WO2023112992A1 - 免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を処置するための医薬組成物 - Google Patents

免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を処置するための医薬組成物 Download PDF

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WO2023112992A1
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disease
mice
sctla
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一直 大崎
志文 坂口
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • the present disclosure relates to pharmaceutical compositions for treating diseases, disorders or conditions associated with abnormalities of the immune system.
  • CTLA-4 Cytotoxic T lymphocyte antigen 4
  • Treg regulatory T cells
  • Activated effector T cells also express CTLA-4, and a feedback mechanism works to prevent an excessive immune response.
  • CTLA-4 is known to have two splicing variants that can bind to the co-stimulatory molecule CD80/86, one with a transmembrane domain encoded by exon 3 and anchored in the cell membrane. is mCTLA-4 that is used. The other is sCTLA-4, which does not have exon 3 for secretion. However, most studies on CTLA-4 do not distinguish the role of each CTLA-4 variant in immune homeostasis.
  • CTLA-4 Based on the discovery of the action of secretory CTLA-4 in vivo, the present inventors discovered that CTLA-4, a nucleic acid encoding it, a functional equivalent thereof, or a factor that induces at least one of them. Pharmaceutical compositions have been found to be relevant for immune regulation.
  • M2-type macrophages can be induced under inflammation, and wound healing can be promoted. M2-type macrophages also express cytokines and molecules that negatively regulate immunity, suppress inflammation, and can achieve tissue repair and remodeling.
  • the present disclosure provides: (Item 1) A pharmaceutical composition comprising CTLA-4 or a nucleic acid encoding it, or a functional equivalent thereof, or a factor that induces at least one thereof, for treating or preventing a wound, or a disease, disorder or condition associated with wound thing. (Item 2) The pharmaceutical composition according to item 1, wherein the CTLA-4 comprises at least one selected from the group consisting of secretory CTLA-4 and membranous CTLA-4. (Item 3) A pharmaceutical composition according to any one of the preceding items, wherein said CTLA-4 comprises secretory CTLA-4. (Item 4) A pharmaceutical composition according to any one of the preceding items, which is administered topically.
  • (Item 5) A pharmaceutical composition according to any one of the preceding items, administered systemically.
  • (Item 6) A pharmaceutical composition according to any one of the preceding items, administered in combination with an antibiotic, antifungal, or antiviral agent.
  • (Item 7) A combination comprising CTLA-4 and an antibiotic for treating or preventing a wound, or a disease, disorder or condition associated with a wound.
  • (Item D1) A pharmaceutical composition comprising secretory CTLA-4 or nucleic acid encoding it, or functional equivalents thereof, or an agent that induces at least one thereof, for treating or preventing a disease, disorder, or condition.
  • (Item D2) The pharmaceutical composition according to any of the preceding items, wherein said functional equivalent comprises a protein or peptide comprising the MYPPPY motif region encoded by Exon2 of the CTLA-4 gene, and a dimer or multimer of said protein or peptide.
  • the functional equivalent includes a protein expressed by replacing the signal sequence encoded by Exon1 of the CTLA-4 gene with another signal sequence of homologous or heterologous origin.
  • pharmaceutical composition of (Item D4) A pharmaceutical composition according to any one of the preceding items, which is administered topically.
  • (Item D5) A pharmaceutical composition according to any one of the preceding items, administered systemically.
  • (Item D6) A pharmaceutical composition according to any one of the preceding items, administered in combination with an antibiotic, antifungal, or antiviral agent.
  • (Item A1) secretory CTLA-4 or nucleic acids encoding it, or functional equivalents thereof, or factors that induce at least one of them, for treating or preventing a disease, disorder, or condition associated with an abnormality of the immune system
  • a pharmaceutical composition comprising: (Item A2) The pharmaceutical composition according to any of the preceding items, wherein the disease, disorder or condition associated with an abnormality of the immune system includes an immune system disease associated with inflammation.
  • the disease, disorder or condition associated with an abnormality of the immune system comprises a disease, disorder or condition associated with an autoimmune disease.
  • a pharmaceutical composition according to any one of the preceding items, wherein the disease, disorder or condition associated with an abnormality of the immune system comprises an allergy-related disease, disorder or condition.
  • composition of (Item A6) Any one of the preceding items, wherein the functional equivalent comprises a protein or peptide comprising the MYPPPY motif region encoded by Exon2 of the CTLA-4 gene, and dimers or multimers of said protein or peptide.
  • pharmaceutical composition of (Item A7) Any one of the above items, wherein the functional equivalent includes a protein expressed by replacing the signal sequence encoded by Exon1 of the CTLA-4 gene with another signal sequence of homologous or heterologous origin.
  • pharmaceutical composition of (Item A8) A pharmaceutical composition according to any one of the preceding items, which is administered topically.
  • (Item A9) A pharmaceutical composition according to any one of the preceding items, administered systemically.
  • (Item A10) A pharmaceutical composition according to any one of the preceding items, administered in combination with an antibiotic, antifungal, or antiviral agent.
  • (Item B1) A method of screening for agents to treat or prevent a wound, or a disease, disorder or condition associated with a wound, comprising: contacting the cell with a candidate substance; measuring the expression level of CTLA-4 in the cell or on the cell surface; selecting said candidate agent that increases the amount or level of CTLA-4 in said cell or on said cell surface compared to prior to contact with said candidate agent.
  • (Item C1) A method of screening for agents to treat or prevent a disease, disorder or condition associated with an abnormality of the immune system, comprising: contacting the cell with a candidate substance; measuring the expression level of secretory CTLA-4 in the cell or outside the cell; selecting said candidate agent that increases the amount or level of secreted CTLA-4 in said cell or extracellularly compared to prior to contact with said candidate agent.
  • (Item E1) A method for treating or preventing a wound, or a disease, disorder or condition associated with a wound, in a subject, comprising the induction of CTLA-4 or nucleic acids encoding it, or functional equivalents thereof, or at least one thereof.
  • a pharmaceutical composition comprising an agent that (Item F1)
  • an agent that (Item F1) A method for treating or preventing a disease, disorder or condition in a subject comprising secreted CTLA-4 or nucleic acids encoding same, or functional equivalents thereof, or factors that induce at least one thereof
  • a method comprising administering a pharmaceutical composition to said subject.
  • (Item G1) A method for treating or preventing a disease, disorder or condition associated with an abnormality of the immune system in a subject comprising secretory CTLA-4 or nucleic acids encoding same, or functional equivalents thereof, or at least one thereof administering to the subject a pharmaceutical composition comprising an agent that induces (Item H1) Induction of CTLA-4 or nucleic acids encoding it, or functional equivalents thereof, or at least one thereof, for the manufacture of a medicament for treating or preventing a wound, or a disease, disorder, or condition associated with wound Use of factors that (Item I1) Use of secretory CTLA-4 or a nucleic acid encoding it, or a functional equivalent thereof, or a factor that induces at least one thereof, for the manufacture of a medicament for treating or preventing a disease, disorder, or condition .
  • a pharmaceutical composition comprising an agent that induces (Item H1) Induction of CTLA-4 or nucleic acids encoding it, or functional equivalents thereof, or at least one thereof,
  • (Item J1) Secretory CTLA-4 or nucleic acids encoding same, or functional equivalents thereof, or at least one thereof, for the manufacture of a medicament for treating or preventing a disease, disorder, or condition associated with an abnormality of the immune system Use of factors that induce one.
  • the present disclosure provides CTLA-4 or nucleic acids encoding it, or functional equivalents thereof, or agents that induce at least one of them, for treating or preventing wounds, or diseases, disorders or conditions associated with wounds.
  • a pharmaceutical composition comprising Since the pharmaceutical composition of the present disclosure is involved in immune regulation, it can be expected not only to treat diseases associated with immune system abnormalities, but also to repair and remodel tissues destroyed by autoimmune diseases and the like.
  • mice After electroporation of ES cells to induce homologous recombination to generate chimeric mice, the mice were crossed with FLPeR mice carrying the FLP1 recombinase gene to delete the neo cassette.
  • the progeny are S+M-knockin mice.
  • a schematic representation of the CTLA-4 locus in sCTLA-4(S)+mCTLA-4(M)+wild-type, S+M- and SM- mice is also shown. Co-staining of CTLA-4 and Foxp3 in CD4+ T cells after stimulation with PMA/ionomycin/monensin for 4 hours. Increased circulating CTLA-4 protein in S+M- mice. Exon3 is skipped in CTLA_4 mRNA of S+M- mice.
  • CD4 T cell sCTLA-4 (with primers that span the exon2-4 junction) and mCTLA-4 (with primers that span the exon3-4 or exon2-3 junction) in splenocytes and lymphocytes of 3-week-old mice ) was measured.
  • Relative FPKM values of M1/M2-related genes in peritoneal macrophages are shown by color-coded matrices. Expression comparison of typical genes induced by IL-4 and IL-13 in macrophages. Serum concentrations of IL-5 and IL-4. Percentage of IL-5-producing cells in Foxp3-CD4+ blood cells stimulated with PMA/ionomycin/monensin for 5 hours. Percentage of IL-4-producing cells in Foxp3-CD4+ blood cells stimulated with PMA/ionomycin/monensin for 5 hours. Percentage of eosinophils among CD45+ blood cells. Siglec-F expression of eosinophils infiltrating the spleen.
  • IL-4 mRNA expression in eosinophils isolated from spleen Serum concentrations of eotaxin (CCL11) and CCL22. CCL24 expression levels in peritoneal macrophages. Increased CD206 expression in alveolar macrophages of S+M- mice. CD80 MFI and CD206 MFI of splenic macrophages from SM- mice cultured with IL-4 and IL-10 for 24 hours. Serum IL-33 was not elevated in S+M- mice. Serum TSLP was not elevated in S+M- mice. Innate lymphocytes (ILCs) were not elevated in the blood of S+M- mice.
  • ILCs Innate lymphocytes
  • Innate lymphocytes were not elevated in the mesentery of S+M- mice. Basophils and c-Kit+ cells were not increased in CD45+ blood cells of S+M- mice. Th2 and Th1 differentiation in the presence of CD80/86 blocking antibodies. Naive T cells were stimulated with anti-CD80 mAb and anti-CD86 mAb with anti-CD3 mAb and T-cell depleted splenocytes (mainly antigen-presenting cells) for 3 days under either Th2 or Th1 conditions, followed by PMA/ionomycin/monensin. After stimulation for 5 hours, the rate of Th2 or Th1 differentiation was examined.
  • Th2 or Th1 differentiation were calculated as 100% for conditions that did not block CD80 or CD86.
  • Th2 and Th1 differentiation in the presence of sCTLA-4 recombinant protein.
  • Naive T cells were stimulated with anti-CD3 mAb and T-cell depleted splenocytes (mainly antigen presenting cells) for 3 days using sCTLA-4 WT (wild type), sCTLA-4 Y139A (mutant) or CTLA-4 Ig After that, the cells were stimulated with PMA/ionomycin/monensin for 5 hours, and the rate of Th2 or Th1 differentiation was examined.
  • the percentage of Th2 or Th1 cell differentiation was calculated with the condition using CTLA-4 Y139A (negative control) as 100%.
  • Dose-response curve of inhibitory effect on Th1 differentiation by sCTLA-4 WT and CTLA-4 Ig The rate of Th1 differentiation was calculated with the condition using CTLA-4 Y139A (negative control) as 100%. * indicates P ⁇ 0.05, *** indicates P ⁇ 0.001, and *** indicates P ⁇ 0.0001 compared to sCTLA-4 Y139A.
  • sCTLA-4 WT 5 ⁇ g/mL
  • sCTLA-4 Y139A 5 ⁇ g/mL
  • CTLA-4 Ig 5 ⁇ g/mL
  • IL-4 10 ng/mL
  • CD206 Arg1 and iNOS mRNA expression.
  • CD206 Fizz1, iNOS and IL-6 mRNA expression in CD45+Siglec-F-Ly6G-CD11b+F4/80+ macrophages isolated from colon. Suppression of colitis by sCTLA-4. 6-week-old combined immunodeficient mice (C.B17/Icr-scid) were injected with CD45RB high naive T cells isolated from CD45.1 congenic mice alone (filled circles) or 3-week-old DEREG S+M- (open circles). , with Foxp3+ (GFP+) CD4+ Tregs isolated from DEREG S ⁇ M ⁇ (open triangles) or DEREG S+M+ mice (open squares).
  • the body weight on the day of cell adoptive transfer (Day 0) was calculated as 100%.
  • Adoptively transferred C Colon hematoxylin and eosin-stained sections of B17/Icr-scid mice after 8 weeks. Colitis was scored histologically. Kruskal-Wallis test and Dunn's multiple comparison test were applied to the data. Suppression of tumor immunity by sCTLA-4. C57BL/6 mice were subcutaneously injected with wild-type sCTLA-4 (sCTLA-4 WT), Y139A mutant sCTLA-4 (sCTLA-4 Y139A) or B16F10 melanoma cells producing CTLA-4 Ig. The long and short sides of the tumor were measured every other day.
  • Tumor area was calculated using the two diameters.
  • the dark bold line represents the average growth curve of individual dotted tumors (n number is indicated in the legend).
  • Statistical significance between sCTLA-4 WT B16F10 and sCTLA-4 Y139A B16F10 was shown on days 6, 8, 11, 13 and 15 after inoculation (* indicates P ⁇ 0.0005).
  • Suppression of tumor immunity by sCTLA-4 is an effect on T cells.
  • Nude mice were subcutaneously administered wild-type sCTLA-4 (sCTLA-4 WT), Y139A mutant sCTLA-4 (sCTLA-4 Y139A) or B16F10 melanoma cells producing CTLA-4 Ig. The long and short sides of the tumor were measured every other day.
  • BAC E. coli artificial chromosome
  • BAC transgenic mice were bred with SM- mice to generate SM+ mice.
  • sCTLA-4 is not expressed in CD4+ T cells of 6-week-old SM+ mice, but mCTLA-4 is expressed.
  • CD8+ T cells in the spleen, mesenteric lymph nodes, or superficial lymph nodes were stimulated with PMA/ionomycin/monensin for 5 hours and co-stained for IFN ⁇ and Eomes.
  • CD4+ T cells from the spleen, mesenteric lymph nodes, or superficial lymph nodes were stimulated with PMA/ionomycin/monensin for 5 hours and co-stained for IFN ⁇ and IL-17A.
  • sCTLA-4 plays an important role in wound healing.
  • the average value of two wound areas (mm 2 ) on the back of each mouse on day 1 (d1), day 3 (d3), and day 5 (d5) after wounding was measured from the images.
  • sCTLA-4 plays an important role in the re-epithelialization process after wounding.
  • K14+ epidermal basal keratinocytes (green) and DAPI (blue) were visualized by immunofluorescence staining in wound skin sections on day 5 (d5).
  • Re-epithelialization was quantified by the length of K14+ epidermal keratinocytes that migrated from the wound edge under the wound during wound healing to proliferate and seal the wound (epitongue length). Arrows indicate wound edges at time points (day 1) that have not yet shown signs of re-epithelialization.
  • External observation of wound healing using 30-week-old mice. A 6 mm biopsy punch was used to make two wounds per mouse on the dorsal skin of 30-week-old S ⁇ M+ mice (indicating autoimmune pathology) and S+M+ mice (n 8 each). The average value of two wound areas (mm 2 ) on the back of each mouse on day 1 (d1), day 3 (d3), and day 5 (d5) after wounding was measured from the images.
  • Follicular helper T cells (Tfh: Bcl-6+CXCR5+Foxp3-CD44+CD4+B220- (FIG. 7B) or PD-1+CXCR5+Foxp3-CD44+CD4+B220-) were increased in Peyer's patches and mesenteric lymph nodes of S-M+ mice (FIG. 7C). ). Follicular helper T cells (Tfh: Bcl-6+CXCR5+Foxp3-CD44+CD4+B220- (FIG.
  • sCTLA-4 suppresses the progression of allergic pathology in healthy mice.
  • OVA-induced asthma experiments in the lung were performed according to the scheme shown in the figure.
  • a significant increase in allergic-reactive GATA3+Th2 was seen in healthy 8-week-old S-M+ mice who had not yet exhibited autoimmune pathology.
  • a significant increase in allergic-reactive GATA3+Th2 was seen in healthy 8-week-old S-M+ mice not exhibiting autoimmune pathology.
  • amino acid residues are represented by the following abbreviations.
  • Ala or A Alanine Arg or R: Arginine Asn or N: Asparagine Asp or D: Aspartic acid Cys or C: Cysteine Gln or Q: Glutamine Glu or E: Glutamic acid Gly or G: Glycine His or H: Histidine Ile or I: Isoleucine Leu or L: Leucine Lys or K: Lysine Met or M: Methionine Phe or F: Phenylalanine Pro or P: Proline Ser or S: Serine Thr or T: Threonine Trp or W: Tryptophan Tyr or Y: Tyrosine Val or V: Valine
  • CTLA-4" refers to cytotoxic T lymphocyte-associated protein 4.
  • CTLA-4 nucleotide and polypeptide sequences are well known in the art.
  • Exemplary human CTLA-4 amino acid sequences are NCBI reference numbers CCDS42803 and CCDS2362 (ID: CCDS42803 stands for human secretory CTLA-4, ID: CCDS2362 stands for human membranous CTLA-4, respectively, and is generally simply referred to as CTLA-4).
  • Exemplary murine CTLA-4 amino acid sequences can be found in NCBI reference numbers CCDS69893 and CCDS14993 (ID: CCDS69893 for mouse secretory CTLA-4, ID: CCDS14993 for mouse membrane type). each representing CTLA-4).
  • transmembrane-type CTLA-4" is a splicing variant of CTLA-4 that has exons 1-4 and is tethered in the cell membrane by a transmembrane domain encoded by exon 3. CTLA-4.
  • secreted CTLA-4" refers to one of the splicing variants of CTLA-4, which is translated by exons 1, 2, and 4 being linked.
  • Secretory CTLA-4 lacks the transmembrane domain encoded by exon 3 and is thus secreted extracellularly.
  • wound refers to a condition in which the tissue surface is damaged due to some cause, such as abrasion, laceration, incision, contusion, ulcer, pressure ulcer, diabetic ulcer, burn, inflammation, cell necrosis, and the like.
  • the tissue includes, for example, skin and mucous membranes.
  • the skin also includes epidermis, dermis, and subcutaneous tissue.
  • the mucosa includes epithelium (or mucosal epithelium), lamina basement, and submucosa.
  • disease, disorder or symptom associated with a wound refers to a wound itself or any disease, disorder or symptom associated with a wound. Therefore, “disease, disorder or condition involving a wound” includes wounds such as abrasions, lacerations, incisions, contusions, ulcers, pressure ulcers, diabetic ulcers, burns, inflammation, cell necrosis, localized scleroderma, psoriasis. , pemphigus, pemphigoid, herpes gestationis, linear IgA bullous dermatosis, epidermolysis bullosa acquired, and dermatitis such as atopic dermatitis.
  • diseases, disorders or conditions associated with abnormalities of the immune system refers to any disease, disorder or symptom caused by an abnormality of the immune system. Accordingly, diseases, disorders or conditions associated with abnormalities of the immune system can include autoimmune diseases and/or allergies, or diseases, disorders or conditions associated therewith; can include autoimmune diseases as described in Section 1.
  • the term "allergy” refers to a hypersensitivity reaction that occurs when a living body that has been sensitized to a certain antigen is reintroduced to that antigen, or a condition exhibiting such a hypersensitivity reaction. Allergic reactions can occur upon contact with an antigen or upon ingestion of the antigen. Therefore, as used herein, "allergies or diseases, disorders or symptoms associated with them” include atopic dermatitis, allergic rhinitis, hay fever, allergic conjunctivitis, allergic gastroenteritis, bronchial asthma, childhood asthma. , food allergies, drug allergies, and urticaria.
  • autoimmune disease refers to an abnormality in the innate immune system or adaptive immune system, which should play a role in recognizing and eliminating foreign substances such as pathogenic microorganisms that have invaded from the outside, resulting in self-cells and tissues.
  • disease, disorder or condition associated with an autoimmune disease includes, for example, Behcet's disease, systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis (systemic sclerosis, progressive systemic sclerosis) , scleroderma, polymyositis, dermatomyositis, periarteritis nodosa (polyarteritis nodosa, microscopic polyangiitis), aortitis syndrome (Takayasu arteritis), malignant rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, juvenile idiopathic arthritis, Wegener's granulomatosis, mixed connective tissue disease, Sjögren's syndrome, adult Still's disease, allergic granulomatous vasculitis, hypersensitivity vasculitis, Cogan's syndrome, RS3PE, temporal arteritis, polymyalgia rheumato
  • inflammation refers to pathological changes caused as a result of reactions of immune system cells. “Inflammation” includes various reaction mechanisms caused by various stimuli, injuries, infections, and the like. Whether or not inflammation is induced can be identified using a known inflammatory marker. Known inflammatory markers include, for example, IL-2, IL-6, TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , iNOS, INF- ⁇ , COX-2, and NF- ⁇ B.
  • treat refers to reducing or eliminating the cause of, slowing or halting the progression of, a disease in a subject with the disease. to cause, reduce, alleviate, ameliorate or eliminate the symptoms thereof, and/or inhibit the exacerbation of the symptoms thereof.
