的丙氨酸至+124位的谷氨酸的CTLA4部分。

本发明提供了在CTLA4的细胞外结构域含有双位点突变的可溶性CTLA4分子，诸如L104EA29YIg，L104EA29LIg，L104EA29TIg或L104EA29WIg，其中+104位的亮氨酸被谷氨酸取代，+29位的丙氨酸分别改变为酪氨酸、亮氨酸、苏氨酸和色氨酸取代。从+1位的甲硫氨酸开始，终止于+357位的赖氨酸的L104EA29YIg，L104EA29LIg，L104EA29TIg和L104EA29WIg序列，加上信号(前导)肽序列，分别在图19-22显示。双位点突变分子进一步包含含有+1位的甲硫氨酸至+124位的天冬氨酸的CTLA4部分，+125位的连接氨基酸残基谷氨酰胺，以及包含+126位的谷氨酸至+357位的赖氨酸的免疫球蛋白部分。突变分子的免疫球蛋白部分可能也发生突变，使得+130，+136，和+139位的半胱氨酸被丝氨酸取代，+148位的脯氨酸被丝氨酸取代。另外，这些突变分子可以具有包含-1位的丙氨酸至+124位的谷氨酸的CTLA4部分。

本发明提供了在CTLA4的细胞外结构域含有双位点突变的可溶性CTLA4分子，如L104EG105FIg，L104EG105WIg和L104EG105LIg，其中+104位的亮氨酸被谷氨酸取代，+105位的甘氨酸分别被苯丙氨酸、色氨酸和亮氨酸取代。双位点突变分子进一步包含含有+1位的甲硫氨酸至+124位的天冬氨酸的CTLA4部分，+125位的连接氨基酸残基谷氨酰胺，以及包含+126位的谷氨酸至+357位的赖氨酸的免疫球蛋白部分。突变分子的免疫球蛋白部分可能也发生突变，使得+130，+136，和+139位的半胱氨酸被丝氨酸取代，+148位的脯氨酸被丝氨酸取代。另外，这些突变分子可以具有包含-1位的丙氨酸至+124位的谷氨酸的CTLA4部分。

本发明提供了双位点突变分子L104ES25RIg，所述分子包含含有+1位的甲硫氨酸至+124位的天冬氨酸的CTLA4部分，+125位的连接氨基酸残基谷氨酰胺，以及包含+126位的谷氨酸至+357位的赖氨酸的免疫球蛋白部分。具有CTLA4的细胞外结构域的部分被突变，使得+25位的丝氨酸被精氨酸取代，位置+104的亮氨酸被谷氨酸取代。另外，L104ES25RIg可以具有包含-1位的丙氨酸至+124位的谷氨酸的CTLA4部分。

本发明提供了CTLA4的细胞外结构域含有双位点突变的可溶性CTLA4突变分子，诸如L104ET30GIg和L104ET30NIg，其中+104位的亮氨酸被谷氨酸取代，+30位的苏氨酸分别被甘氨酸和天冬酰胺取代。双位点突变分子进一步包含含有+1位的甲硫氨酸至+124位的天冬氨酸的CTLA4部分，+125位的连接氨基酸残基谷氨酰胺，以及包含+126位的谷氨酸至+357位的赖氨酸的免疫球蛋白部分。突变分子的免疫球蛋白部分可能也发生突变，使得+130，+136，和+139位的半胱氨酸被丝氨酸取代，+148位的脯氨酸被丝氨酸取代。另外，这些突变分子可以具有包含-1位的丙氨酸至+124位的谷氨酸的CTLA4部分。

本发明提供了在CTLA4的细胞外结构域中含有三位点突变的可溶性CTLA4突变分子，诸如L104EA29YS25KIg，L104EA29YS25NIg，L104EA29YS25RIg，其中+104位的亮氨酸被谷氨酸取代，+29位的丙氨酸被酪氨酸取代，+25位的丝氨酸分别被赖氨酸、天冬酰胺和精氨酸取代。三位点突变分子进一步包含含有+1位的甲硫氨酸至+124位的天冬氨酸的CTLA4部分，+125位的连接氨基酸残基谷氨酰胺，以及包含+126位的谷氨酸至+357位的赖氨酸的免疫球蛋白部分。突变分子的免疫球蛋白部分可能也发生突变，使得+130，+136，和+139位的半胱氨酸被丝氨酸取代，+148位的脯氨酸被丝氨酸取代。另外，这些突变分子可以具有包含-1位的丙氨酸至+124位的谷氨酸的CTLA4部分。

可溶性CTLA4突变分子的其他实施方案包括与B7结合的嵌合CTLA4/CD28同源染色体突变分子(Peach，R.J.，et al.，1994 J Exp Med180：2049-2058)。这些嵌合CTLA4/CD28突变分子的实例包括HS1，HS2，HS3，HS4，HS5，HS6，HS4A，HS4B，HS7，HS8，HS9，HS10，HS11，HS12，HS13和HS14(美国专利5,773,253)。

本发明的优选实施方案是CTLA4Ig等可溶性CTLA4分子(如图24所示，以+1位的甲硫氨酸开始，以+357位的赖氨酸终止)以及可溶性CTLA4突变L104EA29YIg(如图19所示，以+1位的甲硫氨酸开始，以+357位的赖氨酸终止)。

本发明进一步提供了包含编码对应于本发明的可溶性CTLA4分子的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子。在一种实施方案中，核酸分子是DNA(如cDNA)或其杂交体。例如，CTLA4Ig分子可包含GCT或GCC密码子，它编码丙氨酸，位于核苷酸+49位至+51位，如图24所示。在另一个例子中，CTLA4Ig分子可包含GGT或GGG密码子，它编码甘氨酸，位于核苷酸+436至+438位，如图24所示。在又一个例子中，一个CTLA4Ig分子可包含CGG或CGT密码子，它编码精氨酸，位于核苷酸+631至+633位，如图24所示。编码CTLA4Ig(图24)的DNA于1991年5月31日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Blvd.，Manassas，VA20110-2209，ATCC登录号为68629。编码L104EA29YIg(序列包含于图19)的DNA于2000年6月19日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，ATCC登录号为PTA-2104。作为选择，核酸分子为RNA及其杂交体。

本发明的核酸分子也包含与DNA或RNA分子不同的衍生核酸分子和反义分子。衍生分子包含肽核酸(PNAs)，以及包含硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯和甲基膦酸酯的非核酸分子，该非核酸分子与单链DNA或RNA以配对依靠方式相结合(Zamecnik，P.C.，et al.，1978 Proc.Natl.Acad.Sci.75：280284；Goodchild，P.C.，et al.，1986 Proc.Natl.Acad.Sci.83：4143-4146)。肽核酸分子包含附加了氨基酸残基如赖氨酸，和氨基基团的核酸寡聚体。这些小分子，也称为抗基因剂，通过与其核酸互补(模板)链的结合来停止转录物延伸(Nielsen，P.E.，et al.，1993 Anticancer Drug Des8：53-63)。合成DNA，RNA和其相似物的方法的评述可见：Oligonucleotides和Analogues，eds.F.Eckstein，1991，IRL Press，New York；OligonucleotideSynthesis，ed.M.J.Gait，1984，IRL Press，Oxford，Engl。此外，反义RNA技术方法描述于美国专利5,194,428和5,110,802。通过使用在此描述的可溶性CTLA4多聚核苷酸序列，本领域技术人员可以容易地获得这些种类的核酸分子，见例如Innovative和Perspectives in Solid PhaseSynthesis(1992)Egholm，et al.pp 325-328或美国专利5,539,082。

另外，本发明提供了一种载体，它包含本发明的核酸序列。术语载体包括，但不限于质粒、粘粒(cosmid)和噬粒(phagemid)。在一种实施方案中，载体可以是一个自主复制的载体，它包含一个指导适当宿主细胞中rDNA复制的复制子。此外，载体也可指导重组载体进入宿主细胞的整合。也可以使用各种病毒载体，如许多公知的逆转录病毒载体和腺病毒载体(Berkner1988 Biotechniques 6：616-629)。

载体可容许可溶性CTLA4转录物或多肽序列在原核或真核宿主细胞中的表达。载体包含表达载体，它包括表达控制元件，诸如启动子序列，其使得插入的可溶性CTLA4核酸序列得以转录并可用于调节可操作连接的可溶性CTLA4序列在适当宿主细胞中的表达(例如转录和/或转换)。表达控制元件在本领域已知并且包括，但不限于，诱导型启动子、构成型启动子、分泌信号、增强子、转录终止子和其他转录调节元件。其他参与翻译的表达控制元件在本领域已知，并且包含Shine-Dalgarno序列(如原核宿主细胞)，和起始及终止密码子。

可溶性CTLA4序列的有效翻译需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。在可溶性CTLA4起始密码子和上游序列被插入适当表达载体中的情况下，不需要额外的翻译控制信号。但是，在只有编码序列或部分编码序列插入的情况中，可提供外源性的转录控制信号包含ATG起始密码子。而且，其实密码子应在正确的阅读框架中以保证全部插入序列的翻译。外源性的转录元件和起始密码子可有多种来源，可以是天然的和合成的。表达的效率可以通过包含适于所用细胞系统的增强子得到增强(Scharf，D.，et al，1994 Results Probl.Cell.Differ.20：125-62；Bittner，et al.，1987 Methods in Enzymol.153：516-544)。

真核宿主细胞中可溶性CTLA4序列表达的优选载体包括表达控制元件，如杆状病毒多角体蛋白启动子用于在昆虫细胞中的表达。其他表达控制元件包括来自植物细胞基因组的启动子或增强子(如热休克、RUBISCO、存储蛋白基因)、病毒启动子或前导序列，或来自植物病毒，以及来自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子或增强子。

优选的载体包括至少一种选择标记基因，它编码赋予对氨苄青霉素或四环素的抗药性的基因产物。载体也包括可使外源性DNA序列方便插入的多核酸内切酶限制位点。产生编码本发明可溶性CTLA4蛋白的重组细胞表达载体的方法在本领域已知并且可见Sambrook et al.，(Molecular Cloning；ALaboratory Manual，2^nd edition，Sambrook，Fritch，和Maniatis 1989，ColdSpring Harbor Press)和Ausubel et al.(1989 Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，New York N.Y.)。

产生可溶性CTLA4转录和/或编码可溶性CTLA4多肽的优选载体是与原核宿主细胞相容的表达载体。原核细胞表达载体在本领域已知并且可从几个商业来源取得。例如pET载体(如pET-21，Novagen Corp.)，BLUESCRIPT噬粒(Stratagene，LaJolla，CA)，pSPORT(Gibco BRL，Rockville，MD)，或ptrp-lac杂交体，其可用于在细菌主细胞中表达可溶性CTLA4多肽。

此外，产生可溶性CTLA4转录物和/或编码的可溶性CTLA4多肽的优选载体是与真核宿主细胞相容的表达载体。更优选的载体是那些与脊椎动物细胞相容的载体。真核细胞表达载体在本领域已知并且可从几个商业来源取得。通常，提供这样的载体，其含有用于插入所需DNA片段的方便的限制位点。常见的这类载体是PSVL和pKSV-10(Pharmacia)，pBPV-1/pML2d(International Biotechnologies，Inc.)，pTDT1(ATCC，#31255)，以及类似的真核表达载体。

表达载体的例子包括，但不限于用于哺乳动物宿主细胞的载体(如BPV-1，pHyg，pRSV，pSV2，pTK2(Maniatis)；pIRES(Clontech)；pRc/CMV2，pRc/RSV，pSFV1(Life Technologies)；pVPakc载体，pCMV载体，pSG5载体(Stratagene))，逆转录病毒载体(如pFB载体(Stratagene))，pCDNA-3(Invitrogen)或其修饰形式，腺病毒载体；腺伴随病毒载体，杆状病毒载体，酵母载体(如pESC载体(Stratagene))。

也提供了宿主载体系统。宿主载体系统包含位于适当宿主细胞中的本发明的载体。适当的宿主细胞的例子包括，但不限于，原核和真核细胞。根据本发明的实施，真核细胞也是适当的宿主细胞。真核细胞的例子包括任何原代或永生化的动物细胞，酵母(如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，和巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris))，以及植物细胞。示例性动物细胞包括来自牛、绵羊、猪、鼠、马、猴和猿的细胞。骨髓瘤、COS和CHO细胞是可以用作宿主的动物细胞。具体的CHO细胞包括，但不限于，DG44(Chasin，et la.，1986 Som.Cell.Molec.Genet.12：555-556；Kolkekar 1997 Biochemistry 36：10901-10909)，CHO-K1(ATCC No.CCL-61)，CHO-K1 Tet-On细胞系(Clontech)，命名为ECACC 85050302的CHO(CAMR，Salisbury，Wiltshire，UK)，CHO克隆13(GEIMG，Genova，IT)，CHO克隆B(GEIMG，Genova，IT)，命名为ECACC 93061607的CHO-K1/SF(CAMR，Salisbury，Wiltshire，UK)，和命名为ECACC 92052129的RR-CHOK1(CAMR，Salisbury，Wiltshire，UK)。示例性植物细胞包括整个植物、细胞培养物或愈伤组织，烟草、玉米、大豆和稻细胞。玉米、大豆和稻的种子也是可接受的。

本发明的CTLA4突变分子可以作为天然存在的多肽从任何天然的、合成的、半合成的或重组的来源中分离。相应地，CTLA4突变多肽分子可以作为天然蛋白从任何物种物种分离，具体是哺乳动物，包括牛、绵羊、猪、鼠、马，优选人。作为选择，CTLA4突变多肽分子可以作为在原核或真核宿主细胞中表达的重组多肽被分离，或作为化学合成的多肽被分离。

本领域的技术人员可以容易地使用标准分离方法获得分离的CTLA4突变分子。分离的性质和程度将取决于本发明分子的来源和用途。

CTLA4突变分子及其片段或衍生物可以通过重组方法产生。因此，可以对编码野生型CTLA4分子的分离核苷酸序列进行操作以引入突变，产生编码CTLA4突变多肽分子的核苷酸序列。例如，编码CTLA4突变分子的核苷酸序列可以通过定点诱变法，采用引物和PCR扩增而产生。引物可以包括设计为引入所需突变的特定序列。另外，引物可以设计为包括随机化或半随机化的序列，以引入随机突变。可以使用标准重组方法(MolecularCloning；A Laboratory Manual，2^nd edition，Sambrook，Fritch，和Maniatis1989，Cold Spring Harbor Press)和PCR技术(美国专利4,603,102)来产生和分离编码CTLA4突变多肽的CTLA4突变多核苷酸。

本发明包括药物组合物，它包含药学有效剂量的分子，该分子阻断B7与CTLA4和/或CD28，诸如可溶性CTLA4分子、CD28分子、B7(B7-1或B7-2)分子、抗CTLA4单克隆抗体、抗CD28单克隆抗体或抗B7(B7-1或B7-2)单克隆抗体的相互作用。本发明的药物组合物对治疗心血管疾病有用。在某些实施方案中，心血管疾病是由CD28/CTLA4/B7相互作用介导的。可溶性CTLA4突变分子优选是具有野生型序列的可溶性CTLA4分子和/或在CTLA4的细胞外结构域具有一个或多个突变的可溶性CTLA4分子。该药物组合物可以包含可溶性CTLA4蛋白分子和/或核酸分子，和/或编码这些分子的载体。在优选实施方案中，可溶性CTLA4分子具有图24或19(分别为CTLA4Ig或L104EA29Y)所示的CTLA4的细胞外结构域的氨基酸序列。甚至更优选地，可溶性CTLA4突变分子是这里公开的L104EA29YIg。

本发明的组合物可以进一步包括一种或更多的附加、其他或第二种治疗剂。通过“联合给药”或“联合治疗”，意味着本发明的化合物及一或多种附加治疗剂均对被治疗的哺乳动物给药。当联合给药时，每种成分可以在相同时间或在不同时间点按任意顺序给药。因此，每种成分可分开但以足够接近的间隔给药，以提供希望的治疗效果。

当与本发明分子结合使用时，附加治疗剂可按照例如Physician’s DeskReference(PDR)的指示或由本领域一般技术人员决定的剂量使用。

附加、其他或第二种治疗剂包括抗凝血剂或凝血抑制剂、抗血小板或血小板抑制剂、凝血酶抑制剂、维生素K拮抗剂、醣蛋白IIb/IIIa受体拮抗剂、溶血栓剂或纤溶剂、抗心律失常剂、抗高血压剂、血管紧张素转化酶抑制剂(ACE-Is)，血管紧张素受体阻断剂(ARBs)、β受体阻断剂、钙通道阻断剂(L类型和T类型)、强心苷(cardiac glycoside)、利尿剂(diruetics)，盐皮质激素受体拮抗剂、磷酸二酯酶抑制剂、降胆固醇/脂肪药剂和脂肪控制治疗(lipid profile therapy)、抗糖尿病剂、抗抑郁剂、抗炎剂(类固醇的和非类固醇的)、抗骨质疏松剂、激素取代疗法、口服避孕药、抗肥胖剂、抗焦虑剂、抗增殖剂、抗肿瘤剂、抗溃疡和胃食管反流病药剂、生长激素和/或生长激素促分泌素、甲状腺模拟物(thyroid mimetics)(包括甲状腺素受体拮抗剂)、抗感染剂、抗病毒剂，抗细菌剂和抗真菌剂。

可与本发明组合物联用的抗凝血剂(或凝血抑制剂)包含华法令(warfarin)和肝素(或未分级的肝素或任何可通过商业得到的低分子量肝素)、合成戊糖、包含水蛭素(hirulin)和阿加曲班(argatroban)以及Xa因子抑制剂的直接作用型凝血酶抑制剂。

在此使用的术语抗血小板剂(或血小板抑制剂)表示例如通过抑制血小板聚集、粘着或颗粒分泌来抑制血小板功能的药剂。所述药剂包括，但不限于，各种已知非类固醇抗炎症药物(NSAID)如阿司匹林、布洛芬、萘普生(naproxen)、舒林酸(sulindac)、茚甲新(indomethacin)、mefenamate、屈恶昔康(droxicam)，双氯芬酸(diclofenac)，硫氧唑酮(sulfinpyrazone)，吡罗昔康(piroxicam)和可药用的盐或其前体药物。对于NSAID，阿司匹林(乙酰水杨酸或ASA)和吡罗昔康是优选的。其它适宜的血小板抑制剂包括IIb/IIIa拮抗剂(如tirofiban，eptifibatide，和abciximab)、凝血恶烷(thromboxane)A2受体拮抗剂(如伊非曲班(ifetroban))、凝血恶烷A2合成酶抑制剂、PDE-III抑制剂(如哌醇定(dipyridamole))和可药用的盐或其前体药物。

在此使用的术语抗血小板剂(或血小板抑制剂)意图包含ADP(二磷酸腺苷)受体拮抗剂，优选嘌呤能(purinergic)受体P₂Y₁和P₂Y₁₂的拮抗剂，P₂Y₁₂更为优选。优选P₂Y₁₂受体拮抗剂包括噻氯匹定(ticlopidine)及氯吡格雷(clopidogrel)，包括其可药用的盐或其前体药物。氯吡格雷是更优选的药剂。噻氯匹定和氯吡格雷也是优选的化合物，由于已知它们在胃肠道中使用时较温和。

在此使用的术语凝血酶抑制剂(或抗凝血酶剂)是指丝氨酸蛋白酶凝血酶抑制剂。通过抑制凝血酶，各种凝血酶介导的过程，如凝血酶介导的血小板活化(即，例如血小板聚集，和/或纤溶酶原激活物抑制剂1和/或5-羟色胺的颗粒分泌)和/或纤维蛋白形成被破坏。许多凝血酶抑制剂对本领域技术人员已知并且这些抑制剂可与本发明的化合物联用。这些抑制剂包括，但不限于硼酸精氨酸(boroarginine)衍生物、硼酸肽(boropeptides)、肝素、水蛭素、阿加曲班和美拉加群，包括可药用的盐或其前体药物。硼酸精氨酸衍生物和硼酸肽包含硼酸的N乙酰基和肽衍生物，如赖氨酸，鸟氨酸，精氨酸，高精氨酸C末端α氨基硼酸衍生物和其相应的isothiouronium类似物。在此使用的术语水蛭素包含适宜的水蛭素衍生物或类似物，本文指水蛭素类似物(hirulog)，如二磺基水蛭素(disulfatohirudin)。在此使用的术语血栓剂或纤维蛋白溶解剂(或溶血栓剂或纤溶剂)是指溶解血液凝块(血栓)的药剂。这些药剂包括组织纤溶酶原激活物(天然的或重组的)以及其修饰的形式、阿尼普酶(anistreplase)、尿激酶、链激酶、tenecteplase(TNK)、兰替普酶(lanoteplase)(nPA)，因子VIIa抑制剂，PAI-1抑制剂(如组织组织纤溶酶原激活物抑制剂的灭活剂)、α2抗纤溶酶抑制剂，以及乙酰化(anisoylated)纤溶酶原链激酶激活物复合体，包括可药用的盐或其前体药物。在此使用的术语阿尼普酶anistreplase，指乙酰化纤溶酶原链激酶激活物复合体，例如，在EP 028,489中所述，包含在此引入作为参考。在此使用的术语尿激酶是指双链或单链尿激酶，后者也称为前体尿激酶。

与本发明化合物结合使用的适宜的抗心律失常剂例子包括：I类药剂(如心律平(propafenone))；II类药剂(如carvadiol和心得安(propranolol))；III类药剂(如心得怡(sotalol)、多非利特(dofetilide)、胺碘酮(amiodarone)、阿米利特(azimilide)和伊布利特(ibutilide))；IV类药剂(如地尔硫卓(ditiazem)和异搏定(verapamil)；K⁺通道开放药如I_Ach抑制剂，和I_Kur抑制剂(如在WO01/40231披露的化合物)。

与本发明化合物结合使用的适宜的抗高血压剂的例子包括：α肾上腺能(adrenergic)阻断剂；β肾上腺能阻断剂；钙通道阻断剂(如地尔硫卓(diltiazem)、异搏定(verapamil)、硝苯地平(nifedipine)、苯磺酸氨氯地平(amlodipine)和mybefradil)；利尿剂(如氯噻嗪(chlorothiazide)、氢氯噻嗪(hydrochlorothiazide)、氟甲噻嗪(flumethiazide)、氢氟噻嗪(hydroflumethiazide)、苯氟噻嗪(bendroflumethiazide)、甲基氯噻嗪(methylchlorothiazide)、三氯噻嗪(trichloromethiazide)、多噻嗪(polythiazide)、苯噻嗪(benzthiazide)、利尿酸(ethacrynic acid tricrynafen)、氯塞酮(chlorthalidone)、利尿磺胺(furosemide)、musolimine，布美他尼(bumetanide)、triamtrenene、阿米洛利(amiloride)、安体舒通(spironolactone))；肾素抑制剂抑制剂；ACE抑制剂(如卡托普利(captopril)、佐芬普利(zofenopril)、福辛普利(fosinopril)、依那普利(enalapril)、ceranopril、cilazopril、地拉普利(delapril)、喷托普利(pentopril)、喹那普利(quinapril)、雷米普利(ramipril)、赖诺普利(lisinopril))；AT-1受体拮抗剂(如洛沙坦(losartan)、依贝沙坦(irbesartan)、丙戊沙坦(valsartan))；ET受体拮抗剂(如司他生坦(sitaxsentan)、atrsentan和披露于美国专利5,612,359和6,043,265的化合物)；双ET/AII拮抗剂(如披露于WO 00/01389的化合物)；中性肽链内切酶(NEP)抑制剂；血管肽酶(vasopepsidase)抑制剂(双NEP-ACE抑制剂)(如奥马曲拉(omapatrilat)、gemopatrilat和硝酸盐)。

与本发明化合物联用的适宜的钙通道阻断剂(L型或T型)的例子包括地尔硫卓(diltiazem)、异搏定(verapamil)、硝苯地平(nifedipine)、苯磺酸氨氯地平(amlodipine)和mybefradil。

与本发明化合物联用的适宜的强心苷例子包括毛地黄(digitalis)和乌本苷(ouabain)。

与本发明化合物联用的适宜的利尿剂的例子包括：氯噻嗪(chlorothiazide)、氢氯噻嗪(hydrochlorothiazide)、氟甲噻嗪(flumethiazide)、氢氟噻嗪(hydroflumethiazide)、苯氟噻嗪(bendroflumethiazide)、甲基氯噻嗪(methylchlorothiazide)、三氯噻嗪(trichloromethiazide)、多噻嗪(polythiazide)、苯噻嗪(benzthiazide)、利尿酸(ethacrynic acid tricrynafen)、氯塞酮(chlorthalidone)、利尿磺胺(furosemide)、musolimine、布美他尼(bumetanide)、triamtrenene、阿米洛利(amiloride)和安体舒通(spironolactone)。

与本发明化合物结合使用的适宜的盐皮质激素受体拮抗剂例子包括：安体舒通和依普利酮(eplerenone)。

与本发明化合物联用的适宜的磷酸二酯酶抑制剂例子包括：PDE III抑制剂(如西洛他唑(cilostazol))；和PDE V抑制剂(如西地那非(sildenafil))。

与本发明化合物联用的适宜的降低胆固醇/脂肪的药剂和脂肪控制治疗的例子包括：HMG-CoA还原酶抑制剂(如普伐他汀、洛伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀、NK-104(a.k.a.伊他伐他汀(itavastatin)或尼伐他汀(atavastatin)或nisbastatin)以及ZD-4522(a.k.a.罗苏伐他汀(rosuvastatin)或atavastatin或visastatin))；鲨烯(squalene)合成酶抑制剂；氯贝特(fibrate)；胆酸螫合剂(如考来烯胺(questran)；ACAT抑制剂；MTP抑制剂；脂加氧酶抑制剂；胆固醇吸收抑制剂；和胆固醇酯转运蛋白抑制剂(如CP-529414)。