  • the term "functional equivalent” refers to any entity that has the same target function but a different structure from the original target entity. Therefore, when referring to "CTLA-4 or a nucleic acid encoding it, or a functional equivalent thereof", in addition to CTLA-4 or a nucleic acid encoding it itself, fragments, mutations, or mutations of CTLA-4 or a nucleic acid encoding it variants or variants (e.g., amino acid sequence variants, etc.) that have one or more therapeutic or prophylactic effects on wounds or diseases, disorders or conditions associated with wounds, and CTLA-4 or which can be altered into the nucleic acid itself encoding it or fragments, variants or variants of this CTLA-4 or the nucleic acid encoding it (e.g.
  • Representative examples of "CTLA-4 or nucleic acids encoding it, or functional equivalents thereof” include at least one factor selected from the group consisting of CTLA-4 and fragments thereof. It is understood that in the present disclosure, functional equivalents of CTLA-4 or nucleic acids encoding same can be used similarly to CTLA-4 or nucleic acids encoding same, even if not specifically mentioned.
  • fragment refers to a polypeptide or polynucleotide having a sequence length of 1 to n-1 relative to a full-length polypeptide or polynucleotide (length is n).
  • the length of the fragment can be changed as appropriate according to its purpose.
  • the lower limit of the length of the polypeptide is 15, 20, 25, 30, 40, 50 and more amino acids are included, and lengths represented by integers not specifically recited herein (eg, 11, etc.) are also suitable as lower limits. obtain.
  • polynucleotides 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 and more nucleotides are included, specifically recited herein.
  • a length expressed as an integer that does not contain a number may also be suitable as a lower bound.
  • fragments of such CTLA-4 per se fall within the scope of the present invention if they function as a factor in its activity, eg, growth inhibition or maintenance.
  • the term "activity" as used herein refers to the function of a molecule in its broadest sense. Activity generally includes, but is not limited to, any biological, biochemical, physical or chemical function of the molecule. Activities include, for example, activating, promoting, stabilizing, inhibiting, repressing, or destabilizing enzymatic activity, ability to interact with other molecules, and functions of other molecules. stability, ability to localize to specific subcellular locations.
  • the term also relates to the function of protein complexes in the broadest sense.
  • biological function refers to a specific function that the gene, nucleic acid molecule or polypeptide can have in vivo when referring to a gene or a nucleic acid molecule or polypeptide related thereto. Examples include, but are not limited to, generation of specific antibodies, enzymatic activity, imparting resistance, and the like.
  • biological activity refers to an activity that a certain factor (e.g., polynucleotide, protein, etc.) can have in vivo, and exhibits various functions (e.g., transcription promoting activity). For example, activities in which interaction with one molecule activates or inactivates another molecule are also encompassed.
  • a certain factor e.g., polynucleotide, protein, etc.
  • functions e.g., transcription promoting activity
  • activities in which interaction with one molecule activates or inactivates another molecule are also encompassed.
  • two agents interact, their biological activity is determined by the binding between the two molecules and the resulting biological changes, e.g., when one molecule is precipitated with an antibody, the other Two molecules are considered bound when the molecules also co-precipitate. Therefore, observing such coprecipitation is one method of determination.
  • an agent is an enzyme
  • its biological activity includes its enzymatic activity.
  • Another example includes binding to the receptor to which the ligand corresponds when the agent is a ligand.
  • Such biological activity can be measured by techniques well known in the art.
  • "activity” indicates or reveals binding (either directly or indirectly); affecting response (i.e., having a measurable effect in response to some exposure or stimulus);
  • Refers to various measurable indicators, such as the affinity of a compound that binds directly to a polypeptide or polynucleotide of the invention, or, for example, the amount of upstream or downstream protein after some stimulus or event, or other Measures of similar function are included.
  • “functionally active” refers to a protein's structural function, such as biological activity, regulatory function, or biochemical function, according to the aspect to which the polypeptides, fragments or derivatives of the invention relate. It refers to a polypeptide, fragment or derivative that has a functional function.
  • fragment of CTLA-4 refers to any fragment of CTLA-4, and factors used in the present invention include not only full-length CTLA-4 but also fragments of CTLA-4, It is understood that it can be used so long as it treats or prevents its function, particularly a wound, or a disease, disorder or condition associated with a wound.
  • fragments of CTLA-4 used in the present invention typically have at least one function of CTLA-4.
  • Such functions may include, among other things, the function of treating or preventing a wound, or a disease, disorder or condition involving a wound.
  • agent As used herein, “agent”, “agent” or “factor” (both equivalent to the English equivalent of agent) are used broadly and interchangeably to describe any agent capable of achieving its intended purpose. It may be matter or other elements (eg, energy such as light, radiation, heat, electricity, etc.).
  • Such substances include, for example, proteins, polypeptides, oligopeptides, peptides, polynucleotides, oligonucleotides, nucleotides, nucleic acids (including DNA such as cDNA and genomic DNA, RNA such as mRNA), poly Saccharides, oligosaccharides, lipids, organic small molecules (e.g., hormones, ligands, signaling substances, organic small molecules, molecules synthesized by combinatorial chemistry, small molecules that can be used as pharmaceuticals (e.g., small molecule ligands, etc.), etc.) , including but not limited to these complex molecules.
  • proteins proteins, polypeptides, oligopeptides, peptides, polynucleotides, oligonucleotides, nucleotides, nucleic acids (including DNA such as cDNA and genomic DNA, RNA such as mRNA), poly Saccharides, oligosaccharides, lipids, organic small
  • Polynucleotide-specific factors typically include polynucleotides that are complementary to the sequence of the polynucleotide with a certain degree of sequence homology (for example, sequence identity of 70% or more); Examples include, but are not limited to, polypeptides such as transcription factors that bind to promoter regions.
  • Agents specific to a polypeptide typically include an antibody specifically directed against the polypeptide, a derivative thereof, or an analogue thereof (e.g., single-chain antibody); or specific ligands or receptors where the polypeptide is an enzyme, substrates thereof where the polypeptide is an enzyme, and the like.
  • inducing factor refers to expression, transcription, translation, differentiation induction, or the like of CTLA-4 or a nucleic acid encoding it, or a functional equivalent thereof, thereby causing CTLA-4 or A factor that facilitates the production of a nucleic acid that encodes it, or a functional equivalent thereof.
  • expression of a gene, polynucleotide, polypeptide, etc. refers to the transformation of the gene into a different form after undergoing a certain action in vivo. Preferably, it means that genes, polynucleotides, etc. are transcribed and translated into a form of a polypeptide, but being transcribed to produce mRNA is also an aspect of expression.
  • expression level refers to any amount of such "expression.”
  • expression product includes such polypeptides or proteins, or mRNA. More preferably, such polypeptide forms may be post-translationally processed. For example, the expression level or amount of CTLA-4 can be determined by any method.
  • the expression level of CTLA-4 can be determined by evaluating the amount of CTLA-4 mRNA, the amount of CTLA-4 protein, and the biological activity of CTLA-4 protein. Such measurements can be used in companion diagnostics. , CTLA-4 mRNA and protein levels can be determined by methods detailed elsewhere herein or by other methods known in the art.
  • a pharmaceutical composition is provided that includes an inducing agent.
  • a pharmaceutical composition comprising:
  • secretory CTLA-4 or nucleic acids encoding same, or functional equivalents thereof, for treating or preventing a disease, disorder, or condition associated with an abnormality of the immune system includes an agent that induces at least one of
  • CTLA-4 is constitutively expressed in regulatory T cells and is a molecule that negatively regulates immunity. Therefore, CTLA-4 is known to be an essential molecule for maintaining immune homeostasis, since lethal autoimmune diseases are caused by dysfunction of regulatory T cells or deficiency of CTLA-4 molecules. Developmentally engineered disruption of both CTLA-4 exons 2 and 3 in Tregs results in a fatal autoimmune disease with systemic lymphoproliferation and overproduction of IgE and IgG resembling Treg-deficient scurfy mice. CTLA-4 haploinsufficiency in humans is also characteristic of autoimmune disease.
  • sCTLA-4, S secretory CTLA-4
  • mCTLA-4, M membranous CTLA-4
  • sCTLA-4, S secretory CTLA-4
  • mCTLA-4, M membranous CTLA-4
  • sCTLA-4 and mCTLA-4 are important molecules for Treg-mediated self-tolerance and immunosuppression.
  • CTLA-4 interacts with its ligand, CD80/CD86, and directly and indirectly reduces the expression of CD80/86 molecules, preventing excessive immune responses.
  • Tregs highly expressing CTLA-4 pluck CD80/86 molecules on antigen-presenting cells (APCs), physically depleting CD80/86 on APCs.
  • APCs antigen-presenting cells
  • Reduction of CD80 on APC increases free PD-L1 on APC (normally cis-linked to CD80 and suppresses the action of PD-L1), and activates PD-1-expressing T cells.
  • hinder CTLA-4 is also able to competitively bind CD80/86 molecules to a superior extent compared to CD28, inhibiting co-stimulatory (interaction of CD28 and CD80/86 molecules) for T cell activation.
  • Exon 2 of CTLA-4 contains an evolutionarily conserved MYPPPY motif, which is important for stabilizing binding and interaction with CD80/86.
  • CTLA-4 splicing variants with exon 2 There are two CTLA-4 splicing variants with exon 2.
  • CTLA-4 molecule deficiency causes fatal autoimmune diseases
  • CTLA-4 is known as a molecule essential for maintaining immune homeostasis
  • secretory CTLA-4 single nucleotide polymorphisms that decrease its function or expression are known to be associated with the risk of autoimmune diseases such as Graves' disease and type 1 diabetes.
  • This example also shows that loss of secretory CTLA-4 in mice causes age-related dysregulation of type 1 immunity, resulting in preclinical autoimmunity, and also in wound healing. It has been shown to play an important role in the repair of inflammation, such as the delay of .
  • CTLA-4 cytotoxic T lymphocyte antigen 4
  • Treg regulatory T cells
  • Exon 2 of CTLA-4 contains an evolutionarily conserved MYPPPY motif, which is important for stabilizing binding and interaction with CD80/86.
  • CTLA-4 membrane type CTLA-4 (mCTLA-4) and secretory type CTLA-4 (sCTLA-4)).
  • mCTLA-4 has exons 1-4 and is tethered in the cell membrane by a transmembrane domain encoded by exon 3.
  • sCTLA-4 lacks exon 3 and is extracellularly secreted.
  • the CTLA-4 contained in the pharmaceutical composition of the present disclosure may contain at least one selected from the group consisting of secretory CTLA-4 and membranous CTLA-4. can.
  • the CTLA-4 contained in the pharmaceutical composition of the present disclosure comprises secretory CTLA-4.
  • functional equivalents of CTLA-4 include proteins or peptides comprising the MYPPPY motif region encoded by Exon2 of the CTLA-4 gene, dimers of such proteins or peptides Alternatively, multimers or proteins expressed by replacing the signal sequence encoded by Exon1 of the CTLA-4 gene with other signal sequences of homologous or heterologous origin are included.
  • a representative human sCTLA-4 amino acid sequence is disclosed in NCBI reference number CCDS42803.
  • a representative murine sCTLA-4 amino acid sequence is also disclosed in NCBI reference number CCDS69893.
  • the sCTLA-4 of the present application may be a protein derived from humans or mice, or proteins derived from other mammals (e.g., rats, cows, horses, pigs, sheep, monkeys, dogs, cats, birds, etc.). good too.
  • sCTLA-4 has the amino acid sequence identified by NCBI Reference No. CCDS42803, or deletions, substitutions, additions and deletions of one or more amino acid residues in the amino acid sequence identified by NCBI Reference No. CCDS42803. /or comprises or consists of an inserted amino acid sequence.
  • "One or more" in this embodiment preferably means 1 to 20, more preferably 1 to 15, for example 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 means individual.
  • the sCTLA-4 is about 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% , 96%, 97%, 98%, or 99% or greater sequence identity.
  • sCTLA-4 comprises a MYPPPY motif.
  • amino acid substitutions described above may be conservative amino acid substitutions or non-conservative amino acid substitutions.
  • a conservative amino acid substitution is a range that can generally be made without changing the physiological activity of the resulting molecule, that is, a conservative substitution (Watson et al., Molecular Biology of the Gene, etc.).
  • aspartic and glutamic acids acidic amino acids
  • lysine, arginine and histidine basic amino acids
  • alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine and tryptophan nonpolar amino acids
  • glycine asparagine, glutamine, cysteine.
  • sCTLA-4 may be produced by a generally known method based on the above sequence.
  • sequence identity is when two or more sequences (nucleotide or amino acid sequences) are aligned to maximize sequence identity, taking into account gaps and insertions. , the percentage of identical bases or amino acids at corresponding positions in two or more sequences. Methods to determine identity are designed to give the largest match between the aligned sequences. Methods to determine identity between two sequences include, but are not limited to, BLASTP, BLASTN, FASTA, and the like. It can also be determined using DNASIS (manufactured by Hitachi Software Engineering Co., Ltd.) and GENETYX (manufactured by Genetics Co., Ltd.). Alternatively, short peptides can be determined by simple sequence comparison. A person skilled in the art can determine identity between sequences by methods such as those described above.
  • composition of the present disclosure may further contain a pharmaceutically acceptable carrier and/or additive.
  • pharmaceutically acceptable carrier includes any substance capable of retaining the biological activity of its components when combined with sCTLA-4. Examples include stabilizers, solubilizers, suspending agents, emulsifiers, soothing agents, buffers, preservatives, pH adjusters and antioxidants.
  • compositions of the present disclosure can be administered in combination with antibiotics, antifungal agents, or antiviral agents.
  • antibiotics, antifungal agents, or antiviral agents A variety of antibiotics, antifungals, or antivirals known in the art can be used.
  • a combination comprising CTLA-4 and an antibiotic for treating or preventing a wound, or a disease, disorder or condition associated with a wound.
  • parenteral administration includes oral administration or parenteral administration, and is not particularly limited.
  • parenteral administration may be systemic administration or local administration, and more specifically, for example, intratracheal administration, intrathecal administration, intrathecal administration, intracranial administration, intravenous administration, intraarterial administration, portal administration, Examples include intravenous administration, intradermal administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intraperitoneal administration, intranasal administration, and intraoral administration.
  • Dosage forms include granules, fine granules, powders, coated tablets, tablets, suppositories, powders, capsules, microcapsules, chewables, liquids, suspensions, emulsions, and the like. Dosage forms that prolong the release of the active substance may be employed. Injection or infusion dosage forms include aqueous and non-aqueous injection solutions (which may contain antioxidants, buffers, bacteriostats, tonicity agents, etc.); and aqueous and non-aqueous injection suspensions. (which may include suspending agents, thickeners, etc.).
  • dosage forms may be presented as liquids in sealed ampoules or vials, or may be presented as lyophilizates and prepared by adding a sterile liquid (eg, water for injection) immediately prior to use.
  • a sterile liquid eg, water for injection
  • injection solutions or suspensions may be prepared from powders, granules, or tablets.
  • dosage forms are manufactured by formulating in a conventional manner. Furthermore, various pharmaceutically acceptable substances for formulation can be blended according to pharmaceutical needs. The substance for formulation can be appropriately selected depending on the dosage form of the formulation. Coating agents, lubricants, lubricants, flavoring agents, sweeteners, solubilizers and the like are included.
  • the dosage and frequency of administration of the composition of the present disclosure are determined according to the animal species to be administered, the health condition of the subject, age, body weight, route of administration, dosage form, etc. so that an effective amount of the active ingredient is administered to the subject.
  • a person skilled in the art can appropriately set it accordingly.
  • An effective amount for a given situation can be readily determined by routine experimentation and is within the skill and judgment of the ordinary clinician.
  • the daily dosage for an adult is about 0.01 to about 1,000 mg/kg body weight, about 0.01 to about 100 mg/kg body weight, about 0.1 to about 10 mg/kg body weight, or about 1 to about It can be, but is not limited to, 10 mg/kg body weight.
  • compositions of the present disclosure can be used in combination with one or more additional active ingredients, particularly active ingredients for the treatment of autoimmune diseases, wounds or allergies.
  • “Combining” the ingredients includes not only the use of dosage forms containing all of the ingredients and the use of combinations of dosage forms containing each ingredient separately, but also the use thereof for the treatment of autoimmune diseases, wounds or allergies. It also means the simultaneous, sequential administration of each component, or delayed administration of either component, to the extent that it is used for.
  • diseases, disorders or conditions associated with autoimmune diseases include, for example, Behcet's disease, systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis (systemic sclerosis, progressive systemic sclerosis), scleroderma , polymyositis, dermatomyositis, periarteritis nodosa (polyarteritis nodosa, microscopic polyangiitis), aortitis syndrome (Takayasu arteritis), malignant rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, juvenile idiopathic arthritis, Wegener Granulomatosis, mixed connective tissue disease, Sjögren's syndrome, adult Still's disease, allergic granulomatous vasculitis, hypersensitivity vasculitis, Cogan's syndrome, RS3PE, temporal arteritis, polymyalgia rheumatoid arthritis, fibromyalgia disease, antiphospholipid
  • wounds include abrasions, lacerations, incisions, contusions, ulcers, bruises, lacerations, cuts, contusions, ulcers, and ulcers in skin and mucosal tissues, such as the epidermis, dermis, subcutaneous tissue, epidermis (or mucosal epithelium), lamina intestinal, and submucosa. It includes a state in which the tissue surface is damaged due to some factor, such as decubitus, diabetic ulcer, burn, inflammation, and cell necrosis.
  • allergy-related diseases, disorders or conditions include atopic dermatitis, allergic rhinitis, hay fever, allergic conjunctivitis, allergic gastroenteritis, bronchial asthma, childhood asthma, food allergies, drug allergies, Including urticaria.
  • CTLA-4 is known to be an essential molecule for maintaining immune homeostasis. Any associated disease, disorder or condition, any disease, disorder or condition associated with an autoimmune disease, any disease, disorder or condition associated with an allergy is associated with abnormalities of membrane and/or secretory CTLA-4; It can be referred to as a disorder or symptom.
  • CD4-positive T cells for differentiation and activation include essential signal 1 (TCR) and signal 2 (CD28), and CTLA-4 is a molecule that interferes with signal 2, so the present disclosure
  • the disease, disorder, or condition that can be treated or prevented by the pharmaceutical composition of the present disclosure is a condition in which effector differentiation/activation of CD4-positive T cells is not suppressed, that is, effector differentiation/activation of CD4-positive T cells It can be a disease, disorder or condition in which hyperplasia is a constant occurrence.
  • the disorder or condition can also be referred to as a disease, disorder, or condition in which the differentiation/activation of IFN ⁇ -producing CD4-positive helper T cells is not suppressed (that is, it occurs constantly).
  • autoimmune enteritis occurs, and wound healing is delayed.
  • compositions of the present application include animals, typically mammals (e.g., humans, mice, rats, hamsters, rabbits, cats, dogs, cows, sheep, monkeys, etc.), but humans are particularly preferred. preferable.
  • a method of screening for a substance for treating or preventing a wound, or a disease, disorder or condition associated with a wound comprising contacting a cell with a candidate substance; a step of measuring the amount of expression of CTLA-4 on the surface of a cell; and selecting.
  • a method of screening for a substance for treating or preventing a disease, disorder, or condition associated with an abnormality of the immune system comprising the steps of contacting a cell with a candidate substance; or the step of measuring the expression level of secretory CTLA-4 outside the cell, and the amount or level of secretory CTLA-4 in or outside the cell compared to before contact with the candidate substance and selecting said candidate substance that increases .
  • candidate substances include all substances such as proteins, amino acids, nucleic acids, lipids, carbohydrates, low-molecular-weight compounds, and inorganic compounds.
  • Candidate substances can typically be purified or isolated, but may be unpurified or unisolated crude products or mixtures.
  • a candidate substance may be provided in the form of a compound library, nucleic acid library, random peptide library, or the like, or may be provided as a natural product.
  • the cell when a cell is contacted with a candidate substance, the cell is not particularly limited as long as it can express membrane-type or secretory-type CTLA-4, but is, for example, a regulatory T cell.
  • a candidate substance can be added, for example, to the culture medium containing the cells.
  • the candidate substance is contacted with the target, for example, using the above-described medium or various buffers (e.g., HEPES buffer, phosphate buffer, phosphate buffered saline, Tris-HCl buffer, borate buffer, acetate buffer, etc.). etc.) and incubating the cells for a certain period of time.
  • concentration of the test substance to be added varies depending on the type of compound (solubility, toxicity, etc.), but is appropriately selected, for example, within the range of about 0.1 nM to about 100 ⁇ M. Incubation times include, for example, about 10 minutes to about 24 hours.
  • the expression level of CTLA-4 in cells or on the cell surface is measured.
  • the CTLA-4 measured is membrane-type CTLA-4.
  • intracellular or extracellular expression levels of secretory CTLA-4 can also be measured.
  • the expression level of intracellular, extracellular, or cell surface CTLA-4 may be the gene and/or protein amount of intracellular, extracellular, or cell surface CTLA-4.
  • Gene and/or protein levels of CTLA-4 can be measured by well-known methods.
  • the amount of CTLA-4 gene can be measured by, for example, RT-PCR method, Northern blot method, in situ hybridization method, and the like.
  • the amount of CTLA-4 protein can be measured by ELISA, Western blotting, or the like.
  • a candidate substance can be selected that increases the amount or level of CTLA-4 in or on the cell surface compared to before contact with the candidate substance.
  • the candidate agent can be selected that increases the amount or level of secreted CTLA-4 in or outside the cell compared to prior to contact with the candidate agent.