与本发明化合物联用的适宜的抗糖尿病剂例子包括：双胍类药剂(如甲福明(metformin)二甲双胍)；葡糖苷酶抑制剂(如阿卡波糖(acarbose))；胰岛素(包含胰岛素促分泌素或胰岛素增敏剂)；氯茴苯酸类药剂(meglitinide)(如瑞格列泰(repaglinide)；磺酰脲类药剂(如格列美脲(glimepiride)、优降糖(glyburide)和格列吡嗪(glipizide)；双胍/优降糖组合物(如格列本脲盐酸二甲双胍(glucovance)，噻唑烷二酮类药剂(thiozolidinediones)(如曲格列酮(troglitazone)，罗格列酮(rosiglitazone)和吡咯列酮(pioglitazone))、PPAR-alpha拮抗剂，PPAR-gamma拮抗剂、PPAR alpha/gamma双重拮抗剂、SGLT2抑制剂、脂肪酸结合蛋白(aP2)抑制剂，如披露于WO00/59506的药剂，胰高血糖素样肽-1(GLP-1)，和二肽基肽酶IV(DP4)抑制剂。

与本发明化合物联用的适宜的抗抑郁剂例子包括：奈法唑酮(nefazodone)和舍曲林(sertraline)。

与本发明化合物联用的适宜的抗炎症剂例子包括：类固醇化合物如皮质类固醇和糖皮质激素，包含强的松(prednisone)和氟美松(dexamethasone)；依那西普(依那西普)(Enbrel)；英夫利昔单抗(英夫利昔单抗)(Remicade)；蛋白酪氨酸激酶(PTK)抑制剂；环加氧酶抑制剂(包含NSAID，和COX-1和/或COX-2抑制剂)；阿司匹林；茚甲新(indomethacin)；布洛芬；prioxicam；萘普生(naproxen)；西乐葆(celecoxib)；和/或罗非考昔(rofecoxib)。

与本发明化合物联用的适宜的抗骨质疏松剂例子包括：alendronate和雷洛昔芬(raloxifene)。

与本发明化合物结合使用的适宜的技术取代疗法例子包括：雌激素(如偶联的雌激素)和雌二醇。

与本发明化合物联用的适宜的抗凝血剂的例子包括：肝素(如未分级的和低分子量肝素如依诺肝素(enoxaparin)和达肝素(dalteparin))。

与本发明化合物联用的适宜的抗肥胖剂的例子包括：奥利司他(orlistat)和aP2抑制剂(如披露于WO00/59506的药剂)。

与本发明化合物联用的适宜的抗焦虑剂的例子包括：安定(diazepam)、氯羟安定(lorazepam)、丁螺旋酮(buspirone)和hydroxyzine pamoate。

与本发明化合物联用的适宜的抗增殖剂例子包括：环孢素A、紫杉醇(paditaxel)、阿霉素；epithilones、顺氯氨铂和卡铂(carboplatin)。

与本发明化合物结合使用的适宜的抗溃疡剂和胃食管反流病药剂的例子包括：法莫替丁(famotidine)、雷尼替丁(ranitidine)和奥美拉唑(omeprazole)。

附加治疗药剂也包括：胶原、dnaJ，阻断TNF功能的分子(如pegsunercept)、阻断细胞因子功能的分子(如AMG719)，阻断LFA-1功能的分子(如依法利珠单抗(efalizumab)和干细胞移植。这些其它治疗正在临床试验( www.clinicaltrials.gov)中进行研究以确定它们对类风湿性关节炎的效果。

胶原，例如以牛II型胶原形式，可以口服给予患有心血管疾病的病人以减轻一种或多种心血管疾病症状。

DnaJ是一种小的肽，它模拟许多患有心血管疾病的病人的基因中包含的蛋白。该肽来自大肠杆菌热休克蛋白。DnaJ可以对患有心血管疾病的病人口服给药以减轻一种或多种心血管疾病症状。

TNF是分子，它与患类风湿性关节炎和可能的心血管疾病的病人的炎症应答有关。可以想象地，任何通过阻断TNF与TNF受体(TNFR)结合以阻断TNF功能的分子可帮助修饰心血管疾病进程和减轻一些症状。几种TNF阻断剂如英夫利昔单抗和依那西普，在治疗心血管疾病中已表现出疗效。其它TNF阻断剂如pegsunercept治疗心血管疾病的疗效正被开发并测试(II期临床试验)。

细胞因子如白介素1(IL-1)是细胞分泌的分子，其与介导免疫应答有关。可以想象地，任何如通过阻断IL-1与其受体相互作用来阻断细胞因子功能的分子，可以帮助改变心血管疾病进程和减轻其一种或多种症状。Anakinra，阻断IL-1与其受体(IL-1R)相互作用的重组蛋白在治疗类风湿性关节炎中已表现出疗效。IL-1抑制剂，AMG719，治疗类风湿性关节炎的疗剂正被开发并检测(II期临床试验)。

淋巴功能相关性分子1(LFA-1)是两个亚单位构成的分子，CD11a和CD18，它通过介导淋巴细胞与各种细胞类型如内皮的粘附发挥功能。可以想象地，干扰LFA-1功能可以帮助改变心血管疾病进程和减轻一种或多种症状。LFA-1抗体，依法珠单抗(efalizumab)，治疗类风湿性关节炎的疗效正被开发并检测(II期临床试验)。

通过潜在的治疗分子阻断TNF、细胞因子或LFA-1与其配体的相互作用，可由本领域技术人员公知的任意数量的检测确定。例如，可使用竞争性测定以测试被感兴趣分子的阻断作用，例如分子可暴露于TNF/TNFR结合对以与TNF竞争结合TNFR。作为选择，可实施功能性测定以测试阻断，如可测试分子对炎症级联反应或炎症反应的任意部分如肿胀、发红或疼痛的抑制能力，所述反应由细胞因子引起。

附加治疗剂也包括：p38MAP激酶抑制剂，可溶性gp39(也称作CD40配体(CD40L)、CD154、T-BAM、TRAP)，可溶性CD29、可溶性CD40、可溶性CD80(例如ATCC 68627)、可溶性CD86、可溶性CD28(例如ATCC保藏号68628)、可溶性CD56、可溶性Thy-1、可溶性CD3、可溶性TCR、可溶性VLA-4、可溶性VCAM-1、可溶性LECAM-1、可溶性ELAM-1、可溶性CD44、与gp39反应的抗体(例如ATCC HB-10916、ATCC HB-12055和ATCC HB-12056)、与CD40反应的抗体(例如ATCC HB-9110)，与B7反应的抗体(例如ATCC HB-253、ATCC CRL-2223、ATCC CRL-2226、ATCCHB-301、ATCC HB-11341，等)，与CD28反应的抗体(例如ATCC HB-11944或mAb 9.3描述于Martin et al(J.Clin.Immun.4(1)：18-22，1980)，与LFA-1反应的抗体(例如ATCC HB-9579和ATCC TIB-213)，与LFA-2反应的抗体，与IL-2反应的抗体，与IL-12反应的抗体，与IFN-gamma反应的抗体，与CD2反应的抗体，与CD48反应的抗体，与任意ICAM反应的抗体(例如，ICAM-1(ATCC CRL-2252)，ICAM-2和ICAM-3)，与CTLA4反应的抗体(例如ATCC HB-304)，与Thy-1反应的抗体，与CD56反应的抗体，与CD3反应的抗体，与CD29反应的抗体，与TCR反应的抗体，与VLA-4反应的抗体，与VCAM-1反应的抗体，与LECAM-1反应的抗体，与ELAM-1反应的抗体，与CD44反应的抗体。在某些实施方案中，单克隆抗体是优选的。在其它实施方案中，抗体片段是优选的。如本领域技术人员可以容易理解的，化合物可包括：本发明的可溶CTLA4分子和一种其它药剂；可溶性CTLA4分子与两种其他药剂；可溶性CTLA4分子与三种其他药剂；依此类推。最佳组合和剂量的确定可用本领域公知的方法确定和优化。

一些特定的联合给药的组合包括如下组合：CTLA4Ig或L104EA29YIg和CD80单克隆抗体(mAbs)；CTLA4Ig或L104EA29YIg和CD86mAbs；CTLA4或L104EA29YIg、CD80mAbs、和CD86mAbs；CTLA4Ig或L104EA29YIg和gp39mAbs；CTLA4Ig或L104EA29YIg和CD40mAbs；CTLA4Ig或L104EA29YIg和CD28mAbs；CTLA4Ig或L104EA29YIg、CD80和CD86mAbs和gp39mAbs；CTLA4Ig或L104EA29YIg、CD80和CD86mAbs和CD40mAbs；和CTLA4Ig或L104EA29YIg、抗LFA1mAb、和抗gp39mAb。gp39mAb的特定例子是MR1。其它化合物将容易地被本领域技术人员鉴别和理解。

其它治疗药剂也包括：神经钙蛋白(calcinenrin)抑制剂，如环孢菌素A或FK506；免疫抑制性大环内酯，如雷帕霉素(rapamycine)或其衍生物(如40-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素)；淋巴细胞自导引药剂，如FTY720或其相似体；皮质；环磷酰胺；咪唑硫嘌呤(azathioprene)；二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤；来氟米特(leflunomide)或其类似物；咪唑立宾(mizoribine)；麦考酚酸(mycophenolic acid)；霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)；15-deoxyspergualine或其类似物；免疫抑制性单克隆抗体，如白细胞受体单克隆抗体，所述白细胞受体如MHC，CD2，CD3，CD4，CD 11a/CD18，CD7，CD25，CD 27，B7，CD40，CD45，CD58，CD 137，ICOS，CD150(SLAM)，OX40，4-1BB或其配体，或其它免疫调节化合物，如CTLA4/CD28-Ig，或其它粘附分子抑制剂，如mAb或低分子量抑制剂包含LFA-1拮抗剂，选择素(选择蛋白)拮抗剂和VLA-4拮抗剂。所述化合物具体与干扰CD40和其配体的化合物。如CD40抗体和CD40-L抗体联用。

本发明的化合物(即第一治疗剂)与至少一种附加治疗剂(即第二治疗剂)联合给药优选提供超过单独给药所述化合物和治疗剂的效力，优选的是当允许使用低剂量的每种药剂时(如协同联合)。较低的剂量最小化副作用的强度，因此使得安全系数增高。至少一种治疗剂以亚治疗剂量给药是优选的。所有的治疗剂以亚治疗剂量给药是更优选的。亚治疗剂量指治疗剂的量本身对于被治疗病症和疾病没有所需的治疗效果。协同联合指观察到的联用效果好于单独给药各种药剂之和。

包括可溶性CTLA4的药物组合物可用于阻断B7与CTLA4和/或CD28相互作用的方法；或用于治疗心血管疾病。药物组合物中可溶性CTLA4的有效量范围大约0.1到100mg/kg受试者体重。在另一实施方案中，有效量大约0.5到100mg/kg受试者体重，0.5到5mg/kg受试者体重，大约5到10mg/kg受试者体重，大约10到15mg/kg受试者体重，大约15到20mg/kg受试者体重，大约20到25mg/kg受试者体重，大约25到30mg/kg受试者体重，大约30到35mg/kg受试者体重，大约35到40mg/kg受试者体重，大约40到45mg/kg of a subject，大约45到50mg/kg受试者体重，大约50到55mg/kg受试者体重，大约55到60mg/kg受试者体重，大约60到65mg/kg受试者体重，大约65到70mg/kg受试者体重，大约70到75mg/kg受试者体重，大约75到80mg/kg受试者体重，大约80到85mg/kg受试者体重，大约85到90mg/kg受试者体重，大约90到95mg/kg受试者体重，或大约95到100mg/kg受试者体重。

在一种实施方案中，可溶性CTLA4有效量是约2mg/kg到约10mg/kg受试者体重。在另一实施方案中，有效量是约0.1到4mg/kg受试者体重。在另一实施方案中，有效量是约0.1到0.5mg/kg受试者体重，约0.5到1.0mg/kg受试者体重，约1.0到1.5mg/kg受试者体重，约1.5到2.0mg/kg受试者体重，约2.0到2.5mg/kg受试者体重，约2.5到3.0mg/kg受试者体重，约3.0到3.5mg/kg受试者体重or约3.5到4.0mg/kg受试者体重。在另一实施方案中，有效量是约0.1到20mg/kg受试者体重。在另一实施方案中，有效量是约0.1到2mg/kg受试者体重，约2到4mg/kg受试者体重，约4到6mg/kg受试者体重，约6到8mg/kg受试者体重，约8到10mg/kg受试者体重，约10到12mg/kg受试者体重，约12到14mg/kg受试者体重，约14到16mg/kg受试者体重，约16到18mg/kg受试者体重或约18到20mg/kg受试者体重。一种实施方案中，有效量是2mg/kg受试者体重。在另一实施方案中，有效量是约10mg/kg受试者体重。

在特定的实施方案中，可溶性CTLA4的有效量是：受试者体重低于60kg，500mg；受试者体重介于60-100kg，750mg；受试者体重超过100kg，1000mg。

本发明也提供了药物组合物，它包含本发明的分子如CTLA4Ig和本领域技术人员公知的可接受的载体或佐剂。这些药物组合物优选包含适当载体和佐剂，包含任何当与本发明的分子(如可溶性CTLA4分子，例如CTLA4Ig或L104EA29Y)联用时，保持该分子活性并与受试者免疫系统无反应的物质。这些载体和佐剂可以包含，但不限于，离子交换物，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血清蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，磷酸盐缓冲盐溶液，水，乳状液(例如油/水乳状液)，盐或电解质如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，硅胶，三硅酸镁，聚乙烯吡咯酮(PVP)，基于纤维素的物质和聚乙二醇。其它载体可以包括无菌溶液，片剂，包括包衣片剂和胶囊。典型的该类载体包含赋形剂诸如淀粉、牛奶、糖(如蔗糖、葡萄糖、麦芽糖)，某些类型的粘土、明胶、硬脂酸或其盐，硬脂酸镁或硬脂酸钙，滑石粉，植物脂肪或油，树胶，乙二醇，或其它已知赋形剂。这些载体也包含芳香剂和着色剂或及其它成分。包含这些载体的组合物是通过本领域已知的常规方法配制的。这些组合物也可以在诸如脂质体等各种脂质组合物，以及诸如聚合物微球体等各种聚合物组合物中配制。

在本发明的更进一步实施方案中，本发明提供了试剂盒(即，使用说明的包装的试剂组合)，其包含本发明对阻断B7与其配体相互作用和/或对治疗心血管疾病有用的分子。

试剂盒可包含药学组合物，其包括一种或多种治疗剂，例如单独的可溶性CTLA4分子，或第二治疗剂，以及可接受的载体或佐剂，例如可药用的缓冲剂如磷酸盐缓冲的盐水，林格氏(Ringer′s)溶液和葡萄糖溶液。它可以跟进一步地包含从商业和使用者角度理想的其它物质，包括其它缓冲液、稀释液、过滤器、针、注射器和含有使用说明的包装插入物。这些药剂可以作为干粉提供，通常是冻干的，包括在溶解状态下将提供具有适当浓度的药剂溶液的赋形剂。

第二药剂可包含那些如上所述的其它药剂，诸如抗凝血或凝血抑制剂、抗血小板或血小板抑制剂、凝血酶抑制剂、溶血栓剂或纤溶剂、抗心律失常剂、抗高血压剂、钙通道阻断剂(L类型和T类型)、强心苷、利尿剂、盐皮质激素受体拮抗剂、磷酸二脂酶抑制剂，降低胆固醇/脂质的剂和脂肪控制治疗、抗糖尿病剂，抗抑郁剂，抗炎剂(类固醇的和非类固醇的)，抗骨质疏松剂，激素取代疗法，口服避孕药，抗肥胖剂，抗焦虑剂，抗增生剂，抗溃疡和胃食管反流病药剂，生长激素和/或生长激素促分泌素，甲状腺素模拟药剂(thyroid mimetics)(包括甲状腺素受体拮抗剂)，抗感染剂，抗病毒剂，抗细菌剂，和抗真菌剂。

试剂盒包括带标签和使用说明的容器。适当的容器包含，例如瓶子、小瓶和试管。这些容器可以用各种物质如玻璃和塑料加工形成。这些容器可以有无菌可进入的口(例如这些容器可以是静脉溶液袋或具有可被注射针如皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。这些容器可保存药物组合物如含有可有效阻断B7与其配体的相互作用和/或治疗心血管疾病的药剂的药物组合物。

这些试剂盒也包含第二容器，其含有一或多种在此描述的第二药剂和/或可药用的缓冲液，如磷酸盐缓冲的盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。它可以还包含从商业和使用者角度理想的其它物质，包括其它缓冲液、稀释液、过滤物、针、注射器和含有使用说明的包装插页。

这些试剂盒也适当地包含在容器上或伴随容器的标签和/或使用说明。标签可以提供制备所述药剂的说明，例如溶解干粉，和/或对具体的心血管疾病治疗的说明。标签和/或使用说明可以说明本发明组合物的给药以及第二药剂可以同时或以任何顺序在不同时间点序贯使用。

标签和/或使用说明可以指出药学组合物在体内或体外用法的说明。标签和/或使用说明可以指出药学组合物单独使用，或与第二药剂联合使用。

标签可以指出本发明分子的适当剂量。例如，标签可以指出有效阻断B7与其配体相互作用和/或治疗心血管疾病的分子的量是大约0.1到100mg/kg受试者体重，大约0.5到100mg/kg受试者体重，0.5到5mg/kg受试者体重，大约5到10mg/kg受试者体重，大约10到15mg/kg受试者体重，大约15到20mg/kg受试者体重，大约20到25mg/kg受试者体重，大约25到30mg/kg受试者体重，大约30到35mg/kg受试者体重，大约35到40mg/kg受试者体重，大约40到45mg/kg受试者体重，大约45到50mg/kg受试者体重，大约50到55mg/kg受试者体重，大约55到60mg/kg受试者体重，大约60到65mg/kg受试者体重，大约65到70mg/kg受试者体重，大约70到75mg/kg受试者体重，大约75到80mg/kg受试者体重，大约80到85mg/kg受试者体重，大约85到90mg/kg受试者体重，大约90到95mg/kg受试者体重，大约95到100mg/kg受试者体重，大约2到10mg/kg受试者体重，大约0.1到4mg/kg受试者体重，大约0.1到0.5mg/kg受试者体重，大约0.5到1.0mg/kg受试者体重，大约1.0到1.5mg/kg受试者体重，大约1.5到2.0mg/kg受试者体重，大约2.0到2.5mg/kg受试者体重，大约2.5到3.0mg/kg受试者体重，大约3.0到3.5mg/kg受试者体重，大约3.5到4.0mg/kg受试者体重，大约4.0到4.5mg/kg受试者体重，大约4.5到5.0mg/kg受试者体重，大约5.0到5.5mg/kg受试者体重，大约5.5到6.0mg/kg受试者体重，大约6.0到6.5mg/kg受试者体重，大约6.5到7.0mg/kg受试者体重，大约7.0到7.5mg/kg受试者体重，大约7.5到8.0mg/kg受试者体重，大约8.0到8.5mg/kg受试者体重，大约8.5到9.0mg/kg受试者体重，大约9.0到9.5mg/kg受试者体重，大约9.5到10.0mg/kg受试者体重，大约0.1到2mg/kg受试者体重，大约2到4mg/kg受试者体重，大约4到6mg/kg受试者体重，大约6到8mg/kg受试者体重，大约8到10mg/kg受试者体重，大约10到12mg/kg受试者体重，大约12到14mg/kg受试者体重，大约14到16mg/kg受试者体重，大约16到18mg/kg受试者体重，大约18到20mg/kg受试者体重，大约0.5mg/kg受试者体重，2mg/kg受试者体重，10mg/kg受试者体重，大约0.5mg/kg到100受试者体重，大约0.5到10mg/kg受试者体重，大约0.1到20mg/kg受试者体重，对于体重低于60kg的受试者，大约500mg，对于体重介于60-100kg的受试者，750mg，或体重超过100kg的受试者，1000mg。

标签和使用说明也可以指出药学组合物可单独使用或与第二药剂联合使用以治疗所选疾病，例如心血管疾病，所述药物可同时或以任何顺序在不同时间点序贯使用。

在本发明的特定实施方案中，试剂盒包括含有可药用的载体和有效量的第一治剂药学组合物，其中第一药剂是阻断B7与CTLA4和/或CD28相互作用的分子，诸如可溶性CTLA4分子、CD28分子、B7(B7-1或B7-2)分子、抗CTLA4单克隆抗体，抗CD28单克隆抗体或抗B7(B7-1或B7-2)单克隆抗体。在优选的实施方案中，可溶性CTLA4分子具有如图24或19所示的CTLA4细胞外结构域的氨基酸序列(分别为CTLA4Ig或L104EA29Y)。

方法

本发明提供了调节功能性CTLA4和CD28阳性细胞与B7阳性细胞相互作用的方法。该方法包括将B7阳性细胞与本发明的可溶性CTLA4分子接触，以便调节功能性CTLA4和CD28阳性细胞与B7阳性细胞的相互作用，例如通过干扰内源性CTLA4分子和/或CD28与B7分子的反应。用于本发明方法的可溶性CTLA4的适当数量见以上描述。

本发明进一步提供了治疗心血管疾病的方法。该方法包括给予受试者有效量的本发明的治疗组合物诸如本发明的可溶性CTLA4分子，以便减轻至少一种与心血管疾病相关的症状。可溶性CTLA4包括CTLA4Ig和可溶性CTLA4突变分子例如L104EA29YIg。心血管疾病症状包括，但不限于，心律不齐；缺血；心绞痛；运动耐量减少；劳力性呼吸困难和短暂性缺血发作。此外，本发明可以通过阻断T细胞/B7阳性细胞相互作用对心血管疾病提供长期治疗，从而通过诸如B7与CD28结合等共刺激信号阻断T细胞活化/刺激，导致对T细胞无反应性或耐受的诱导。

心血管疾病包括，但不限于以下疾病或病症：血栓栓塞性疾病，包含动脉心血管血栓栓塞性疾病、静脉心血管血栓栓塞性疾病、心室内血栓栓塞性疾病；动脉粥样硬化、再狭窄病变、外周动脉疾病、冠状动脉旁路移植术、颈动脉疾病、动脉炎、心肌炎、心血管炎症、脉管炎症、冠心病(CHD)、不稳定性心绞痛(UA)、顽固性不稳定性心绞痛、稳定性心绞痛(SA)、慢性稳定性心绞痛、急性冠状动脉综合征(ACS)、首发或复发性心肌梗塞、急性心肌梗塞(AMI)、心肌梗塞、非Q波心肌梗塞、非ST段抬高性心肌梗塞、冠状动脉疾病、心肌缺血、缺血；缺血性突然死亡；短暂性缺血发作；发作综合征；动脉粥样硬化；周围动脉闭塞性疾病；静脉血栓形成；深静脉血栓形成；血栓性静脉炎；动脉栓塞；冠状动脉血栓形成；脑动脉血栓形成；脑栓塞；肾栓塞；肺栓塞；由以下情况导致的血栓形成(a)人工瓣膜或其他移植物(b)留置导管(c)支架(d)心肺分流术(e)血液透析或(f)其中血液被暴露于促进血栓形成的人工表面的其它方法；由动脉粥样硬化、外科手术或外科手术并发症、延期的固定、心房纤颤、先天性血栓形成倾向、癌症、糖尿病、药物或激素的影响，和妊娠并发症；包含室上性心律不齐、房性心律不齐、心房扑动、心房纤颤的心律失常，其它列在《Heart Disease》：一本心血管医学的教材，2 VolumeSet，6th Edition，2001，Eugene Braunwald，Douglas P.Zipes，Peter Libby，Douglas D.Zipes中的疾病。

优选的心血管疾病是：动脉粥样硬化、冠心病(CHD)、再狭窄病变、外周动脉疾病、冠状动脉旁路移植术、颈动脉疾病、动脉炎、心肌炎、心血管炎症、脉管炎症、不稳定性心绞痛(UA)、顽固性不稳定性心绞痛、稳定性心绞痛(SA)、慢性稳定性心绞痛、急性冠状动脉综合征(ACS)、心肌梗塞、急性心肌梗塞(AMI)，包括首发或复发性心肌梗塞、非Q波心肌梗塞、非ST段抬高性心肌梗塞和ST段抬高性心肌梗塞。

更优选的心血管疾病是：动脉粥样硬化、冠心病(CHD)、不稳定性心绞痛(UA)、顽固性不稳定性心绞痛、稳定性心绞痛(SA)、慢性稳定性心绞痛、急性冠状动脉综合征(ACS)、心肌梗塞、急性心肌梗塞(AMI)，包括首发或复发性心肌梗塞、非Q波心肌梗塞、非ST段抬高性心肌梗塞和ST段抬高性心肌梗塞。

优选的心血管疾病是由T细胞与B7阳性细胞相互作用介导的心血管疾病。

也优选的是与至少一种炎症标记物相关的心血管疾病。与炎症标记物相关，意味着标记物(出现、消失或特定浓度)在统计学上与疾病将来的发展、或疾病复发的风险、或目前疾病活动性的水平相关联。炎症标记物包括，但不限于CRP、hsCRP、IL-10、CD40L、sCD40L、IL-6、sICAM-1、TNF-α、白细胞计数、纤维蛋白原、和血清淀粉样蛋白A。优选的炎症标记物是CRP、hsCRP、IL-6和TNF-α；最优选的是hsCRP。高CRP、高hsCRP、low IL-10、高sCD40L、高IL-6、高sICAM-1、高TNF-α、高白细胞计数，高纤维蛋白原和高血清淀粉样蛋白A是已知的炎症指示剂。

本发明的可溶性CTLA4分子表现出体内抑制特性。在T细胞/B7阳性细胞相互作用例如T细胞/B细胞相互作用作为T细胞与B7阳性细胞接触的结果出现的条件下，结合引入的CTLA4分子以便与例如B细胞等B7阳性细胞反应可以干扰，即抑制T细胞/B7阳性细胞相互作用，从而导致对免疫应答的调节。

本发明的优选实施方案包括用CTLA4Ig或可溶性CTLA4突变分子L104EA29YIg调节功能性CTLA4和CD28阳性细胞与B7阳性细胞的相互作用，以治疗或预防心血管疾病，包括复发性心血管事件(例如心肌梗塞)，和/或下调免疫应答。本发明的L104EA29YIg是可溶性CTLA4突变分子，其中包含至少两种氨基酸改变，即+104位的亮氨酸(L)改变为谷氨酸(E)，以及+29位的丙氨酸(A)改变为酪氨酸(Y)(图19)。L104EA29YIg分子可以进一步包含这里指出的两个突变以外的突变。

用于阻断B7与CTLA4和/或CD28相互作用的分子的适当量如上所述。用于阻断B7/CTLA4相互作用的分子可以是可溶性CTLA4诸如CTLA4Ig，CTLA4Ig/CD28Ig或L104EA29YIg，可溶性CD28诸如CD28Ig，可溶性B7(B7-1或B7-2)诸如B7Ig，抗CTLA4单克隆抗体，抗CD28单克隆抗体或抗B7单克隆抗体。

本发明提供的症状减轻的量可以用任何已接受的标准进行测定，以便测量并记录一种临床状况中的症状减轻。已接受的测定症状减轻的标准可以包括：心绞痛；复发性心绞痛；不稳定性心绞痛；缺血时间；心血管原因的住院治疗；急性心肌梗塞；复发性心肌梗塞；紧急再血管化(revascularization)的需求；经皮冠脉介入的需求；所有原因的死亡率；心血管疾病死亡率；短暂性缺血发作；和发作综合征。

本发明治疗的受试者包括哺乳动物受试者，包括人、猴、猿、狗、猫、牛、马、山羊、猪、兔、小鼠和大鼠。

本发明提供了各种给予本发明的治疗组合物诸如单独的可溶性CTLA4分子或与附加治疗药剂联合的局部或全身方法。这些方法包括静脉内、肌肉内、腹腔内、口服、吸入、和皮下方法，以及可植入泵、连续输注、药团(bolus)输注、基因治疗、脂质体、栓剂、局部接触、载体、胶囊、可生物降解的聚合体，药物洗脱型支架(drug-eluting stents)，水凝胶，控制释放帖剂和注射方法。与载体复合的治疗剂通常被冻干保存，在给药之前用中性pH值(pH约7-8，如pH7.5)的水和缓冲液重建。

本发明的治疗组合物，如可溶性CTLA4分子，可以作为附加治疗药剂同时给药，或在不同时点以任意顺序依次给药。

如本发明的标准实践，本发明的组合物可以以任何可药用形式给予受试者。

根据本发明的实施，这些方法包括给予受试者本发明的可溶性CTLA4分子，以便调节CD28和/或CTLA4阳性细胞与B7阳性细胞的相互作用。使B7阳性细胞与有效量的本发明的可溶性CTLA4分子、或其片段或衍生物接触，以便形成可溶性CTLA4/B7复合物。可溶性CTLA4的适当量如上描述。这些复合物干扰内源性CTLA4和CD28分子与B7家族分子的相互作用。

以一定量和一个时间(例如时间长度和/或多次)给予受试者可溶性CTLA4分子，其足以阻断内源性B7分子与受试者中的它们各自的配体结合。因此，内源性B7/配体结合的阻断抑制B7阳性细胞与CD28和/或CTLA4阳性细胞的相互作用。在一种实施方案中，可溶性CTLA4可以根据需要按日、周、月和/或年，每天/周/月/年一次或多次对受试者给药。例如，在一个实施方案中，所述分子最初在一个月中每两周给药一次，以后每月给药一次。

治疗剂的剂量取决于许多因子，包括但不限于，受影响组织的类型、被治疗的心血管疾病的类型、疾病的严重程度、受试者的健康和对该试剂治疗的反应。因此，这些试剂的剂量可以根据每个受试者和给药方式而不同。可溶性CTLA4分子的给药量可以是大约0.1到100mg/kg患者体重/日。可溶性CTLA4的适当数量描述如上。

本发明也包括用本发明的组合物与其他治疗剂或药剂一起治疗心血管疾病。例如，可以用本发明的分子可联用，但不限于，上文本发明组合物的讨论中所列的附加治疗剂来治疗心血管疾病。

当本发明的可溶性CTLA4突变分子与其它治剂如这里指出的药剂联合给药时，共同给予的药剂剂量将必然根据共同使用的药物的剂量、使用的具体药物、接受治疗的条件等而变化。

根据前述内容，本发明还提供了如前面所定义的另一方面的方法，包括共同给予，如同时或以任何顺序贯序(即同时或在不同时间点以任何顺序贯序)给予治疗有效量的游离形式或可药用盐形式的本发明的可溶性CTLA4分子，如CTLA4Ig和/或L104EA29YIg，以及第二种药物物质，该第二种药物物质为例如前面所指出的免疫抑制剂、免疫调节或抗炎药物。

进一步提供了包含游离形式或可药用盐形式的可溶性CTLA4分子的治疗组合，如试剂盒，它与至少一种包含附加治疗剂的药物组合物同时或以任何顺序序贯(即同时或在不同时间点以任何顺序贯序)使用。该试剂盒可以包含给药的说明。本发明的试剂盒可用于本发明的任一方法。

本发明也提供了产生本发明的可溶性CTLA4突变分子的方法。可溶性CTLA4突变分子的表达可以在原核细胞或真核细胞中。

原核生物最常以各种细菌株为代表。该细菌可以使革兰氏阳性或革兰氏阴性。一般地，优选大肠杆菌等革兰氏阴性菌。其他微生物株也可以使用。可以将编码可溶性CTLA4突变分子的序列插入设计为在诸如大肠杆菌等原核细胞中表达外来序列的载体中。这些载体可以包括常用的原核控制序列，他们在此处定义为包含用于转录起始的启动子，可选择包含操纵子，以及同时包含核糖体结合位点序列，包括常用的启动子，如β内酰胺酶(青霉素酶(penicillinase))和乳糖(lac)系统(Chang，et al.，(1977)Nature 198：1056)，色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel，et al.，(1980)Nucleic Acids Res.8：4057)和λ衍生的P_L启动子和N基因核糖体结合位点(Shimatake，et al.，(1981)Nature292：128)。

这些表达载体也将包含复制起点和可选择标记，如β内酰胺酶或赋予抗生素抗性的新霉素磷酸转移酶基因，使得载体可以在细菌中复制，并且当细胞在抗生素如氨苄青霉素或卡那霉素等存在下生长时可以选择携带该质粒的细胞。

可以通过各种标准方法将表达质粒引入原核细胞，这些方法包括但不限于CaCl₂-休克(Cohen，(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69：2110，andSambrook et al.(eds.)，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，2ndEdition，Cold Spring Harbor Press，(1989))和电穿孔。

根据本发明的实施，真核细胞也是适宜的宿主细胞。真核细胞的例子包括任何原代或永生化的动物细胞，酵母(如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，和巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris))，以及植物细胞。骨髓瘤、COS和CHO细胞是可以作为宿主的动物细胞。具体的CHO细胞包括，但不限于，DG44(Chasin，et la.，1986 Som.Cell.Molec.Genet.12：555-556；Kolkekar 1997 Biochemistry 36：10901-10909)，CHO-K1(ATCC No.CCL-61)，CHO-K1 Tet-On细胞系(Clontech)，命名为ECACC 85050302的CHO(CAMR，Salisbury，Wiltshire，UK)，CHO克隆13(GEIMG，Genova，IT)，CHO克隆B(GEIMG，Genova，IT)，命名为ECACC93061607的CHO-K1/SF(CAMR，Salisbury，Wiltshire，UK)，以及命名为ECACC 92052129的RR-CHOK1(CAMR，Salisbury，Wiltshire，UK)。示例性的植物细胞包括烟草(整个植物、细胞培养物或愈伤组织)、玉米、大豆和稻细胞。玉米、大豆和稻种子也是可接受的。

编码CTLA4突变分子的核酸序列也可以插入设计用于在真核宿主中表达外来序列的载体。该载体的调节序列可以根据具体的真核宿主而不同。

用于表达载体的常用的真核控制序列包括与哺乳动物细胞相容的启动子核控制序列，如CMV启动子(CDM8载体)和禽肉瘤病毒(ASV)(πLN载体)。其它常用启动子包括猴病毒40(SV40)早期和晚期启动子(Fiers，etal.，(1973)Nature 273：113)，或其它病毒启动子，如来源于多形瘤病毒(polyoma)、腺病毒和牛乳头瘤病毒的病毒启动子。也可以使用诱导型启动子，如hMTII(Karin，et al.，(1982)Nature 299：797-802)。

用于在真核细胞中表达CTLA4突变分子的载体也可以携带称作增强子区的序列。其在优化基因表达中是重要的，发现位于启动子区的上游或下游。

用于真核宿主细胞的表达载体的例子包括，但不限于，哺乳动物宿主细胞的载体(如BPV-1，pHyg，pRSV，pSV2，pTK2(Maniatis)；pIRES(Clontech)；pRc/CMV2，pRc/RSV，pSFV1(Life Technologies)；pVPakc载体，pCMV载体，pSG5载体(Stratagene))，逆转录病毒载体(例如pFB载体(Stratagene))，pCDNA-3(Invitrogen)或其修饰形式，腺病毒载体；腺伴随病毒载体，杆状病毒载体，酵母载体(例如，pESC载体(Stratagene))。

编码CTLA4突变分子的核酸序列可以整合至真核宿主细胞的基因组，并且随宿主基因组复制。此外，携带CTLA4突变分子的载体可以含有允许染色体外复制的复制起点。

为了在酿酒酵母中表达核酸序列，可以使用来自于内源性酵母治疗的复制起点，2μ环(Broach，(1983)Meth.Enz.101：307)。此外，可以使用来源于酵母基因组的可以促进自主复制的序列(见例如Stinchcomb etal.，(1979)Nature 282：39)；Tschemper et al.，(1980)Gene 10：157；and Clarke etal.，(1983)Meth.Enz.101：300).

酵母载体的转录控制序列包括用于糖酵解酶合成的启动子(Hess etal.，(1968)J.Adv.Enzyme Reg.7：149；Holland et al.，(1978)Biochemistry17：4900)。本领域已知的其它启动子包括提供于CDM8载体中的CMV启动子(Toyama and Okayama，(1990)FEBS 268：217-221)；3-磷酸甘油激酶的启动子(Hitzeman et al.，(1980)J.Biol.Chem.255：2073)，以及其它糖酵解酶的启动子。

其它启动子是诱导型的，因为他们可以被细胞的环境刺激或生长培养基调节。这些诱导型启动子包括来自于热休克蛋白、乙醇脱氢酶2、同种细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮分解(catabolism)相关的酶，以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的基因的启动子。

调节序列也可以位于编码序列的3′端度。这些序列可以用于稳定信使RNA。这些终止子位于一些酵母来源的和哺乳动物基因中的编码序列之后的3′非翻译区中。

植物和植物细胞的示例性载体包括，但不限于，土壤杆菌T_i质粒、花椰菜花叶病毒(CaMV)，和马铃薯金色花叶病毒(TGMV)。

哺乳动物细胞宿主系统转化的一般方面已经由Axel(1983年8月16日授权的美国专利4,399,216)进行过描述。哺乳动物细胞可以用包括但不限于在磷酸钙存在下转染、微注射、电穿孔、或通过利用病毒载体的转导等方法转化。

将外来DNA序列引入真核细胞基因组，包括植物和酵母基因组的方法包括(1)机械方法，如将DNA微注射至单细胞或原生质体，在DNA存在下用玻璃珠涡旋细胞，或将DNA包被的钨或金珠射入细胞或原生质体，(2)通过乙二醇处理或接受高电压电脉冲，使细胞膜可以透过大分子，以便引入DNA(电穿孔)，(3)使用融合于细胞膜的脂质体(含cDNA)。

一旦本发明的CTLA4突变分子被表达，它们可以通过本领域公知的方法而收获，如细胞裂解(如通过超声、溶菌酶和/或去污剂)，利用标准蛋白纯化方法，如亲和层析或离子交换层析进行蛋白回收以产生基本纯的产物(R.Scopes in：“Protein Purification，Principles and Practice”，ThirdEdition，Springer-Verlag(1994)；Sambrook et al.(eds.)，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，2nd Edition，Cold Spring Harbor Press，(1989))。CTLA4突变分子的表达可以通过本领域公知的方法检测。例如，可以通过考马斯染色SDS-PAGE凝胶和使用结合CTLA4的抗体的免疫印迹检测突变分子。

实施例

下面的实施例是为了举例说明本发明并帮助本领域技术人员进行和使用本发明，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

以下提供了用于产生编码本发明的CTLA4分子的核苷酸序列的方法。

首先构建编码CTLA4Ig的质粒，其表达CTLA4Ig，如美国专利5,434,131，5,885,579和5,851,795的描述。然后从CTLA4Ig编码序列产生单点突变分子(如L104EIg)，对其进行表达并检验对各种B7分子的结合动力学。用L104EIg核苷酸序列(如图18所示序列中包括的序列)作为模板产生双位点CTLA4突变序列(如图19-22所示序列中包括的序列)，它们被表达为蛋白，并且检验其结合动力学。双位点CTLA4突变序列包括：L104EA29YIg，L104EA29LIg，L104EA29TIg，和L104EA29WIg。也产生了三位点突变体。

构建CTLA4Ig

构建编码CTLA4Ig的基因构建体，其包含CTLA4Ig的细胞外结构域和IgCγ结构域，其构建方法见美国专利5,434,131，5,844,095和5,851,795描述，其内容在此引入作为参考，CTLA4基因的细胞外结构域基因使用对应予公开序列(Dariavach et al.，Eur.Journ.Immunol.18：1901-1905(1988))的合成寡核苷酸通过PCR克隆得到。

因为在CTLA4基因内没有鉴定CTLA4的信号肽，用重叠寡核苷酸以两个步骤把预测的CTLA4序列的N末端与制瘤素M(Malik et al.，Mol.和Cell.Biol.9：2847(1989))的信号肽相融合。第一步，用寡核苷酸CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC(SEQ ID NO：1)(编码制瘤素M信号肽C末端15个氨基酸，融合于CTLA4的N末端的7个氨基酸)作为正向引物，TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGG CACGGTTG(SEQ ID NO：2)(编码CTLA4受体的编码氨基酸序列的119-125位氨基酸残基，并且包含Bcl I限制性酶切位点)作为反向引物。该步骤的模板是从1微克H38细胞(Salahudin和Gallo博士，NCI，Bethesda，MD提供的HTLV II感染的T细胞白血病细胞系)总RNA合成的cDNA。第一步PCR的部分产物被再扩增，利用编码制瘤素M信号肽的N末端部分合并Hind III限制性制酶切位点的重叠正向引物CTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACA-GAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC(SEQ ID NO：3)和相同反向引物。PCR反应产物用Hind III和Bcl I消化，并与Bcl I/Xba I切割的、编码相应IgC1铰链区，CH2和CH3区氨基酸序列的cDNA片段一起连接至HindIII/Xba I切割的表达载体CDM8或Hind III/Xba I切割的表达载体piLN(也称为πLN)。

编码相应于CTLA4Ig的氨基酸序列的DNA已根据布达佩斯条约于1991年5月31日保藏于ATCC，并给予ATCC保藏号68629。

基于CTLA4Ig密码子的诱变：

开发了诱变和筛选技术用以鉴定自CD80和/或CD86分子的解离速率(off速率)较慢，即结合能力的改进的突变CTLA4Ig分子。在该实施方案中，在CTLA4的细胞外结构域的CDR-1，CDR-2(也称做C’链)和/或CDR-3区中或附近的残基处进行突变(如美国专利6,090,914，5,773,253和5,844,095；共同未决的美国专利申请60/214,065和Peach，R.J.，et al J Exp Med 1994180：2049-2058等的描述。CDR样区包括每个CDR区和向CDR序列的上游和/或下游延伸数个氨基酸)。这些位点的选择是基于对嵌合CD28/CTLA4融合蛋白的研究(Peach et al.，J.Exp.Med.，1994，180：2049-2058)，并且基于预测哪些氨基酸残基侧链将暴露于溶剂的模型，以及在CD28和CTLA4之间的某些位置缺乏氨基酸残基同一性或同源性。同样，在空间上非常接近(5-20个Angstrom单位)所鉴定残基的任何残基都被认为是本发明的一部分。

为了合成并筛选对B7分子(如CD80，CD86)的亲和力改变的可溶性CTLA4突变分子，采用了一种两步策略。该实验首先产生在CTLA4的细胞外部分的特定密码子的突变文库，然后通过BIAcore分析鉴定对B7的反应性改变的突变体筛选所述文库。BIAcore分析系统(Pharmacia，Piscataway，N.J.)使用表面等离子共振检测系统，该系统基本涉及CD80Ig或CD86Ig与位于检测器中的葡萄糖包被的传感器共价结合。然后将待检测分子注射至含有传感器芯片和一定量的互补蛋白的小室中，该一定量的互补蛋白的结合可以根据与传感器芯片的葡聚糖包被侧在身体上相关的分子量的改变而评估，分子量的改变可以通过检测器系统进行测量。

具体地，用编码CTLA4Ig的非突变(如野生型)DNA(美国专利5,434,131，5,844,095；5,851,795；和5,885,796；ATCC保藏号68629)作为模板产生单位点突变的核苷酸序列。诱变寡核苷酸PCR引物被设计为用于特异密码子的随机诱变，这是通过允许密码子第1和2位为任意碱基，以及第3位仅仅是鸟嘌呤或胸腺嘧啶(XXG/T；也称为NNG/T)进行的。编码氨基酸的具体密码子可随机突变为20种氨基酸的每一种。因此，XXG/T诱变产生编码20种氨基酸的每一种的32个可能的密码子。编码接近CTLA4Ig的CDR3样环的突变的PCR产物(MYPPPY)经SacI/XbaI消化，亚克隆入进类似切割的CTLA4Ig(图24)πLN表达载体。使用该方法产生单位点突变的CTLA4分子L104EIg。

对于接近CTLA4Ig的CDR-1样环的诱变，通过PCR引物指导的诱变，在该环5’中首先引入沉默的NheI限制性位点。PCR产物经NheI/XbaI消化，亚克隆入进类似切割的CTLA4Ig或L104EIg表达载体。使用该方法产生双位点CTLA4突变分子L104EA29YIg(如图19中包括的)。具体地，将编码单位点CTLA4突变分子L104EIg的核酸分子用作产生双位点突变CTLA4分子L104EA29YIg的模板。

该编码CTLA4突变分子，如L104EA29YIg(于2000年6月19日保藏与美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Blvd.，Manassas，VA20110-2209，ATCC保藏号为PTA-2104)的双位点突变的核苷酸序列是通过使用L104EIg作为模板，重复上述诱变程序而产生的。该方法用于产生多种双位点突变核苷酸序列，如编码以下分子的核苷酸序列：CTLA4分子L104EA29YIg(如图19中所示序列中包括的)、L104EA29LIg(如图20中所示序列中包括的)、L104EA29TIg(如图21中所包括序列)，以及L104EA29WIg(如图22中所包括序列)。也产生了诸如编码L104EA29YS25KIg，L104EA29YS25NIg和L104EA29YS25RIg的三位点突变体。

该可溶性CTLA4分子自该核苷酸序列所表达，并用于下文的实施例3中描述的II期临床研究。

本领域技术人员将理解，对核苷酸序列进行复制，具体是通过PCR扩增，可以很容易地将碱基改变引入DNA链。然而，核苷酸改变并不一定翻译为氨基酸改变，因为一些密码子冗余性地编码同样的氨基酸。从原始或野生型序列的任何核苷酸改变，不论是否沉默型(即不引起所翻译的氨基酸的改变)，尽管没有在此详细描述，也包括于本发明的范围中。

实施例2

以下实施例提供用于识别以上描述的单和双位点突变CTLA4多肽的筛选方法，该突变CTLA4多肽由实施例1所述构建体表达，与非突变CTLA4分子相比，对B7分子显示较高的结合亲和力。

目前体内和体外研究表明，CTLA4Ig本身不足以完全阻断抗原特异性活化的T细胞的激发。用CTLA4Ig和CD80或CD86的特异单克隆抗体进行了体外研究，测量了T细胞增殖的抑制，表明抗CD80单克隆抗体不能增强CTLA4Ig的抑制。然而，抗CD86单克隆抗体确实增强CTLA4Ig的抑制，说明CTLA4Ig在阻断CD86相互作用上并不十分有效。这些数据支持早期Linsley等的发现(Immunity，(1994)，1：793-801)，说明对于CD80介导的细胞应答的抑制与CD86介导的应答相比需要大约低100倍的CTLA4Ig浓度。基于这些发现可以推测，可溶性CTLA4突变分子与野生型CTLA4相比，前者对CD86有更高亲和力，可以比CTLA4Ig更好地阻断抗原特异活化细胞的激发。

因此，使用一种新的筛选过程筛选以上实施例1描述的可溶性CTLA4突变分子，以便识别一些可改进与CD80和CD86的结合亲和力的CTLA4细胞外结构域中的突变。这种筛选技术提供直接鉴别能明显降低“解离”速度的突变体的有效方法，而不需要蛋白纯化或定量，因为解离速率是浓度非依赖性的(O′Shannessy et al.，(1993)Anal.Biochem.，212：457-468)。

COS细胞用各种小量制备的(miniprep)纯化质粒DNA转染并增殖数日。将三日的经调节的培养基施加于包被可溶性CD80Ig或CD86Ig的BIAcore生物传感芯片(Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden)。突变蛋白的特异性结合和解离经表面等离子体共振检测(O’Shannessy，D.J.，et al.，1997 Anal.Biochem.212：457-468)。所有实验在25℃，BIAcore或BIAcore 2000生物传感器上进行。使用标准N-乙基-N’-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺N-羟基琥珀酰亚胺偶联，将配体固定于研究级NCM5传感器芯片(Pharmacia)(Johnsson，B.，et al.(1991)Anal.Biochem.198：268-277；Khilko，S.N.，et al.(1993)J.Biol.Chem 268：5425-15434).