  • the expression level of membrane-type or secretory-type CTLA-4 in cells measured in the step of measuring the expression level of CTLA-4 is compared with the expression level of control membrane-type or secretory-type CTLA-4.
  • a control can be, for example, cells that have not been contacted with the candidate substance or cells prior to being contacted with the candidate substance.
  • the candidate substance can be selected as a substance that induces or promotes the expression of membrane-type or secretory-type CTLA-4.
  • the selected candidate substance can be used as a substance to prevent or treat a wound, or a disease, disorder or condition associated with a wound, or a disease, disorder or condition associated with an abnormality of the immune system.
  • Short Protocols in Molecular Biology A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F.; M. (1995). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M.; A. et al. (1995). PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F.; M. (1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; J. et al. (1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press, Supplementary Volume Experimental Medicine "Gene Introduction & Expression Analysis Experimental Method” Yodosha, 1997, etc., and these are the relevant parts (may be all) of this specification. is incorporated by reference.
  • mice Female 5-6 week old C. B17/Icr-scid mice, 6-8 week old BALB/cAJcl mice, BALB/cAJcl-nu/nu mice, and C57BL/6JJcl mice were purchased from CLEA Japan. CTLA-4 full KO (deficient in exon2 and exon3), CD45.1, RAG2 KO, FLPeR, and DEREG mice were previously reported (Waterhouse, P. et al. Lymphoproliferative Disorders with Early Lethality in Mice Deficient in Ctla-4. Science 270, 985-988 (1995).;Farley, F., Soriano, P., Steffen, L. & Dymecki, S.
  • sCTLA-4 knock-in mice were generated by standard molecular techniques. Briefly, Balb/c-IES cells (received from B. Ledermann; Noben-Trauth, Kohler, Burki & Ledermann. Efficient targeting of the IL-4 gene in a BALB/c embryonic stem cell line.
  • mice All mice were maintained under specific pathogen-free conditions and treated according to animal welfare guidelines approved by the Osaka University Immunology Frontier Research Center or Kyoto University Institute for Frontier Medical Sciences.
  • sCTLA-4 knock-in mice S+M- mice
  • CTLA-4 full KO mice S-M- mice
  • BAC Tg CTLA-4 full KO mice S-M+ mice
  • Antibodies The following antibodies were used for flow cytometric analysis and in vitro experiments and were obtained from BD Biosciences, BioLegend, eBioscience: anti-mCD3 (145-2C11), anti-mCD28 (37.51), anti-mCD4 (RM4-5).
  • anti-mCD8 53-6.7
  • anti-mCD25 PC61
  • anti-mGITR DTA-1
  • anti-mFR4 T6
  • anti-mTCR ⁇ H57-597
  • anti-mCTLA-4 U10-4F10-11
  • anti-mPD1 RPM1-30
  • anti-mCD44 IM7
  • anti-mCD69 H1.2F3
  • anti-mCD103 2E7
  • anti-mCD62L MEL-14
  • anti-mCD45RB C363.16A
  • anti-mCD223 C9B7W
  • anti-mCD90.2 53-2.1
  • anti-mCD80 (16-10A1)
  • anti-mCD86 PO3.1
  • anti-mLy6C HK1.4
  • anti-mLy6G anti-mGr-1
  • anti-TER119 TER119
  • anti-Siglec-F E50-2440
  • anti-mCD41 MWReg30
  • anti-mCD117 2B8)
  • anti-CD200 anti-mCD200
  • Anti-iNOS mAb (4E5, Abcam) was labeled with Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit (molecular probes).
  • Anti-CD3 (0.5 ⁇ g/mL) and anti-CD28 (1 ⁇ g/mL) or anti-CD3/CD28 Dynabeads (Invitrogen) were used to activate mouse CD4+ T cells in vitro.
  • To generate monoclonal antibodies using a peptide of sCTLA-4 specific amino acids ( NH2 -AKEKKSSYNRGLCENAPNRARM-COOH; SEQ ID NO: 1), Anti-sCTLA-4 specific amino acid antibodies were generated by standard techniques.
  • T cells were cultured in RPMI-1640 medium supplemented with 10% FCS (Gibco), penicillin-streptomycin (Gibco) and 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol. T cells were depleted in the presence of 100 U/ml human IL-2 (Imunase35, Shionogi) and treated with mitomycin C (KYOWA KIRIN) with splenocytes treated with anti-CD3/CD28 Dynabeads (invitrogen) or Activated by CD3 antibody.
  • Splenocytes or lymphocytes prepared from 21-day-old sCTLA-4 KI (S+M-), CTLA-4 full KO (S-M-) and littermate controls (S+M+) were transfected with Golgistop (Monensin, BD). bioscience) with 25 ng/mL PMA (Sigma-Aldrich) and 1 ⁇ M ionomycin (Sigma-Aldrich) for 5 hours.
  • Sf9 cells were shaken at 130 rpm at 27° C. in Trichoplusia ni Medium-Formulation Hink (TNM-FH) supplemented with 10% FCS, penicillin-streptomycin and 0.1% Pluronic F-68 (Gibco). It was cultured using High Five cells (BTI-TN-5B1-4) were placed in shake flasks shaken at 130 rpm at 27° C. in Express Five SFM (Thermo Fisher Scientific) supplemented with penicillin-streptomycin, 10 U/mL heparin and 18 mM L-glutamine. was cultured using
  • ELISA IFN ⁇ , IL-4, TNF- ⁇ and IL-6 were measured using ELISA kits from eBioscience.
  • IL-3, IL-10 and TSLP were measured using ELISA kits from Biolegend.
  • CTLA-4, IL-33 and M-CSF were measured using ELISA kits from R&D Systems.
  • IL-5 and IL-17A were measured using the Bio-plex kit from Bio-Rad Laboratories.
  • Serum antibodies were measured by Mouse Isotyping 6plex Kit and Mouse IgE FlowCytomix Simplex kit (eBioscience).
  • Eotaxin (CCL11), CCL17, CCL22 and CXCL13 were measured using the LEGENDplex kit from Biolegend.
  • Anti-mouse dsDNA IgG and anti-mouse IgE were measured using ELISA kits from Sibayagi. Anti-gastric wall antibodies were determined as previously described (Wing, K. et al. CTLA-4 control over Foxp3+ regulatory T cell function. Science 322, 271-5 (2008).). Total protein from B16F10 melanoma was recovered using M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (Thermo Scientific) with Complete mini EDTA-free (Roche). Cell extracts were centrifuged at 18000 ⁇ g for 10 minutes at 4° C. and the supernatant collected. Protein concentrations in lysates were determined by the Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific). Concentrations of IFN ⁇ (pg/mg of total protein) in tumor lysates were quantified by ELISA. IL-10 production in peritoneal macrophages was measured by ELISA after 24 hours of cell culture in vitro.
  • Assay numbers are: Hprt, Mm01545399_m1; Il10, Mm00439614_m1; Ifng, Mm01168134_m1; Il4, Mm00445259_m1; Il17a, Mm00439618_m1; mm00469294_m1; Tgfb1, Mm03024053_m1; Nos2, Mm00440502_m1; Mrc1, Mm00485148_m1; Retnla, Mm00445109_m1 Arg1, Mm00475988_m1.
  • the primer sequences for sCTLA-4 and mCTLA-4 are: mouse sCTLA-4; forward: 5'-cgcagatttatgtcattgctaaag-3' (SEQ ID NO:2); reverse: 5'-aaacggcctttcagttgatg-3' (SEQ ID NO:3); TaqMan probe (FAMNFQ-MGB): 5'-aagaagtcctctttacaacagg-3' (SEQ ID NO: 4): mouse mCTLA-4; forward: 5'-ggcaacgggacgcaga - 3' (SEQ ID NO: 5); Reverse: 5'- cccaagctaactgcgacaagg - 3' (SEQ ID NO: 6); TaqMan probe (FAMNFQ-MGB): 5'-ttatgtcattgatccagaacc - 3' (SEQ ID NO: 7): human sCTLA-4; Forward:
  • Plasmid mouse mCTLA-4 cDNA was cloned from Baldb/c CD4+CD25+ T cells.
  • mCTLA-4 cDNA was subcloned into pCMV-Tag4A vector (Agilent Technologies) and exon3 deletion construct was generated by KOD Plus Mutagenesis Kit (TOYOBO).
  • the Y139A (tyrosine at position 139>alanine) mutant sCTLA-4 was generated by mutating the MYPPPY motif (ATGTACCCACCGCCATAC (SEQ ID NO: 14) ⁇ ATGTACCCACCGCCAGCC (SEQ ID NO: 15)).
  • wild-type sCTLA-4, Y139A mutant sCTLA-4 and CTLA-4 Ig (pME18S-mCTLA4/WT-hIgG, received from T. Saito, RIKEN Center for Integrative Medical Sciences, Kanagawa, Japan) ) was transformed into a pMCsIg retroviral vector (T. Kitamura, The Institute of Medical Sciences, The University of Tokyo, Tokyo, Japan) to generate pMCsIg-sCTLA-4, pMCsIg-sCTLA-4 Y139A and pMCsIg-CTLA-4 Ig.
  • FLAG-tagged WT sCTLA-4 and Y139A sCTLA-4 in pCMV-Tag4A were subcloned into the pFastBac vector (Thermo Fisher Scientific) to generate pFastBac-sCTLA-4-FLAG and pFastBac-sCTLA.
  • -4 Y139A-FLAG was generated.
  • B16F10 melanoma retroviral constructs expressing sCTLA-4 or CTLA-4 Ig was performed as previously described (Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A. & Krogsgaard, M. Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells. J Vis Exp Jove 2307 (2010). doi:10.3791/2307).
  • B16F10 cells which are adherent cells, were transduced with 8 ⁇ g/mL polybrene (Millipore) at 32° C. for 90 minutes at 1000 ⁇ g using a spin inoculation protocol. After retroviral transduction, GFP+ transduced cells were sorted and enriched twice by BD FACSARIA II. Protein expression was assessed by FACS and ELISA.
  • sCTLA-4 Recombinant baculovirus was generated using the Bac-to-Bac baculovirus expression system (Thermo Fisher Scientific). High Five cells (BTI-TN-5B1-4) were infected with baculovirus to produce FLAG-tagged WT sCTLA-4 and Y139A mutated sCTLA-4.
  • FLAG-tagged WT sCTLA-4 (SEQ ID NO: 16, CCDS69893) or Y139A sCTLA-4 in the culture supernatant was purified by anti-FLAG M2 affinity gel (Sigma-Aldrich) and washed with washing buffers (phosphate-buffered saline, 0.05% Tween-20), eluted with elution buffer (phosphate buffered saline, 160 ⁇ g/mL 3x FLAG peptide (Sigma-Aldrich)), Slide-A-Lyzer Dialyzed against phosphate buffered saline using G2 Dialysis Cassettes (Thermo Fisher Scientific). Concentrations of sCTLA-4 were estimated by ELISA and CBB staining.
  • B17/Icr-scid mice were injected with 4 ⁇ 10 5 CD4+CD25 ⁇ CD45RB high cells purified from CD45.1 congenic mice alone or 3 ⁇ from 3-week-old DEREG S+M- or DEREG S-M- mice. Administered intravenously with 10 5 CD4 + Foxp3 + (GFP + ) cells.
  • 1 ⁇ 10 6 B16F10 melanocytes were inoculated subcutaneously into C57BL/6 mice.
  • Histological analysis Histological analysis of the colon was performed as previously described (Yamaguchi, T. et al. Construction of self-recognizing regulatory T cells from conventional regulatory T cells). T cells by controlling CTLA-4 and IL-2 expression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110, E2116-25 (2013).). Hematoxylin and eosin (H E) Staining was observed with a BZ-X700 microscope (KEYENCE). Total lung area and lymphocyte infiltrated area (cellular foci: >1000 ⁇ m 2 ) were calculated and quantified by BZ-X analyzer software (KEYENCE).
  • RNA-seq Total RNA was extracted from isolated CD11b high + F4/80 high + peritoneal macrophages using the miRNeasy Mini Kit (QIAGEN). Purity of macrophages after FACS sorting was >99%.
  • a cDNA library prepared with the TruSeq RNA Sample Prep Kit (Illumina) was sequenced using the HiSeq 2000 (Illumina). Read sequences were mapped to the reference genome (mm10) by TopHat. The overall read mapping rate from all samples was >94%. Expression levels and statistical significance were calculated and tested by Cuffdiff included in the Cufflinks package. Output files were visualized with CummeRbund and gplots packages in the R environment.
  • mice were given 40 ⁇ g grade V ovalbumin (Sigma-Aldrich) emulsified in 2 mg alhydrogel adjuvant (InvivoGen) intraperitoneally (i.p. p.) was administered.
  • the trachea of mice was surgically exposed and 50 ⁇ L 0.1% ovalbumin was injected intratracheally (it) by microsyringe. Mice were sacrificed on day 22 and lungs were perfused with PBS.
  • dorsal skin tissue was harvested for immunostaining, fixed with 4% paraformaldehyde for 48 h at 4° C., embedded in paraffin, and sectioned (5 ⁇ m) along the long axis of the wounded area.
  • each data point represents the value measured in different randomly selected individual animals, independently performed experiments, or quantification of mRNA isolated from separate animals. Unless otherwise stated, data were analyzed by one-way analysis of variance using GraphPad Prism version 7.0d (GraphPad software) followed by Holm-Sidak multiple comparison test for multiple groups or An unpaired two-tailed t-test was performed. The Kruskal-Wallis test and Dunn's multiple comparison test were applied when multiple group nonparametric tests were performed. Where statistical analysis was performed by two-group non-parametric Mann-Whitney test or log-rank test, it is noted in each figure legend. A P-value >0.05 was considered NS (not significant).
  • sCTLA-4 Has an Immunomodulatory Role CD44 high CD62L low effector Tregs more than double the expression of sCTLA-4 compared to CD44 low CD62L high naive Tregs or conventional CD44 high CD62L low effector T cells (Tconv) (Fig. 1A). Consistent with this result, human CD4+CD45RA-CD25 high ( ⁇ 1%) effector Tregs had the highest expression of sCTLA-4 mRNA in vivo compared to CD4+CD45RA+CD25+ na ⁇ ve Tregs (Fig. 1B).
  • DEREG DO11.10 TCR transgenic (Tg) mice were immunized with OVA antigen to stimulate CD4+ T cells in vivo.
  • sCTLA-4 in Tregs decreased 7 days after immunization, but the amount of sCTLA-4 increased and exceeded the steady-state level 21 days after immunization (Fig. 1C).
  • Fig. 1C This result suggests that sCTLA-4 may be required late in inflammation.
  • SCTLA-4+mCTLA-4- mice were generated to evaluate the in vivo function of sCTLA-4 in inflammatory conditions (Fig. 1E). Briefly, the splicing acceptor site upstream of exon 3 of the endogenous CTLA-4 locus was deleted. S+M- mice lacked mCTLA-4 at the protein and mRNA levels, but expressed sCTLA-4 (FIGS. 1F-1H). As expected, mCTLA-4 deficiency was associated with weight loss, spleen and lymph node hypertrophy, and serum levels of autoantibodies (such as anti-dsDNA IgG and anti-gastric parietal cell antibodies) even in the presence of sCTLA-4.
  • autoantibodies such as anti-dsDNA IgG and anti-gastric parietal cell antibodies
  • sCTLA-4 could not prevent autoimmune diseases observed in conventional SM-mice, it significantly suppressed weight loss and lymphocyte increase associated with autoimmune diseases, and significantly prolonged survival. lengthened (Fig. 1M).
  • sCTLA-4 can alleviate the severe autoimmune phenotype caused by mCTLA-4 deficiency, but that mCTLA-4 plays an important role in maintaining immune homeostasis. This suggests that sCTLA-4 is important in the inflammatory setting, but acts through a different mechanism than mCTLA-4.
  • sCTLA-4 promotes the differentiation of M2 macrophages.
  • exon2 has a MYPPPY motif that interacts with mCTLA-4 and sCTLA-4 interacts with CD80/86 molecules
  • antigen-presenting cells CD11b+, CD11c+, and B220+ cells
  • CD80+CD11b+ cells in S+M- mice were not increased despite having strong inflammation
  • CD80+CD11b+ cells in S-M- mice were increased by inflammation (Fig. 2A).
  • CD11b+ F4/80+ peritoneal macrophages isolated from S+M- mice which are the major population of intraperitoneal CD11b+ cells, had higher IL-10 than CD11b+ F4/80+ peritoneal macrophages isolated from S-M- mice. production (Fig. 2C). This result suggests that sCTLA-4 is involved in phenotypic changes of CD11b+ cells, mainly monocytes, macrophages and granulocytes. In addition, S+M- mice had 1.5-fold higher levels of serum IL-10 (Fig. 2D).
  • RNA-seq analysis was performed to determine whether there was a difference in the transcriptome (total transcript) of CD11b+ macrophages with or without sCTLA-4.
  • Principal coordinate analysis (PCoA) and gene ontology (GO) analysis showed that S+M- mouse macrophages differed in gene expression profile from SM- mouse macrophages, e.g., with respect to phagocytosis, wound healing, cell chemotaxis and angiogenesis.
  • FIGS. 2E-2H The differentially expressed genes showing significant differences between S+M- and SM- mouse macrophages included many genes important for the functions and properties of M1 macrophages or M2 macrophages (Fig. 2I).
  • S+M- mouse macrophages express high levels of the well-known M2 markers Mrc1 (encoding CD206), Retnla (Fizz1), Arg1 and Ym1, and S-M- mouse macrophages express , NOS2 (iNOS), known as M1 markers, Il6 and Tnf were expressed at high levels (Fig. 2J).
  • Mrc1 and Retnla Fcgr2b, Mgl2, Clec7a, and Igf1
  • typical genes regulated by IL-4 and IL-13 in macrophages were all significantly expressed in S+M- mouse macrophages. (Fig. 2K).
  • sCTLA-4 in inflammatory situations directly or indirectly affected the phenotype of CD11b+ cells and differentiated macrophages into an M2-like phenotype.
  • sCTLA-4 increases circulation of Th2 and eosinophils in inflammatory conditions
  • IL-4 is a key cytokine in inducing M2 macrophages in vitro and in vivo
  • IL-4/IL-5-producing CD4+ T cells were significantly less frequent in the blood of SM-mice.
  • Eosinophils migrated significantly more in the blood of S+M- mice than in SM- mice (Fig. 3D). Eosinophils mature in response to Th2 cytokine stimulation and upon activation express more IL-4 and the signature gene Siglec-F. Siglec-F induces apoptosis and suppresses eosinophil hyperpopulation in a negative feedback manner. Tissue-infiltrating mature eosinophils from S+M- mice had increased Siglec-F and expressed more than twice as much IL-4 as SM- mice (FIGS. 3E and 3F).
  • eosinophils from S-M- mice had a reduced ability to produce IL-4 compared to eosinophils from S+M- and S+M+ wild-type mice.
  • Increased IL-4/IL-5-producing CD4+ T cells and circulating eosinophils in S+M- mice showed eotaxin (CCL11), CCL22 and CCL24 (which are increased by Th2 cytokines and decreased by Th1 cytokines). was significantly higher in S+M- mice compared to SM- mice (FIGS. 3G and 3H).
  • Serum IL-33 and TSLP were suppressed in both S+M- and SM- mice (Figs. 3K and 3L), and Lin-CD45+CD90+ ILCs (common in innate lymphocytes) in blood and mesentery of S+M- mice marker) decreased (FIGS. 3M and 3N: no detectable GATA3+ ILC cells in S+M- mice) and no increase in basophils or c-kit+ cells in S+M- mice (FIG. 3O).
  • sCTLA-4 Affects Th1 and Th2 Differentiation Bias
  • Th1 differentiation was highly dependent on the number of free CD80/86 molecules, whereas Th2 differentiation was independent (Fig. 4A and 4B).
  • Th2 differentiation was independent (Fig. 4A and 4B).
  • blocking CD86 significantly promoted Th2 differentiation (Fig. 4B).
  • wild-type sCTLA-4 recombinant protein was used to clarify the physiological role of sCTLA-4 in Th cell differentiation.
  • sCTLA-4 Y139A recombinant protein that is unable to bind to CD80/86 was generated. Similar to anti-CD80/86 antibodies, addition of recombinant sCTLA-4 in vitro dose-dependently inhibited Th1 differentiation, whereas high concentrations significantly promoted Th2 differentiation (FIGS. 4C-4F). From the above, sCTLA-4 has the same function as anti-CD80/86 antibody, and blocking of CD80/86 molecule by sCTLA-4 suppresses Th1 differentiation. It was also suggested that sCTLA-4 promotes Th2 differentiation, not to mention not affecting it under sufficient TCR stimulation.
  • sCTLA-4 has the function of suppressing Th1 differentiation and promoting Th2 differentiation even when TCR stimulation is sufficient, and indirectly promotes the differentiation of M2 macrophages.
  • sCTLA-4 Blocks Th1 Inflammation in the Intestinal and Tumor Environments
  • CD4+ T cells in mesenteric lymph nodes and Peyer's patches express sCTLA-4 compared to other somatic lymph nodes (such as inguinal lymph nodes) in healthy conditions. It was expressed more than twice (Fig. 5A).
  • S-M- mice lacking sCTLA-4 had significantly shorter colons and significantly reduced body weight at 3 weeks of age compared to S+M-mice, and small lymphocytic infiltrating foci in the colon tissue. had occurred (FIGS. 5B-D and FIG. 1I).