筛选方法

用突变CTLA4Ig瞬时转染24孔组织培养板内生长的COS细胞。三天后收集含分泌的可溶性突变CTLA4Ig的培养基。

使调节的COS细胞培养基流过用CD80Ig或CD86Ig衍生化的BIAcore生物传感器芯片(描述于Greene et al.，1996 J.Biol.Chem.271：26762-26771)，鉴定比野生型CTLA4Ig的解离速度低的突变分子。对相应于所选培养基样品进行测序，并制备更多DNA进行较大规模COS细胞瞬时转染，由此在培养基的蛋白A纯化后制备突变CTLA4Ig蛋白。

BIAcore分析条件和平衡结合数据分析如Green等在1996 J.Biol.Chem.271：26762-26771，及美国专利申请.09/579,927和60/214,065中的描述进行，在此引入作为参考。

BIAcore数据分析

传感图基线在分析前校准到零反应单位(RU)。由于溶液的容量(bolk)折射指数不同，样品通过模拟衍生的流式细胞(mock-derivatized flow cell)检测本底反应单位值(RU)。平衡解离常数(K_d)由R_eq对C的作图计算得出，其中R_eq为稳态反应减去模拟衍生的芯片上的反应；C为分析物的摩尔浓度。结合曲线的分析使用的是商业化非线性曲线拟和软件(Prism，GraphPAD软件)。

实验数据首先拟合到单配体结合单受体模型(1位点模型，即简单朗缪尔系统，A+B←→AB)，平衡结合常数(K_d＝[A]·[B]\[AB]))由方程R＝R_maxC/(K_d+C)计算得到。接下来，数据拟合到最简单的2位点配体结合模型(即，对于具有2个非相互作用的独立结合位点的受体，如方程R＝R_max1C\(K_d1+C)+R_max2C\(K_d2+C)的描述)。

这两种模型的匹配程度通过对比实验数据直观分析并通过平方和的F检验进行统计学分析。简单的1位点模型为最佳选择，除非2-位点模型的拟合明显更佳(p＜0.1)。

结合和解离分析使用BIA评估软件2.1(Pharmacia)进行分析。结合速度常数k_on通过两种计算方法来计算，假设同时有同源单-位点相互作用和平行2-位点相互作用。对于单-位点相互作用，k_on值通过方程R_t＝R_eq(1-exp^-ks(t-t0)计算，其中R_t是在给定时间t的反应；R_eq是稳态反应；t₀是注射起始时间；k_s＝dR/dt＝k_on Ck_off，其中C为分析物浓度，由单体结合位点的形式计算。对于两-位点相互作用，k_on值通过方程R_t＝R_eq1(1-exp^-ks1(t-t0)+R_eq2(1-exp^ks2(t-t0)计算。对于每个模型，k_on值由k_s相对C作图的计算的斜率(最大结合达约70％)确定。

根据1-位点(AB＝A+B)或2-位点(AiBj＝Ai+Bj)模型分析解离数据，由最佳拟合曲线得到速度常数(k_off)。除残余比机器本底大时(其中使用2-结合位点模型)，使用所述结合位点模型。受体被占用的一半时间(half-time)使用等式t_1/2＝0.693/k_off计算。

流式细胞术

鼠mAb L307.4(抗CD80)购买于Becton Dickinson(San Jose，Calif或nia)，IT2.2(抗B7-0[也称为CD86])，购买于Pharmingen(San Diego，Calif或nia)。免疫染色时，CD80阳性和/或CD86阳性CHO细胞从培养试管转移，其通过在含10mM EDTA的磷酸缓冲液(PBS)中保温进行。CHO细胞(1-10×10⁵)先和mAbs或免疫球蛋白融合蛋白在含10％胎牛血清(FBS)的DMEM中保温，接着洗涤细胞并和荧光素异硫氰酸酯偶联的山羊抗鼠或抗人免疫球蛋白第二步试剂(Tago，Burlingame，Calif或nia)一起保温。最后洗涤细胞并在FACScan(Bec到n Dickinson)上分析。

SDS-PAGE和大小排阻层析

SDS-PAGE在Tris/甘氨酸4-20％丙烯酰胺凝胶(Novex，San Diego，CA)上进行。分析凝胶经考马司亮蓝染色，使用数字扫描获得凝胶的影像。使用TSK-GEL G300 SW_XL柱(7.8×300mm，到sohaas，Montgomeryville，PA)通过大小排阻层析分析CTLA4Ig(25μg)和L104EA29YIg(25μg)，在含0.02％NAN₃，流速为1.0ml/分的磷酸盐缓冲的盐水中平衡所述的柱。

CTLA4XC120S和L104EA29YXC120S

单链CTLA4X_C120S如前描述(Linsley等，(1995)J.Biol.Chem.，270：15417-15424))制备。简单地说，用制瘤素M CTLA4(OMCTLA4)表达质粒作为模板，正向引物GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG(SEQ IDNO：4)被选择用于与载体中的序列配对；反向引物GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC(SEQ IDNO：5)相当于CTLA4细胞外结构域中最后7个氨基酸(即118-124位氨基酸)，并且包含限制性酶切位点和终止密码子(TGA)。反向引物规定C120S(120位的半胱氨酸被取代为丝氨酸)突变。具体地，以上给出的反向引物核苷酸序列GCA(34-36位核苷酸)被以下核苷酸序列之一代替：AGA，GGA，TGA，CGA，ACT，或GCT。本领域技术人员可以理解，核苷酸序列GCA是半胱氨酸密码子TGC的反向互补序列。同样，核苷酸序列AGA，GGA，TGA，CGA，ACT，或GCT是丝氨酸密码子的反向互补序列。聚合酶链反应产物经HindIII/XbaI酶消化并直接亚克隆入表达载体πLN(Bris到1-Myers Squibb Company，Prince到n，NJ)。L104EA29YX_C120S用同样的方法制备。每种构建体均经DNA测序验证。

高亲和性突变体的鉴定和生化特征

选择24种氨基酸用于诱变产生约2300的突变蛋白，通过表面等离子体共振(如以上描述的SPR)分析用于CD86Ig结合，表II总结了每个位点突变体的主要效应。CDR-1区(S25-R33)中一些氨基酸的随机突变并不改变配体结合。E31、R33和M97-Y102残基的诱变明显导致配体结合减少。残基S25，A29和T30，K93，L96，Y103，L104和G105的诱变导致蛋白产生缓慢“结合”和/或缓慢“解离”速度。这些结果证实了先前的发现，CDR-1(S25-R33)区中的残基和M97-Y102区中或附近的残基影响配体的结合(Peach et al.，(1994)J.Exp.Med.，180：2049-2058)。

S25，T30，K93，L96，Y103，和G105位的诱变导致可以鉴定自CD86Ig的“解离”速度缓慢的一些突变蛋白。然而，在这种情况下，缓慢“解离”速度被缓慢“结合”速度抵消，导致对CD86Ig的总体亲和力明显近似于野生型CTLA4Ig的突变蛋白。而且K93的诱变导致明显的聚集，其与观察到的动力学改变有关。

对L104进行随机诱变，然后用COS细胞转染，并通过SPR筛选固定的CD86Ig上的培养基样品，得到包含比野生型CTLA4Ig的“解离”速度慢约2倍的突变蛋白的六种培养基样品。对这些突变体的相应cDNA测序后，发现每一种都编码亮氨酸至谷氨酸的突变(L104E)。显然，亮氨酸104至天冬氨酸(L104D)的取代并不影响CD86Ig的结合。

然后在表II列出的每个位点重复诱变，这次使用L104E替代野生型CTLA4Ig作为PCR模板。再次使用固定的CD86Ig，经SPR分析鉴定来自29位丙氨酸诱变的、较野生型CTLA4Ig的“解离”速度慢约4倍的六种培养基。最慢的两种为酪氨酸取代物(L104EA29Y)，两种为亮氨酸取代物(L104EA29L)，一种为色氨酸取代物(L104EA29W)，并且一种为苏氨酸取代物(L104EA29T)。显然，在野生型CTLA4Ig中，当29位丙氨酸被随机诱变，不能鉴定到“解离”速度缓慢的突变体。

纯化L104E和L104EA29YIg的相对分子量和聚集状态通过SDS-PAGE和大小排阻层析估测。L104EA29YIg(～1μg；第3道)和L104EIg(～1μg；第2道)与CTLA4Ig(～1μg；第1道)在还原(～50kDa；+βME；加2-巯基乙醇)和非还原(～100kDa；-βME)情况下有明显相同的电泳迁移率(图25A)。大小排阻层析证实L104EA29YIg(图25C)和二聚体CTLA4Ig(图25B)有明显相同的迁移率。图25B中，主峰代表蛋白二聚体，而较快的洗脱小峰代表更高分子量的聚集体。约5.0％的CTLA4Ig作为高分子量聚集体出现，但没有L104EA29YIg或L104EIg聚集的证据。因此，L104EIg和L104EA29YIg与CD86Ig更强的结合并不是归因于由诱变诱导的聚集。

平衡和动力学结合分析

使用表面等离子体共振(SPR)对蛋白A纯化的CTLA4Ig、L104EIg和L104EA29YIg进行平衡和动力学结合分析。下表1是分析结果。根据在一定浓度范围(5.0-200nM)产生的结合曲线计算观察到的平衡解离常数(K_d；表I)。L104EA29YIg比L104EIg或CTLA4Ig与CD86Ig有更强的结合力。L104EA29YIg(3.21nM)的K_d值比L104EIg(6.06nM)或CTLA4Ig(13.9nM)的K_d值更低，说明L104EA29YIg与CD86Ig的结合亲和力较高。L104EA29YIg的K_d值(3.66nM)比L104EIg的(4.47nM)或CTLA4Ig的(6.51nM)的K_d值更低，说明L104EA29YIg对CD80Ig的亲和力较高。

动力学结合分析揭示，CTLA4Ig，L104EIg，和L104EA29YIg与CD80的“结合”速度相似，如CD86Ig的“结合”速率一样(表I)。然而，这些分子的“解离”速度并不一致(表I)。与CTLA4Ig相比，L104EA29YIg从CD80Ig“解离”的速度慢约2倍，从CD86Ig“解离”的速度慢约4倍。L104E的“解离”速度在L104EA29YIg和CTLA4Ig之间。由于这些突变的引入并不明显影响“结合”速度，L104EA29YIg与CD80Ig和CD86Ig亲和力的升高可能主要是由于“解离”速度的降低。

为了确定L104EA29YIg与CD86Ig和CD80Ig亲和力的升高是否是由于突变影响了每个单体结合成二聚体的方式，或每个单体内是否引入了导致亲和力增强的结构变化，CTLA4和L104EA29Y细胞外结构域的单链构建体在如上述将120位半胱氨酸诱变至丝氨酸后得以制备，如Linsley等，(1995)J.Biol.Chem.，270：15417-15424(84)所述。在使用SPR分析配体结合特性前，通过凝胶渗透层析显示了纯化的蛋白CTLA4X_C120S和L104EA29YX_C120S为单体(Linsley等，(1995)，上文)。结果显示两种单体蛋白与CD86Ig的结合亲和力比它们各自的二聚体具体低约35-80倍(表I)。结果支持先前公开的数据，确定CTLA4二聚化是高亲和力配体结合所需的(Greene et al.，(1996)J.Biol.Chem.，271：26762-26771)。

L104EA29YX_C120S与CD80Ig和CD86Ig两者的结合亲和力比CTLA4X_C120S与所述两者的亲和力高约2倍。亲和力的增加是由于自两种配体解离速度慢约3倍。因此，L104EA29Y的配体亲和力增高最可能是因为每个单链而非二聚体分子内引入使亲和力升高的结构改变。

对使亲和力增加的突变的位置和结构的分析

CTLA4的细胞外IgV样结构域的溶液结构已于最近通过NMR光谱检测确定(Metzler et al.，(1997)Nature Struct.Biol.，4：527-531)。这容许104位亮氨酸和29位丙氨酸在三维折叠的精确定位(图26左图和右图)。104位亮氨酸位于高保守的MYPPPY氨基酸序列附近。29位丙氨酸位于CDR-1(S25-R33)区C末端附近，与MYPPPY区的空间位置邻近。两个区域基部(base)的残基有明显的相互作用，L104和A29间没有直接的相互作用，但它们都包含蛋白中连续疏水核心的部分。两种亲和力增高的突变体的结构影响通过建立模型进行分析。A29Y突变可以容易地容纳于CDR-1(S25-R33)区和MYPPPY区之间的缝隙内，起到稳定MYPPPY区构象的作用。野生型CTLA4中，L104构成广泛的疏水相互作用，其中L96和V94在MYPPPY区附近。很可能有两种原因导致谷氨酸突变不采用L104突变的构象。第一，在不明显干扰CDR-1(S25-R33)区的情况下，结构内没有充足的空间容纳更长的谷氨酸侧链。第二，在疏水区埋藏谷氨酸侧链的负电荷的能量消耗将是很大的。模型研究预测，谷氨酸侧链翻转至表面时，其电荷可通过溶解而被稳定。G105可以容易地容纳这种构象改变，对这些区域中其它残基的扭曲最小。

高亲和力突变体与表达CD80或CD86的CHO细胞的结合

CTLA4Ig和突变分子结合稳定转染CD80+和CD86+CHO细胞的FACS分析(图27)使用在此描述的方法进行。CD80阳性和CD86阳性CHO细胞使用浓度逐渐升高的CTLA4Ig，L104EA29YIg，或L104EIg保温，并洗涤。使用荧光素异硫氰酸酯偶联的山羊抗人免疫球蛋白检测结合的免疫球蛋白融合蛋白。

如图27所示，CD80阳性和CD86阳性CHO细胞(1.5×10⁵)使用规定浓度的CTLA4Ig(实心方块)，L104EA29YIg(圆圈)，或L104EIg(三角)于23C保温2小时，洗涤细胞，并用荧光素异硫氰酸酯偶联的山羊抗人免疫球蛋白抗体保温。在FACScan上分析(单测定)在总共5,000个存活细胞上的结合，使用PC-LYSYS从数据柱状图测定平均荧光强度(MFI)检测。数据用对仅用第二步试剂保温的细胞(MFI＝7)所测定的本底荧光强度进行校正。对照L6mAb(80μg/ml)的MFI＜30。这些结果代表四个独立的实验。

L104EA29YIg，L104EIg，和CTLA4Ig与人CD80转染的CHO细胞的结合几乎相同(图27A)。L104EA29YIg和L104EIg与用人CD86稳定转染的CHO细胞的结合力比CTLA4Ig的更强(图27B)。

功能测定

通过免疫磁性阴性选择分离人类CD4阳性T细胞(Linsley et al.，(1992)J.Exp.Med.176：1595-1604)。在滴定浓度的抑制剂存在下，用佛波醇豆蔻酸乙酸酯(PMA)加CD80阳性或CD86阳性CHO细胞刺激分离的CD4阳性T细胞。在有或无辐射的CHO细胞刺激物、1nM PMA存在的条件下，培养CD4阳性T细胞(8-10×10⁴/孔)。在72小时的培养的最后7小时，通过添加1μCi/孔[3H]胸苷检测增生反应。用L104EA29YIg和CTLA4Ig进行PMA加CD80阳性或CD86阳性CHO，刺激的T细胞的抑制。结果在图28中给出。L104EA29YIg与CTLA4Ig相比对CD80阳性PMA处理的CHO细胞增殖有更强的抑制(图28A)。L104EA29YIg与CTLA4Ig相比对CD86阳性PMA处理的CHO细胞增殖也有更强的抑制(图28B)。因此，L104EA29YIg是CD80-和CD86-介导的T细胞共刺激的更有效的抑制剂。

图29说明了L104EA29YIg和CTLA4Ig对按上述方法制备的人T细胞的抑制，所述T细胞用表达CD80和CD86的称为PM的人类B淋巴母细胞系(LCL)进一步进行同种异体刺激(T细胞3.0×10⁴/孔，PM 8.0×10³/孔)。初次同种异体刺激6天后，然后用³H胸苷脉冲细胞7小时，再测定放射性标记的掺入。

次级同种异体刺激依以下方法进行。从淋巴细胞分离培养基(LSM)(ICN，Aur或a，OH)收获经7天初次同种异体刺激的T细胞并静置24小时。在滴定量的CTLA4Ig或L104EA29YIg存在下，依上述比例添加PM，对T细胞再刺激(第二次)。刺激3天后，按上述方法用放射标记脉冲细胞并收集细胞。图29A给出L104EA29YIg对初次同种异体刺激T细胞的作用。图29B给出L104EA29YIg对次级同种异体刺激T细胞的作用。L104EA29YIg能比CTLA4Ig更好地抑制初次和次级T细胞增殖。

为了测定细胞因子产量(图12)，建立双份次级同种异体刺激平板。3天后，在生产商推荐的条件下使用ELISA试剂盒(Biosource，Camarillo，CA)测定培养基。发现在第二次同种异体刺激后，L104EA29YIg能比CTLA4Ig更有效地阻断T细胞IL-2，IL-4，和γ-IFN(gamma-IFN)细胞因子的产生(图30A-C)。

图31给出L104EA29YIg和CTLA4Ig对猴混合淋巴细胞应答(MLR)的影响。通过淋巴细胞分离培养基(LSM)纯化来自2只猴的外周血单核细胞(PBMC’S；每只猴3.5×10⁴cells/孔)，并与2μg/ml植物凝集素(PHA)混合。刺激细胞3天后，在收获前用放射性标记脉冲16小时。L104EA29YIg能比CTLA4Ig更好地抑制猴T细胞增殖。

表I：

平衡和表观动力学常数在下表给出(值为平均值±标准差，来源于三个不同的实验)

固定的蛋白	分析物	kon(×105)M1S-1	koff(×10-3)S-1	KdnM
					CD80Ig	CTLA4Ig	3.44±0.29	2.21±0.18	6.51±1.08
CD80Ig	L104EIg	3.02±0.05	1.35±0.08	4.47±0.36
					CD80Ig	L104EA29YIg	2.96±0.20	1.08±0.05	3.66±0.41
CD80Ig	CTLA4XC120S	12.0±1.0	230±10	195±25
					CD80Ig	L104EA29YXC120S	8.3±0.26	71±5	85.0±2.5
CD86Ig	CTLA4Ig	5.95±0.57	8.16±0.52	13.9±2.27
					CD86Ig	L104EIg	7.03±0.22	4.26±0.11	6.06±0.05

固定的蛋白	分析物	kon(×105)M1S-1	koff(×10-3)S-1	KdnM
					CD86Ig	L104EA29YIg	6.42±0.40	2.06±0.03	3.21±0.23
CD86Ig	CTLA4XC120S	16.5±0.5	840±55	511±17
					CD86Ig	L104EA29YXC120S	11.4±1.6	300±10	267±29

表II：

在列出位点的CTLA4Ig诱变对CD86Ig结合的影响由上文所述SPR测定，主要的影响以“+”标记表示。

诱变位点	诱变的影响
					无影响	缓慢“结合”速度/缓慢的“解离”速度	减少的配体结合
S25		+
				P26	+
G27	+
				K28	+
A29		+
				T30		+
E31			+
				R33			+
K93		+
				L96		+
M97			+
				Y98			+
P99			+
				P100			+
P101			+
				Y102			+

诱变位点	诱变的影响
					无影响	缓慢“结合”速度/缓慢的“解离”速度	减少的配体结合
Y103		+
				L104		+
G105		+
				I106	+
G107	+
				Q111	+
Y113	+
				I115	+

实施例3

以下提供了对给药可溶性CTLA4突变分子L104EA29YIg(也称作L104EA29YIG或LEA)或CTLA4Ig的人类患者的II期临床研究的描述，所述给药用于减轻至少一种与类风湿性关节炎相关的症状，包括减轻：关节肿胀、关节触痛、炎症、晨僵和疼痛。这里使用的CTLA4Ig分子以+1位的甲硫氨酸(或-1位的丙氨酸)开始，以+357位的赖氨酸终止，如图24所示。编码一种实施方案中的CTLA4Ig分子的DNA被保藏位ATCC 68629。这里使用的L104EA29YIg分子以+1位的甲硫氨酸(或-1位的丙氨酸)开始，以+357位的赖氨酸终止，如图19所示。编码L104EA29YIg分子的一种实施方案的DNA已经保藏为ATCC PTA 2104。

此外，下面提供了将L104EA29YIg或CTLA4Ig给药患者，来缓解至少一种与类风湿关节炎相关的生物替代指标的说明，包括减低红细胞沉降率、以及C反应蛋白和/或IL2受体的血清水平。

患者队列

总共214名患者，包括54名男性和160名女性参与了研究(图1A，1B)。出于基线的患者的平均疾病持续时间为3.4(±2.0)年，并且使用至少一种疾病改变性抗风湿药物(DARD)治疗失败。允许使用稳定的非类固醇抗炎药(NSAID)或类固醇(≤10mg/日)，禁止同时使用DMARD。患者随机分为每个治疗组25-32名患者。32名患者接受安慰剂，92名接受L104EA29YIg，90名接受CTLA4Ig。遵照用药方案指导并且在57天前没有停药的患者中共接受4次静脉输注，1，15，29，和57日每日一次。在1，15，29，43，57，71，和85日对所有患者进行评价。给药剂量包括0.5，2.0，或10.0mg/kgL104EA29YIg(在图1A-1E中分别称作LEA.5，LEA2和LEA10)或CTLA4Ig(在1A-1E中称作CTLA.5，CTLA2和CTLA10)。

通过回答列出可能的副作用的问卷，监测所有受试者的围输注不良反应和总体安全性。对患者询问可能在输注后24小时内发生的不良事件。此外，鼓励患者自己主动汇报他们所经历的不良事件。医生们常规监测患者的实验室样品的血液化学和血液学异常，例如，评价炎症反应介导剂，如细胞因子(TNF，IL-6)、胰蛋白酶和补体的水平。主要终点为在第85天满足ACR 20标准的受试者比例。

试验材料的保存

用分别含200mg/管CTLA4Ig或100mg/管L104EA29YIg的一次性玻璃管提供CTLA4Ig和L104EA29YIg。输送前，用注射用无菌水(SWFI)将CTLA4Ig和L104EA29YIg稀释至浓度为25mg/ml。

给药方案

所有输注都通过静脉内给药，持续1小时(图1-17)。所有受试者至少接受一次研究药物输注。

组1：32名患者，CTLA4Ig或L104EA29YIg的匹配的安慰剂。

组2：26名患者；剂量0.5mg/kg的CTLA4Ig。

组3：32名患者；剂量2.0mg/kg的CTLA4Ig。

组4：32名患者；剂量10.0mg/kg的CTLA4Ig。

组5：32名患者；剂量0.5mg/kg的L104EA29YIg。

组6：29名患者；剂量2.0mg/kg的L104EA29YIg。

组7：31名患者；剂量10.0mg/kg的L104EA29YIg。

临床检测

在接受任何输注之前评价疾病活动度的基线症状。这些基线评价包括：关节肿胀、关节触痛、炎症、晨僵、由患者和医生评价的疾病活动度，以及由健康问卷评估(HAQ)评价的残疾(如图1C报道的身体功能评分)、以及疼痛(图1A-1D)。此外，基线评价包括红细胞沉降速度(ESR)、以及C反应蛋白(CRP)的血浆水平，以及可溶性IL-2受体(IL-2r)(图1C和1D)。

临床反应研究是基于美国风湿病学学院(ACR)建立的标准。如果20％的患者的触痛和关节肿胀改善，20％的患者中所检测的其他症状中的3/5改善，所述症状如患者和医生评价的总体疾病改变、疼痛、残疾和急性期反应物，则受试者满足ACR20标准(Felson，D.T.，et al.，1993Arthritis和Rheumatism36：729-740；Felson，D.T.，et al.，1995 Arthritis和Rheumatism 38：1-9)。相似的，如果50％或70％的患者的触痛和关节肿胀改善，50％或70％的患者所检测的其他症状中的3/5改善，所述症状如患者和医生评价的总体疾病改变、疼痛、残疾和急性期反应物如CRP或ESR，则受试者满足ACR50或ACR70标准。

生物指标

也评估了疾病活性的潜在生物指标(类风湿因子，CRP，ESR，可溶性IL-2R，可溶性ICAM-1，可溶性E-选择蛋白，和MMP-3)。用已经证明的酶免疫测定(EIA)方法测定IL-2sRα，sICAM-1，sE-选择蛋白和MMP-3的血清浓度。如果必要，在输注前2小时和后2小时评估TNFα和IL-6。

用从R&D Systems，Inc.(Minneapolis，MN)买到的比色EIA试剂盒测定IL-2sRα，sICAM-1，和sE-选择蛋白。定量的下限和上限分别为312-20,000pg/mL，40-907ng/mL和10-206ng/mL。测定间变异系数分别为4.48-8.4％，3.8-5.0％和5.5-9.0％。根据制造商的试剂盒，正常血清浓度分别为676-2,132pg/mL。

用从Amersham Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)购买的比色EIA试剂盒测定MMP-3。定量的下限和上限为30-7,680ng/mL。测定间的变异系数为6.3-10.6％。根据制造商的试剂盒，正常血清浓度为28-99ng/mL。

用从R&D Systems，Inc.(Minneapolis，MN)购买的化学发光EIA试剂盒测定IL-6和TNFα。定量的下限和上限分别为0.3-3,000pg/mL和0.7-7,000pg/mL。测定间的变异系数分别为3.1-5.7％和6.4-20.7％。根据制造商的试剂盒，正常血清值为＜0.3-12pg/mL和＜0.7-7.5pg/mL。

抗体检测

在第1天，以及大约15，29，57，85和169天给药前评估药物特异性抗体而获得样品。由于针对分子的免疫球蛋白(Ig)部分的预存在的高滴度，也评估了抗CTLA4Ig和L104EA29YIG而无Ig恒定区的特异性抗体的形成。

用磷酸缓冲液(PBS)中分别为2，4，2，或1μg/ml的CTLA4Ig、没有Ig恒定区的CTLA4Ig、没有Ig恒定区的L104EA29YIG，或L104EA29YIG包被96孔Immulon II ELISA板(Dynex，Chantilly，Virginia)，并且在2-8℃保温过夜，用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤板，并且用含有1％牛血清蛋白(BSA)的PBS在37℃孵育1小时。然后洗涤板，将试验血清或质量对照(QC)血清的系列稀释液加入适当的孔中，在37℃孵育2小时。在含有0.25％BSA和0.05％Tween 20的PBS中将血清稀释3倍，开始于1∶10稀释度。洗涤板，加入碱性磷酸酶偶联的山羊抗人kappa和lambda抗体混合物(Southern Biotechnology Associates，Inc.，Birmingham，Alabama)。在37℃孵育1小时后，洗涤板，加入含有1mg/ml对硝基苯磷酸的二乙醇胺缓冲液。25℃30分钟后，用3N NaOH终止反应，记录吸光度(双波长：405nm和550nm)。结果表达为终点滴度(EPT)，其定义为导致吸光度读数大于等于平均板本底吸光度的5倍的最高稀释度的倒数。板本底测量为无血清时记录的吸光度测量值。如果这些值为至少两次连续稀释(9倍)或相对于预定EPT值更大，那么就认为它们是对于血清转换是阳性的。从经免疫的猴中产生CTLA4Ig-或L104EA29YIG-特异性抗体阳性的血清QC样品。在每个分析过程中测定适当QC样品的等分物。仅仅当QC样品处于测定接受标准内时才接受分析过程。

结果

CTLA4Ig和L104EA29YIg一般在所有剂量水平都是耐受良好的。除头痛以外，围输注的不良事件在所有剂量组中一般是相似的。在第85天患者的头痛反应在分别以0.5，2.0，和10.0mg/kg的CTLA4Ig治疗的患者中剂量依赖性地增加23％，44％，和53％，在分别以0.5，2.0，和10.0mg/kg的L104EA29YIg治疗的患者中剂量依赖性地增加34％，45％，和61％。相反，给予安慰剂的患者中有31％经历了头痛。

由于关节炎发作(flare)和其他不良反应导致的不能继续进行临床研究的患者的百分比总结于图2。安慰剂组的患者由于关节炎发作而停止治疗的患者百分比更高。CTLA4Ig治疗的患者中随剂量增加停止治疗越少。用L104EA29YIg治疗的患者中很少停止治疗。这些结果表明对CTLA4Ig具有良好的反向剂量依赖性反应和对L104EA29YIg具有更强的治疗反应。

用CTLA4Ig、L104EA29YIg或安慰剂治疗的患者在第85天的ACR-20，-50，和-70反应总结于图3A。同样，图3B和C描述了具有95％置信区间的ACR-20反应。这些反应看起来是剂量依赖性的，在10mg/kg患者体重的剂量具有显著的反应。

与对CTLA4Ig、L104EA29YIg，或安慰剂治疗无反应的患者相比，关节肿胀和触痛减轻的患者的百分比显示于图4A和B。治疗反应似乎是剂量依赖性的。在两种产品的2和10mg/kg组中，更大比例的患者表现出了20，50，70，以及甚至100％的改善。