  • sCTLA-4 exerts an influence on differentiation control of Th1 cells in mesenteric lymph nodes and colonic macrophages in vivo.
  • the numbers of Th1 and Th17 cells in mesenteric lymph nodes of SM- mice were significantly increased by deletion of sCTLA-4 (Fig. 5E).
  • colonic macrophages isolated from S-M- mice have high iNOS and IL-6 expression (indicative of an M1-like phenotype) with increased IFN ⁇ -producing Th1; CD206 and Fizz1 were highly expressed in colonic macrophages isolated from mice, indicating an M2-like phenotype (Fig. 5F).
  • IBD Inflammatory bowel disease induced by adoptive transfer of CD45RB high CD4+ T cells into SCID mice involves the differentiation of effector Th1 cells.
  • S+M- By transferring Tregs or SM-Tregs (the difference between them is the presence or absence of sCTLA-4) into SCID mice together with CD45RB high naive CD4+ T cells, the in vivo Th1 suppressive function of sCTLA-4 was verified.
  • Co-transfer of S+M- Tregs could protect mice from developing colitis, whereas co-transfer of SM- Tregs failed to suppress colitis (FIGS. 5G-I).
  • mice exhibited significant weight loss, marked colonic epithelial hyperplasia and elevated colitis disease scores (FIGS. 5G-5I).
  • B16F10 melanoma cell lines secreting wild-type sCTLA-4 or mutant sCTLA-4 Y139A were then generated.
  • the B16F10 melanoma line secreting sCTLA-4 Y139A is incapable of blocking CD80/86 molecules.
  • These B16F10 melanoma cell lines were administered subcutaneously to C57BL/6J wild-type mice to assess whether sCTLA-4 affects IFN ⁇ -dependent anti-tumor immunity.
  • sCTLA-4-producing melanoma which mimics sCTLA-4 secreted by Tregs in the tumor microenvironment, showed rapid tumor growth, similar to studies with nude mice (T cell-deficient mice) (Fig. 5J and 5K). This result suggests that sCTLA-4-producing melanoma suppressed T cell-dependent anti-tumor immunity. Consistent with this result, it was found that sCTLA-4 in the tumor environment significantly suppressed IFN ⁇ production (Fig. 5L). Suppression of IFN ⁇ was accompanied by a marked increase in CD206 high M2-like tumor macrophages (TAM) in tumor tissue (Fig. 5M).
  • TAM tumor macrophages
  • Th1 inhibition of sCTLA-4 in an inflammatory environment in vivo promoted the differentiation of M2 macrophages.
  • sCTLA-4 Prevents Spontaneous Differentiation of IFN ⁇ -Producing T Cells and Autoantibody Production in Healthy Conditions was made (Fig. 6A).
  • This mouse expresses mCTLA-4 alone (mCTLA-4 mRNA and protein) at the same levels as wild-type mice (FIGS. 6B and 6C).
  • the percentage of CD44 + CD8 + effector memory T cells gradually increased with age in the spleen and lymph nodes, and was more than doubled at 24 weeks of age compared to 8 weeks of age (Fig. 6D). It was increased in the lymph nodes (Fig. 6E) and was compared to wild-type mice at 30 weeks of age.
  • S-M+ mice Compared to mice lacking mCTLA-4, S-M+ mice displayed normal appearance and showed no enlarged spleens and lymph nodes even at 30 weeks of age (FIGS. 6F-6H). However, 30-week-old SM+ mice exhibited ectopic lymph node structures in adipose tissue and leukocyte infiltration in lung tissue (Fig. 6I). In addition, S-M+ mice had significantly higher levels of autoantibodies anti-dsDNA IgG, anti-gastric parietal cell IgG, IL-6 and TNF- ⁇ at 30 weeks of age than S+M+ mice (FIG. 6J). Furthermore, macrophages isolated from the peritoneal cavity of S-M+ mice expressed significantly higher levels of iNOS and IL-6 (Fig.
  • sCTLA-4 suppresses the differentiation of Tfh and allergen-responsive Th2 and the production of IgE S-M+ mice had high levels of IgE (Fig. 7A), whereas IL was detected in the lymph nodes of S-M+ mice. -4-producing Th2 cells were not detected (data not shown). It has been reported that Tfh cell-derived IL-4, but not Th2, is important for IgE class switching. It has also been reported that Tfh has a high requirement for CD80/86 for differentiation. Therefore, it was investigated whether sCTLA-4 affects Tfh differentiation in vivo.
  • Loss of sCTLA-4 increased the percentage of Bcl6+PD1+CXCR5+Tfh cells in Peyer's patch and mesenteric lymph nodes and increased the percentage of CD38-GL7+IgD-IgM-germinal center (GC) B cells in mesenteric lymph nodes ( 7B and 7C). Considering that sCTLA-4 is expressed at high levels in Peyer's patches and mesenteric lymph nodes in a healthy state, this result suggests that sCTLA-4 plays an important role in regulating Tfh cell differentiation. suggested (Fig. 5A).
  • sCTLA-4 promoted Th2 differentiation by suppressing Th1 differentiation in inflammatory conditions, and suppressed spontaneous differentiation and proliferation of Th1 and Tfh cells in healthy conditions.
  • An experimental model of asthma dependent on allergen-reactive Th2 cells was used to investigate whether sCTLA-4 acts to suppress the progression of allergy.
  • Eight-week-old healthy (non-increased IFN ⁇ +-producing T cells) S ⁇ M+ or S+M+ mice were sensitized by intraperitoneal administration (ip) of OVA and adjuvant mixture, then the OVA solution was administered surgically. Asthma was induced by intratracheal instillation (it) and stimulation of OVA-reactive Th2 cells.
  • S ⁇ M+ mice had more Th2 cells, eosinophils and M2 alveolar macrophages in lung tissue compared to S+M+ mice (FIGS. 7D-7G).
  • sCTLA-4 functions not as a promoter of Th2 differentiation but as a threshold for activation of allergen-reactive naive T cells (force to suppress differentiation into Th2) in early inflammation under healthy conditions. It suggests.
  • differentiation of M2 macrophages was promoted by increased Th2 and eosinophils even in the absence of sCTLA-4 (Fig. 7F).
  • sCTLA-4 can sufficiently block CD80/86 when CD80/86 levels are low in non-inflammatory conditions (antigen-presenting cell numbers are low and CD80/86 expression is low in healthy conditions), It was also found to interfere with the differentiation of Th2 cells. This suggests that sCTLA-4 can delay or suppress the development of allergy, as observed in S+M+ mice with sCTLA-4.
  • sCTLA-4 raises the activation threshold of naive and effector T cells in both non-inflammatory and inflammatory conditions, and regulates the balance between helper T cells and macrophage differentiation. It suppresses autoimmunity and allergy in a healthy state, and reduces or calms inflammation by promoting Th2/M2 macrophage differentiation and tissue repair/remodeling in an inflammatory state.
  • sCTLA-4 restricts CD80/86-mediated differentiation of naive T cells into effector T cells and induces sustained co-stimulation (CD28-CD80/86 interaction) during inflammation. By interfering, it has the unique ability to modulate the differentiation bias of helper T cells. It was also demonstrated that sCTLA-4 plays an important role in the differentiation of M2 macrophages in inflammatory conditions and is involved in quenching inflammation.
  • sCTLA-4-rich tumor milieu promoted tumor growth with large numbers of M2 tumor macrophages
  • sCTLA-4 is associated with spontaneous autoantibody production in lymphoid tissues and Th1, Tfh, Th17 and Th2 prevented the abnormal differentiation of
  • Inflammatory bowel diseases such as IBD are induced by adoptive transfer of CD45RB-high positive naive T cells into SCID mice.
  • recombinant secretory CTLA-4 is periodically administered intraperitoneally, and the progression and degree of inflammatory bowel disease are measured by multiple parameters.
  • Body weight is measured weekly.
  • the colon is histopathologically analyzed, and the effect of secretory CTLA-4 is evaluated by the pathological score.
  • the degree of proliferation of IFN ⁇ -producing CD4-positive helper T cells in intestinal lymph nodes is measured by FACS to evaluate the effects of secretory CTLA-4.
  • Asthma and allergic diseases are sensitized and induced in mice using ovalbumin.
  • recombinant secretory CTLA-4 is periodically administered intraperitoneally, and the eventual progression and severity of allergy are measured by multiple parameters.
  • FACS analysis of lung tissue suspensions and bronchoalveolar lavage fluids and histopathological analysis of lungs will be performed.
  • Th2 differentiation and accumulation of eosinophils are suppressed.
  • wound healing A biopsy punch is used to create a wound on the back of the mouse.
  • recombinant secretory CTLA-4 is periodically applied to the wound site or intraperitoneally administered, and the progress and degree of wound healing are measured by multiple parameters. Wound size is measured daily.
  • the re-epithelialization process after wounding is quantified by how much K14+ epidermal basal keratinocytes covered the wound site. In addition to accelerated wound healing and faster wound site shrinkage, the re-epithelialization process is also accelerated when the effects of secretory CTLA-4 are observed.
  • the pharmaceutical composition of the present disclosure can be used for treatment and prevention of inflammatory diseases such as various autoimmune diseases, allergies, and wounds.
  • the pharmaceutical composition of the present disclosure can safely induce immunosuppression without side effects when applied to a living body, and is expected to be applied in the medical field.
  • SEQ ID NO: 1 peptide sequence of sCTLA-4 specific amino acids
  • SEQ ID NOS: 2-3 mouse sCTLA-4 forward and reverse primers
  • SEQ ID NO: 4 TaqMan probe (FAMNFQ-MGB)
  • SEQ ID NOS: 5-6 forward and reverse primer sequences for mouse mCTLA-4
  • SEQ ID NO: 7 TaqMan probe (FAMNFQ-MGB)
  • SEQ ID NO: 16 amino acid sequence of WTsCTLA-4

Abstract

本開示によれば、安全な免疫制御法が提供される。　本開示は、創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物を提供する。

Description

免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を処置するための医薬組成物
　本開示は、免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を処置するための医薬組成物に関する。
　細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）は、免疫系において重要な負の制御分子である。恒常的なＣＴＬＡ－４の高発現は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の特徴である。Ｔｒｅｇが有害な免疫応答を抑制し、免疫恒常性を維持するためにはＣＴＬＡ－４が必要である。また活性化エフェクターＴ細胞もＣＴＬＡ－４を発現し、免疫応答が過剰にならないようフィードバック機構が働いている。
　ＣＴＬＡ－４には、共刺激分子であるＣＤ８０／８６に結合できる２つのスプライシングバリアントが存在することが知られ、１つは、エクソン３によってコードされる膜貫通ドメインを有し、細胞膜中に係留されるｍＣＴＬＡ－４である。もう１つは、分泌のためにエクソン３を持たないｓＣＴＬＡ－４である。しかしながら、ＣＴＬＡ－４に関するほとんどの研究では免疫恒常性における各ＣＴＬＡ－４バリアントの役割を区別していない。
　本発明者らは、生体内における分泌型ＣＴＬＡ－４の作用の発見に基づき、ＣＴＬＡ－４やそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物が、免疫制御に関連することを見出した。
　ＣＴＬＡ－４、特に分泌型ＣＴＬＡ－４を用いることで、炎症下でＭ２型マクロファージを誘導することができ、創傷治癒などを促進することができる。またＭ２型マクロファージは免疫を負に制御するサイトカインや分子を発現し、炎症を抑え、さらには組織の修復およびリモデリングを達成し得る。
　したがって、本開示は以下を提供する。
（項目１）
　創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物。
（項目２）
　前記ＣＴＬＡ－４が分泌型ＣＴＬＡ－４、及び膜型ＣＴＬＡ－４からなる群より選択される少なくとも１つを含む、項目１に記載の医薬組成物。
（項目３）
　前記ＣＴＬＡ－４が分泌型ＣＴＬＡ－４を含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目４）
　局所的に投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目５）
　全身投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目６）
　抗生物質、抗真菌薬、または抗ウイルス薬と組み合わせて投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目７）
　創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための、ＣＴＬＡ－４と抗生物質とを含む組み合わせ物。
（項目Ｄ１）
　疾患、障害または症状を治療または予防するための、分泌型ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物。
（項目Ｄ２）
　前記機能的等価物が、ＣＴＬＡ－４遺伝子のＥｘｏｎ２にコードされるＭＹＰＰＰＹモチーフ領域を含むタンパク質またはペプチド、及び該タンパク質またはペプチドの二量体または多量体を含む、上記項目に記載の医薬組成物。
（項目Ｄ３）
　前記機能的等価物は、ＣＴＬＡ－４遺伝子のＥｘｏｎ１にコードされるシグナル配列が、同種または異種由来の他のシグナル配列に置換されて発現されたタンパク質を含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ｄ４）
　局所的に投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ｄ５）
　全身投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ｄ６）
　抗生物質、抗真菌薬、または抗ウイルス薬と組み合わせて投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ１）
　免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を治療または予防するための、分泌型ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物。
（項目Ａ２）
　前記免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状は、炎症を伴う免疫系疾患を含む、上記項目に記載の医薬組成物。
（項目Ａ３）
　前記免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状は、自己免疫疾患および／もしくはアレルギー、あるいはそれらに関連する疾患、障害または症状を含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ４）
　前記免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状は、自己免疫疾患に関連する疾患、障害または症状を含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ５）
　前記免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状は、アレルギーに関連する疾患、障害または症状を含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ６）
　前記機能的等価物は、ＣＴＬＡ－４遺伝子のＥｘｏｎ２にコードされるＭＹＰＰＰＹモチーフ領域を含むタンパク質またはペプチド、及び該タンパク質またはペプチドの二量体または多量体を含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ７）
　前記機能的等価物は、ＣＴＬＡ－４遺伝子のＥｘｏｎ１にコードされるシグナル配列が、同種または異種由来の他のシグナル配列に置換されて発現されたタンパク質を含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ８）
　局所的に投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ９）
　全身投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ１０）
　抗生物質、抗真菌薬、または抗ウイルス薬と組み合わせて投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ｂ１）
　創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための物質をスクリーニングする方法であって、
　細胞を候補物質と接触させる工程と、
　該細胞中、または該細胞表面におけるＣＴＬＡ－４の発現量を測定する工程と、
　該候補物質との接触前と比較して、該細胞中、または該細胞表面におけるＣＴＬＡ－４の量またはレベルを増加させる該候補物質を選択する工程と
を含む、方法。
（項目Ｃ１）
　免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を治療または予防するための物質をスクリーニングする方法であって、
　細胞を候補物質と接触させる工程と、
　該細胞中、または該細胞外における分泌型ＣＴＬＡ－４の発現量を測定する工程と、
　該候補物質との接触前と比較して、該細胞中、または該細胞外における分泌型ＣＴＬＡ－４の量またはレベルを増加させる該候補物質を選択する工程と
を含む、方法。
（項目Ｅ１）