给予CTLA4Ig，L104EA29YIg，或安慰剂后疼痛减轻，由患者和医生平均得分单位评价的疾病活动度减少的患者的百分比显示于图5A，B，C，和D。由Likert标准监测的治疗反应似乎是剂量依赖性的，在第85天时，与安慰剂相比，有利于活性药物治疗组。该标准是已经证明的采用对症状分级的形容词的词语评分标准(The American College of Rheuma到logyPreliminary C或e Set of Disease Activity Measures for Rheuma到id ArthritisClinical Trials：Arthritis和Rheumatism，June 1993，36(6)：729-740)。

由CTLA4Ig、L104EA29YIg或安慰剂治疗造成的疾病活动度改变的患者和医生评估自基线改变了至少2个单位显示于图6A和6B。这些反应似乎是剂量依赖性的，对于剂量更高的活性药物，改进更显著。

用CTLA4Ig，L104EA29YIg或安慰剂治疗的患者的C反应蛋白(CRP)水平减少的百分比显示于图7A和B。这些反应似乎是剂量依赖性的，在2或10mg/kg活性药物治疗组中明显减轻。此外，图7B表示在有95％置信区间与安慰剂相比，该差异是显著的。图7C表示第85天时自基线的血清水平改变。

用CTLA4Ig，L104EA29YIg或安慰剂治疗的患者的血清可溶性IL-2受体的量显示于图8。可溶性IL-2受体的减少似乎是剂量依赖性的。

用CTLA4Ig，L104EA29YIg或安慰剂治疗的患者的血清可溶性ICAM-1和可溶性E选择蛋白的量显示于图33。血清可溶性ICAM-1和可溶性E选择蛋白的减少似乎是剂量依赖性的。

用CTLA4Ig或安慰剂治疗的患者不同时间的关节触痛计数的中值和平均值显示于图9A和9B。在2或10mg/kg治疗组中，自基线的改变(例如关节肿胀的减少)显示比在安慰剂或0.5mg/kg组中更多(important)。

用CTLA4Ig或安慰剂治疗的患者中不同时间的关节肿胀计数的中值和平均值显示于图10A和B。在2或10mg/kg治疗组中，自基线的改变(例如关节肿胀的减轻)似乎比在安慰剂或0.5mg/kg组中更多。

用CTLA4Ig或安慰剂治疗的患者中不同时间的平均疼痛评分。在2或10mg/kg治疗组中显示于图11，自基线的改变(例如疼痛减轻)似乎比在安慰剂或0.5mg/kg组中更多。

用CTLA4Ig或安慰剂治疗的患者中不同时时间的患者或医生对平均疾病活动度的评分显示于图12A和12B。在2或10mg/kg治疗组中，自基线的改变(例如疾病活动性减低)似乎比在安慰剂或0.5mg/kg组中更多。

L104EA29YIg(在图中表示为LEA)或安慰剂治疗的患者中不同时间的关节触痛计数的中值和平均值显示于图13A和13B。自基线的改变(例如关节触痛减轻)表现为剂量依赖性的。

L104EA29YIg(在图中称作LEA)或安慰剂治疗的患者中不同时间的关节肿胀计数的中值和平均值显示于图14A和14B。在2或10mg/kg治疗组中，自基线的改变(例如关节肿胀减轻)似乎比安慰剂或0.5mg/kg组更多。

L104EA29YIg(在图中称作LEA)或安慰剂治疗的患者中不同时间的平均疼痛评分显示于图15。自基线的改变(例如疼痛减轻)显示为剂量依赖性的。

L104EA29YIg(在图中称作LEA)或安慰剂治疗的患者中不同时间的患者或医生评估的平均疾病活动度评分显示于图16A和16B。自基线的改变(例如疾病活动度减轻)似乎是剂量依赖性的。

用CTLA4Ig，L104EA29YIg或安慰剂治疗的患者在第85天由HAQ评价的身体残疾改进百分比显示于图17(健康评估问卷(HAQ)；Fries，J.F.，etal.，1982 J.of Rheuma到logy 9：789-793)。此参数具有明显的剂量依赖性改进。

可溶性IL-2r和C反应蛋白自基线的改变在两个治疗组中都是剂量依赖性的。治疗后，分别以0.5，2.0，和10.0mg/kg的CTLA4Ig治疗的患者中可溶性IL-2r的水平为-2％，-10％，和-22％，分别以0.5，2.0，和10.0mg/kg的L104EA29YIg治疗的患者中可溶性IL-2r的水平分别为-4％，-18％，和-32％而安慰剂组的为3％。分别以0.5，2.0，和10.0mg/kg的CTLA4Ig治疗的患者中C反应蛋白的水平为+12％，-15％，和-32％，分别以0.5，2.0，和10.0mg/kg的L104EA29YIg治疗的患者中C反应蛋白的水平为+47％，-33％，和-47％，而安慰剂组为+20％(图7A)。

在常规血液学检验、化学实验室检验、身体检查、和生命体征评估中没有临床上显著的发现，除了在高剂量的两种药物组中发现了IgA和IgG的轻微抑制。

实施例4

以下实施例描述人类患者的II期临床研究，其中给药L104EA29YIg来减轻或预防结构破坏，包括用已经证明的放射照片标准评价的骨或关节侵蚀。减轻或预防结构破坏的改进与临床参数测量的临床改进相平行。

在用CTLA4Ig或L104EA29YIg治疗之前，在一些人类患者中监测骨结构状态。长期给予这些患者0.5到20mg/kg CTLA4Ig或L104EA29YIg，每2-12周一次(单独用或与其他试剂联合用药)，以保持他们随时间的治疗改进。以预定间隔对患者的手和脚进行射线拍照：按照FDA的推荐，6个月时进行一次，然后每年一次。在6和12月后长期监测这些患者，以判断用CTLA4Ig或L104EA29YIg治疗是否减少骨破坏的进展，然后每年监测。根据本领域的标准实践，通过放射照像方法，包括X线和/或磁共振成像(MRI)监测患者(Larsen，A.K.和M.Eek 1977 Acta.Radiol.Diag.18：481-491；Sharp，J.T.，et al.，1985 Arthritis和Rheumatism28：1326-1335)。评价反射照片的数据，观察对结构破坏的预防，包括减慢骨侵蚀和软骨损坏的进展(伴有关节腔变窄)和/或新的侵蚀的预防。

实施例5

评价在给甲氨蝶呤同时，静脉给予患活动性类风湿性关节炎的受试者两个不同的CTLA4剂量的安全性和临床效果的研究

随着用更多强有力的治疗方法来获得更好的效果和更高的成功率这一愿望的日益增加，风湿性关节炎的治疗正在快速变化着。通过提高治疗中的主要和完全临床治疗响应率，以及在可接受的安全性条件下维持这种益处，在这种更有力的途径下，终极目标是改进受试者的病情。

甲氨蝶呤保持着风湿性关节炎(RA)的核心地位。与过去常用的治疗RA的经典方法DMARD(例如，金、羟氯喹、柳氮磺吡啶)相比，它是另一个显示早期作用、更好的效果和耐受性的制剂。临床效果在开始治疗后的3个星期就能看到，通常到6个月时可以达到最大的改进效果。然而，甲氨蝶呤有许多限制，例如，尽管对它的耐受性提高了，但是有效性和肝脏毒性之间的窗口期是十分狭窄的，用甲氨蝶呤治疗，受试者需要小心监测，不可接受的毒性理由经常是终止治疗的原因。

甲氨蝶呤也没有显示出有效地控制疾病进展和关节破坏。对一些受试者来说，医生感受到需要增加另一种DMARD以增加疗效，尽管有增加毒性的风险。

作为另一种手段，甲氨蝶呤和共刺激阻断剂(例如CD80和CD86的阻断剂如CTLA4Ig)的共治疗可能可以增加疗效，所述阻断剂靶向作用于细胞因子感染级联上游的自身免疫机理。

如上述实施例3，对于剂量2和10mg/kg的CTLA4Ig有意义的临床响应和疾病活动标志物的减少伴随好的耐受图谱。也肯定了在上述实施例3中使用的组合物CTLA4Ig不诱导任何副作用。结果决定在IIB期继续进行CTLA4Ig对风湿性关节炎的临床开发。

下面提供了给予病人可溶性CTLA4Ig分子和甲氨蝶呤的II B期临床研究的描述，以及6个月后的研究结果。

实施例描述了12个月的研究，其中在所有受试者完成6个月的治疗或终止治疗后评估初步(primary疗效。在整个研究期间，也评价疗效、安全性和疾病进展。

研究采用随机、双盲、安慰剂对照的、平行剂量设计。研究设计为评价2或10mg/kg的两个剂量的CTLA4Ig的安全性、临床活动性、免疫原性和药代动力学。活动性RA和接受甲氨蝶呤的共大约330个受试者被随机分配到3个剂量组中的一个：2mg/kg体重CTLA4Ig(N＝110)，10mg/kg体重(N＝110)以及安慰剂对照组(N＝110)。每月给药一次，持续12个月。所有组连续每周一次给甲氨蝶呤(10-30mg，每周一次)(图57-62)。

第15天也给CTLA4Ig或者安慰剂。每个剂量静脉滴注约30分钟。6个月后第一(primary)疗效指标(endpoint)是ACR 20响应率。

在另一个6个月期间，不允许改变受试者的类固醇，糖皮质激素或者NSAID剂量。在第一个6个月期间，也不允许增加甲氨蝶呤的剂量，只有当感觉产生毒性时允许减少甲氨蝶呤剂量。用甲氨蝶呤治疗受试者至少6个月，在首次使用CTLA4Ig或安慰剂治疗前，甲氨蝶呤剂量保持不变28天。不允许除甲氨蝶呤外的DMARD。低剂量恒量(每天10mg或更少)使用类固醇和/或使用恒量非胆固醇抗炎药物((NSAID)，包括乙酰水杨酸(ASA)是允许的。除了在关节评价前12小时，允许受试者使用不包含ASA或NSAID的麻醉镇痛剂，所述受试者的疼痛不能适宜地被基线和研究药物所控制。只有因为副反应事件如胃肠毒性，才允许减少NSAID的剂量。

受试产品、剂量、给药的方式和治疗持续时间

第一个月每2周输注一次2mg/kg或10mg/kg的CTLA4Ig，随后每月给药一次，持续12个月。

所有受试者在随机分组前至少6个月每周接受甲氨蝶呤(10-30mg)，在试验开始头6个月，维持入组(entry)剂量，在试验头6个月只能因为毒性原因减少剂量。

评价标准

本研究第一阶段的第一指标(endpoint)是第180天(6个月)时符合美国关节炎协会对20％(ACR 20)修订的标准的受试者比例。ACR 20修订的定义是与基线相比压痛和肿胀关节数有20％的改进，以及由下列5个核心测定(set)指标中的3个有自基线的20％的改进：受试者疼痛整体评估、受试者疾病活动整体评估、医生的疾病活动整体评估、受试者身体功能和急性反应物值(C反应蛋白(CRP))评估。相似地评价50％改进(ACR 50)和70％改进(ACR70)。受试者由于缺少疗效(如关节炎加重)而中止研究，认为自中止时间起受试是ACR非响应者。对其他原因而退出的所有受试者来说，在中止时刻他们ACR响应结果被提呈。

统计学方法

2个剂量的CTLA4Ig(2mg/kg和10mg/kg)与安慰剂对照组相比。所有受试者维持入组时的稳定甲氨蝶呤剂量。首先分析比较10mg/kg CTLA4Ig与安慰剂组。样本量是基于5％(双尾)显著性。根据公开的研究，6个月时安慰剂加甲氨蝶呤剂对照的ACR 20响应率是大约25％。每个治疗方案(arm)107个受试者的样本(以约15％的出组率调整)被测定产生94％的权(power)来在5％水平(双尾)检测25％的差异。相似地，所述样本被测定为分别产生95％和90％的权，以检测ACR 50和ACR 70中20％和14％的差异。就ACR 20而言，CTLA4Ig 10mg/kg与安慰剂组的比较的有统计学显著性，则比较CTLA4Ig 2mg/kg和安慰剂，第二个检测应该有88％的权。这种根据卡方检验的连续排除性方法也被用于检测ACR 50和ACR 70响应率的差异。

所有的有效性分析是根据包括可得自接受至少一个剂量的研究药剂的所有受试者的所有评估的数据组。

也报道了针对ACR的个别因素的自基线的改变。对于中止试验的受试者，也对他们进行最后的观察也被提交(carry porward)。

结果  人口统计学和基线特征

表III

受试者组成和人口统计学

	甲氨蝶呤+CTLA4Ig10mg/kg	甲氨蝶呤+CTLA4Ig2mg/kg	甲氨蝶呤+安慰剂
				入组的/随机化的	115	105	119
完成的	99(86.1％)	82(78.1％)	78(65.5％)
				中止的	16(13.9％)	23(21.9％)	41(34.5％)
-副反应	2(1.7％)	7(6.7％)	7(5.9％)
				-缺乏有效性	12(10.4％)	13(12.4％)	29(24.4％)
-其他	2(1.7％)	3(2.9％)	5(4.2％)
				年龄(年)平均(范围)	55.8(17-83)	54.4(23-80)	54.7(23-80)
体重(kg)-平均(范围)	77.8(40.1-144)	78.7(48.4-186.8)	79.9(44-140)
				性别	75％女性	63％女性	66％女性
种族	87％白人	87％白人	87％白人
				疾病持续期(年)平均±SD	9.7±9.8	9.7±8.1	8.9±8.3

在治疗组中，人口统计和基线临床特征是相似的。60-75％的受试者是女性，87％是白人。对应于10、2mg/kg及对照组，入组时疾病的平均持续时期是9.7±9.8、9.7±8.1、8.9±8.3年。平均体重在77.8和79.9kg之间，范围是40.1到186.8kg，都是非常相似的(表III)。

6个月后，对照组中中止试验(35.5％)的受试者要比活性治疗组中的多，10mg/kg和2mg/kg治疗组分别是13.9％和21.9％。主要原因是缺乏有效性：在对照组中是有24.3％中止。在2mg/kg和10mg/kg治疗组中分别是有12.4％和10.4％中止。由于副反应事件中止的比率在10mg/kg组中是较低的1.7％，而在2mg/kg和对照组中分别是6.7％和5.9％。

在第一个3-4个月期间，相比活性治疗组，对照组的中止出现的速率更快。120天后，整个初期治疗期期间(6个月)，所有的治疗组的中止稳定。

表IV

基线临床特征

	甲氨蝶呤+CTLA4Ig10mg/kg(n＝115)	甲氨蝶呤+CTLA4Ig2mg/kg(n＝105)	甲氨蝶呤+安慰剂(n＝119)
				压痛关节(平均±SD)	30.8±12.2	28.2±12.0	29.2±13.0
肿胀关节(平均±SD)	21.3±8.4	20.2±8.9	21.8±8.8
				疼痛(VAS 100mm)(平均±SD)	62.1±21.4	64.5±22.3	65.2±22.1
身体功能(0到3范围的MHAQ得分)(平均±SD)	1.0±0.5	1.0±0.5	1.0±0.6
				受试者整体评估(VAS 100mm)(平均±SD)	60.1±20.7	59.4±23.7	62.8±21.6

	甲氨蝶呤+CTLA4Ig10mg/kg(n＝115)	甲氨蝶呤+CTLA4Ig2mg/kg(n＝105)	甲氨蝶呤+安慰剂(n＝119)
				医生整体评估(VAS 100mm)(平均±SD)	62.1±14.8	61.0±16.7	63.3±15.5
CRP(mg/dL)	2.9±2.8	3.2±2.6	3.2±3.2
				晨僵(分钟)	97.9±63.1	104.1±63.9	106.0±64.2

三个治疗组中压痛和肿胀关节的基线平均数是可比较的，在10mg/kg组中，压痛和肿胀关节平均数分别是30.8±12.2和21.3±8.4。在2mg/kg组中，压痛和肿胀关节平均数分别是28.2±12.0，和20.2±8.9。在对照组中压痛和肿胀关节平均数分别是29.2±13.0，和21.8±8.8。在所有的治疗组中进行，这些评价和其它的临床评价是相似的(表IV)。

ACR响应和核心因素

表V

6个月时的ACR响应

	甲氨蝶呤+CTLA4Ig10mg/kg(n＝115)	甲氨蝶呤+CTLA4Ig2mg/kg(n＝105)	甲氨蝶呤+安慰剂(n＝119)
				ACR 20	60.0％	41.9％	35.3％
与对照组的差异	24.7	6.6	-
				95％CI	11.9，37.5	-6.2，19.4	-
p-值	＜0.001	0.31	-
				ACR 50	36.5％	22.9％	11.8％
与对照组的差异	24.8	11.1	-
				95％CI	13.8，35.7	1.2，20.9	-

	甲氨蝶呤+CTLA4Ig10mg/kg(n＝115)	甲氨蝶呤+CTLA4Ig2mg/kg(n＝105)	甲氨蝶呤+安慰剂(n＝119)
				p-值	＜0.001	0.027	-
ACR 70	16.5％	10.5％	1.7％
				与对照组的差异	14.8	8.8	-
95％CI	7.5，22.2	2.7，14.9	-
				p-值	＜0.001	0.005	-

10mg/kg治疗组中ACR 20、50、和70的响应率的改进，在6个月时相对于甲氨蝶呤对照组，是有统计学显著性的(图34-38，40)。在2mg/kg治疗组中，ACR 50和ACR 70的改进也是有统计学显著性的。2mg/kg组与对照组的ACR 20相差6.6％，这个差异没有统计学显著性，p＝0.31(表V，图49)。

图34-37表明第1天到第180天的ACR响应率。图38和40表明对应各个治疗组在180天时ACR20、-50和-70的响应率。ACR 50和ACR 70的响应率说明这种可能性：最大的治疗效果可能不是在10mg/kg获得。

图39说明经甲氨蝶呤单独或与CTLA4Ig联合(以2或10mg/kg受试者体重给药)治疗后第180天新发的压痛关节和肿胀关节的比率。

图46说明用HAQ测定的平均身体功能自基线的改进百分比。

表VI

180天时个别ACR因素

(平均改进百分比)

核心因素	甲氨蝶呤+CTLA4Ig10mg/kg(n＝115)	甲氨蝶呤+CTLA4Ig2mg/kg(n＝105)	甲氨蝶呤+安慰剂(n＝119)
				压痛关节	59.9％	43.3％	32.1％

核心因素	甲氨蝶呤+CTLA4Ig10mg/kg(n＝115)	甲氨蝶呤+CTLA4Ig2mg/kg(n＝105)	甲氨蝶呤+安慰剂(n＝119)
				肿胀关节	54.9％	45.1％	33.4％
疼痛	46.4％	22.7％	8.4％
				身体功能(mHAQ)	41.5％	17.3％	14.1％
受试者的整体评估	40.8％	9.6％	17.6％
				医生的整体评估	52.0％	38.6％	25.6％
CRP	31.5％	16.2％	-23.6％

在所有的ACR响应标准的临床因素中，2mg/kg和10mg/kg组证明有某种程度的有效性(表VI；图41-45，47-48)；2mg/kg组中受试者的整体评价指标是仅有的例外。压痛和肿胀关节数的减少呈剂量依赖性。10mg/kg、2mg/kg和对照组的压痛关节减少数分别是59.9％、43.3％和32.1％。对于肿胀关节数观察到相似的模式，10mg/kg、2mg/kg和对照组分别是54.9％、45.1％和33.4％。对于疼痛评估，观察到相对于对照组的最大差异，与对照组中的8.4％相比，其相对于10mg和2mg/kg CTLA4Ig的基线分别减少46.4％和22.7％。比较对照组中的23.6％的增加，在10mg/kg和2mg/kg组中平均CRP相对于基线分别减少31.5％和16.2％。

健康相关的生活质量

采用医疗结果研究简表36(SF-36)来测定CTLA4Ig对健康相关的生活质量(HRQOL)的影响。在基线、90和180天时给所有受试者SF-36表。SF-36由36个项目组成，涵盖8个领域(domain)(身体功能(physical function)、作用-身体(role-physical)、躯体疼痛(body pain)、总体健康(general health)、活力(vitality)、社会功能(social function)、作用-情绪(role-emotional)和精神健康(mental health))。这些单个领域被用于产生身体和精神因素的总结性得分。这些得分范围从0到100。高得分说明有较好的生活质量。在SF-36中，绝对差异5分或者更多被认为有临床意义。

与安慰剂治疗的受试者相比，在10mg/kg CTLA4Ig组中的受试者的SF-36的所有8个主项都有统计数意义的较大改进(图50-51)。在2mg/kgCTLA4Ig治疗的受试者，与安慰剂治疗组相比所述改进更大，但是差异没有统计学显著性(图50-51)。

在三个组中，基线SF-36得分是可比较的。经过6个月的治疗后生活质量的改进显示出清晰的剂量反应趋势。10mg/kg CTLA4Ig治疗组中的受试者显示SF-36的所有8个主项指标都有临床和统计学显著性的改进(对照基线)。最大的效果显示在作用-身体、躯体疼痛和作用-情绪领域。该阳性发现与有效性结果一致。对于用2mg/kg CTLA4Ig治疗的受试者，所有主项指标(除精神健康)，自基线的改进也有统计学显著性。

药代动力学

药代动力学参数值

	CMAX(μG/ML)	TMAX(H)	AUC(TAU)(μG.H/ML)	T-HALF(天)	CLT(ML/H/KG)	VSS(L/KG)
							2mg/kg
平均	57.96	0.50*	10176.14	13.50	0.23	0.07
							SD	16.93	(0.00，4.00)	3069.84	5.91	0.13	0.04
N	15	15	15	15	15	15
							10mg/kg
平均	292.09	0.50*	50102.56	13.11	0.22	0.07
							SD	67.78	(0.00，4.00)	15345.95	5.32	0.09	0.03
N	14	14	14	14	14	14

^*平均(最小，最大)

CTLA4Ig的药代动力学是来自于给药60至90天之间的血药浓度相对于时间的数据。第60天给药前，0.5小时，给药后4小时，在第67、74、81天，以及第90天给药前收集样品。初步的数据说明，相比剂量增加Cmax和AUC也成比例增加。对以1∶5比例的较小(nominal)剂量增加，Cmax和AUC值分别增加1∶5.04和1∶4.92。T-HALF、CLT和Vss值显示是可比的和剂量非依赖性。

两个剂量水平的平均VSS值是0.07L/kg，大约是血浆容量的1.6倍。

药效学

表VII

药效学生物学标志物的平均基线值

生物学标志物	甲氨蝶呤+CTLA4Ig10mg/kg(n＝115)	甲氨蝶呤+CTLA4Ig2mg/kg(n＝105)	甲氨蝶呤+安慰剂(n＝119)
				CRP(mg/dL)	2.9	3.2	3.2
RF(IU/L)	207	274`	179
				IL-2r(pg/ml)	1388	1407	1398
IL-6(pg/ml)	26.7	31.7	21.4
				TNFα(pg/ml)	11.8	6.0	11.9

研究期间分析了各个时间的药效学生物学标志物的生物标志物血清水平。基线值显示在表VII，第180天时相对于基线的值显示在图52-56。

与对照组相比，两CTLA4Ig治疗组中的CRP水平自基线的减少量更多大，10mg/kg剂量组中观察到更大量的减少(见图47、48和52)。

与对照组相比，两CTLA4Ig治疗组的类风湿关节炎因子水平自基线的减少量更大，对于10mg/kg剂量组观察到更大量的减少(见图53)。

与对照组相比，两CTLA4Ig治疗组的可溶性IL-2r水平相对基线的减少更大，对于10mg/kg剂量组观察到更大量的减少(见图54)。

与对照组相比，两CTLA4Ig治疗组的血清IL-6水平相对基线的减少量更大(见图55)。

CTLA4Ig对血清TNFα水平的影响没有结论。相比对照组，2mg/kg剂量组的增加，10mg/kg剂量组的减少(见图56)。

安全性

CTLA4Ig在所有剂量范围内是被很好地耐受。在任何接受CTLA4Ig的受试者中，没有死亡、恶性肿瘤或者机会性感染的情况发生。与对照组相比，活性治疗组中的严重副反应事件(SAEs)和不严重副反应事件(NSAEs)相似或者频率更低。

在10mg/kg受试者中由于副反应事件而中止试验的比率与对照组相比更少(分别为1.7％和5.9％)。在2mg/kg组中，由于副反应事件而中止试验的比率与对照组相似(分别为6.7％与5.9％)。SAE按照与由于副反应事件而中止相似的模式。

在10mg/kg剂量组中，认为没有与试验药物有关的严重副反应事件。

免疫原性

整个180天，在两个CTLA4Ig剂量水平中没有检测到抗药物抗体反应。

采用ACR响应标准评估时，在接受甲氨蝶呤治疗的受试者中，CTLA4Ig明显减轻了类风湿性关节炎的体征和症状。CTLA4Ig的作用与剂量水平成比例增加。在10mg/kg剂量组中，所有ACR核心因素中自基线的改进要高于2mg/kg剂量组中的情况。10mg/kg CTLA4Ig剂量组证明在SF-36的所有8个领域的改进有临床和统计学显著性。除了TNFα，所有测定的药效学生物标志物显示出与CTLA4Ig剂量水平成比例的减少。在接受甲氨蝶呤的类风湿性关节炎受试者中，CTLA4Ig是安全和可很好耐受的。两个CTLA4Ig剂量组中副反应事件的情况与对照组相似。

实施例6

共刺激因子阻断物CTLA4Ig，每月一次与依那西普联用给予活动性类风湿性关节炎病人

下列实施例中描述了将CTLA4Ig与依那西普联用给予活动性类风湿性关节炎病人的描述。

依那西普与英夫利昔单抗代表新一代靶向肿瘤坏死因子(TNF)的类风湿性关节炎药物。依那西普是具有连接于人免疫球蛋白(IgG1)的Fc部分的TNF受体胞外部分相连的二聚融合蛋白。这个融合蛋白结合TNF，阻断TNF与细胞受体表面TNF受体的作用，使TNF在生物上无活性。