　被験者における創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための方法であって、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物を該被験者に投与する工程を含む、方法。
（項目Ｆ１）
　被験者における疾患、障害または症状を治療または予防するための方法であって、分泌型ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物を該被験者に投与する工程を含む、方法。
（項目Ｇ１）
　被験者における免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を治療または予防するための方法であって、分泌型ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物を該被験者に投与する工程を含む、方法。
（項目Ｈ１）
　創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための医薬を製造するための、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子の使用。
（項目Ｉ１）
　疾患、障害または症状を治療または予防するための医薬を製造するための、分泌型ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子の使用。
（項目Ｊ１）
　免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を治療または予防するための医薬を製造するための、分泌型ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子の使用。
　本開示において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。なお、本開示のさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
　なお、上記した以外の本開示の特徴及び顕著な作用・効果は、以下の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。
　本開示は、創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物を提供することができる。本開示の医薬組成物は、免疫制御に関わるため、免疫系の異常に関連する疾患の治療とともに、自己免疫疾患などで破壊された組織の修復やリモデリングも期待できる。
８週齢野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスのナイーブもしくはエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞におけるｓＣＴＬＡ－４およびｍＣＴＬＡ－４　ｍＲＮＡ発現。 ヒトエフェクターＴｒｅｇにおけるｓＣＴＬＡ－４の増加。ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋細胞（ナイーブＴｒｅｇ）、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋細胞（エフェクターＴｒｅｇ：ＣＤ２５ｈｉｇｈの＜１％）およびＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ２５ｉｎｔ＋細胞（Ｆｏｘｐ３＋非Ｔｒｅｇ）におけるヒトｓＣＴＬＡ－４のｍＲＮＡ発現を測定した。 ＯＶＡ／ＣＦＡで免疫したＤＥＲＥＧ　ＤＯ１１．１０マウスから免疫後０、７、１４および２１日目に単離したＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋（ＧＦＰ＋）細胞におけるｓＣＴＬＡ－４およびｍＣＴＬＡ－４のｍＲＮＡ発現。 慢性創傷マウスから単離したＴｒｅｇにおけるｓＣＴＬＡ－４の増加。群飼中の喧嘩により偶発的に負傷したＤＥＲＥＧ雄マウスの体表リンパ節から単離したＦｏｘｐ３＋（ＧＦＰ＋）ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるｓＣＴＬＡ－４およびｍＣＴＬＡ－４のｍＲＮＡ発現を測定した。 Ｓ＋Ｍ－マウスにおけるＣＴＬＡ－４遺伝子座の模式図。エクソン３の前側のスプライシングアクセプター部位（８６ｂｐ）を欠失させたベクターを設計した。ＥＳ細胞にエレクトロポレーションを行って相同組換えを誘導し、キメラマウスを作製した後、そのマウスをＦＬＰ１リコンビナーゼ遺伝子を有するＦＬＰｅＲマウスと交配させ、ｎｅｏカセットを欠失させた。その子孫がＳ＋Ｍ－ノックインマウスである。ｓＣＴＬＡ－４（Ｓ）＋ｍＣＴＬＡ－４（Ｍ）＋野生型マウス、Ｓ＋Ｍ－マウスおよびＳ－Ｍ－マウスのＣＴＬＡ－４遺伝子座の模式図も示した。 ＰＭＡ／イオノマイシン／モネンシンで４時間刺激した後のＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ－４およびＦｏｘｐ３の共染色。 Ｓ＋Ｍ－マウスにおける血中循環ＣＴＬＡ－４タンパク質の増加。 Ｓ＋Ｍ－マウスのＣＴＬＡ＿４　ｍＲＮＡではｅｘｏｎ３がスキップされる。３週齢マウスの脾臓細胞およびリンパ球におけるＣＤ４＋Ｔ細胞のｓＣＴＬＡ－４（ｅｘｏｎ２－４ジャンクションを挟んだプライマーを用いた）およびｍＣＴＬＡ－４（ｅｘｏｎ３－４またはｅｘｏｎ２－３ジャンクションを挟んだプライマーを用いた）のＲＮＡ発現を測定した。 ３週齢の雄Ｓ＋Ｍ＋マウス、Ｓ＋Ｍ－マウスおよびＳ－Ｍ－マウス、ならびにそれらのマウスの体重。 Ｓ＋Ｍ－マウスおよびＳ－Ｍ－マウスの脾臓およびリンパ節の肥大。 抗ｄｓＤＮＡ　ＩｇＧ抗体（抗核抗体）の血清中濃度。 抗胃壁細胞ＩｇＧ抗体の血清中濃度。 Ｓ＋Ｍ－マウス、Ｓ－Ｍ－マウス、Ｓ－Ｍ＋マウスおよびＳ＋Ｍ＋マウスの生存曲線。Ｓ＋Ｍ－マウスとＳ－Ｍ－マウスとの間の統計的有意性をログランク検定によって得た（Ｐ＜０．０００１）。 脾臓ＣＤ１１ｂ＋細胞、ＣＤ１１ｃ＋細胞、Ｂ２２０＋細胞におけるＣＤ８０＋サブセットもしくはＣＤ８６＋サブセットの割合。 単離した脾臓ＣＤ１１ｂ＋細胞におけるＩＬ－４、ＩＬ－６およびＩＬ－１０のｍＲＮＡ発現。 Ｆ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋腹腔マクロファージを２４時間培養した上清中のＩＬ－１０濃度。 ＩＬ－１０の血清中濃度。 Ｆ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋腹腔マクロファージのＲＮＡ－ｓｅｑ。全転写物解析による多次元スケーリングプロット（ＰＣｏＡ）を示した。 生物学的プロセスに関する遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析（１）。図に示したマウスから単離したＭφ群比較において最も濃縮されたＧＯタームの上位セットを示す。 生物学的プロセスに関する遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析（２）。図に示したマウスから単離したＭφ群比較において最も濃縮されたＧＯタームの上位セットを示す。 生物学的プロセスに関する遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析（３）。図に示したマウスから単離したＭφ群比較において最も濃縮されたＧＯタームの上位セットを示す。 野生型Ｓ＋Ｍ＋マウス腹腔マクロファージの遺伝子発現量を基準としたＳ＋Ｍ－マウスおよびＳ－Ｍ－マウスの腹腔マクロファージの遺伝子発現量比（Ｌｏｇ　ｆｏｌｄ　ｃｈａｎｇｅ）のヒートマップ。Ｓ＋Ｍ－対Ｓ－Ｍ－で、有意差Ｐ＜０．００１の発現変化を示す遺伝子リストを示した。 腹腔マクロファージにおけるＭ１／Ｍ２関連遺伝子の相対的なＦＰＫＭ値を、色分けしたマトリックスによって示す。 マクロファージにおいてＩＬ－４およびＩＬ－１３によって誘導される典型的な遺伝子の発現比較。 ＩＬ－５およびＩＬ－４の血清中濃度。 ＰＭＡ／イオノマイシン／モネンシンで５時間刺激したＦｏｘｐ３－ＣＤ４＋血球中のＩＬ－５産生細胞の割合。 ＰＭＡ／イオノマイシン／モネンシンで５時間刺激したＦｏｘｐ３－ＣＤ４＋血球中のＩＬ－４産生細胞の割合。 ＣＤ４５＋血球中の好酸球の割合。 脾臓に浸潤した好酸球のＳｉｇｌｅｃ－Ｆ発現。 脾臓から単離した好酸球におけるＩＬ－４のｍＲＮＡ発現。 エオタキシン（ＣＣＬ１１）およびＣＣＬ２２の血清中濃度。 腹腔マクロファージにおけるＣＣＬ２４発現レベル。 Ｓ＋Ｍ－マウスの肺胞マクロファージにおけるＣＤ２０６発現の増加。 ＩＬ－４およびＩＬ－１０で２４時間培養したＳ－Ｍ－マウスの脾臓マクロファージのＣＤ８０　ＭＦＩおよびＣＤ２０６　ＭＦＩ。 Ｓ＋Ｍ－マウスでは、血清ＩＬ－３３は増加していなかった。 Ｓ＋Ｍ－マウスでは、血清ＴＳＬＰは増加していなかった。 Ｓ＋Ｍ－マウスの血液において、自然リンパ球（ＩＬＣ）は増加していなかった。 Ｓ＋Ｍ－マウスの腸間膜において、自然リンパ球（ＩＬＣ）は増加していなかった。 Ｓ＋Ｍ－マウスのＣＤ４５＋血球において、好塩基球およびｃ－Ｋｉｔ＋細胞は増加していなかった。 ＣＤ８０／８６ブロッキング抗体の存在下におけるＴｈ２およびＴｈ１の分化。抗ＣＤ８０　ｍＡｂおよび抗ＣＤ８６　ｍＡｂを用いて、ナイーブＴ細胞を抗ＣＤ３　ｍＡｂおよびＴ細胞枯渇脾臓細胞（主に抗原提示細胞）でＴｈ２条件もしくはＴｈ１条件で３日間刺激した後、ＰＭＡ／イオノマイシン／モネンシンで５時間刺激し、Ｔｈ２もしくはＴｈ１の分化の割合を調べた。 Ｔｈ２またはＴｈ１の分化の割合を、ＣＤ８０またはＣＤ８６をブロックしない条件を１００％として算出した。 ｓＣＴＬＡ－４組換えタンパク質の存在下におけるＴｈ２およびＴｈ１の分化。ｓＣＴＬＡ－４　ＷＴ（野生型）、ｓＣＴＬＡ－４　Ｙ１３９Ａ（変異型）またはＣＴＬＡ－４　Ｉｇを用いて、ナイーブＴ細胞を抗ＣＤ３　ｍＡｂおよびＴ細胞枯渇脾臓細胞（主に抗原提示細胞）で３日間刺激した後、ＰＭＡ／イオノマイシン／モネンシンで５時間刺激し、Ｔｈ２もしくはＴｈ１の分化の割合を調べた。 Ｔｈ２細胞またはＴｈ１細胞の分化の割合を、ＣＴＬＡ－４　Ｙ１３９Ａ（陰性対照）を用いた条件を１００％として算出した。 ｓＣＴＬＡ－４　ＷＴおよびＣＴＬＡ－４　ＩｇによるＴｈ１分化に対する抑制効果の用量反応曲線。Ｔｈ１の分化の割合を、ＣＴＬＡ－４　Ｙ１３９Ａ（陰性対照）を用いた条件を１００％として算出した。ｓＣＴＬＡ－４　Ｙ１３９Ａと比較して、＊はＰ＜０．０５を示し、＊＊＊はＰ＜０．００１を示し、＊＊＊＊はＰ＜０．０００１を示す。 ｓＣＴＬＡ－４　ＷＴおよびＣＴＬＡ－４　ＩｇによるＴｈ２分化に対する抑制効果の用量反応曲線。Ｔｈ２の分化の割合を、ＣＴＬＡ－４　Ｙ１３９Ａ（陰性対照）を用いた条件を１００％として算出した。ｓＣＴＬＡ－４　Ｙ１３９Ａと比較して、＊はＰ＜０．０５を示し、＊＊＊はＰ＜０．００１を示し、＊＊＊＊はＰ＜０．０００１を示す。 ｓＣＴＬＡ－４　ＷＴ（５μｇ／ｍＬ）、ｓＣＴＬＡ－４　Ｙ１３９Ａ（５μｇ／ｍＬ）、ＣＴＬＡ－４　Ｉｇ（５μｇ／ｍＬ）またはＩＬ－４（１０ｎｇ／ｍＬ）で２４時間培養した後のＲＡＷ２６４．７細胞におけるＣＤ２０６、Ａｒｇ１およびｉＮＯＳのｍＲＮＡ発現。 図に示す各リンパ節由来のＣＤ４＋Ｔ細胞におけるｓＣＴＬＡ－４およびｍＣＴＬＡ－４のｍＲＮＡ発現。 Ｓ＋Ｍ－マウス、Ｓ－Ｍ－マウスおよびＳ＋Ｍ＋マウスの大腸。 大腸の長さ。 大腸のヘマトキシリン・エオジン染色。 腸間膜リンパ節のＦｏｘｐ３－ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＦＮγ産生細胞およびＩＬ－１７Ａ産生細胞。 大腸から単離したＣＤ４５＋Ｓｉｇｌｅｃ－Ｆ－Ｌｙ６Ｇ－ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋マクロファージにおけるＣＤ２０６、Ｆｉｚｚ１、ｉＮＯＳおよびＩＬ－６のｍＲＮＡ発現。 ｓＣＴＬＡ－４による大腸炎の抑制。６週齢の複合免疫不全マウス（Ｃ．Ｂ１７／Ｉｃｒ－ｓｃｉｄ）に、ＣＤ４５．１コンジェニックマウスから単離したＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈナイーブＴ細胞を単独（黒丸）または３週齢のＤＥＲＥＧ　Ｓ＋Ｍ－（白丸）、ＤＥＲＥＧ　Ｓ－Ｍ－（白三角形）もしくはＤＥＲＥＧ　Ｓ＋Ｍ＋マウス（白四角形）から単離したＦｏｘｐ３＋（ＧＦＰ＋）ＣＤ４＋Ｔｒｅｇとともに静脈内投与した。細胞養子移入の日（Ｄａｙ０）の体重を１００％として算出した。 図５Ｇに記載したように養子細胞移入したＣ．Ｂ１７／Ｉｃｒ－ｓｃｉｄマウスの８週間後の大腸ヘマトキシリン・エオジン染色切片。 大腸炎を組織学的にスコア化した。データにはクラスカル・ウォリス検定およびＤｕｎｎの多重比較検定を適用した。 ｓＣＴＬＡ－４による腫瘍免疫の抑制。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、野生型ｓＣＴＬＡ－４（ｓＣＴＬＡ－４　ＷＴ）、Ｙ１３９Ａ変異体ｓＣＴＬＡ－４（ｓＣＴＬＡ－４　Ｙ１３９Ａ）またはＣＴＬＡ－４　Ｉｇを産生するＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞を皮下投与した。腫瘍の長辺と短辺を１日おきに測定した。腫瘍の面積を、２つの直径を用いて算出した。濃い太字で示した線は、点線で示した個々の腫瘍（ｎ数は凡例に示してある）の平均増殖曲線を示す。ｓＣＴＬＡ－４　ＷＴ　Ｂ１６Ｆ１０とｓＣＴＬＡ－４　Ｙ１３９Ａ　Ｂ１６Ｆ１０との間の統計的有意性を、接種後６日目、８日目、１１日目、１３日目および１５日目において示した（＊はＰ＜０．０００５を示す）。 ｓＣＴＬＡ－４による腫瘍免疫の抑制はＴ細胞への作用である。ヌードマウスに、野生型ｓＣＴＬＡ－４（ｓＣＴＬＡ－４　ＷＴ）、Ｙ１３９Ａ変異体ｓＣＴＬＡ－４（ｓＣＴＬＡ－４　Ｙ１３９Ａ）またはＣＴＬＡ－４　Ｉｇを産生するＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞を皮下投与した。腫瘍の長辺と短辺を１日おきに測定した。腫瘍の面積を、２つの直径を用いて算出した。濃い太字で示した線は、点線で示した個々の腫瘍（ｎ＝５）の平均増殖曲線を示す。 接種後１２日目の腫瘍の細胞抽出物中のＩＦＮγの濃度。データにはクラスカル・ウォリス検定およびその後のＤｕｎｎの検定を適用した。 ｓＣＴＬＡ－４による腫瘍Ｍ２マクロファージ分化の促進。接種後１２日目のＢ１６Ｆ１０黒色腫浸潤マクロファージにおけるＣＤ２０６発現。 Ｓ－Ｍ＋マウスにおける大腸菌人工染色体（ＢＡＣ）ＣＴＬＡ－４遺伝子座の模式図。ＢＡＣベクター（ＲＰ２３－１４６Ｊ１７）を改変し、ｅｘｏｎ３とｅｘｏｎ４の間のイントロンを欠失させた。ＢＡＣトランスジェニックマウスをＳ－Ｍ－マウスと交配させ、Ｓ－Ｍ＋マウスを作製した。 Ｓ－Ｍ＋マウスおよびＳ＋Ｍ＋マウスのＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ－４およびＦｏｘｐ３の共染色。 ６週齢Ｓ－Ｍ＋マウスのＣＤ４＋Ｔ細胞においてｓＣＴＬＡ－４は発現していないが、ｍＣＴＬＡ－４は発現する。 ８、１６および２４週齢マウスの脾臓（Ｓｐ）またはリンパ節（Ｌｎ）のＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌの共染色。代表的なフローサイトメトリーのデータは、２４週齢マウスのＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。 ２４週齢マウスの脾臓またはリンパ節のＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌの共染色。 ３０週齢雌Ｓ－Ｍ＋マウスおよび野生型対照（Ｓ＋Ｍ＋）マウス。 脾臓および末梢リンパ節の代表的な画像。 脾臓（Ｓｐ）、腸間膜または体表リンパ節（Ｌｎ）における細胞総数。 Ｓ－Ｍ＋マウスおよび対照（Ｓ＋Ｍ＋）マウスの脂肪組織（それぞれｎ＝１０）および肺（それぞれｎ＝６）のヘマトキシリン・エオジン染色の代表切片。 抗ｄｓＤＮＡ　ＩｇＧ抗体（抗核抗体）、抗胃壁細胞ＩｇＧ抗体、ＩＬ－６およびＴＮＦ－αの血清中濃度。データにはマン・ホイットニー検定を適用した。 ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋腹腔マクロファージにおけるｉＮＯＳ（Ｎｏｓ２）およびＩＬ－６のｍＲＮＡ発現。 脾臓、腸間膜リンパ節、または体表リンパ節のＣＤ８＋Ｔ細胞をＰＭＡ／イオノマイシン／モネンシンで５時間刺激後、ＩＦＮγおよびＥｏｍｅｓを共染色した。 脾臓、腸間膜リンパ節、または体表リンパ節のＣＤ４＋Ｔ細胞をＰＭＡ／イオノマイシン／モネンシンで５時間刺激後、ＩＦＮγおよびＩＬ－１７Ａを共染色した。 ｓＣＴＬＡ－４は創傷治癒に重要な役割を果たす。６ｍｍの生検パンチを用いて１２週齢のＳ－Ｍ＋マウスおよびＳ＋Ｍ＋マウスの背部の皮膚に１匹あたり２箇所創傷した（それぞれｎ＝８のマウスを用いた）。創傷後１日目（ｄ１）、３日目（ｄ３）、５日目（ｄ５）の各マウス背部の２箇所の創傷面積（ｍｍ２）の平均値を画像から測定した。 ｓＣＴＬＡ－４は創傷後の再上皮化プロセスに重要な役割を果たす。５日目（ｄ５）の創傷皮膚切片においてＫ１４＋表皮基底角化細胞（緑色）とＤＡＰＩ（青色）を免疫蛍光染色で可視化した。創傷治癒において傷端から創傷下に遊走したＫ１４＋表皮角化細胞が増殖し傷をふさいだ長さ（Ｅｐｉ　ｔｏｎｇｕｅ　ｌｅｎｇｔｈ）によって、再上皮化を定量した。矢印は、再上皮化の徴候をまだ示していない時点（１日目）の傷端を示す。 ３０週齢マウスを用いた創傷治癒の外部観察。６ｍｍの生検パンチを用いて３０週齢のＳ－Ｍ＋マウス（自己免疫の病態を示す）およびＳ＋Ｍ＋マウスの背部の皮膚に１匹あたり２箇所創傷した（それぞれｎ＝８）。創傷後１日目（ｄ１）、３日目（ｄ３）、５日目（ｄ５）の各マウス背部の２箇所の創傷面積（ｍｍ２）の平均値を画像から測定した。 ３０週齢マウスを用いた再上皮化プロセスの定量。５日目（ｄ５）の創傷皮膚切片においてＫ１４＋表皮基底角化細胞（緑色）とＤＡＰＩ（青色）を免疫蛍光染色で可視化し、Ｅｐｉ　ｔｏｎｇｕｅ　ｌｅｎｇｔｈによって再上皮化を定量した。矢印は、再上皮化の徴候をまだ示していない時点（１日目）の傷端を示す。 ＩＦＮγ産生Ｔ細胞による炎症で創傷治癒が遅延する。１２週齢Ｓ－Ｍ＋マウスを用いた図６Ｎと３０週齢Ｓ－Ｍ＋マウス（１型自己免疫の病態を示す）を用いた図６Ｐの創傷治癒の程度を比較した。 ３０週齢マウスにおけるＩｇＥの血清中濃度。データにはマン・ホイットニー検定を適用した。 Ｓ－Ｍ＋マウスのパイエル板および腸間膜リンパ節において、濾胞性ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ：Ｂｃｌ－６＋ＣＸＣＲ５＋Ｆｏｘｐ３－ＣＤ４４＋ＣＤ４＋Ｂ２２０－（図７Ｂ）、もしくはＰＤ－１＋ＣＸＣＲ５＋Ｆｏｘｐ３－ＣＤ４４＋ＣＤ４＋Ｂ２２０－）が増加していた（図７Ｃ）。 Ｓ－Ｍ＋マウスのパイエル板および腸間膜リンパ節において、濾胞性ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ：Ｂｃｌ－６＋ＣＸＣＲ５＋Ｆｏｘｐ３－ＣＤ４４＋ＣＤ４＋Ｂ２２０－（図７Ｂ）、もしくはＰＤ－１＋ＣＸＣＲ５＋Ｆｏｘｐ３－ＣＤ４４＋ＣＤ４＋Ｂ２２０－）が増加していた（図７Ｃ）。 ｓＣＴＬＡ－４は、健康なマウスにおいてアレルギー病態の進行を抑制する。肺におけるＯＶＡ誘発性喘息実験は図に示したスキームで行った。まだ自己免疫病態を示していない健康な８週齢のＳ－Ｍ＋においてアレルギー反応性ＧＡＴＡ３＋Ｔｈ２の有意な増加が見られた。 自己免疫病態を示していない健康な８週齢のＳ－Ｍ＋においてアレルギー反応性ＧＡＴＡ３＋Ｔｈ２の有意な増加が見られた。 肺ＣＤ１１ｃ－Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ－ＣＤ２４＋Ｓｉｇｌｅｃ－Ｆ＋好酸球の割合。 肺胞マクロファージ（ＣＤ１１ｃ＋Ｓｉｇｌｅｃ－Ｆ＋ＣＤ１１ｂｉｎｔＣＤ６４＋）におけるＣＤ２０６とＣＤ７１の共染色。各々の発現を蛍光強度の中央値で定量した（図７Ｈ、Ｉ）。 ＣＤ２０６の発現を蛍光強度の中央値で定量した。 ＣＤ７１の発現を蛍光強度の中央値で定量した。 ｓＣＴＬＡ－４はアレルギーによる組織へのリンパ球の浸潤を抑制する。肺組織のヘマトキシリン・エオジン染色を示した。
　以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
　以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
　本明細書において、「約」とは、後に続く数値の±１０％を意味する。例えば、「約２０」は、「１８～２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。したがって、例えば、「約２０～３０」は、「１８～３３」を含むものとする。
　本明細書において、アミノ酸残基は以下の略号で表される。
ＡｌａまたはＡ：アラニン
ＡｒｇまたはＲ：アルギニン
ＡｓｎまたはＮ：アスパラギン
ＡｓｐまたはＤ：アスパラギン酸
ＣｙｓまたはＣ：システイン
ＧｌｎまたはＱ：グルタミン
ＧｌｕまたはＥ：グルタミン酸
ＧｌｙまたはＧ：グリシン
ＨｉｓまたはＨ：ヒスチジン
ＩｌｅまたはＩ：イソロイシン
ＬｅｕまたはＬ：ロイシン
ＬｙｓまたはＫ：リジン
ＭｅｔまたはＭ：メチオニン
ＰｈｅまたはＦ：フェニルアラニン
ＰｒｏまたはＰ：プロリン
ＳｅｒまたはＳ：セリン
ＴｈｒまたはＴ：スレオニン
ＴｒｐまたはＷ：トリプトファン
ＴｙｒまたはＹ：チロシン
ＶａｌまたはＶ：バリン
　本明細書において、「ＣＴＬＡ－４」とは、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４を指す。ＣＴＬＡ－４ヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、本分野において周知である。例示的なヒトＣＴＬＡ－４アミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照番号ＣＣＤＳ４２８０３やＣＣＤＳ２３６２（ＩＤ：ＣＣＤＳ４２８０３はヒト分泌型ＣＴＬＡ－４を、ＩＤ：ＣＣＤＳ２３６２はヒト膜型ＣＴＬＡ－４をそれぞれ表し、一般に単にＣＴＬＡ－４と称する場合には膜型を指す）に記載され、例示的なマウスＣＴＬＡ－４アミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照番号ＣＣＤＳ６９８９３やＣＣＤＳ１４９９３（ＩＤ：ＣＣＤＳ６９８９３はマウス分泌型ＣＴＬＡ－４を、ＩＤ：ＣＣＤＳ１４９９３はマウス膜型ＣＴＬＡ－４をそれぞれ表す）に記載されている。
　本明細書において、「膜型ＣＴＬＡ－４」とは、ＣＴＬＡ－４のスプライシングバリアントの1つであり、エクソン１～４を有し、エクソン３によってコードされる膜貫通ドメインによって細胞膜中に係留されるＣＴＬＡ－４をいう。
　本明細書において、「分泌型ＣＴＬＡ－４」とは、ＣＴＬＡ－４のスプライシングバリアントの1つであり、エクソン１、２、４が連結され、翻訳されたものをいう。分泌型ＣＴＬＡ－４は、エクソン３によってコードされる膜貫通ドメインを欠損しているため、細胞外に分泌される。
　本明細書において「創傷」とは、擦過傷、裂傷、切創、挫傷、潰瘍、褥瘡、糖尿病性潰瘍、熱傷、炎症、細胞壊死等、何らかの要因によって組織表面が欠損した状態を示す。前記組織には、例えば、皮膚や粘膜が含まれる。また、前記皮膚には、表皮、真皮、及び皮下組織が含まれる。前記粘膜には、上皮（若しくは、粘膜上皮）、粘膜固有層、及び粘膜下層が含まれる。
　本明細書において「創傷を伴う疾患、障害もしくは症状」とは、創傷そのものや、創傷に関連して生じる任意の疾患、障害もしくは症状を指す。したがって、「創傷を伴う疾患、障害もしくは症状」には、擦過傷、裂傷、切創、挫傷、潰瘍、褥瘡、糖尿病性潰瘍、熱傷、炎症、細胞壊死などの創傷や、限局性強皮症、乾癬、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、アトピー性皮膚炎などの皮膚炎を含む。
　本明細書において「免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状」とは、免疫系の異常に起因する任意の疾患、障害または症状を指す。したがって、免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状は、自己免疫疾患および／もしくはアレルギー、あるいはそれらに関連する疾患、障害または症状を含むことができ、自己免疫疾患としては本明細書の他の箇所に記載される自己免疫疾患を含むことができる。
　本明細書において、「アレルギー」とは、ある抗原に感作されている生体に、再びその抗原が入った場合に起こる過敏反応、またはその過敏反応を示す状態をいう。抗原と接触した場合、あるいは当該抗原を摂取した場合に、アレルギー反応を生じ得る。したがって、本明細書において、「アレルギー、あるいはそれらに関連する疾患、障害または症状」には、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、アレルギー性結膜炎、アレルギー性胃腸炎、気管支喘息、小児喘息、食物アレルギー、薬物アレルギー、蕁麻疹などが含まれる。
　本明細書において、「自己免疫疾患」とは、本来外部から侵入した病原微生物等の異物を認識し排除する役割を果たすべき自然免疫系もしくは獲得免疫系に異常が生じ、自己の細胞や組織を構成する成分を異物として認識することで自己抗体や自己反応性のリンパ球が恒常的に過剰に産生され、全身的あるいは臓器特異的にサイトカインの産生などを伴った炎症が生じ組織障害に至る疾患の総称をいう。したがって、本明細書において、「自己免疫疾患に関連する疾患、障害または症状」には、例えば、ベーチェット病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症（全身性強皮症、進行性全身性硬化症）、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性動脈周囲炎（結節性多発動脈炎、顕微鏡的多発血管炎）、大動脈炎症候群（高安動脈炎）、悪性関節リウマチ、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、ウェゲナー肉芽腫症、混合性結合組織病、シェーグレン症候群、成人スティル病、アレルギー性肉芽腫性血管炎、過敏性血管炎、コーガン症候群、ＲＳ３ＰＥ、側頭動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、線維筋痛症、抗リン脂質抗体症候群、好酸球性筋膜炎、ＩｇＧ４関連疾患（例えば、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性膵炎など）、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、慢性萎縮性胃炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、大動脈炎症候群、グッドパスチャー症候群、急速進行性糸球体腎炎、巨赤芽球性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、バセドウ病（甲状腺機能亢進症）、橋本病、自己免疫性副腎機能不全、原発性甲状腺機能低下症、特発性アジソン病（慢性副腎皮質機能低下症）、Ｉ型糖尿病、緩徐進行性Ｉ型糖尿病（成人潜在性自己免疫性糖尿病）、慢性円板状エリテマトーデス、限局性強皮症、乾癬、乾癬性関節炎、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、円形脱毛症、白斑、尋常性白斑、アトピー性皮膚炎、視神経脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、サルコイドーシス、水疱性類天疱瘡、巨細胞性動脈炎、筋委縮性側索硬化症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、原田病、自己免疫性視神経症、特発性無精子症、習慣性流産、自己免疫性腸炎、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病）、セリアック病、ＩＢＤ、ＩＢＳ、肥満細胞症、及びＩＦＮγ産生型ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞の増殖を伴う自己免疫疾患などが含まれる。
　本明細書において、「炎症」とは、免疫系細胞の反応の結果引き起こされる病理学上の変化を示す。「炎症」には、各種の刺激、損傷、感染等によって引き起こされる様々な反応機序が含まれる。炎症が惹起されているかは、公知の炎症マーカーを用いて特定できる。炎症マーカーとしては、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ｉＮＯＳ、ＩＮＦ－γ、ＣＯＸ－２、ＮＦ－κＢ等が知られている。
　本明細書で使用されるとき、「処置する」、「治療する」、「処置」または「治療」は、疾患を有する対象において、疾患の原因を軽減または除去すること、その進行を遅延または停止させること、その症状を軽減、緩和、改善または除去すること、および／または、その症状の悪化を抑制することを意味する。
　本明細書において「機能的等価物」とは、対象となるもとの実体に対して、目的となる機能が同じであるが構造が異なる任意のものをいう。したがって、「ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物」という場合は、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸自体のほか、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸のフラグメント、変異体または改変体（例えば、アミノ酸配列改変体等）であって、創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状の治療または予防作用を１つ以上有するもの、ならびに、作用する時点においてＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸自体またはこのＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸のフラグメント、変異体もしくは改変体に変化することができるもの（例えば、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸自体またはＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸のフラグメント、変異体もしくは改変体をコードする核酸、およびその核酸を含むベクター、細胞等を含む）が包含されることが理解される。「ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物」としては、ＣＴＬＡ－４およびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子が代表例として挙げられる。本開示において、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸の機能的等価物は、格別に言及していなくても、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸と同様に用いられうることが理解される。
　本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１～ｎ－１までの配列長を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、このようなＣＴＬＡ－４は、その活性、例えば、増殖抑制または維持の因子として機能する場合、そのフラグメント自体も本発明の範囲内に入ることが理解される。本発明に従って、用語「活性」は、本明細書において、最も広い意味での分子の機能を指す。活性は、限定を意図するものではないが、概して、分子の生物学的機能、生化学的機能、物理的機能または化学的機能を含む。活性は、例えば、酵素活性、他の分子と相互作用する能力、および他の分子の機能を活性化するか、促進するか、安定化するか、阻害するか、抑制するか、または不安定化する能力、安定性、特定の細胞内位置に局在する能力を含む。適用可能な場合、この用語はまた、最も広い意味でのタンパク質複合体の機能にも関する。本明細書において「生物学的機能」とは、ある遺伝子またはそれに関する核酸分子もしくはポリペプチドについて言及するとき、その遺伝子、核酸分子またはポリペプチドが生体内において有し得る特定の機能をいい、これには、例えば、特異的な抗体の生成、酵素活性、抵抗性の付与等を挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書において、生物学的機能は、「生物学的活性」によって発揮され得る。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含され、例えば、ある分子との相互作用によって別の分子が活性化または不活化される活性も包含される。２つの因子が相互作用する場合、その生物学的活性は、その二分子との間の結合およびそれによって生じる生物学的変化、例えば、一つの分子を抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、２分子は結合していると考えられる。従って、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。従って、「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が挙げられる。
　本明細書で使用される「機能的に活性な」は、本発明のポリペプチド、フラグメントまたは誘導体が関連する態様に従って、生物学的活性などの、タンパク質の構造的機能、制御機能、または生化学的機能を有する、ポリペプチド、フラグメントまたは誘導体を指す。
　本明細書において、ＣＴＬＡ－４の「フラグメント」とは、ＣＴＬＡ－４の任意のフラグメントを指し、本発明において使用される因子としては、ＣＴＬＡ－４全長のみならず、ＣＴＬＡ－４のフラグメントも、その機能、特に創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防する限り使用されうることが理解される。したがって本発明において使用されるＣＴＬＡ－４のフラグメントは、通常、ＣＴＬＡ－４の機能を少なくとも１つ有する。そのような機能としては、特に創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防する機能が含まれうる。
　本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではａｇｅｎｔに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
　本明細書において「誘導する因子」とは、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物を発現し、転写し、翻訳し、または分化誘導などすることにより、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物の産生を促進する因子をいう。
　本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様である。本明細書において「発現量」は、このような「発現」の任意の量を指す。したがって、本明細書において「発現産物」とは、このようなポリペプチドもしくはタンパク質、またはｍＲＮＡを含む。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。例えば、ＣＴＬＡ－４の発現レベルまたは発現量は、任意の方法によって決定することができる。具体的には、ＣＴＬＡ－４のｍＲＮＡの量、ＣＴＬＡ－４タンパク質の量、そして、ＣＴＬＡ－４タンパク質の生物学的な活性を評価することによって、ＣＴＬＡ－４の発現レベルを知ることができる。このような測定値はコンパニオン診断において使用し得る。、ＣＴＬＡ－４のｍＲＮＡやタンパク質の量は、本明細書の他の箇所に詳述したような方法あるいは他の当該分野において公知の方法によって決定することができる。
　（好ましい実施形態）
　以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。したがって、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができる。
［組成物］
　本開示の一局面において、創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物が提供される。
　本開示の他の局面において、疾患、障害または症状を治療または予防するための、分泌型ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物が提供される。
　さらに本開示の他の局面において、免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を治療または予防するための、分泌型ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物が提供される。
　ＣＴＬＡ－４は制御性Ｔ細胞において恒常的に発現しており、免疫を負に制御する分子である。そのため、制御性Ｔ細胞の機能不全、もしくはＣＴＬＡ－４分子が欠損することにより、致死の自己免疫疾患を引き起こすことから、ＣＴＬＡ－４は免疫恒常性の維持に必須の分子として知られる。ＴｒｅｇにおいてＣＴＬＡ－４エクソン２とエクソン３の両方を発生工学的に破壊すると、Ｔｒｅｇ欠損ｓｃｕｒｆｙマウスに類似した全身性リンパ球増殖およびＩｇＥ・ＩｇＧの過剰産生を伴う致死的な自己免疫疾患が生じる。また、ヒトにおけるＣＴＬＡ－４ハプロ不全は自己免疫疾患の特徴を示す。分泌型ＣＴＬＡ－４（ｓＣＴＬＡ－４、Ｓ）と膜型ＣＴＬＡ－４（ｍＣＴＬＡ－４、Ｍ）の機能または発現にネガティブな影響を与える一塩基多型は関節リウマチ、グレーブス病および１型糖尿病などの自己免疫疾患のリスクに関連している。そして、多くのヒトの慢性自己免疫疾患ではｓＣＴＬＡ－４の血清中濃度が上昇し、Ｔ細胞上のｍＣＴＬＡ－４発現も増加する。これらの知見は、ｓＣＴＬＡ－４とｍＣＴＬＡ－４がともにＴｒｅｇ介在性の自己寛容および免疫抑制に重要な分子であることを示唆している。
　ＣＴＬＡ－４はそのリガンドであるＣＤ８０／ＣＤ８６と相互作用し、直接および間接的にＣＤ８０／８６分子の発現を減少させ、過剰な免疫応答を妨げる。例えば、ＣＴＬＡ－４を高発現しているＴｒｅｇは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＣＤ８０／８６分子を引き抜き、物理的にＡＰＣ上のＣＤ８０／８６を減少させる。ＡＰＣ上のＣＤ８０の減少は、ＡＰＣ上のフリーのＰＤ－Ｌ１（普段はＣＤ８０とシス結合しＰＤ－Ｌ１の働きは抑制されている）を増加させ、ＰＤ－１を発現したＴ細胞の活性を妨げる。また、ＣＴＬＡ－４はＣＤ２８と比較しＣＤ８０／８６分子に優位に競合結合でき、Ｔ細胞活性化のための共刺激（ＣＤ２８とＣＤ８０／８６分子の相互作用）を阻害する。ＣＴＬＡ－４のエクソン２は進化的に保存されたＭＹＰＰＰＹモチーフを含み、ＭＹＰＰＰＹモチーフはＣＤ８０／８６との結合および相互作用の安定化に重要である。エクソン２を有するＣＴＬＡ－４スプライシングバリアントは２つ存在する。１つは、エクソン３によってコードされる膜貫通ドメインを有し、細胞膜中に係留されるｍＣＴＬＡ－４である。もう１つは、分泌のためにエクソン３を持たないｓＣＴＬＡ－４である。
　上記のとおり、ＣＴＬＡ－４分子が欠損することにより、致死の自己免疫疾患を引き起こすことから、ＣＴＬＡ－４は免疫恒常性の維持に必須の分子として知られており、分泌型ＣＴＬＡ－４についても、その機能や発現を減少させるような一塩基多型は、グレーブス病や１型糖尿病などの自己免疫疾患のリスクに関連することが知られている。本実施例においても、マウスにおける分泌型ＣＴＬＡ－４の欠損が加齢に伴って１型免疫の制御異常を引き起こし、前臨床的な自己免疫がもたらされることが示されており、また創傷の治癒の遅延など、炎症の修復において重要な働きを果たしていることが示されている（図６Ａ～Ｒ）。
　現在までのＣＴＬＡ－４に関するほとんどの研究では免疫恒常性における各ＣＴＬＡ－４バリアントの役割を区別していない。抗ｓＣＴＬＡ－４特異的抗体またはｓＣＴＬＡ－４に対するｓｉＲＮＡによってｓＣＴＬＡ－４の機能や発現を低下させると、Ｔ細胞のリコール応答が促進されたり、がん転移が減少すること、ＮＯＤマウスにおいて１型糖尿病に対する感受性が増加することなどが示されている。しかしながら、ｓＣＴＬＡ－４のブロッキングおよびノックダウン解析のみではインビボでのｓＣＴＬＡ－４とｍＣＴＬＡ－４の役割を理解するのに十分ではなく、例えばｍＣＴＬＡ－４非存在下でのｓＣＴＬＡ－４の具体的な機能に関しては全く示せていない。
　上記のとおり、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）は免疫を負に制御する分子であり、特に制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）において恒常的に高発現している。ＣＴＬＡ－４のエクソン２は進化的に保存されたＭＹＰＰＰＹモチーフを含んでおり、ＭＹＰＰＰＹモチーフはＣＤ８０／８６との結合および相互作用の安定化に重要である。
　ＣＴＬＡ－４には２つのスプライシングバリアント（膜型ＣＴＬＡ－４（ｍＣＴＬＡ－４）および分泌型ＣＴＬＡ－４（ｓＣＴＬＡ－４））が存在する。ｍＣＴＬＡ－４はエクソン１～４を有し、エクソン３によってコードされる膜貫通ドメインによって細胞膜中に係留されている。ｓＣＴＬＡ－４はエクソン３を欠損しており、細胞外に分泌される。
　したがって、本開示の一実施形態において、本開示の医薬組成物に含まれるＣＴＬＡ－４は、分泌型ＣＴＬＡ－４、及び膜型ＣＴＬＡ－４からなる群より選択される少なくとも１つを含むことができる。好ましくは、本開示の医薬組成物に含まれるＣＴＬＡ－４は、分泌型ＣＴＬＡ－４を含むものである。
　また、本開示の一実施形態において、ＣＴＬＡ－４の機能的等価物には、ＣＴＬＡ－４遺伝子のＥｘｏｎ２にコードされるＭＹＰＰＰＹモチーフ領域を含むタンパク質またはペプチド、そのようなタンパク質またはペプチドの二量体または多量体、またはＣＴＬＡ－４遺伝子のＥｘｏｎ１にコードされるシグナル配列が、同種または異種由来の他のシグナル配列に置換されて発現されたタンパク質が含まれる。
　代表的なヒトｓＣＴＬＡ－４のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照番号ＣＣＤＳ４２８０３に開示されている。また、代表的なマウスｓＣＴＬＡ－４のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照番号ＣＣＤＳ６９８９３に開示されている。本願のｓＣＴＬＡ－４はヒトまたはマウス由来のタンパク質であってもよく、他の哺乳動物（例えば、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、トリなど）由来のタンパク質であってもよい。
　ある実施形態において、ｓＣＴＬＡ－４は、ＮＣＢＩ参照番号ＣＣＤＳ４２８０３で特定されるアミノ酸配列、またはＮＣＢＩ参照番号ＣＣＤＳ４２８０３で特定されるアミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含むか、前記アミノ酸配列からなる。この実施形態における「１個または複数個」とは、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１５個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個を意味する。他の実施形態において、ｓＣＴＬＡ－４は、ＮＣＢＩ参照番号ＣＣＤＳ４２８０３で特定されるアミノ酸配列と約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、前記アミノ酸配列からなる。さらなる実施形態において、ｓＣＴＬＡ－４は、ＭＹＰＰＰＹモチーフを含む。
　上述したアミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換であってもよく、非保存的アミノ酸置換であってもよい。本明細書において、保存的アミノ酸置換とは、生じる分子の生理学的活性を変化させることなく一般的になされ得る範囲、すなわち保存的置換の範囲で認められるもの（Ｗａｔｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ
　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅなど）である。例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸（酸性アミノ酸）；リジン、アルギニンおよびヒスチジン（塩基性アミノ酸）；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファン（非極性アミノ酸）；グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニンおよびチロシン（非荷電極性アミノ酸）；フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン（芳香族アミノ酸）といった、側鎖に類似性のあるアミノ酸同士で起こる置換を挙げることができる。同様に、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンおよびトレオニン（脂肪族アミノ酸）；セリンおよびトレオニン（脂肪族－ヒドロキシアミノ酸）；アスパラギンおよびグルタミン（アミド型アミノ酸）；システインおよびメチオニン（含硫アミノ酸）といった分類をすることができる。ｓＣＴＬＡ－４は、上記配列に基づき一般に周知の方法で製造すれば良い。
　本明細書で用いる場合、「配列同一性」とは、二以上の配列（塩基配列又はアミノ酸配列）が、配列の一致度が最大となるように、ギャップおよび挿入を考慮してアラインメントされる場合の、二以上の配列における対応する位置での同一の塩基又はアミノ酸のパーセンテージを意味する。同一性を決定する方法は、アラインメントされる配列間に最大の一致度を与えるように設計される。二つの配列間の同一性を決定する方法は、限定するものではないが、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ等が挙げられる。また、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング（株）製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（（株）ジェネティクス製）を用いて決定することもできる。あるいは、短鎖ペプチドであれば、単純に配列を比較して決定することもできる。当業者であれば、上述のような方法で、配列間の同一性を決定することができる。
　本開示の組成物は、医薬上許容される担体および／または添加剤をさらに含んでも良い。本開示において、「医薬上許容される担体」は、ｓＣＴＬＡ－４と組み合わせた場合にその成分の生物学的活性を保持し得る任意の物質が含まれる。例えば、安定剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、無痛化剤、緩衝剤、保存剤、ｐＨ調整剤および抗酸化剤などが挙げられる。
　一実施形態において、本開示の組成物は、抗生物質、抗真菌薬、または抗ウイルス薬と組み合わせて投与されることができる。抗生物質、抗真菌薬、または抗ウイルス薬としては、本分野に公知の種々のものを用いることができる。また本開示の一局面において、創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための、ＣＴＬＡ－４と抗生物質とを含む組み合わせ物が開示される。
　本開示の組成物の投与経路は、経口投与または非経口投与を含み、特に限定されない。適用部位や対象とする疾患に応じて公知の各種投与形態を採用できる。例えば、非経口投与は、全身投与でも局所投与でもよく、より具体的には、例えば、気管内投与、髄腔内投与、くも膜下腔投与、頭蓋内投与、静脈内投与、動脈内投与、門脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、口腔内投与等が挙げられる。
　剤形としては、顆粒剤、細粒剤、粉剤、被覆錠剤、錠剤、坐剤、散剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤、チュアブル剤、液剤、懸濁剤、乳濁液などが挙げられる。活性物質の放出を延長する剤形を採用してもよい。注射または点滴用の剤形としては、水性および非水性の注射溶液（抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、等張化剤等を含んでもよい）；ならびに水性および非水性の注射懸濁液（懸濁剤、増粘剤等を含んでもよい）が挙げられる。これらの剤形は、密閉したアンプルやバイアル中に液体として提供されてもよく、凍結乾燥物として提供され、使用直前に滅菌液体（例えば、注射用水）を加えて調製してもよい。注射溶液または懸濁液を、粉末、顆粒または錠剤から調製してもよい。
　これらの剤形は、常法により製剤化することによって製造される。さらに製剤上の必要に応じて、医薬的に許容し得る各種の製剤用物質を配合することができる。製剤用物質は製剤の剤形により適宜選択することができるが、例えば、緩衝化剤、界面活性剤、安定化剤、防腐剤、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤等が挙げられる。
　本開示の組成物の投与量および投与回数は、有効量の有効成分が対象に投与されるように、投与対象の動物種、投与対象の健康状態、年齢、体重、投与経路、投与形態等に応じて当業者が適宜設定できる。ある状況での有効量は、日常的な実験によって容易に決定することができ、通常の臨床医の技術および判断の範囲内である。例えば、成人１日あたりの投与量は約０．０１～約１，０００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、または約１～約１０ｍｇ／ｋｇ体重であり得るが、これに限定はされない。
　本開示の組成物は、１種以上のさらなる有効成分、特に自己免疫疾患、創傷またはアレルギーの処置のための有効成分と併用できる。成分を「併用する」ことは、全成分を含有する投与剤形の使用および各成分を別個に含有する投与剤形の組合せの使用のみならず、それらが自己免疫疾患、創傷またはアレルギーの処置のために使用される限り、各成分を同時に、連続的に、または、いずれかの成分を遅延して投与することも意味する。
　一実施形態において、自己免疫疾患に関連する疾患、障害または症状には、例えば、ベーチェット病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症（全身性強皮症、進行性全身性硬化症）、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性動脈周囲炎（結節性多発動脈炎、顕微鏡的多発血管炎）、大動脈炎症候群（高安動脈炎）、悪性関節リウマチ、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、ウェゲナー肉芽腫症、混合性結合組織病、シェーグレン症候群、成人スティル病、アレルギー性肉芽腫性血管炎、過敏性血管炎、コーガン症候群、ＲＳ３ＰＥ、側頭動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、線維筋痛症、抗リン脂質抗体症候群、好酸球性筋膜炎、ＩｇＧ４関連疾患（例えば、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性膵炎など）、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、慢性萎縮性胃炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、大動脈炎症候群、グッドパスチャー症候群、急速進行性糸球体腎炎、巨赤芽球性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、バセドウ病（甲状腺機能亢進症）、橋本病、自己免疫性副腎機能不全、原発性甲状腺機能低下症、特発性アジソン病（慢性副腎皮質機能低下症）、Ｉ型糖尿病、緩徐進行性Ｉ型糖尿病（成人潜在性自己免疫性糖尿病）、慢性円板状エリテマトーデス、限局性強皮症、乾癬、乾癬性関節炎、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、円形脱毛症、白斑、尋常性白斑、アトピー性皮膚炎、視神経脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、サルコイドーシス、水疱性類天疱瘡、巨細胞性動脈炎、筋委縮性側索硬化症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、原田病、自己免疫性視神経症、特発性無精子症、習慣性流産、自己免疫性腸炎、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病）、セリアック病、ＩＢＤ、ＩＢＳ、肥満細胞症、及び包括的な病態としてＩＦＮγ産生型ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞の増殖を伴う自己免疫疾患などが含まれる。ある実施態様では、自己免疫疾患は、自己免疫性腸炎である。
　一実施形態において、創傷には、表皮、真皮、皮下組織、上皮（若しくは、粘膜上皮）、粘膜固有層、及び粘膜下層などの皮膚や粘膜組織において、擦過傷、裂傷、切創、挫傷、潰瘍、褥瘡、糖尿病性潰瘍、熱傷、炎症、細胞壊死等、何らかの要因によって組織表面が欠損した状態を含む。
　一実施形態において、アレルギーに関連する疾患、障害または症状には、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、アレルギー性結膜炎、アレルギー性胃腸炎、気管支喘息、小児喘息、食物アレルギー、薬物アレルギー、蕁麻疹などが含まれる。
　上記のとおり、ＣＴＬＡ－４は免疫恒常性の維持に必須の分子として知られていることから、本開示の一実施形態において、創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状、免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状、自己免疫疾患に関連する疾患、障害または症状、アレルギーに関連する疾患、障害または症状はいずれも、膜型および／または分泌型ＣＴＬＡ－４の異常に関連する疾患、障害または症状ということができる。ＣＤ４陽性Ｔ細胞がの分化・活性化のために受け取るシグナルには、必須のシグナル１（ＴＣＲ）とシグナル２（ＣＤ２８）があり、ＣＴＬＡ－４はシグナル２を妨げる分子となるため、本開示の一実施形態において、本開示の医薬組成物の治療または予防対象となり得る疾患、障害または症状は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞のエフェクター分化・活性化が抑制されない状態、つまりＣＤ４陽性Ｔ細胞のエフェクター分化・活性化が恒常的に起こる疾患、障害または症状とすることができる。またＩＦＮγ産生型ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞の分化・活性化には、他のタイプのエフェクターＴ細胞よりもシグナル２の要求性が高いため、ＣＤ４陽性Ｔ細胞のエフェクター分化・活性化が抑制されない疾患、障害または症状は、ＩＦＮγ産生型ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞の分化・活性化が抑制されない（つまり、恒常的に起こる）疾患、障害または症状ということもできる。ＩＦＮγ産生型ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞の分化・活性化が抑制されない場合には、自己免疫性腸炎などが生じ、また創傷治癒の遅延も生じる。
　本願の組成物の投与対象としては、動物、典型的には哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サルなど）が挙げられるが、ヒトが特に好ましい。
［スクリーニング方法］
　本開示の一局面において、創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための物質をスクリーニングする方法であって、細胞を候補物質と接触させる工程と、該細胞中、または該細胞表面におけるＣＴＬＡ－４の発現量を測定する工程と、該候補物質との接触前と比較して、該細胞中、または該細胞表面におけるＣＴＬＡ－４の量またはレベルを増加させる該候補物質を選択する工程とを含む、方法が提供される。
　また本開示の他の局面において、免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を治療または予防するための物質をスクリーニングする方法であって、細胞を候補物質と接触させる工程と、該細胞中、または該細胞外における分泌型ＣＴＬＡ－４の発現量を測定する工程と、該候補物質との接触前と比較して、該細胞中、または該細胞外における分泌型ＣＴＬＡ－４の量またはレベルを増加させる該候補物質を選択する工程とを含む、方法が提供される。
　一実施形態において、「候補物質」には、タンパク質、アミノ酸、核酸、脂質、糖質、低分子化合物、無機化合物などのあらゆる物質が包含される。候補物質は、典型的には、精製または単離されているものを使用できるが、未精製または未単離の粗精製品であっても混合物であってもよい。候補物質は、化合物ライブラリー、核酸ライブラリー、ランダムペプチドライブラリーなどの形態で提供されてもよく、また、天然物として提供されてもよい。
　本開示の一実施形態の方法において、細胞を候補物質と接触させる場合には、細胞は膜型、または分泌型ＣＴＬＡ－４を発現できる限り特に限定されないが、例えば制御性Ｔ細胞である。候補物質は、例えば細胞を含む培養培地に添加され得る。
　候補物質の標的との接触は、例えば、上記の培地や各種緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液など）の中に被検物質を添加して、細胞を一定時間インキュベートすることにより実施することができる。添加される被検物質の濃度は化合物の種類（溶解度、毒性等）により異なるが、例えば、約０．１ｎＭ～約１００μＭの範囲で適宜選択される。インキュベート時間としては、例えば、約１０分～約２４時間が挙げられる。
　本開示の一実施形態の方法において、細胞中、または細胞表面におけるＣＴＬＡ－４の発現量を測定する。この場合、測定されるＣＴＬＡ－４は膜型ＣＴＬＡ－４である。他の実施形態において、細胞中、または細胞外における分泌型ＣＴＬＡ－４の発現量を測定することもできる。細胞中、細胞外、または細胞表面のＣＴＬＡ－４の発現量は、細胞中、細胞外、または細胞表面のＣＴＬＡ－４の遺伝子量および／またはタンパク質量であってもよい。ＣＴＬＡ－４の遺伝子量および／またはタンパク質量は周知の方法によって測定することができる。ＣＴＬＡ－４の遺伝子量は、例えばＲＴ－ＰＣＲ法、ノーザンプロット法、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法などによって測定できる。また、ＣＴＬＡ－４のタンパク質量は、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法などにより測定できる。