这个实施例描述了12个月的研究，其中对所有受试者完成了6个月的治疗或中止治疗后的疗效评估。也评价了整个研究过程中的有效性、安全性和疾病的进展。

该研究采用随机、双盲、空白对照的、平行剂量设计。总计大约141个接受依那西普(25mg，每周两次)的活动性RA病人被随机分入2个剂量组之一：1)一个组接收2mg/kg CTLA4Ig(n＝94)及依那西普或2)一个安慰剂组只接受依那西普(n＝47)。

受试产品、给药剂量和模式，治疗持续时间

治疗前所有的受试者接受依那西普(25mg，每周两次)至少3个月。

在第1天、15天、30天及以后每月一次、持续6个月(首期治疗)经输注给予CTLA4Ig。研究药物的每个剂量静脉输注给药大约30分钟。

首期治疗研究在治疗头6个月内进行。在这个期间，受试者被要求保持稳定的依那西普剂量(25mg，每周两次)。除了依那西普不允许使用DMARD。稳定的低剂量类固醇(10mg每天或更少)和/或稳定非类固醇抗感染药物(NSAID)，包括乙酰水杨酸(ASA)被允许使用。除了在关节评价前12小时，允许疼痛受试者使用麻醉镇痛剂(不包括ASA或NSAID)，所述疼痛不能由基线和研究药物恰当地控制。

评价标准

本研究的主要目标是收集与以下情况有关的数据：6个月后符合修订后美国关节炎协会(ACR)关于20％改进(ACR 20)标准的受试者比例。修订后的ACR 20标准一般适于该研究受试者群体中的低水平CRP值。修订后的ACR标准定义为：1)在压痛关节数和肿胀关节计数方面有大于20％的改进和2)在其余4个核心数据组(set)测定指标(总体疼痛、医生、受试者、功能性评价)中有两个有大于20％的改进。CRP是标准ACR核心数据组的一部分，但是由于在采用TNF阻断剂，如依那西普的，受试者中的CRP水平较低，所以在修订后的ACR标准中不包括这一指标。标准ACR标准，以及两种可选标准(SF-36身体健康和SF-36精神健康)也作为第二指标来评估。

统计方法

联用依那西普与CTLA4Ig 2mg/kg治疗的患者组与依那西普加安慰剂的对照组相比较。根据以前利用依那西普在相似的病人人群中的研究结果，推定对照组中6月时的修订后的ACR 20响应率(修订后的评价标准)是35％。这个预计的响应率是那些对依那西普治疗没有适当的反应的受试者的响应率。用2∶1随机化，141名(以可能的10％的出组率调整)受试者(47安慰剂/94给药)的样本产生90％的权以来5％的显著性水平检测30％的差异(双尾，基于卡方检测，没有对连续性校正的调整)。

相似地，在ACR 50和70中，样品被测定为产生91％和83％的权来检测30％和14％的差异。然而，由于入组缓慢，仅有122个受试者被随机分组，121个受试者经过治疗和分析(一个受试者被随机分组，但从未接受治疗)。

人口统计学和基线特性

表1

180天时的受试者组成(Disposition)

	CTLA4Ig+依那西普	安慰剂+依那西普	总计
				随机化的*	85	36	121
完成的	68(80％)	22(61％)	90(74％)
				中止的	17(20％)	14(39％)	31(26％)

	CTLA4Ig+依那西普	安慰剂+依那西普	总计
				不利事件	6(7.0％)	1(2.7％)	7(6％)
缺乏有效性	6(7.0％)	12(33％)	18(15％)
				其他	5(5.8％)	1(2.7％)	6(5％)

^*排除一个未接受治疗的受试者

与CTLA4Ig加依那西普组(20％)相比，6个月后安慰剂加依那西普治疗组中，总体中止的比例更高(39％)。由于在安慰剂加依那西普组中缺乏疗效，致使较高的中止率，产生了这种差异(表1)。

在两个治疗组中，人口的统计特征是相似的。大多数受试者是女性和白人。平均病史是13年，平均年龄是52岁(表2)。

表2

平均基线人口统计和临床特征

	CTLA4Ig+依那西普N＝85	安慰剂+依那西普N＝36	总计N＝121
				平均年龄：年(范围)	50(24-74)	55(28-72)	52(24-74)
平均体重：kg(范围)	81(45-154)	79(46-126)	81(45-154)
				性别：女性：n(％)	66(78％)	26(72％)	92(76％)
种族：白人-n(％)	80(94％)	36(100％)	116(96％)
				平均疾病持续时间：年±sd	13.0±10.1	12.8±8.6	13.0±9.7
压痛关节(/68)平均±sd	28.7±14.0	29.5±13.7	28.9±13.8
				肿胀关节-(/66)平均±sd	19.6±9.4	20.3±11.0	19.8±9.9

两个组的基线临床特征是相似的，包括一个平均值为29的压痛关节数和平均值20的肿胀关节数。除较低的CRP值外，基线特征是活动性类风湿性关节炎受试者以及入组临床研究的受试者常见的。

ACR响应和核心因素

与安慰剂加CTLA4Ig组相比，CTLA4Ig加依那西普组的ACR 20和ACR70响应的改进有统计学显著性(表3和图63)。

表3

180天时修订后的ACR响应  受试者数目(％)^*

	ACR 20	ACR 50	ACR 70
				CTLA4Ig+依那西普***	48.2％	25.9％	10.6％
与安慰剂+依那西普的差异	20.5％	6.4％	10.6％
				95％CI	(1.2，39.7)	(-10.2，23.1)	(0.4，20.8)
p-值	0.037**	0.448	0.042**

^*见评价标准

^**p＜0.05(CTLA4Ig+依那西普相对于安慰剂+依那西普中，ACR响应的可能性)

^***CTLA4Ig+依那西普：N＝85；安慰剂+依那西普：N＝36

经过2个月的治疗，在CTLA4Ig加依那西普组中观察到ACR标准的所有因素中响应数值更高。7个ACR因素中的3个显示在图64A-C。

第180天时，与安慰剂加依那西普组相比，CTLA4Ig加依那西普治疗组中ACR标准的个别指标的平均改进率一致性地更高(表4)。

表4

180天时个别ACR指标的平均改进比例

ACR指标	CTLA4Ig+依那西普N＝85	安慰剂+依那西普N＝36
			压痛关节	42％(5.5)	24％(8.3)
肿胀关节	37％(5.0)	21％(8.1)
			疼痛	34％(4.3)	-1％(10.8)
身体功能(MHAQ)	31％(5.2)	-5％(13.8)
			受试者全面评估	27％(5.4)	3％(9.5)
医生整体评估	43％(4.3)	27％(5.8)

生活质量

对比基线(subscale)，CTLA4Ig加依那西普组显示在180天时SF-36的所有8个亚标准都有统计学显著性的改进--而安慰剂加依那西普组的受试者中只有一项(身体功能)。HRQOL亚标准的绝对变化被认为有临床意义。

与安慰剂加依那西普组相比，CTLA4Ig加依那西普组的受试者在SF-36的4个项目中有统计学显著的更大的改进：作用-身体、躯体疼痛、活力和社会性功能(图65)。尽管没有统计学显著性，其它4个项目中的改进也比安慰剂加依那西普组的更高。

安全性

在首期6个月的研究中，没有死亡或者机会性感染发生。在最经常报道的不利事件中，头痛、上呼吸道感染、肌肉/骨骼疼痛、恶心/呕吐、高血压和腹泻在CTLA4Ig加依那西普组的发生率要比安慰剂加依那西普组的高。CTLA4Ig加依那西普组中鼻窦疾病(sinus alnormalities)和皮疹发生率也略高。

与安慰剂加依那西普组相比(2.8％)，在CTLA4Ig加依那西普组中更多的受试者经历了严重副反应事件(SAE)(7.1％)。然而，没有SAE被认为与研究的药物有关。

两个接受CTLA4Ig加依那西普治疗的受试者有皮肤恶性疾病。一个受试者的基底细胞肉瘤在第150天就诊日被切除。另一个受试者有以前就有的鳞状细胞癌，在第120天就诊日，受试者决定切除。另一个受试者经历了血管性水肿，调查者认为是对阿奇霉素的药物反应。

所有导致中止试验的副反应事件是轻微或中等程度的。在CTLA4Ig加依那西普组由于震颤导致的一例中止，被认为是一个严重的副反应事件。

免疫原性

没有受试者接受CTLA4Ig后血清转化产生CTLA4Ig或CTLA4-T特异性抗体。对CTLA4Ig或CTLA4-T特异性抗体而言，没有观察到GMT中明显的变化。

比较CTLA4Ig/依那西普和CTLA4Ig/甲氨蝶呤ACR的响应

表5

CTLA4Ig+依那西普相对于CTLA4Ig+甲氨蝶呤ACR响应(％改进)：

	CTLA4Ig+依那西普a(IM101-101)		CTLA4Ig+甲氨蝶呤b(IM101-100)
							2mg/kgN＝85	0mg/kgcN＝36	10mg/kgN＝115	2mg/kgN＝105	0mg/kgcN＝119
ACR20	48.2％d	27.8％	60.0％d	41.9％	35.3％
						ACR50	29.3％	19.4％	36.5％d	22.9％d	11.8％
ACR70	10.6％d	0％	16.5％d	10.5％d	1.7％

^a修订后ACR.见评价标准

^b标准的ACR标准

^c安慰剂+背景治疗(依那西普或甲氨蝶呤)

^dp＜0.05ACR响应差异vs安慰剂治疗+背景治疗

2mg/kg CTLA4Ig加依那西普的疗效与在接受相同剂量的CTLA4Ig加甲氨蝶呤的受试者中观察到的治疗效果相似(实施例5)。然而，在甲氨蝶呤(实施例5)中的评价标准是标准的ACR，核心因素包括CRP，而在依那西普试验(实施例6)中的评价标准是修订后的ACR，不包括CRP。

结论

与单独采用依那西普相比，6个月研究的初步评价发现CTLA4Ig(2mg/kg)与依那西普联用，减少了风湿性关节炎的指标和症状。修订后的ACR20和ACR 70的增加有统计学显著性。在开始治疗的一个月内观察到CTLA4Ig加依那西普疗法的疗效。当与依那西普联合给药时，CTLA4Ig通常是安全和可良好耐受的，安全性的状况与依那西普单独给药相似。在6个月的试验期间，CTLA4Ig没有免疫原性。另外，联用依那西普与CTLA4Ig(实施例6)的疗效与相同剂量的CTLA4Ig与甲氨蝶呤的效果相似(实施例5)。

实施例7

多中心、随机、双盲、安慰剂对照的一年IIB期临床研究结果，以评估经静脉给药接受甲氨蝶呤的活动性风湿性关节炎受试者两个不同剂量的BMS-188667的安全性和临床疗效。

下列实施例中说明多中心、随机、双盲、安慰剂对照的一年IIB期治疗研究结果，用以评估将两个不同剂量的CTLA4Ig与氨喋甲呤联用给予活动性风湿性关节炎病人(RA)的安全性和临床疗效。本实施例的研究是实施例5中所述的6个月研究的继续。

根据上文实施例3的初步疗效结果，以及甲氨蝶呤加其它治疗来治疗治疗风湿性关节炎的标准实践，这个研究设计为验证在经过甲氨蝶呤治疗仍有活动性疾病的RA受试者中，CTLA4Ig(BMS-188667)加甲氨蝶呤比MTX加安慰剂有更大的临床疗效。

这个临床研究结果的报道是根据于所有的受试者完成6个月治疗后，以及再次于所有受试者完成12个月的治疗后进行的分析。

这个实施例中，10mg/kg CTLA4Ig加甲氨蝶呤组可以表示为10mg/kg组，2mg/kg加甲氨蝶呤组可以表示为2mg/kg组，CTLA4Ig(BMS-188667)安慰剂加甲氨蝶呤组可以表示为安慰剂组。

研究方法学

在活动性RA受试者中，本研究比较两个不同的CTLA4Ig(BMS-188667)剂量联用甲氨蝶呤，或联用甲氨蝶呤加安慰剂的临床效果，所述临床效果如6个月和12个月的治疗期间的ACR评估的那样。本研究选择对甲氨蝶呤响应不佳的活动性RA成年受试者入组。

对经静脉给药活动性RA受试者1)2mg/kg体重的CTLA4Ig加甲氨蝶呤2)10mg/kg体重的CTLA4Ig加甲氨蝶呤或3)安慰剂加甲氨蝶呤(以后称作安慰剂)的活动性类风湿患者进行一年的监测后，本文给出研究结果。

有活动性RA的受试者(尽管已经经过甲氨蝶呤治疗，并且符合本研究包括/排除标准)以1∶1∶1随机化分配，接受下列治疗中的一种，其背景为甲氨蝶呤治疗：CTLA4Ig(BMS-188667)10mg/kg，CTLA4Ig(BMS-188667)2mg/kg，或安慰剂。受试者必须已经经过甲氨蝶呤至少6个月的治疗(10mg到30mg每周)，本研究第一天前持续28天给予稳定剂量。

治疗组：受试者以1∶1∶1随机化分配进三个治疗组之一：

1)第1组：静脉滴注CTLA4Ig(BMS-188667)10mg/kg

2)第2组：静脉滴注CTLA4Ig(BMS-188667)2mg/kg

3)第3组：静脉滴注安慰剂

滴注剂量是根据第一天就诊前的预治疗获得的受试者体重(对只采用甲氨蝶呤的受试者而言，在筛选就诊中获得体重；对甲氨蝶呤联合治疗(联合剂其它DMARD)的受试者而言，体重数据从排除随访(washout visit)时获得，-2天)。从第一天到第360天，滴注剂量不能改变。

贯穿整个试验，在大约相同的时间进行滴注。所有研究药物剂量为固定的75mL体积、有恒定的流速，给药大约30分钟。每次输注结束时静脉滴注用包和管的两端用25mL 5％葡萄糖水(D5W)溶液冲洗。所有受试者采用坐姿接受静脉滴注。观察受试者副反应事件(Aes)以及生命征(血压、心率、体温)的改变，从开始每一次滴注(滴注前，15、30、45、60、75、90、120分钟)，持续到开始滴注后最少2个小时。如果临床有指征，观察期可能被延长。

在首期(第1天到第180天)研究期间，允许选择的药剂的伴随给药，允许的药剂包括：

·甲氨蝶呤：持续用现在的剂量(不增加，并仅仅因为毒性而减量)

·系统(非局部的)皮质类固醇：剂量保持稳定，总剂量少于或者等于10mg/天强的松等同物。避免关节内注射，但如果需要，最多允许两次关节内注射。注释：在所有随后的评估、评价中，接受关节内注射的关节记为活动性。

·NSAID，包括ASA：条件是剂量是稳定的。

·对乙氨基酚，联用的产品包括对乙氨基酚和麻醉镇痛剂(例如：对乙氨基酚与磷酸可待因、对乙氨基酚与荼璜酸右丙氧酚(propoxyphenenapsylate)、对乙氨基酚与盐酸羟二氢可待因酮(oxycodone hydrochloride)、对乙氨基酚与酒石酸羟二氢可待因酮(oxycodone bitartrate)等)或者曲马多(tramadol)：用于那些经历疼痛不能有效被基线或者研究用药剂控制的受试者(除了关节评价前12小时)。

表1是一个研究方法和评价的日程表

表1

研究方法和评价的日程表

治疗期	预处理(天)		治疗日期efjh
																	就诊日	筛选(-28到-2)	(-2)	1	15	30	60	90	120	150	180	210	240	270	300	330	360
筛选评价
																	知情同意	X
完整病史和身体检查	X															Xi
																	CXR	Xa
ECG	Xa															X

治疗期	预处理(天)		治疗日期efjh
																	就诊日	筛选(-28到-2)	(-2)	1	15	30	60	90	120	150	180	210	240	270	300	330	360
稳定化/撤销禁止的药物(如果需要)b	X
																	入组受试者	X	Xm
随机化的受试者k			X
																	给药h			X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X
中期评估f
																	晨僵的持续时间	X		X	X	X	X	X	X	X	X		X		X		X
中期病史和身体检查			X	X	X	X	X	X	X	X		X		X
																	压痛关节数	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X		X		X		X
肿胀关节数	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X		X		X		X
																	受试者的疼痛评估	X		X	X	X	X	X	X	X	X		X		X		X
受试者的全面疾病活动性评估	X		X	X	X	X	X	X	X	X		X		X		X
																	医生的全面疾病活动性评估	X		X	X	X	X	X	X	X	X		X		X		X
受试者的身体功能评估	X		X	X	X	X	X	X	X	X		X		X		X
																	简表-36健康问卷(SF-36)	X		X				X			X						X

治疗期	预处理(天)		治疗日期efjh
																	就诊日	筛选(-28到-2)	(-2)	1	15	30	60	90	120	150	180	210	240	270	300	330	360
受试者对治疗的响应							X			X						X
																	安全性评估
副反应事件监控			X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	Xo
																	体重g	X	X														X
乳房X光摄影(仅仅女性)1	X															X
																	生命体征	X		X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X
实验室
																	CBC	X		X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X
化学图谱(panel)	X		X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X
																	尿分析	X															X
尿/血清妊娠测试	X		X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X
																	乙肝表面抗原	X
丙肝抗体	X
																	药效学(PD)
类风湿因子	X		X							X						X
																	CRP	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X		X		X		X
IL-2R			X		X	X	X	X	X	X		X		X		X
																	探索性细胞因子(ICAM-1e-选择蛋白，IL-6和TNFα)			X				X			X						X
药代动力学			X			X	X			X

治疗期	预处理(天)		治疗日期efjh
																	就诊日	筛选(-28到-2)	(-2)	1	15	30	60	90	120	150	180	210	240	270	300	330	360
免疫球蛋白检测
																	量化的免疫球蛋白(IgG，IgA，IgM)			X							X						X
免疫原性
																	抗BMS-188667Ab测定			X		X		X			X			X			X
放射照像(radiograpbic)评估
																	X-光(手/腕和足)			X							X						X

^a如果6个月内没有进行胸部X光和ECG检查或没有记录，进行胸部X光和ECG检查。

^b如果受试者在甲氨蝶呤治疗顶峰用DMARD治疗，而且不符合起始的入组标准，在试验第一天前必须清除DMARD至少28天。

^c只有受试者采用甲氨蝶呤治疗时，这个就诊被要求。

^d对所有可能怀孕的女性，给药前48小时内，进行尿或血清妊娠测试。血清妊娠测试在当地进行。

^e中止试验的受试者必须有一个“早期终止”随访。这次随访的评估是和第360天的评估相同的。这次随访的评估替代已经预期要在中止的那天进行的评估。不允许改变现有的DMARD、胆固醇或者NSAID治疗，直到完成了这些评估。为了收集安全性数据(副反应事件)，终止后30天联系受试者。

^f尽一切努力保证相同的检查者完成对每个病人的评价。

^g大多数现在的体重应该被用于计算药物剂量。研究期间的所有给药剂量基于这个体重。

^h对第15天而言，允许一个+/-3天的随访窗口期。随后的随访，允许一个+/-7天的随访窗口期。

ⁱ仅仅完成身体检查。

^j除非另有指示，所有的评价应该在给予研究药物之前进行或监督。

^k为了随机化，在联系中心随机系统之前，已经所有的评价结果进行可行性要求的检测(review)。

^l见乳房成像原理的方法2.1.4.3部分。如果在签订同意书前6个月没有做(必须记录在档)。自第一天后中止试验的受试者需要在筛选期间进行的乳房成像一年后再进行跟踪乳房成像术。

^m受试者的体重被提供给中心随机系统。

ⁿ对那些在前9个月治疗期间中止试验的受试者而言，在最后随访时不要求进行放射图像评估。

^o早期终止试验的受试者，有副反应事件和伴随给药，记录在完成最后一次给药后30和60天。

疗效评估

临床测定和响应

采用美国关节炎协会(ACR)核心数据组和响应来评价临床响应。对于这个评价，收集七个因素的数据：1)压痛关节炎(标准化68个关节计数)；2)肿胀关节数(标准化66关节计数；3)受试者全面疼痛评估；4)受试者全面疾病活动性评估；5)医生的全面疾病活动性评估；6)受试者身体功能评估(MHAQ)；以及7)急性期反应物值CRP。

响应的ACR 20、ACR 50和ACR 70定义分别对应于相对于压痛和肿胀关节基线(因素1和2)的20％、50％或70％改进，以及在其它5个核心数据天数指标中的3个(因素3到7)分别有20％、50％和70％的改进。主要临床响应被定义为维持ACR70连续6个月。见表1中每个因素数据被收集的组。

在6个月时(第180天)进行两个CTLA4Ig(BMS-188667)治疗组和安慰剂组之间的ACR20响应差异的初步疗效分析。又进行依次的测试过程。首先，在0.05显著性水平，进行卡方测试，比较10mg/kgCTLA4Ig组与安慰剂组的数据。如果这个结果有意义，在0.05显著性水平，比较2mg/kgCTLA4Ig组与安慰剂组的数据。这个测试过程保持总α水平在5％。在6个月时，进行ACR 50和ACR 70的相似分析。在每个CTLA4Ig(BMS-188667)治疗组与安慰剂组之间，ACR 20、ACR 50和ACR 70响应的差异用点估计和95％可信区间来总结。在随后所有的时间点，由于缺少疗效(如RA恶化)而中止试验的受试者被认为ACR非响应者。对所有因其它原因而中止试验的受试者，他们最后的ACR响应被提呈。

在Dunnett校正的0.027(双尾)显著性水平，比较360天时每个CTLA4Ig(BMS-188667)和安慰剂组之间的ACR 20、ACR 50和ACR 70响应率。

在每个时间点实现ACR20响应的响应者比例相对于时间作图。CochranMantel-Haenszel测试(W.G.Cochran，1954，Some Methods of Strengtheningthe Common卡方Test，Biometrics 10：417-451；N.Mantel and W.Haenszel，1959，Biostatistical Aspects of the Analysis of Data from Retrospective Studiesof Disease，J Nat Cancer Inst，22：719-748)被用来比较在每个CTLA4Ig(BMS-188667)中达到ACR 20响应受试者的频次相对于安慰剂组中的所述频次。

也显示出两个CTLA4Ig(BMS-188667)组与安慰剂组的第15、30、60、90、120、150、180、240、300和360天的ACR 20、ACR 50和ACR 70响应。用95％的可信区间来总结CTLA4Ig(BMS-188667)组和安慰剂组之间的ACR响应差异。ACR数据相对于时间的作图被用于评估作用开始和确定达最大响应的时间。

主要临床响应被定义为维持ACR70连续6个月。在12月分析时，三个组中达到主要临床响应的受试者比例被总结。

为了评估设计的分析的完整性，所有接受研究药物治疗，而且以任何理由中止研究的受试者在中止后进行的所有后期研究随访时，被认为是ACR非响应者。

在每次随访评估评价积累指数ACR-N，评价AUC直到6个月和直到12个月。用梯形规则(trapezoidal rule)来计算AUC。对于6个月和12个月的数据，用变异分析(ANOVA)，比较两个CTLA4Ig(BMS-188667)给药组和安慰剂组之间的ACR-N AUC。这个方式可以评估整个研究过程中受试者的响应。这些数据分析在LOCF数据组上进行。

有关ACR-N AUC数据正态分布的推定以10％的显著性水平利用对来自ANOVA模型的标准残余(residue)的Shapiro-Wilks test检验来检测。

用替代生物标志物来评价CTLA4Ig+MTX或安慰剂+MTX治疗方案的有效性。RA中针对免疫调节和炎症的有效生物标志物包括：CRP、可溶性IL-2r、RF、可溶性ICAM-1、E-选择蛋白、血清IL-6和TNFα。180天和360天时，利用频率和从基线的平均改变来总结治疗组的这些参数。

副反应事件(AE)定义为研究过程中当任何新的或恶化的疾病、体征、症状、研究者注意到的临床有意义的实验室检测异常，而不管病因。严重副反应事件被定义为符合下列标准时的副反应事件：是致死的；是威胁生命的；导致或延长住院治疗；导致持续或有明显的残疾或不能(incapability)、是癌症、是先天性异常/新生儿缺损、导致剂量过度、导致出现药物依赖性或药物滥用、或是重要的医学事件。

在筛选病人和每次随访时，研究药物给药期间和随后，获得生命体征指标。用治疗组的平均数总结生命体征指标(坐姿血压、心率和体温)。

两个CTLA4Ig(BMS-188667)给药组(10和2mg/kg)与安慰剂组相比较。首先比较10mg/kg和安慰剂组的6个月ACR响应率，仅当前者是显著的时，随后比较2mg/kg与安慰剂组。样本量根据5％显著性水平(双尾)。6个月安慰剂组的ACR 20响应率估计是大约25％(Weinblatt M，Kremer JM，Bankhurst AD et.al.A trial of etanercept，a recombinant TNF：Tc fusion proteinin patients with RA receiving methotrexate.NEJM 1999；340：253-259)。每个治疗组107个受试者的样本量(按15％的中止率调整)，被测定为产生94％的权，以在5％(双尾)水平检测25％的差异。表2总结为检测6个月时ACR 20，ACR 50，和ACR 70规定的治疗差异所需的权。

表2

每组107个受试者^a的响应率和权

响应	控制率(％)	治疗差异	权(％)
				ACR 20	25	25	94

响应	控制率(％)	治疗差异	权(％)
				ACR 50	5	20	95
ACR 70	1	14	90

^a样本量按可能的15％中止率调整；实际样本量是91。

如果10mg/kg CTLA4Ig与安慰剂组的首次比较是显著的，然后比较2mg/kg CTLA4Ig与安慰剂组。对于涉及6个月时的ACR 20、ACR 50和ACR70的比较，检测的权将分别至少是0.88、0.90和0.81。(Koch DD，Gansky SA.Statistical considerations for multiplicity in confirmatory protocols.Drug InfoJoumal 1996；30：523-534).

统计学分析

研究的人群

受试者的分布

在这个研究的524个入组受试者中，339个受试者被随机分组：115个在10mg/kg组；105个在2mg/kg组；119个在安慰剂组(图68)。没有被随机分组的主要原因是不符合入组和/或出组标准。

首期(1-180天)

总计256个受试者(其中75.5％被随机分组)完成了首期研究；83个受试者在这个期间中止了试验(表3)。总体上，与10mg/kg CTLA4Ig组相比，安慰剂组的中止高两倍。对于由于缺乏疗效和由于AE的中止，在安慰剂组中也比10mg/kg CTLA4Ig组中高两倍。

表3

中止的原因：首期(1-180天)

CTLA4Ig(BMS188667)

	10mg/kg	2mg/kg	安慰剂	总计
					治疗的数目，n	115	105	119	339
中止的数目，n(％)	17(14.8)	25(23.8)	41(34.5)	83(24.5)
					副反应事件	3(2.6)	7(6.7)	9(7.6)	19(5.6)
缺乏疗效	12(10.4)	16(15.2)	28(23.5)	56(16.5)
					同意退出	2(1.7)	2(1.9)	4(3.4)	8(2.4)
完成180天的治疗，n(％)	98(85.2)	80(76.2)	78(65.5)	256(75.5)

累积的中止(1-360天)

总计235个受试者(其中有69.3％被随机分组)完成了两期试验；第360天时有104个受试者中止(表4)。在首期中观察到的相同的总体模式(安慰剂组中的发生率比10mg/kg CTLA4Ig高两倍)在全过程(1-360天)中也观察到。这包括总体中止率、由于缺乏疗效中止、由于AE中止。

表4

中止的原因：两期(1-360天)

	CTLA4Ig(BMS-188667)
						10mg/kg	2mg/kg	安慰剂	总计
治疗的数目，n	115	105	119	339
					中止的数目，n(％)	25(21.7)	31(29.5)	48(40.3)	104(30.7)
副反应事件	5(4.3)b	9(8.6)	11(9.2)	25(7.4)
					死亡	0	1(1.0)	0	1(0.3)
失去随访	1(0.9)	2(1.9)	0	3(0.9)
					其他a	1(0.9)	0	1(0.8)	2(0.6)
缺少疗效	13(11.3)	17(16.2)	30(25.2)	60(17.7)
					同意撤回	5(4.3)	2(1.9)	6(5.0)	13(3.8)

	CTLA4Ig(BMS-188667)
						10mg/kg	2mg/kg	安慰剂	总计
完成360天的治疗，n(％)	90(78.3)	74(70.5)	71(59.7)	235(69.3)

^a其他中止的原因与顺从(医嘱)有关。

^b10mg/kg CTLA4Ig组中的受试者IM101100-32-5报道了副反应事件，被记录为导致研究中止；然而，这个受试者没有包括在此表中。

由于任何理由在12个月期间中止的受试者的累积比例显示在图69；由于缺乏疗效，受试者的累积比例显示在图70。大约30天治疗后，注意到两个图中安慰剂的中止比例与两个CTLA4Ig(BMS-188667)组相比一致性更高；此外，大约150天治疗后，2mg/kg CTLA4Ig组的中止率比10mg/kg组的高。

人口统计学和受试者特征

三个组中基线人口统计学特征和基线临床RA特征总体上是可比的，对于临床实践中遇到的晚期RA是常见的(表15和16)。大多数受试者是约55岁的白人女性，她们有大约9到10年RA史，相对多的活动性关节(大约29压痛和21肿胀关节)，视觉模拟评分(VAS)大约为59-65mm(100mm标准)。

表5

基线人口统计学特征

	CTLA4Ig(BMS-188667)
					10mg/kg	2mg/kg	安慰剂
随机化的数	115	105	119
				年龄(年)

	CTLA4Ig(BMS-188667)
							10mg/kg		2mg/kg		安慰剂
平均±SD(范围)	55.8±12.5(17，83)			54.4±11.3(23，80)	54.7±12.0(23，80)
						体重(kg)
平均±SD(范围)		77.8±18.6(40.1，144.0)		78.7±21.4(48.4，186.8)	79.9±17.6(44.0，140.0)
						性别
男性，n(％)女性，n(％)	29(25)86(75)			39(37)66(63)	40(34)79(66)
						种族
白人，n(％)黑人，n(％)其他，n(％)	100(87)6(5)9(8)		91(87)014(13)		104(87)3(3)12(10)
						RA史(年)
平均±SD(范围)	n＝114a9.7±9.8(0，38)		n＝1059.7±8.1(0，36)		n＝117a8.9±8.3(0，41)

三个受试者的RA持续时间没有报道

尽管不是一个ACR标准的，也评价晨僵的持续期，三个组中每一个是大约2小时。基线的的阳性RF结果也被评价，CTLA4Ig(BMS-188667)治疗组有更高的RF阳性结果受试者百分比例(10mg/kg和2mg/kgCTLA4Ig组都是86％，安慰剂组为76％)。

表6

基线临床类风湿性关节炎特征

	CTLA4Ig(BMS-188667)
				特征	10mg/kg(n＝115)	2mg/kg(n＝105)	安慰剂(n＝119)

	CTLA4Ig(BMS-188667)
				特征	10mg/kg(n＝115)	2mg/kg(n＝105)	安慰剂(n＝119)
压痛关节，n平均±SD(范围)	11530.8±12.211.0，66.0	10528.2±12.03.0，62.0	11929.2±13.04.0，68.0
				肿胀关节，n平均±SD(范围)	11521.3±8.49.0，54.0	10520.2±8.94.0，48.0	11921.8±8.88.0，64.0
疼痛(VAS 100mm)，n平均±SD(范围)	11362.1±21.40.0，99.0	10464.3±22.38.0，100.0	11965.2±22.13.0，95.0
				身体功能(MHAQ 0-3)，n平均±SD(范围)	1151.0±0.50.0，2.5	1051.0±0.50.0，2.5	1191.0±0.60.0，2.3
受试者全面评价(VAS 100mm)，n平均±SD(范围)	11360.1±20.710.0，100.0	10559.4±23.78.0，99.0	11962.8±21.64.0，94.0
				MD全面评价(VAS 100mm)，n平均±SD(范围)	11362.1±14.820.0，98.0	10561.0±16.78.0，95.0	11963.3±15.518.0，93.0
CRP(mg/dL)，n平均±SD(范围)	1122.9±2.80.2，19.9	993.2±2.50.2，10.8	1153.2±3.20.2，20.9
				晨僵(分钟)，n平均±SD(范围)	11597.9±63.10.0，180.0	103104.1±63.90.0，180.0	119106.0±64.20.0，180.0
类风湿因子(IU/mL)，n％阳性	9986％	9086％	9076％

接受至少一个剂量的研究药物并由于缺乏疗效而中止试验的受试者的总体人群的基线人口统计学和RA特征，与整个研究人群相比是总体上相当的。然而，与全体研究人群(34％)相比，该亚群中较大比例的受试者被诊断为RA＞10年(45％)。

病史发现和用药史

这个研究中的受试者病史发现与相对晚期RA相一致，在各个治疗组之间通常是相似的。最常见的症状(在＞40％的受试者中)是骨骼肌肉发现(不包括RA症状；59.3％)、肠胃症状(45.1％)、泌尿生殖症状(42.2％)。其他重要的医学史症状包括心血管疾病，见于所有的治疗组中大约是39％的受试者，以及见于全部受试者的大约29％的内分泌/代谢症状。

进入研究之前，在三个组中甲氨蝶呤、系统的(非局部)类固醇、DMARD和生物性RA药物的总体使用情况总体上是相当的(表7)。所有受试者将接受类风湿药物包括甲氨蝶呤的预治疗，以使其对于研究来说是合格的。有4个受试者没有接受甲氨蝶呤预治疗的记录。随机分组前系统的(非局部的)类固醇使用在三个治疗组之间是相当的，在接受系统的(非局部的)类固醇的2mg/kg CTLA4Ig组，安慰剂组中的受试者(～67-68％)与10mg/kg CTLA4Ig组(60.0％)相比略多。使用DMARD和生物性RA药物变化从0到12％，任何组中没有明显的差异。第一天的平均甲氨蝶呤系统的(非局部性)类固醇剂量是相当的，在所有三个组中分别为～15-16mg/周，～6-7mg/天)

表7

入组前类风湿药物治疗的总结

	CTLA4Ig(BMS-188667)
				入组前类风湿药物治疗，n(％)a	10mg/kg(n＝115)	2mg/kg(n＝105)	安慰剂(n＝119)
接受入组前药物治疗的受试者的数目	114(99.1)	103(98.1)	118(99.2)
				甲氨蝶呤b	114(99.1)	103(98.1)	118(99.2)
系统的(非局部的)类固醇	69(60.0)	71(67.6)	80(67.2)
				其它DMARD	19(16.5)	19(18.1)	25(21.0)

	CTLA4Ig(BMS-188667)
				入组前类风湿药物治疗，n(％)a	10mg/kg(n＝115)	2mg/kg(n＝105)	安慰剂(n＝119)
柳氮磺吡啶	9(7.8)	2(1.9)	10(8.4)
				羟氯喹	8(7.0)	6(5.7)	14(11.8)
环孢霉素	2(1.7)	4(3.8)	4(3.4)
				英夫利昔单抗	2(1.7)	2(1.9)	2(1.7)
依那西普	1(0.9)	4(3.8)	1(0.8)
				氯喹	1(0.9)	0	0
来氟米特	0	2(1.9)	2(1.7)

^a入组前类风湿药物治疗的分类不相互排斥

^b4个受试者没有甲氨蝶呤给药记录

研究治疗

在3个治疗组中，对于两个研究阶段，10mg/kg CTLA4I组有最长的平均暴露时间，安慰剂组有最短的平均暴露时间，(对于10mg/kg、2mg/kg和安慰剂组分别是：第180天：163天、156天、140天；第360天：286天、268天和234天)。

在第180天时(首期结束时)，与2mg/kg CTLA4Ig组(79％)和安慰剂组(66％)(表8)相比，10mg/kg CTLA4Ig组接受输注的受试者比例(85％)更高。在第330天(二期中规定的最后给药天数)，与2mg/kg CTLA4Ig组(70％)和安慰剂组(59％)(表8)相比，10mg/kg CTLA4Ig组中接受输注的受试者的比例(78％)也较高。

表8

在给定的研究天数接受输注的受试者

	数(％)受试者
				CTLA4Ig(BMS-188667)

天	10mg/kg(n＝115)	2mg/kg(n＝105)	安慰剂(n＝119)
				1	115(100)	105(100)	119(100)
15	114(99)	104(99)	117(98)
				30	113(98)	101(96)	111(93)
60	108(94)	97(92)	103(87)
				90	106(92)	94(90)	94(79)
120	100(87)	86(82)	83(70)
				150	98(85)	83(79)	81(68)
180	98(85)	83(79)	78(66)
				210	94(82)	80(86)	78(66)
240	95(83)	78(74)	76(64)
				270	93(81)	77(73)	73(61)
300	90(78)	74(70)	72(61)
				330	90(78)	73(70)	70(59)

甲氨蝶呤

第1天前28天(for 28days prior to Day 1)，受试者将用稳定剂量的甲氨蝶呤(10-30mg每周一次)治疗至少6个月。除了4个受试者，首期治疗期间所有受试者除了接受CTLA4Ig(BMS-188667)，每周接受甲氨蝶呤(10-30mg)。第二期(第181-360天)，如果甲氨蝶呤剂量依然保持在每周10到30mg之间，剂量可以被调整。

测定治疗的依从性

首期期间，在任何时间点研究药物的漏输数目≤2(表9)。二期期间，安慰剂组的受试者与CTLA4Ig(BMS-188667)组的受试者相比漏输次数略少。然而，在晚期时间点，安慰剂组受试者与CTLA4Ig(BMS-188667)受试者相比，前者中止得更多(见上文)。

表9

漏输研究药物的数目

	CTLA4Ig(BMS-188667)
				天	10mg/kg(n＝115)	2mg/kg(n＝105)	安慰剂(n＝119)
1天	0	0	0
				15天	1	1	0
30天	0	1	1
				60天	0	0	0
90天	0	0	0
				120天	0	1	2
150天	1	2	0
				180天	1	0	1
210天	4	0	0
				240天	1	2	1
270天	0	2	0
				300天	1	1	0
330天	0	0	0

伴随治疗

系统的(非局部的)类固醇使用在三个组中在筛选/入组期间(58-67％)和在首期研究期间(67-71％)是相当的，分别见表10和11。当第360天类固醇使用在所有三个治疗组中减少时，与其他两个组相比(对于2mg/kg CTLA4Ig和安慰剂组分别是53.3％和45.4％)，在10mg/kg CTLA4Ig组中有更多的受试者用系统的(非局部的)类固醇(63.5％)。筛选/入组期间有几个受试者(CTLA4Ig：0-3％，安慰剂：0-10％)接受DMARD而不是甲氨蝶呤。

表10

筛选/入组期间类风湿伴随治疗总结

	CTLA4Ig(BMS-188667)
				类风湿药物治疗，n(％)a	10mg/kg(n＝115)	2mg/kg(n＝105)	安慰剂(n＝119)
药物治疗前受试者的数目	114(99.1)	103(98.1)	118(99.2)
				甲氨蝶呤c	114(99.1)	103(98.1)	118(99.2)
系统的(非局部性)类固醇	67(58.3)	70(66.7)	75(63.0)
				其它DMARD	5(4.3)	6(5.7)	14(11.8)
柳氮磺吡啶	3(2.6)	1(1.0)	4(3.4)
				羟氯喹	2(1.7)	3(2.9)	12(10.1)
环孢霉素	1(0.9)	1(1.0)	2(1.7)
				依那西普	0	1(1.0)	0

^a药物的分类不相互排斥

表11

二个治疗期期间接受临床相关的伴随治疗的受试者

	CTLA4Ig(BMS-188667)
				药物治疗a	10mg/kg(n＝115)	2mg/kg(n＝105)	安慰剂(n＝119)
系统的(非局部的)类固醇(首期)	77(67.0)	71(67.6)	85(71.4)
				系统的(非局部的)类固醇(二期)	73(63.5)	56(53.3)	54(45.4)

^a药物的分类不相互排斥

注意：在第1天到第180天之间，受试者IM101100-83-3(10mg/kgCTLA4Ig)使用mefloquine，受试者IM101100-28-7(安慰剂)使用奎宁；在第181天到第360天之间，受试者IM101100-18-11(10mg/kg CTLA4Ig)使用奎宁，用作抗疟药，不被认为是一个有意义的方案破坏。

疗效结果

第180天和第360天，与安慰剂组相比，CTLA4Ig(BMS-188667)10mg/kg组有更好的疗效。对2mg/kg CTLA4Ig组来说，一些疗效参数结果比安慰剂组明显更好，其他大多数疗效参数比安慰剂组的值更高。

180天时的ACR响应

对这个研究的主要疗效变量——180天时的ACR20响应率的分析显示，10mg/kg CTLA4Ig组比安慰剂有意义的(p＜0.001)更有效(表12图71A和图71B)。

180天时10mg/kg CTLA4Ig组的ACR50和ACR70响应也是比安慰剂组明显更高(表12图71A和图71B)。180天时2mg/kg CTLA4Ig组的ACR50和ACR70响应也是比安慰剂组明显更高。180天时2mg/kgCTLA4Ig组的ACR20响应是比安慰剂组略高，然而，没有观察到统计学显著的差异。

表12

180时的ACR响应

	CTLA4Ig(BMS-188667)
					10mg/kg(n＝115)	2mg/kg(n＝105)	安慰剂(n＝119)
ACR 20
				n(％)	70(60.9)	44(41.9)	42(35.3)
CI	25.6(12.8，38.4)	6.6(-6.2，19.4)	N/A
				p-值	＜0.001a	0.31	N/A
ACR 50
				n(％)	42(36.5)	24(22.9)	14(11.8)

	CTLA4Ig(BMS-188667)
					10mg/kg(n＝115)	2mg/kg(n＝105)	安慰剂(n＝119)
CI	24.8(13.8，35.7)	11.1(1.2，20.9)	N/A
				p-值	＜0.001a	0.027a	N/A
ACR 70
				n(％)	19(16.5)	11(10.5)	2(1.7)
CI	14.8(7.5，22.2)	8.8(2.7，14.9)	N/A
				p-值	＜0.001a	0.005a	N/A

^a比较BMS-188667与安慰剂的统计学显著差异

360天时的ACR响应

180天时10mg/kg CTLA4Ig组的ACR20、ACR50和ACR70响应比安慰剂组明显(p＜0.001)更高(表13图72A和图72B)。尽管2mg/kg CTLA4Ig组的相同的响应率比安慰剂组在数值上更高，这些差异没有统计学显著性。

表13

360天时ACR响应

	CTLA4Ig(BMS-188667)
					10mg/kg(n＝115)	2mg/kg(n＝105)	安慰剂(n＝119)
ACR 20
				N(％)	72(62.6)	43(41.0)	43(36.1)
CI	26.5(13.7，39.3)	4.8(-7.9，17.6)	N/A
				P-值	＜0.001a	0.459	N/A
ACR 50

	CTLA4Ig(BMS-188667)
					10mg/kg(n＝115)	2mg/kg(n＝105)	安慰剂(n＝119)
N(％)	48(41.7)	23(21.9)	24(20.2)
				CI	21.6(9.7，33.4)	1.7(-8.9，12.4)	N/A
P-值	＜0.001a	0.75	N/A
				ACR 70
N(％)	24(20.9)	13(12.4)	9(7.6)
				CI	13.3(4.4，22.2)	4.8(-3.0，12.6)	N/A
P-值	0.003a	0.227	N/A

^a比较10/mg/kg CTLA4Ig与安慰剂的统计学显著差异

随访时的ACR响应

为了比较10mg/kg CTLA4Ig组与安慰剂组，90天时对于所有三个响应率(ACR 20、ACR 50和ACR 70)都观察到统计学显著的改进，直到和包括360天，在每个时间点这些值保持统计学显著性(对所有三个响应率p≤0.008)(图73A、图73B，和图73C)。事实上，10mg/kg CTLA4Ig组的ACR 50和ACR 70响应有统计学显著性的改进最早发生在第30天(相应p＝0.039和p＝0.04)。

第180天，对于2mg/kg CTLA4Ig组的ACR 50和ACR 70观察到与安慰剂相比有统计学显著性的改进(相应p＝0.027和p＝0.005)。第360天，2mg/kg CTLA4Ig组的ACR响应改进比安慰剂组略高，然而，没有观察到统计学显著的差异。

随访用Cochran-Mantel Haenszel检测调整后，观察到第180天和360天，10mg/kg CTLA4Ig组的ACR 20响应率，与安慰剂组相比有明显的差异。在这两个时间点上，2mg/kg CTLA4Ig和安慰剂组之间没有显著的差异。两个时间点的ACR 50响应得到相似的结果。对于两个时间点的ACR 70响应，与安慰剂组相比，对于两个CTLA4Ig(BMS-188667)治疗组观察到显著的差异。

主要(major)临床响应总结

主要临床响应被定义为：维持ACR 70响应超过连续6个月的时间。360天时10mg/kg和2mg/kg CTLA4Ig两个组中取得主要临床响应受试者的百分比(分别为7.8％和5.7％)与安慰剂组相比明显更高(0.8％；分别为p＝0.008和0.036)(表14)。

表14

360天时主要临床响应总结

	CTLA4Ig(BMS-188667)
					10mg/kg(n＝115)	2mg/kg(n＝105)	安慰剂(n＝119)
主要临床响应受试者的数目	9(7.8)	6(5.7)	1(0.8)
				差异(CI)	7.0(1.8，12.2)	4.9(0.3，9.4)	N/A
p-值	0.008a	0.036a	N/A

^a比较BMS-188667与安慰剂，表明统计学显著的差异。

平均数值ACR(ACR-N)和ACR-N曲线下面积(ACR-N-AUC)

总体上，研究的前6个月期间，所有治疗组的平均数值(ACR-N)随时间增加(图74)。在第二个6个月研究期间，10mg/kg CTLA4Ig组的平均数值(ACR-N)略增加，但是2mg/kg CTLA4Ig和安慰剂组保持相对不变。在每次研究随访，与2mg/kg CTLA4Ig和安慰剂组相比，10mg/kg CTLA4Ig组的ACR-N是一致性地更高。

与安慰剂组相比，第360天时10mg/kg CTLA4Ig组的ACR-N AUC值的差异明显的较高(p＜0.001)。

180天时自基线改进的百分比

对于10mg/kg CTLA4Ig组，180天时每个单个ACR因素(压痛和肿胀关节数、CRP、疼痛、受试者的全面评价、医生的全面评价和身体功能)的改进相对与安慰剂组的改进来说是明显的(表15)。

对于2mg/kg CTLA4Ig组，180天时，相比安慰剂组，在医生的全面评价和CRP中观察到有统计学显著性的改进。进一步，安慰剂组中的CRP水平在180天时实际上更为恶化。180天时，晨僵平均持续期自基线的改变在三个组中是相当的。

表15

180天时自基线的平均改进百分比(ACR标准的单个因素)

	CTLA4Ig(BMS-188667)
				因素	10mg/kg(n＝115)	2mg/kg(n＝105)	安慰剂(n＝119)
关节压痛	n＝114	n＝104	n＝118
				平均％变化	59.78*	43.15	31.88
关节肿胀	n＝114	n＝104	n＝118
				平均％变化	55.28*	45.34*	33.49
CRP	n＝108	n＝98	n＝114
				平均％变化	31.79*	16.41*	-23.43
疼痛	n＝109	n＝102	n＝118
				平均％变化	46.19*	22.09*	8.20
受试者的全面评价	n＝111	n＝103	n＝118
				平均％变化	40.76*	9.07	17.48
MD全面评价	n＝111	n＝103	n＝116
				平均％变化	51.91*	38.71*	25.14
身体功能	n＝107	n＝98	n＝110
				平均％变化	41.21*	21.63	13.71
晨僵持续期	n＝98	n＝82	n＝80
				平均±SD(分钟)	61.9±55.4	60.8±66.1	55.9±66.2

^*表示与安慰剂相比p＜0.05因为95％CI不包括零

360天时自基线改进的百分比

对于10mg/kg CTLA4Ig组，360天时每个单个ACR因素(压痛和肿胀关节数、CRP、疼痛、受试者的全面评价、医生的全面评价和身体功能)的改进是相对与安慰剂组的改进来说有统计学显著性的。360天时所有治疗组的ACR标准临床参数自基线的平均改进百分数见表16。

对于2mg/kg CTLA4Ig组，360天时，相比安慰剂组在医生的全面评价和CRP中观察到有统计学显著性的改进。进一步，安慰剂组的CRP水平在360天时实际上更为恶化。360天时，就晨僵平均持续期自基线的改变而言，CTLA4Ig(BMS-188667)组比安慰剂组有更大的变化。

表16

360天时自基线的平均改进百分比(ACR标准的单个成分)

	CTLA4Ig(BMS-188667)
				因素	10mg/kg(n＝115)	2mg/kg(n＝105)	安慰剂(n＝119)
关节压痛	n＝115	n＝105	n＝119
				平均％变化	66.39*	43.54*	29.97
关节肿胀	n＝115	n＝105	n＝119
				平均％变化	59.74*	46.40	36.17
CRP	n＝112	n＝98	n＝115
				平均％变化	27.59*	10.31*	-31.26
疼痛	n＝112	n＝104	n＝119
				平均％变化	44.93*	26.26	12.55
受试者的全面评价	n＝113	n＝105	n＝119
				平均％变化	41.01*	16.08	1.99
医生的全面评价	n＝113	n＝105	n＝119

	CTLA4Ig(BMS-188667)
				因素	10mg/kg(n＝115)	2mg/kg(n＝105)	安慰剂(n＝119)
平均％变化	53.48*	37.87*	24.14
				身体功能	n＝109	n＝100	n＝111
平均％变化	42.32*	22.94	10.25
				清晨僵直持续期	n＝88	n＝71	n＝72
平均±SD(分钟)	66.2±59.5*	66.6±72.2	49.7±73.9

^*与安慰剂相比指示p＜0.05因为95％CIs不包括零

新发活动性关节

用Smollen等(Smollen JS，Breedveld FC，Eberl G，Jones I et al.Validity and reliability of the twenty-eight-joint count for the assessment of RAactivity.Arthritis & Rheum 1993；38：38-43)建议的确认的28个关节数来确定新活动性关节的比例(相对于68个总压痛关节数和66个总肿胀关节数)。接受10mg/kg CTLA4Ig的受试者180天时的新发活动性关节数(包括压痛和肿胀)的比例是最低的(图75)。

第180天，在10mg/kg CTLA4Ig组中，报道的没有新发压痛和没有新发肿胀关节的受试者的比例是最高的(图76A、图77A)。在10mg/kgCTLA4Ig组中，报道的没有新发压痛和新发肿胀关节受试者的比例分别是大约59％和52％，在2mg/kg CTLA4Ig组中分别是大约38％和44％，在安慰剂组分别是大约41％和37％。

接受10mg/kg CTLA4Ig的受试者360天时的新发活动性关节数(包括压痛和肿胀)的比例是最低的(图78)。这个新发活动性关节比例模式反映了180天时所见的模式。

相似的，360天时在10mg/kg CTLA4Ig组中报道的没有新发压痛和没有新发肿胀关节受试者的比例是最高的(图76B、图77B)。在10mg/kgCTLA4Ig组中报道的没有新发压痛和没有新发肿胀关节的受试者的比例分别是大约71％和61％，在2mg/kg CTLA4Ig组中分别是大约41％和44％，在安慰剂组都是大约42％。