　本開示の一実施形態の方法において、候補物質との接触前と比較して、該細胞中、または該細胞表面におけるＣＴＬＡ－４の量またはレベルを増加させる該候補物質を選択することができる。他の実施形態において、候補物質との接触前と比較して、該細胞中、または該細胞外における分泌型ＣＴＬＡ－４の量またはレベルを増加させる該候補物質を選択することができる。ある態様において、ＣＴＬＡ－４の発現量を測定する工程において測定した細胞中の膜型、または分泌型ＣＴＬＡ－４の発現量を対照の膜型、または分泌型ＣＴＬＡ－４の発現量と比較することもできる。対照は、例えば候補物質を接触させていない細胞または候補物質を接触させる前の細胞であってもよい。細胞中、細胞外、または細胞表面の膜型、または分泌型ＣＴＬＡ－４の発現量が対照の膜型、または分泌型ＣＴＬＡ－４の発現量と比較して増加していた場合、その候補物質を、膜型、または分泌型ＣＴＬＡ－４の発現を誘導または促進する物質として選択することができる。選択された候補物質は、創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状、または免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を予防または治療するための物質として使用できる。
　（一般技術）
　本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．（１９８９）．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ　Ｅｄ．（２００１）；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９８９）．　Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；　Ｉｎｎｉｓ，　Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．　（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；　Ｉｎｎｉｓ，　Ｍ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｗｉｌｅｙ，　ａｎｄ　ａｎｎｕａｌ　ｕｐｄａｔｅｓ；　Ｓｎｉｎｓｋｙ，　Ｊ．Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）．
　ＰＣＲ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
　人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えばＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）などの遺伝子合成やフラグメント合成サービスを用いることもでき、その他、例えば、Ｇａｉｔ，　Ｍ．Ｊ．（１９８５）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｇａｉｔ，　Ｍ．Ｊ．（１９９０）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ
　Ｐｒｅｓｓ；　Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，　Ｆ．（１９９１）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｄａｍｓ，　Ｒ．Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）．　Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，　Ｃｈａｐｍａｎ　＆　Ｈａｌｌ；　Ｓｈａｂａｒｏｖａ，　Ｚ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；　Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，　Ｇ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９６）．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，　Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
　本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
　以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
［試料および方法］
マウス
　雌性５～６週齢のＣ．Ｂ１７／Ｉｃｒ－ｓｃｉｄマウス、６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌマウス、ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ－ｎｕ／ｎｕマウス、およびＣ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウスをＣＬＥＡ　Ｊａｐａｎから購入した。ＣＴＬＡ－４　ｆｕｌｌ　ＫＯ（ｅｘｏｎ２とｅｘｏｎ３の欠損）、ＣＤ４５．１、ＲＡＧ２　ＫＯ、ＦＬＰｅＲ、およびＤＥＲＥＧマウスは以前に報告されている（Waterhouse,　P.　et　al.　Lymphoproliferative
　Disorders　with　Early　Lethality　in　Mice　Deficient　in　Ctla-4.　Science　270,　985-988　(1995).；Farley,　F.,　Soriano,　P.,　Steffen,　L.　&　Dymecki,　S.　Widespread　recombinase　expression　using　FLPeR　(Flipper)　mice.　genesis
　28,　106-110　(2000).；Lahl,　K.　et　al.　Selective　depletion　of　Foxp3+　regulatory　T　cells　induces　a　scurfy-like　disease.　The　Journal　of　Experimental　Medicine　204,　57-63　(2007).）。ｓＣＴＬＡ－４ノックインマウスを標準的な分子的手法で作製した。簡潔に述べると、Ｂａｌｂ／ｃ－Ｉ　ＥＳ細胞（B.　Ledermannから受領した；Noben-Trauth,　Kohler,　Burki　&　Ledermann.　Efficient　targeting　of　the　IL-4　gene　in　a　BALB/c　embryonic　stem　cell　line.　Transgenic
　research　5,　487-91　(1996).）に、ＣＴＬＡ－４遺伝子座のエクソン３の前側のス
プライシングアクセプター部位（８６ｂｐ）を除去した改変ＣＴＬＡ－４標的化ベクター（ＲＰ２３－１４６Ｊ１７）を遺伝子導入した。標的化ベクターを、ファージに基づく大腸菌相同組換えシステムを用いて作製した。ＢＡＣ（ｓＣＴＬＡ－４－ｍＣＴＬＡ－４＋）トランスジェニック（Ｔｇ）マウスを、エクソン３とエクソン４を結合させたＣＴＬＡ－４　ＢＡＣ導入遺伝子によって作製し、Ｓ－Ｍ－マウスと交配させた。特に記載がない限り、すべてのマウスをＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドに１０回以上戻し交配した。すべてのマウスを特定の病原体が存在しない条件下で維持し、大阪大学免疫学フロンティア研究センターまたは京都大学ウイルス・再生医科学研究所によって承認された動物福祉のガイドラインに従って処置した。ｓＣＴＬＡ－４ノックインマウス（Ｓ＋Ｍ－マウス）およびＣＴＬＡ－４　ｆｕｌｌ　ＫＯマウス（Ｓ－Ｍ－マウス）を３週齢で使用し、ＢＡＣ　Ｔｇ　ＣＴＬＡ－４　ｆｕｌｌ　ＫＯマウス（Ｓ－Ｍ＋マウス）を３０～３２週齢で使用した。
抗体
　以下の抗体をフローサイトメトリー分析およびインビトロでの実験に使用し、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手した：抗ｍＣＤ３（１４５－２Ｃ１１）、抗ｍＣＤ２８（３７．５１）、抗ｍＣＤ４（ＲＭ４－５）、抗ｍＣＤ８（５３－６．７）、抗ｍＣＤ２５（ＰＣ６１）、抗ｍＧＩＴＲ（ＤＴＡ－１）、抗ｍＦＲ４（ＴＨ６）、抗ｍＴＣＲβ（Ｈ５７－５９７）、抗ｍＣＴＬＡ－４（ＵＣ１０－４Ｆ１０－１１）、抗ｍＰＤ１（ＲＰＭ１－３０）、抗ｍＣＤ４４（ＩＭ７）、抗ｍＣＤ６９（Ｈ１．２Ｆ３）、抗ｍＣＤ１０３（２Ｅ７）、抗ｍＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ－１４）、抗ｍＣＤ４５ＲＢ（Ｃ３６３．１６Ａ）、抗ｍＣＤ２２３（Ｃ９Ｂ７Ｗ）、抗ｍＣＤ９０．２（５３－２．１）、抗ｍＣＤ８０（１６－１０Ａ１）、抗ｍＣＤ８６（ＰＯ３．１）、抗ｍＬｙ６Ｃ（ＨＫ１．４）、抗ｍＬｙ６Ｇ（１Ａ８）、抗ｍＧｒ－１（ＲＢ６－８Ｃ５）、抗ＴＥＲ１１９（ＴＥＲ１１９）、抗Ｓｉｇｌｅｃ－Ｆ（Ｅ５０－２４４０）、抗ｍＣＤ４１（ＭＷＲｅｇ３０）、抗ｍＣＤ１１７（２Ｂ８）、抗ＣＤ２００Ｒ３（Ｂａ１３）、抗ｍＣＤ２４（Ｍ１／６９）、抗ｍＦｃεＲＩα（ＭＡＲ－１）、抗ｍＣＤ４９ｂ（ＤＸ５）、抗ｈ／ｍＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、抗ｍＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８またはＨＬ３）、抗ｍＣＸ３ＣＲ１（２Ａ９－１）、抗ｍＦ４／８０（ＢＭ８）、抗ｍＣＤ２０６（Ｃ０６８Ｃ２）、抗ｍＣＤ６８（ＦＡ－１１）、抗ｍＣＤ６４（Ｘ５４－５／７．１）、抗ｍＣＤ７１（ＲＩ７２１７）、抗Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ（Ｍ５／１１４．１５．２）、抗ｍＣＤ４５（３０－Ｆ１１）、抗ｍＣＤ４５．１（Ａ２０）、抗ｍＣＤ４５．２（１０４）、抗ｍＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（ＲＡ３－６Ｂ２）、抗ｍＣＤ１９（１Ｄ３）、抗ｍＣＸＣＲ５（Ｌ１３８Ｄ７）、抗ｍＢｃｌ－６（Ｋ１１２－９１）、抗ＣＤ３８（９０）、抗ｈ／ｍＧＬ－７（ＧＬ－７）、抗ｍＩｇＤ（１１－２６ｃ．２ａ）、抗ｍＩｇＭ（ｌｌ／４１）、抗ｍＣＤ１３８（２８１－２）、抗ｍＣＤ１６／３２（２．４Ｇ２）、抗ｍＩＬ－２（ＪＥＳ６－５Ｈ４）、抗ｍＩＦＮγ（ＸＭＧ１．２）、抗ｍＩＬ－４（ＢＶＤ４－１Ｄ１１）、抗ｍＩＬ－５（ＴＲＦＫ５）、抗ｍＩＬ－１７Ａ（ＴＣ１１－１８Ｈ１０．１）、抗ｍＩＬ－１０（ＪＥＳ５－１６Ｅ３）、抗ｍＦｏｘｐ３（ＦＪＫ－１６ｓ）、抗ｍＧａｔａ－３（ＴＷＡＪ）、抗ｍＴ－ｂｅｔ（Ｏ４－４６）、抗ｍＨｅｌｉｏｓ（２２Ｆ６）、抗ｍＥｏｍｅｓ（Ｄａｎ１１ｍａｇ）、抗ｈＣＤ２５（Ｍ－Ａ２５１）、抗ｈＣＤ４　（ＲＰＡ－Ｔ４）、抗ｈＣＤ４５ＲＡ（ＨＩ１００）、抗ｈ／ｍＫｉ－６７（Ｂ５６）、および抗バキュロウイルスｇｐ６４（ＡｃＶ１）。抗ｉＮＯＳ　ｍＡｂ（４Ｅ５、Ａｂｃａｍ）を、Ｚｅｎｏｎ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ１　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐｒｏｂｅｓ）で標識した。マウスＣＤ４＋　Ｔ細胞をインビトロで活性化するために、抗ＣＤ３（０．５μｇ／ｍＬ）および抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍＬ）または抗ＣＤ３／ＣＤ２８　Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。ｓＣＴＬＡ－４特異的アミノ酸のペプチド（NH2-AKEKKSSYNRGLCENAPNRARM-COOH；配列番号１）を用いてモノクローナル抗体を作製するために、
抗ｓＣＴＬＡ－４特異的アミノ酸抗体を標準的な手法により作製した。
細胞培養
　マウスＴ細胞を、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）および５０μＭ　２－メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地中で培養した。Ｔ細胞を、１００Ｕ／ｍｌヒトＩＬ－２（Ｉｍｕｎａｓｅ３５、Ｓｈｉｏｎｏｇｉ）の存在下においてＴ細胞を枯渇させ、マイトマイシンＣ（ＫＹＯＷＡ　ＫＩＲＩＮ）で処理した脾細胞を伴って抗ＣＤ３／ＣＤ２８　Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または抗ＣＤ３抗体により活性化した。２１日齢のｓＣＴＬＡ－４　ＫＩ（Ｓ＋Ｍ－）、ＣＴＬＡ－４　ｆｕｌｌ　ＫＯ（Ｓ－Ｍ－）および同腹の対照（Ｓ＋Ｍ＋）から調製した脾細胞またはリンパ球を、Ｇｏｌｇｉｓｔｏｐ（Ｍｏｎｅｎｓｉｎ、ＢＤ
　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の存在下において２５ｎｇ／ｍＬ　ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１μＭイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で５時間刺激した。細胞を、サイトカインの染色のためにＣｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏｐｅｒｍおよびＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定および透過処理し、Ｆｏｘｐ３の染色のためにＦｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｅｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で固定および透過処理し、Ｆｏｘｐ３とサイトカインの共染色のためにＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｅｔ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定および透過処理した。マウスマクロファージを、ＨｙｄｒｏＣｅｌｌ　２４　Ｍｕｌｔｉ－ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（ＣｅｌｌＳｅｅｄ）を用いて１０ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ－４および１０ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ－１０の存在下で培養した。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞を、１０％ＦＣＳおよびペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ中で培養した。Ｓｆ９細胞を、１０％ＦＣＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび０．１％プルロニックＦ－６８（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ　Ｍｅｄｉｕｍ－Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ　Ｈｉｎｋ（ＴＮＭ－ＦＨ）中で２７℃において１３０ｒｐｍで振盪させた振盪フラスコを用いて培養した。Ｈｉｇｈ　Ｆｉｖｅ細胞（ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４）を、ペニシリン－ストレプトマイシン、１０Ｕ／ｍＬヘパリンおよび１８ｍＭ　Ｌ－グルタミンを添加したＥｘｐｒｅｓｓ　Ｆｉｖｅ　ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で２７℃において１３０ｒｐｍで振盪させた振盪フラスコを用いて培養した。
ＥＬＩＳＡ
　ＩＦＮγ、ＩＬ－４、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手したＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。ＩＬ－３、ＩＬ－１０およびＴＳＬＰを、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから入手したＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。ＣＴＬＡ－４、ＩＬ－３３およびＭ－ＣＳＦを、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓから入手したＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。ＩＬ－５およびＩＬ－１７Ａを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手したＢｉｏ－ｐｌｅｘキットを用いて測定した。血清抗体を、Ｍｏｕｓｅ　Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ　６ｐｌｅｘ　ＫｉｔおよびＭｏｕｓｅ　ＩｇＥ　ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘ　Ｓｉｍｐｌｅｘ　ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって測定した。エオタキシン（ＣＣＬ１１）、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２およびＣＸＣＬ１３を、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから入手したＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘキットを用いて測定した。抗マウスｄｓＤＮＡ　ＩｇＧおよび抗マウスＩｇＥを、Ｓｉｂａｙａｇｉから入手したＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。抗胃壁抗体を以前に記載されたように決定した（Wing,　K.　et　al.　CTLA-4
　control　over　Foxp3+　regulatory　T　cell　function.　Science　322,　271-5　(2008).）。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫からの全タンパク質を、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｍｉｎｉ　ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ）とともにＭ－ＰＥＲ哺乳類タンパク質抽出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて回収した。細胞抽出物を４℃において１８０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収した。溶解物中のタンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により決定した。腫瘍溶解物中のＩＦＮγ（ｐｇ／全タンパク質のｍｇ）の濃度を、ＥＬＩＳＡにより定量した。腹腔マクロファージ中のＩＬ－１０産生を、インビトロでの細胞培養の２４時間後にＥＬＩＳＡにより測定した。
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
　全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により抽出した。ｃＤＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成した。リアルタイムＰＣＲを、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックス（ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、またはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０プローブマスター（Ｒｏｃｈｅ）およびユニバーサルプローブライブラリープローブ（Ｒｏｃｈｅ）を用いたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０システム（Ｒｏｃｈｅ）により実施した。転写物をＨＰＲＴ１レベルに正規化した。アッセイ番号は以下である：Hprt、Mm01545399_m1；Il10、Mm00439614_m1；Ifng、Mm01168134_m1；Il4、Mm00445259_m1；Il17a、Mm00439618_m1；Il6、Mm00446190_m1；Ebi3、mm00469294_m1；Tgfb1、Mm03024053_m1；Nos2、Mm00440502_m1；Mrc1、Mm00485148_m1；Retnla、Mm00445109_m1；Arg1、Mm00475988_m1。ｓＣＴＬＡ－４およびｍＣＴＬＡ－４のプライマー配列は以下である：マウスsCTLA-4；フォ
ワード：5’-cgcagatttatgtcattgctaaag - 3’（配列番号２）；リバース：5’- aaacggcctttcagttgatg - 3’（配列番号３）；TaqManプローブ（FAMNFQ-MGB）：5’-aagaagtcctcttacaacagg - 3’（配列番号４）：マウスmCTLA-4；フォワード：5’-ggcaacgggacgcaga
- 3’（配列番号５）；リバース：5’- cccaagctaactgcgacaagg - 3’（配列番号６）；TaqManプローブ（FAMNFQ-MGB）：5’-ttatgtcattgatccagaacc - 3’（配列番号７）：ヒトsCTLA-4；フォワード：5’-ggacacgggactctacatctg - 3’（配列番号８）；リバース：5’-aagagggcttcttttctttagca - 3’（配列番号９）；ユニバーサルプローブライブラリープローブ＃39（Roche）：ヒトmCTLA-4；フォワード：5’-ataggcaacggaacccagat- 3’（配列番号１０）；リバース：5’- cccgaactaactgctgcaa - 3’（配列番号１１）；ユニバーサルプローブライブラリープローブ＃69（Roche）：ヒトHPRT1；フォワード：5’-gaccagtcaacaggggacat- 3’（配列番号１２）；リバース：5’- gtgtcaattatatcttccacaatcaag - 3’（配列番号１３）；ユニバーサルプローブライブラリープローブ＃22（Roche
）。
プラスミド
　マウスｍＣＴＬＡ－４　ｃＤＮＡをＢａｌｄｂ／ｃ　ＣＤ４＋ＣＤ２５＋　Ｔ細胞からクローニングした。ｓＣＴＬＡ－４　ｃＤＮＡを作製するために、ｍＣＴＬＡ－４　ｃＤＮＡをｐＣＭＶ－Ｔａｇ４Ａベクター（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にサブクローニングし、ｅｘｏｎ３欠失コンストラクトをＫＯＤ　Ｐｌｕｓ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）により作製した。Ｙ１３９Ａ（１３９番目のチロシン＞アラニン）変異体ｓＣＴＬＡ－４を、ＭＹＰＰＰＹモチーフ（ATGTACCCACCGCCATAC（配列番号１４） → ATGTACCCACCGCCAGCC（配列番号１５））に変異を導入することにより作製した。レトロウイルス遺伝子導入のために、野生型ｓＣＴＬＡ－４、Ｙ１３９Ａ変異体ｓＣＴＬＡ－４およびＣＴＬＡ－４　Ｉｇ（pME18S-mCTLA4/WT-hIgG、T.　Saito,　RIKEN　Center　for　Integrative　Medical　Sciences,　Kanagawa,　Japanから受領した）をｐＭＣｓＩｇレトロウイルスベクター（T.　Kitamura,　The　Institute　of　Medical
　Sciences,　The　University　of　Tokyo,　Tokyo,　Japanから受領した）にサブクロ
ーニングし、ｐＭＣｓＩｇ－ｓＣＴＬＡ－４、ｐＭＣｓＩｇ－ｓＣＴＬＡ－４　Ｙ１３９ＡおよびｐＭＣｓＩｇ－ＣＴＬＡ－４　Ｉｇを作製した。組換えバキュロウイルスを作製するために、ｐＣＭＶ－Ｔａｇ４Ａ内のＦＬＡＧタグ付きＷＴ　ｓＣＴＬＡ－４およびＹ１３９Ａ　ｓＣＴＬＡ－４をｐＦａｓｔＢａｃベクター（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にサブクローニングし、ｐＦａｓｔＢａｃ－ｓＣＴＬＡ－４－ＦＬＡＧおよびｐＦａｓｔＢａｃ－ｓＣＴＬＡ－４　Ｙ１３９Ａ－ＦＬＡＧを作製した。
ｓＣＴＬＡ－４またはＣＴＬＡ－４　Ｉｇを発現するＢ１６Ｆ１０黒色腫
　レトロウイルスコンストラクトの遺伝子導入を、以前に記載されているように実施した（Zhong,　S.,　Malecek,　K.,　Perez-Garcia,　A.　&　Krogsgaard,　M.　Retroviral
　Transduction　of　T-cell　Receptors　in　Mouse　T-cells.　J　Vis　Exp　Jove　2307　(2010).　doi:10.3791/2307）。Ｂ１６Ｆ１０細胞は接着細胞であるが、スピンイノキュレーションのプロトコルを用いて８μｇ／ｍＬポリブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により３２℃で１０００×ｇにおいて９０分間形質導入を行った。レトロウイルスを形質導入した後、ＧＦＰ＋形質導入細胞をＢＤ　ＦＡＣＳＡＲＩＡ　ＩＩによって２回選別および濃縮した。タンパク質の発現を、ＦＡＣＳおよびＥＬＩＳＡによって評価した。
ｓＣＴＬＡ－４の発現および精製
　組換えバキュロウイルスを、Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃバキュロウイルス発現システム（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて作製した。Ｈｉｇｈ　Ｆｉｖｅ細胞（ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４）にバキュロウイルスを感染させ、ＦＬＡＧタグ付きＷＴ　ｓＣＴＬＡ－４およびＹ１３９Ａ変異ｓＣＴＬＡ－４を産生させた。培養上清中のＦＬＡＧタグ付きＷＴ　ｓＣＴＬＡ－４（配列番号１６、ＣＣＤＳ６９８９３）またはＹ１３９Ａ　ｓＣＴＬＡ－４を抗ＦＬＡＧ　Ｍ２アフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）により精製し、洗浄緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０）で洗浄し、溶出緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水、１６０μｇ／ｍＬ　３ｘＦＬＡＧペプチド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））で溶出し、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ
　Ｇ２　Ｄｉａｌｙｓｉｓ　Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてリン酸緩衝生理食塩水で透析した。ｓＣＴＬＡ－４の濃度をＥＬＩＳＡおよびＣＢＢ染色により概算した。
細胞移植および腫瘍接種
　６週齢のＣ．Ｂ１７／Ｉｃｒ－ｓｃｉｄマウスに、ＣＤ４５．１コンジェニックマウスから精製した４×１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５－ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ細胞を単独または３週齢のＤＥＲＥＧ　Ｓ＋Ｍ－マウスもしくはＤＥＲＥＧ　Ｓ－Ｍ－マウス由来の３×１０５個のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋（ＧＦＰ＋）細胞とともに静脈内投与した。腫瘍の実験では、１×１０６個のＢ１６Ｆ１０メラニン細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下接種した。
粘膜固有層細胞の単離
　大腸粘膜固有層リンパ球および骨髄細胞を、以前に記載されている方法を用いて単離した（Weigmann,　B.　et　al.　Isolation　and　subsequent　analysis　of　murine　lamina　propria　mononuclear　cells　from　colonic　tissue.　Nature　Protocols　2,
　2307-2311　(2007).）。酵素処理により単細胞懸濁した後、ＣＤ４５＋Ｓｉｇｌｅｃ－Ｆ－Ｌｙ６Ｇ－ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋大腸マクロファージをＦＡＣＳソートし（純度＞９９％）、ｍＲＮＡの測定を行った。
組織学的分析
　大腸の組織学的分析を以前に記載されているように実施した（Yamaguchi,　T.　et　al.　Construction　of　self-recognizing　regulatory　T　cells　from　conventional
　T　cells　by　controlling　CTLA-4　and　IL-2　expression.　Proc.　Natl.　Acad.