有ACR相应的受试者中临床参数的改进

在ACR 20、ACR 50和ACR 70响应者中，两个CTLA4Ig(BMS-188667)治疗组的ACR标准核心因素的改进比安慰剂组略高。

接受10mg/kg CTLA4Ig剂量的受试者，作用开始发生在大约15天后，ACR 20改进明显的增加出现在≥60天，ACR50在≥90天，ACR70在≥30天，每种情况都持续到第360天(见图73A、图73B和图73C)。

健康结果简表问答(SF-36)自基线的变化

用健康结果简表问答SF-36(在0-100范围总结得分，分高指示生活质量好)评估CTLA4Ig(BMS-188667)对健康相关生活质量的影响。分析对LOCF(最后执行的观察)数据组以及观察到的数据组进行。

对于10mg/kg CTLA4Ig组，与安慰剂组相比，180天时，在所有四个精神健康和所有四个身体健康的SF-36功能区(domain)中观察到统计学显著的自基线的改进，其中用LOCF分析(即95％Cis不包括零)(图79A、79B)。对于2mg/kg CTLA4Ig组，180天时观察到，相比安慰剂组，在精神健康或身体健康因素中在数值上有所改进，但是这些改进没有统计学显著性。

对观察到的数据(as-observed data set)进行分析的结果与对LOCF数据组的分析结果是相似的，除了180天时“精神作用”因素没有明显的改进(但是是在数字上的改进)，采用观察到的数据组(as-observed data set)比较10mg/kg CTLA4Ig和安慰剂组。

180天时身体和精神健康因素测定总结见表17。

表17

180天时对于SF-36(身体和精神健康因素)自基线的平均变化

	CTLA4Ig(BMS-188667)
				总结得分	10mg/kg(n＝115)	2mg/kg(n＝105)	安慰剂(n＝119)

	CTLA4Ig(BMS-188667)
				总结得分	10mg/kg(n＝115)	2mg/kg(n＝105)	安慰剂(n＝119)
精神健康因素	n＝115	n＝103	n＝118
				基线平均值	44.52	43.06	41.75
基线后平均值	48.69	45.59	44.04
				自基线的平均变化	4.17	2.53	2.30
95％CI	(2.46，5.88)	(0.39，4.67)	(0.42，4.17)
				身体因素	n＝115	n＝103	n＝118
基线平均值	31.13	30.80	32.33
				基线后平均值	39.30	35.47	35.21
自基线的平均变化	8.16	4.67	2.88
				95％CI	(6.33，9.99)	(3.25，6.09)	(1.54，4.22)

360天的健康指数(outcone)结果非常相似于180天所见的结果。对于10mg/kg CTLA4Ig组，相对与安慰剂组，360天时SF-36的所有四个精神健康和所有四个身体因素中观察到统计学明显的自基线的改进，其中用LOCF分析(即95％Cis不包括零)(图80A、80B)。对于2mg/kg CTLA4Ig组，360天时观察到相比安慰剂组在身体因素四个指标中有三个、在四个精神因素中有一个有有统计学显著的改进。

对观察到的数据组(as-observed data set)进行分析的结果与对LOCF数据组的观察到的结果是相似的。

360天时身体因素和精神健康因素指标总结见表18。

表18

360天时对于SF-36自基线的平均变化(身体因素和精神健康因素的总结)

	CTLA4Ig(BMS-188667)
				总得分	10mg/kg(n＝115)	2mg/kg(n＝105)	Placebo(n＝119)
精神健康因素	n＝115	n＝103	n＝118
				基线平均值	44.52	43.06	44.75
基线后(postbasline)平均值	48.83	45.65	43.22
				自基线的平均变化	4.31	2.59	1.47
95％CI	(2.64，5.98)	(0.64，4.55)	(-0.14，3.08)
				身体因素	n＝115	n＝103	n＝118
基线平均	31.13	30.80	32.33
				基线后平均	38.93	36.49	34.93
对应基线平均变化	7.79	5.69	2.60
				95％CI	(5.90，9.68)	(4.10，7.28)	(1.09，4.11)

生物标志物和药效学数据

180天时10mg/kg CTLA4Ig组中六个生物标志物/药效学(PD)参数中有五个有明显的改进(减少)(可溶性IL-2r，关节炎因子(RF)，ICAM-1，E-选择蛋白和IL-6)，以及TNF-α在值上减少(表19)。180天时，2mg/kg CTLA4Ig组中，六个生物标志物/药效学(PD)参数中有三个有明显的改进(减少)(可溶性IL-2r，关节炎因子(RF)，IL-6)，以及ICAM-1在值上有所改进。180天时安慰剂组中生物标志物/药效学(PD)参数没有一个有明显的改进。在生物标志物/药效学(PD)参数中，存在与改进(减少的)有剂量响应关系。

表19

180天时药效学测定

	CTLA4Ig(BMS-188667)
				参数	10mg/kg(n＝115)	2mg/kg(n＝105)	安慰剂(n＝119)
可溶性IL-2r(正常范围：640-2543pg/mL)	n＝95	n＝84	n＝76
				基线平均(±SD)	1426.19±751.76	1396.82±610.21	1429.13±667.84
基线后平均(±SD)	1112.62±699.68	1261.31±473.66	1470.03±637.75
				平均变化	-316.23	-135.51	43.59
95％CI	(-417.73，-214.72)	(-241.48，-29.53)	(-71.24，158.43)
				类风湿因子(正常范围：0-20IU/mL)	n＝95	n＝84	n＝74
基线平均(±SD)	289.71±401.95	256.19±307.92	196.11±265.48
				基线后平均(±SD)	185.43±269.52	227.82±276.27	204.36±320.09
平均变化	-104.27	-28.12	-0.62
				95％CI	(-151.53，-57.01)	(-52.13，-4.11)	(-31.67，30.43)
ICAM-1	n＝95	n＝82	n＝75
				基线平均(±SD)	404.89±137.72	393.47±150.85	387.33±230.93
基线后平均(±SD)	364.74±109.47	387.25±142.73	386.17±163.82
				平均变化	-40.42	-6.22	1.09
95％CI	(-58.06，-22.78)	(-27.49，15.05)	(-31.88，34.05)

	CTLA4Ig(BMS-188667)
				参数	10mg/kg(n＝115)	2mg/kg(n＝105)	安慰剂(n＝119)
E-选择蛋白	n＝89	n＝80	n＝71
				基线平均(±SD)	68.07±32.93	67.32±37.13	68.23±43.09
基线后平均(±SD)	61.01±31.53	67.86±40.20	67.37±35.66
				平均变化	-8.41	0.54	-0.68
95％CI	(-13.24，-3.58)	(-5.95，7.03)	(-6.87，5.51)
				血清IL-6(正常范围：0.3-14.8pg/mL)	n＝86	n＝74	n＝69
基线平均(±SD)	28.47±38.28	31.75±42.29	21.20±26.51
				基线后平均(±SD)	9.25±15.85	16.00±22.13	23.98±37.92
平均变化	-20.30	-16.10	1.98
				95％CI	(-27.55，-13.06)	(-24.20，-8.00)	(-7.21，11.17)
TNFα(1.2-8.0pg/mL)	n＝84	n＝74	n＝69
				基线平均(±SD)	11.17±23.72	7.51±13.25	13.12±23.20
基线后平均(±SD)	7.57±7.90	6.20±4.48	9.59±11.21
				平均变化	-3.66	-1.21	-3.54
95％CI	(-8.62，1.30)	(-4.32，1.90)	(-7.82，0.75)

总之，360天时的生物标志物/药效学(PD)数据的变化模式与180天时相似。10mg/kg CTLA4Ig组中六个生物标志物/PD参数中的五个有明显的改进(减少)(可溶性IL-2r，关节炎因子(RF)，ICAM-1，E-选择蛋白和IL-6)，以及TNF-α有数值的但没有统计学明显的减少(表20)。360天时2mg/kgCTLA4Ig组中IL-6有明显的改进，而RF和ICAM-1值的改进。这些结果显示所有生物标志物/药效学(PD)参数的改进以剂量响应关系出现。

比较180天和360天的基线后平均值，展示一个重要的趋势。10mg/kgCTLA4Ig组所有的生物标志物/药效学(PD)参数继续减少，除了可溶性IL-2r略增加。2mg/kg CTLA4Ig组生物标志物/药效学(PD)参数中的三个的平均值，或略减少(ICAM-1，血清IL-6)，或保持相对稳定(E-选择蛋白)，其他三个的平均值略增加(可溶性IL-2r，RF，TNFα)。安慰剂组所有生物标志物/药效学(PD)参数的平均值都略增加，除了TNF α保持相对不变。

表20

360天时药效学测定

	CTLA4Ig(BMS-188667)
				参数	10mg/kg(n＝115)	2mg/kg(n＝105)	安慰剂(n＝119)
可溶性IL-2r(正常范围：640-2543pg/mL)	n＝68	n＝56	n＝55
				基线平均(±SD)	1372.10±770.11	1373.86±567.75	1459.93±695.07
基线后平均(±SD)	1185.51±638.95	1413.84±452.50	1666.59±611.97
				平均变化	-194.31	39.99	206.22
95％CI	(-305.67，-82.96)	(-69.87，149.84)	(35.88，376.56)

类风湿因子(正常范围：0-20IU/mL)	n＝69	n＝55	n＝58
				基线平均(±SD)	261.43±333.58	258.42±318.65	179.12±207.72
基线后平均(±SD)	143.13±180.80	236.61±287.36	206.42±256.27
				平均变化	-118.30	-25.64	20.90
95％CI	(-175.19，-61.42)	(-58.50，7.23)	(-10.72，52.51)
				ICAM-1	n＝77	n＝68	n＝64
基线平均(±SD)	406.44±145.22	393.41±132.97	405.67±245.16
				基线后平均(±SD)	354.90±111.40	380.42±113.20	405.07±194.15
平均变化	-55.15	-12.98	1.47
				95％CI	(-74.80，-35.49)	(-35.36，9.39)	(-26.41，29.35)
E-选择蛋白	n＝75	n＝68	n＝62
				基线平均(±SD)	68.84±34.38	66.75±37.10	69.72±44.38
基线后平均(±SD)	58.77±26.61	67.58±31.50	71.90±47.43
				平均变化	-10.89	0.83	2.34
95％CI	(-15.70，-6.08)	(-5.62，7.28)	(-4.53，9.20)
				血清IL-6(正常范围：0.3-14.8pg/mL)	n＝56	n＝47	n＝48

基线平均(±SD)	27.68±38.56	27.19±32.45	17.27±22.47
				基线后平均(±SD)	7.64±14.21	13.93±19.00	17.72±29.76
平均变化	-20.88	-12.72	-0.19
				95％CI	(-31.56，-10.19)	(-22.49，-2.94)	(-7.55，7.18)
TNFα(1.2-8.0pg/mL)	n＝61	n＝48	n＝50
				基线平均(±SD)	9.71±22.80	6.27±3.62	10.81±21.24
基线后平均(±SD)	6.67±4.80	7.18±8.14	9.36±26.43
				平均变化	-3.02	1.08	-1.41
95％CI	(-8.70，2.67)	(-1.26，3.42)	(-5.14，2.33)

用图显示这些生物标志物/药效学(PD)参数，以及CRP水平的变化，见图81到87。

为了评价设计的分析的完整性，所有接受了治疗但不管以任何理由中止了试验的受试者，在紧随中止的所有定期研究中，被认作ACR非响应者。这些分析结果(表21)与已显示的有效性结果一致。180天时接受10mg/kgCTLA4Ig并实现ACR 20、ACR 50或ACR 70响应率的受试者比例与接受安慰剂的受试者比例相比明显(p＜0.001)更高。对于2mg/kg CTLA4Ig组，实现ACR 50或ACR 70响应率的受试者比例明显(p≤0.009)更高。

表21

180天时ACR响应(未完成者等于未响应者)

	CTLA4Ig(BMS-188667)
					10mg/kg(n＝115)	2mg/kg(n＝105)	安慰剂(n＝119)

	CTLA4Ig(BMS-188667)
					10mg/kg(n＝115)	2mg/kg(n＝105)	安慰剂(n＝119)
ACR 20，n(％)	67(58.3)	41(39.0)	38(31.9)
				差异(CI)	26.3(13.6，39.1)	7.1(-5.4，19.7)	N/A
p-值	＜0.001a	0.266	N/A
				ACR 50，n(％)	41(35.7)	24(22.9)	12(10.1)
差异(CI)	25.6(14.8，36.3)	12.8(3.1，22.4)	N/A
				p-值	＜0.001a	0.009a	N/A
ACR 70，n(％)	19(16.5)	11(10.5)	2(1.7)
				差异(CI)	14.8(7.5，22.2)	8.8(2.7，14.9)	N/A
p-值	＜0.001a	0.005a	N/A

^a表示BMS-188667与安慰剂相比有统计学显著的差异

另外，所有初期有效性分析采用WOCF(提呈最坏结果)数据组。根据WOCF数据组，ACR响应比表13报告的那些略低，与表21所示的数据相当。这些发现肯定了CTLA4Ig(BMS-188667)治疗组中的ACR响应率的一致性。

第6和12个月，收集抗类风湿伴随药物治疗的剂量，来评估对这些药物治疗剂的需求。然而，获得的数据不适宜用于这些分析。仅仅提供了甲氨蝶呤和系统(非局部性)类固醇平均剂量的基线值。

有效性结论

第180天和360天，10mg/kg CTLA4Ig(BMS-188667)(+MTX)组比安慰剂组有更高的有效性。对下列有效性参数来说，给予10mg/kg CTLA4Ig比安慰剂明显更好：

·初期有效性变量：180天时的ACR20响应(p＜0.001)

·180天时ACR50和ACR70响应(p＜0.001)

·360天时ACR20、ACR50和ACR70响应(p≤0.003)

·30天时观察到ACR50和ACR70响应的统计学明显的差异(p＝0.039和p＝0.04)，90天时观察到所有三个响应率(ACR 20、ACR50和ACR70)的统计学明显的差异；在每个时间点这些差异保持统计学显著性，直到和包括360天。

·360天时实现主要临床响应(维持ACR 70响应超过连续6个月)的受试者的比例(p＝0.008)

·360天时平均数值ACR-AUC(p＜0.001)

·180天和360天时单个ACR因素的平均改进百分比(p＜0.05，95％CIs不包括0)

·180天和360天时健康指数评价(SF-36)的所有四个精神健康和有四个身体因素的改进(p＜0.05，95％CIs不包括0)

除了上述的统计学显著性的差异，180天和360天时与安慰剂组相比，10mg/kg CTLA4Ig组中报道更低的新发活动性关节数和更高的没有新压痛关节和没有新肿胀关节的受试者数目的报道。

与安慰剂组相比，10mg/kg CTLA4Ig组在几乎所有测定的药效学参数(可溶性IL12r，RF，ICAM-1，E-选择蛋白和IL-6)中有明显的改进，以及TNF-α的数值改进，持续到一年。

对于2mg/kg CTLA4Ig组，一些有效性参数比安慰剂组明显更好：

·180天时ACR50响应(p＝0.027)

·180天时ACR70响应(p＝0.005)

·60天时观察到ACR70统计学明显的差异(p＝0.032)，以及180天时ACR50和ACR 70统计学明显的差异(p＝0.027和p＝0.005)

·360天时实现主要临床响应(维持ACR 70响应超过连续6个月)的受试者的比例(p＝0.036)

·180天和360天时单个ACR因素中一些的平均改进百分比(p＜0.05，95％CIs不包括0)

对许多其它有效性参数来说，2mg/kg CTLA4Ig比安慰剂组在数值上更好。

安全结果

总体上讲，CTLA4Ig(BMS-188667)的安全性结果与安慰剂相似。没有大的安全问题。

临床实验室评价

总体上讲，没有新的安全性问题产生于对实验室值的平均改变的评估。研究过程中，血红蛋白、白细胞、嗜中性粒细胞、血小板、ALT、AST、GGT和总蛋白的平均值在基线的正常范围，而且保持在正常范围。总之，实验室测定的结果没有显示一致性的超范围值，或有利于研究药物治疗的异常趋势。

生命体征、身体发现和有关安全性的观察

每天给研究药物时，在给药前和输注后15、30、45、60、75、90和120分钟测定生命体征(体温、心率和坐姿血压)。总体上，所有治疗组的平均值都在正常范围，而且在整个360天研究期间保持稳定。

实施例8

尽管模拟人急性冠状动脉整体征的动物模型尚不存在，在动物模型中使用CTLA4Ig或L104EA29YIg来抑制动脉粥样硬化是可能的。采用鼠CTLA4Ig，抑制维持高脂肪饮食的脂蛋白(apolipoprotein)E空(apoE-/-)小鼠的动脉粥样硬化的能力，而且没有给一个刺激因子(例如感染性制剂、细胞因子)来激发炎症反应。可以预测：在这个动物模型中，与接受安慰剂注射的鼠相比，CTLA4Ig可能产生动脉粥样硬化斑的减少。

实施例9

在数个病人群体中研究使用CTLA4Ig或L104EA29YIg的潜力。

有不稳定性心绞痛、非ST段抬高性心肌梗死(非-STEMI)，以及潜在炎症证据(例如hsCRP增高)而进医院的病人，被随机分组接受安慰剂或CTLA4Ig/L104EA29YIg。病人接受标准药物或介入治疗的背景治疗，这是遵守伦理要求的并符合美国心脏协会/美国心血管协会大部分最新的条款。初期目标(endpoint)将是一个临床的整体结果：反映在随后的病人发病率和死亡率的减少/或者随后风险的减少，如通过hsCRP测定(或其他炎症标志物)那样。

Claims (29)

1.一种治疗心血管疾病的方法，包括给予受试者有效量的分子，所述分子可以阻断B7与CTLA4和/或CD28的相互作用。

2.权利要求1的方法，其中所述的阻断B7与CTLA4和/或CD28的相互作用的分子是可溶性CTLA4分子。

3.权利要求1的方法，其中所述的心血管疾病选自以下疾病组成的组：动脉粥样硬化、冠心病(CHD)、再狭窄病变、外周动脉疾病、冠状动脉旁路移植术、颈动脉疾病、动脉炎症、心肌炎、心血管炎症、脉管炎症、不稳定性心绞痛(UA)、顽固性不稳定性心绞痛、稳定性心绞痛(SA)、慢性稳定性心绞痛、急性冠状动脉综合征(ACS)、心肌梗塞、急性心肌梗塞(AMI)，包括首发或复发性心肌梗塞、非Q波心肌梗塞、非ST段抬高性心肌梗塞和ST段抬高性心肌梗塞。

4.权利要求3的方法，其中所述的心血管疾病是选自以下疾病组成：动脉粥样硬化、冠心病(CHD)、不稳定性心绞痛(UA)、顽固性不稳定心绞痛、稳定性心绞痛(SA)、慢性稳定性心绞痛、急性冠状动脉综合征(ACS)、心肌梗塞、急性心肌梗塞(AMI)，包括首发或复发性心肌梗塞、非Q波心肌梗塞、非ST段抬高性心肌梗塞和ST段抬高性心肌梗塞。

5.权利要求1的方法，其中所述的心血管疾病由T细胞与B7阳性细胞的相互作用所介导。

6.权利要求1的方法，其中所述的心血管疾病与至少一种炎症标志物相关联。

7.权利要求6的方法，其中所述的炎症标志物选自下列物质组成的组：CRP、hsCRP、IL-10，CD40L，sCD40L、IL-6、sICAM-1、TNF-α、白细胞计数、纤维蛋白原及血清淀粉样蛋白A。

8.权利要求7的方法，其中所述的炎症标志物选自下列物质组成的组：CRP、hsCRP、IL-6、和TNF-α。

9.权利要求2的方法，其中所述可溶性CTLA4的有效量是大约0.1到100mg/kg受试者体重，大约0.5到100mg/kg受试者体重，大约0.5到5mg/kg受试者体重，大约5到10mg/kg受试者体重，大约10到15mg/kg受试者体重，大约15到20mg/kg受试者体重，大约20到25mg/kg受试者体重，大约25到30mg/kg受试者体重，大约30到35mg/kg受试者体重，大约35到40mg/kg受试者体重，大约40到45mg/kg受试者体重，大约45到50mg/kg受试者体重，大约50到55mg/kg受试者体重，大约55到60mg/kg受试者体重，大约60到65mg/kg受试者体重，大约65到70mg/kg受试者体重，大约70到75mg/kg受试者体重，大约75到80mg/kg受试者体重，大约80到85mg/kg受试者体重，大约85到90mg/kg受试者体重，大约90到95mg/kg受试者体重，大约95到100mg/kg受试者体重，大约2到10mg/kg受试者体重，大约0.1到4mg/kg受试者体重，大约0.1到0.5mg/kg受试者体重，大约0.5到1.0mg/kg受试者体重，大约1.0到1.5mg/kg受试者体重，大约1.5到2.0mg/kg受试者体重，大约2.0到2.5mg/kg受试者体重，大约2.5到3.0mg/kg受试者体重，大约3.0到3.5mg/kg受试者体重，大约3.5到4.0mg/kg受试者体重，大约4.0到4.5mg/kg受试者体重，大约4.5到5.0mg/kg受试者体重，大约5.0到5.5mg/kg受试者体重，大约5.5到6.0mg/kg受试者体重，大约6.0到6.5mg/kg受试者体重，大约6.5到7.0mg/kg受试者体重，大约7.0到7.5mg/kg受试者体重，大约7.5到8.0mg/kg受试者体重，大约8.0到8.5mg/kg受试者体重，大约8.5到9.0mg/kg受试者体重，大约9.0到9.5mg/kg受试者体重，大约9.5到10.0mg/kg受试者体重，大约0.1到2mg/kg受试者体重，大约2到4mg/kg受试者体重，大约4到6mg/kg受试者体重，大约6到8mg/kg受试者体重，大约8到10mg/kg受试者体重，大约10到12mg/kg受试者体重，大约12到14mg/kg受试者体重，大约14到16mg/kg受试者体重，大约16到18mg/kg受试者体重，大约18到20mg/kg受试者体重，大约0.5mg/kg受试者体重，2mg/kg受试者体重，10mg/kg受试者体重，大约0.5到100mg/kg受试者体重，大约0.5到10mg/kg受试者体重，大约0.1到20mg/kg受试者体重，对于体重低于60kg的受试者为大约500mg，对于体重介于60-100kg的受试者为750mg，或者对于体重超过100kg的受试者为1000mg。

10.权利要求2的方法，其中所述可溶性CTLA4分子包含CTLA4分子胞外结构域或其一部分，该可溶性CTLA4分子结合在活化的B细胞上表达的B7抗原。

11.权利要求10的方法，其中CTLA4分子的胞外结构域包含图23所示的氨基酸，所述的氨基酸从+1位的甲硫氨酸或从-1位的丙氨酸开始，在124位的天冬氨酸终止。

12.权利要求2的方法，其中所述可溶性CTLA4分子是融合分子。

13.权利要求11的方法，其中所述CTLA4融合分子包含与活化的B细胞上表达的B7抗原相结合的CTLA4分子的胞外结构域，所述B细胞连接于非CTLA4分子。

14.权利要求13的方法，其中所述CTLA4分子的胞外结构域包含图23所示的氨基酸，所述的氨基酸从+1位的甲硫氨酸或从-1位的丙氨酸开始，以124位的天冬氨酸终止。

15.权利要求13的方法，其中所述非CTLA4分子包含氨基酸序列，该序列改变可溶性CTLA4分子的溶解性或亲和性。

16.权利要求15的方法，其中改变溶解性或亲和性的氨基酸序列包含免疫球蛋白部分。

17.权利要求16的方法，其中所述免疫球蛋白部分包含一个或多个突变以减少效应子功能。

18.权利要求16的方法，其中所述免疫球蛋白部分包含铰链区，且该铰链区中的任意或全部半胱氨酸残基被丝氨酸取代。

19.权利要求16的方法，其中所述免疫球蛋白部分是免疫球蛋白恒定区或其一部分。

20.权利要求19的方法，其中所述免疫球蛋白恒定区或其一部分被突变，以降低效应子功能。

21.权利要求19的方法，其中所述免疫球蛋白恒定区或其一部分包含免疫球蛋白分子的铰链区，CH2区和CH区。

22.权利要求19的方法，其中所述免疫球蛋白恒定区或其一部分是人或者猴免疫球蛋白的恒定区或其一部分。

23.权利要求12的方法，其中所述CTLA4融合分子是CTLA4Ig。

24.权利要求23的方法，其中所述CTLA4Ig显示于图24，其从+1位的甲硫氨酸或者-1位的丙氨酸开始，于+357位的赖氨酸终止。

25.权利要求2的方法，其中所述可溶性CTLA4分子是可溶性CTLA4突变分子。

26.权利要求25的方法，其中所述可溶性CTLA4突变分子与活化的B细胞上表达的B7抗原结合，并且在CTLA4分子的胞外结构域中包含突变。

27.权利要求25的方法，其中所述可溶性CTLA4突变分子包含CTLA4的胞外结构域，

a)其中CTLA4胞外结构域如图23所示，于+1位的甲硫氨酸或-1位的丙氨酸开始，以+124位的天冬氨酸终止，且

b)其中在CTLA4胞外结构域的+104位，亮氨酸被任意其他氨基酸取代

28.权利要求25的方法，其中所述可溶性CTLA4突变分子包含CTLA4胞外结构域，

a)其中CTLA4胞外结构域如图23所示，于+1位的甲硫氨酸或-1位的丙氨酸开始，于+124位的天冬氨酸终止，

b)其中在CTLA4胞外结构域的+104位，亮氨酸被谷氨酸取代，

c)其中在CTLA4胞外结构域的+29位，丙氨酸被酪氨酸取代。

29.权利要求25的方法，其中可溶性CTLA4突变分子是图19所示的L104EA29YIg，其于+1位的甲硫氨酸或-1位的丙氨酸开始，于+357位的赖氨酸终止。

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