　Sci.　U.S.A.　110,　E2116-25　(2013).）。肺切片のヘマトキシリン・エオジン（Ｈ
Ｅ）染色をＢＺ－Ｘ７００顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ）により観察した。肺全体の面積およびリンパ球が浸潤した面積（細胞病巣：＞１０００μｍ２）をＢＺ－Ｘアナライザーソフトウェア（ＫＥＹＥＮＣＥ）により算出および定量した。
ＲＮＡ　ｓｅｑ
　全ＲＮＡを、単離したＣＤ１１ｂｈｉｇｈ＋Ｆ４／８０ｈｉｇｈ＋腹腔マクロファージからｍｉＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて抽出した。ＦＡＣＳソート後のマクロファージの純度は＞９９％であった。ＴｒｕＳｅｑ　ＲＮＡ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）により調製したｃＤＮＡライブラリーを、ＨｉＳｅｑ　２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて配列決定した。リード配列をＴｏｐＨａｔにより参照ゲノム（ｍｍ１０）にマッピングした。すべての試料からの全体的なリードマッピング率は＞９４％であった。発現レベルおよび統計的有意性を、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓのパッケージに含まれているＣｕｆｆｄｉｆｆにより算出および検定した。出力ファイルを、Ｒ環境のＣｕｍｍｅＲｂｕｎｄおよびｇｐｌｏｔｓパッケージにより可視化した。遺伝子オントロジー（ＧＯ）濃縮分析のために、各遺伝子のリードカウントをＨＴＳｅｑのスクリプトであるｈｔｓｅｑ－ｃｏｕｎｔにより算出し、発現変動解析をＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒのｅｄｇｅＲパッケージにより実施した。発現変動遺伝子のリストを評価するために、ＥｒｍｉｎｅＪソフトウェアの過剰出現分析（ｏｖｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ；ＯＲＡ）法を用いた。
喘息モデル
　アレルゲンの抗原感作、投与および分析を、以前に記載されているように実施した（Reddy,　A.,　Lakshmi,　S.　&　Reddy,　R.　Murine　Model　of　Allergen　Induced　Asthma.　Journal　of　Visualized　Experiments　e3771　(2012).　doi:10.3791/3771；Misharin,　A.,　Morales-Nebreda,　L.,　Mutlu,　G.,　Budinger,　S.　&　Perlman,　H.　Flow　Cytometric　Analysis　of　Macrophages　and　Dendritic　Cell　Subsets　in　the　Mouse　Lung.　American　journal　of　respiratory　cell　and　molecular　biology　49,　130522202035005　(2013).）。簡潔に述べると、マウスに、２ｍｇのアルハイドロゲルアジュバント（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）中に乳化させた４０μｇのグレードＶのオボアルブミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を０日目と７日目に２回腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。１４、１６、１８および２０日目にマウスの気管を外科的に露出させ、５０μＬ　０．１％オボアルブミンをマイクロシリンジにより気管内（ｉ．ｔ．）に注入した。２２日目にマウスを屠殺し、肺をＰＢＳで灌流した。肺組織切片を酵素液（１ｍｇ／ｍＬヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．０５ｍｇ／ｍＬリベラーゼＴＭ（Ｒｏｃｈｅ）、および０．１ｍｇ／ｍＬ　ＤＮａｓｅ　Ｉ（Ｒｏｃｈｅ））で処理した後、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）によって単細胞懸濁液を得た。
オボアルブミンによるＤＯ１１．１０マウスの免疫
　８～１２週齢のＤＥＲＥＧ　ＤＯ１１．１０　ＴＣＲトランスジェニックマウスの腋窩／上腕リンパ節または鼠径リンパ節に近い背部の４点に、フロイント完全アジュバントＨ３７　Ｒａ（ＢＤ　Ｄｉｆｃｏ）と２ｍｇ／ｍＬのグレードＶのオボアルブミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の１：１エマルジョンを５０μＬ皮下注射した。０、７、１４および２１日目に、ｑＰＣＲによるｓＣＴＬＡ－４およびｍＣＴＬＡ－４　ｍＲＮＡの定量のために、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋（ＧＦＰ＋）Ｔｒｅｇを流入領域リンパ節から単離した（純度＞９９％）。
創傷治癒モデルおよび再上皮化の免疫蛍光
　皮膚の切除および創傷治癒の定量を以前に記載されているように行った（Keyes,　B.　et　al.　Impaired　Epidermal　to　Dendritic　T　Cell　Signaling　Slows　Wound　Repair　in　Aged　Skin.　Cell　167,　1323-1338.e14　(2016).）。簡潔に述べると、剪毛した背部の皮膚にエタノールで消毒し、６ｍｍ生検パンチ（ｋａｉ　ｍｅｄｉｃａｌ）によって２組の創傷を生成した。創傷後１、３および５日目に、２組の傷の平均創傷面積（ｍｍ２）を定規と共に撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアバージョン１．５３ａ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）を用いて面積を算出した。創傷５日後に、背部皮膚組織を免疫染色のために採取し、４％パラホルムアルデヒドで４℃において４８時間固定後、パラフィン包埋し、創傷領域の長軸について薄片（５μｍ）を作製した。再水和し、１０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）中において１２１℃で５分間蒸気滅菌することにより抗原賦活化し、精製抗ケラチン１４抗体（Ｐｏｌｙ９０６０、ニワトリポリクローナルＩｇＹ、１：５００、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色し、その後Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　Ｐｌｕｓ　４８８と結合した吸着処理済み抗ニワトリＩｇＹ二次抗体（ヤギポリクローナルＩｇＧ、１：１０００、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＤＡＰＩで染色した。創傷下の再上皮化の画像をＢＺ－Ｘ７００顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ）で撮影し、創縁から移動したＫ１４＋表皮角化細胞層の長さをＩｍａｇｅＪソフトウェアで定量した。
統計分析
　すべての図において、各データ点はランダムに選択された異なる個体動物、独立して実施された実験、または別々の動物から単離されたｍＲＮＡの定量で測定された値を表す。特に記載がない限り、データをＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍ　ｖｅｒｓｉｏｎ　７．０ｄ（ＧｒａｐｈＰａｄ　ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて一元配置分散分析により分析し、次いで適用可能な場合には、複数群についてＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ多重比較検定または２群について対応のない両側ｔ検定を行った。複数群のノンパラメトリック検定を行う場合は、クラスカル・ウォリス検定およびＤｕｎｎの多重比較検定を適用した。２群のノンパラメトリックなマン・ホイットニー検定またはログランク検定によって統計分析を行った場合、各図面の説明に記載した。Ｐ値＞０．０５をＮＳ（有意でない）とみなした。
［結果］
ｓＣＴＬＡ－４は免疫調節の役割を有する
　ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ６２ＬｌｏｗエフェクターＴｒｅｇは、ＣＤ４４ｌｏｗＣＤ６２ＬｈｉｇｈナイーブＴｒｅｇまたは従来のＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ６２ＬｌｏｗエフェクターＴ細胞（Ｔｃｏｎｖ）と比較してｓＣＴＬＡ－４の発現が２倍以上に増加していた（図１Ａ）。この結果と一致して、ヒトＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ２５ｈｉｇｈ（＜１％）エフェクターＴｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ナイーブＴｒｅｇと比較して生体内でのｓＣＴＬＡ－４　ｍＲＮＡの発現が最も高かった（図１Ｂ）。ｓＣＴＬＡ－４とｍＣＴＬＡ－４の長期的な動態を調べるために、ＤＥＲＥＧ　ＤＯ１１．１０　ＴＣＲトランスジェニック（Ｔｇ）マウスをＯＶＡ抗原で免疫し、ＣＤ４＋　Ｔ細胞をインビボで刺激した。Ｔｒｅｇ中のｓＣＴＬＡ－４は免疫７日後に減少したが、免疫２１日後にはｓＣＴＬＡ－４の量は増加し、定常レベルを上回った（図１Ｃ）。この結果は、ｓＣＴＬＡ－４が炎症の後期に必要とされ得ることを示唆している。さらに、喧嘩により皮膚に慢性的な傷を有する雄マウスは、無傷の雄マウスと比較してｓＣＴＬＡ－４およびｍＣＴＬＡ－４を高発現していた（図１Ｄ）。これらの結果から、炎症条件において活性化ＴｒｅｇがｓＣＴＬＡ－４の転写・発現を一時的に停止させた後に、ｓＣＴＬＡ－４を増加させていることを示唆している。
　炎症状況におけるｓＣＴＬＡ－４の生体での機能を評価するためにｓＣＴＬＡ－４＋　ｍＣＴＬＡ－４－マウス（Ｓ＋Ｍ－マウス）を作製した（図１Ｅ）。簡潔に述べると、内在性ＣＴＬＡ－４遺伝子座のエクソン３の上流にあるスプライシングアクセプター部位を欠損させた。Ｓ＋Ｍ－マウスはタンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルにおいてｍＣＴＬＡ－４を欠失したが、ｓＣＴＬＡ－４を発現していた（図１Ｆ～１Ｈ）。予想されたように、ｍＣＴＬＡ－４の欠損は、ｓＣＴＬＡ－４の存在下においても体重減少、脾臓およびリンパ節の肥大、ならびに自己抗体（抗ｄｓＤＮＡ　ＩｇＧ抗体および抗胃壁細胞抗体など）の血清中濃度の上昇を伴う致死的な自己免疫疾患を引き起こした（図１Ｉ～１Ｌ）。ｓＣＴＬＡ－４は従来のＳ－Ｍ－マウスにおいて観察される自己免疫疾患を防ぐことが出来なかったが、自己免疫病に伴う体重減少やリンパ球の増加を有意に抑制し、生存期間を有意に延長させた（図１Ｍ）。
　以上から、ｓＣＴＬＡ－４はｍＣＴＬＡ－４の欠損により引き起こされる自己免疫の重篤な表現型を緩和できるが、免疫恒常性の維持にはｍＣＴＬＡ－４が重要な役割を果たしていると結論付けた。これはｓＣＴＬＡ－４が炎症状況において重要であるが、ｍＣＴＬＡ－４とは異なる機序で働いていることを示唆している。
ｓＣＴＬＡ－４はＭ２マクロファージの分化を促進する
　ｍＣＴＬＡ－４とｓＣＴＬＡ－４がＣＤ８０／８６分子と相互作用するＭＹＰＰＰＹモチーフをｅｘｏｎ２に有していることを考慮して、抗原提示細胞（ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１１ｃ＋、およびＢ２２０＋細胞など）がＣＤ８０／８６を発現する割合を評価した。強い炎症を有しているにもかかわらず、Ｓ＋Ｍ－マウスのＣＤ８０＋ＣＤ１１ｂ＋細胞は増加していなかったが、Ｓ－Ｍ－マウスのＣＤ８０＋ＣＤ１１ｂ＋細胞は炎症により増加していた（図２Ａ）。対照的に、ＣＤ１１ｃ＋またはＢ２２０＋細胞のＣＤ８０＋またはＣＤ８６＋サブセットにおいてはＳ＋Ｍ－マウスとＳ－Ｍ－マウスとの間に有意な差はなかったが、Ｓ＋Ｍ－マウスのＣＤ８６＋Ｂ２２０＋細胞は増加していた（図２Ａ）。ｓＣＴＬＡ－４がＣＤ１１ｂ＋細胞の表現型に影響を与えるか否かを調べるために、脾臓および腹腔内のＣＤ１１ｂ＋細胞のサイトカイン発現レベルをｑＰＣＲにより測定した。Ｓ＋Ｍ－マウスの脾臓ＣＤ１１ｂ＋細胞はＩＬ－４を最も高く発現していたが、Ｓ－Ｍ－マウスの脾臓ＣＤ１１ｂ＋細胞はＩＬ－６を最も高く発現していた（図２Ｂ）。また、Ｓ＋Ｍ－マウスから単離されたＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋腹腔マクロファージ（腹腔内ＣＤ１１ｂ＋細胞の主な集団である）は、Ｓ－Ｍ－マウスから単離されたＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋腹腔マクロファージよりも高いＩＬ－１０産生を示した（図２Ｃ）。この結果は、ｓＣＴＬＡ－４が単球・マクロファージ・顆粒球を主としたＣＤ１１ｂ＋細胞の表現型の変化に関与していることを示唆している。さらに、Ｓ＋Ｍ－マウスは、血清ＩＬ－１０のレベルが１．５倍高かった（図２Ｄ）。以上から、Ｓ＋Ｍ－マウスとＳ－Ｍ－マウスは、ともにリンパ球の過剰増殖および自己抗体を含む抗体産生を伴う自己免疫疾患を発症していたが、Ｓ＋Ｍ－マウスのＣＤ１１ｂ＋サブセットの表現型は、ＣＤ８０、ＩＬ４、ＩＬ－６およびＩＬ－１０の発現に関してＳ－Ｍ－マウスとは異なっていた。
　ｓＣＴＬＡ－４の有無で、ＣＤ１１ｂ＋マクロファージのトランスクリプトーム（全転写物）に違いがあるかＲＮＡ－ｓｅｑ解析を行った。主座標分析（ＰＣｏＡ）と遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析により、Ｓ＋Ｍ－マウスのマクロファージが、例えば貪食、創傷治癒、細胞走化性および血管新生に関して、Ｓ－Ｍ－マウスのマクロファージとは異なる遺伝子発現プロファイルを有していることが確認された（図２Ｅ～２Ｈ）。Ｓ＋Ｍ－とＳ－Ｍ－マウスのマクロファージとの間で有意な差を示す発現変動遺伝子は、Ｍ１マクロファージまたはＭ２マクロファージの働きや性質に重要な遺伝子を数多く含んでいた（図２Ｉ）。次に、Ｍ１／Ｍ２マクロファージを規定する確立されたマーカーを選択し、これらの遺伝子を比較した。Ｓ＋Ｍ－マウスのマクロファージは、Ｍ２マーカーとしてよく知られているＭｒｃ１（ＣＤ２０６をコードしている）、Ｒｅｔｎｌａ（Ｆｉｚｚ１）、Ａｒｇ１およびＹｍ１を高レベルで発現しており、Ｓ－Ｍ－マウスのマクロファージは、Ｍ１マーカーとして知られるＮＯＳ２（ｉＮＯＳ）、Ｉｌ６およびＴｎｆを高レベルで発現していた（図２Ｊ）。また、Ｍｒｃ１やＲｅｔｎｌａ以外にもマクロファージにおいてＩＬ－４やＩＬ－１３によって制御される典型的な遺伝子であるＦｃｇｒ２ｂ、Ｍｇｌ２、Ｃｌｅｃ７ａ、およびＩｇｆ１は、すべてＳ＋Ｍ－マウスのマクロファージにおいて有意に発現が高かった（図２Ｋ）。
　以上から、炎症状況におけるｓＣＴＬＡ－４の存在は、ＣＤ１１ｂ＋細胞の表現型に直接的または間接的に影響を与え、マクロファージをＭ２様の表現型に分化させた。
ｓＣＴＬＡ－４は炎症状態においてＴｈ２と好酸球の循環を増加させる
　ＩＬ－４は生体外および生体内でＭ２マクロファージを誘導するのに重要なサイトカインであるため、Ｓ＋Ｍ－マウスのＴｈ２サイトカイン発現を調べた。高い血中濃度のＩＬ－５およびＩＬ－４がＳ＋Ｍ－マウスにおいて検出され（図３Ａ）、血中のＩＬ－４／ＩＬ－５産生ＣＤ４＋Ｔ細胞がＳ＋Ｍ－マウスで有意に増加していた（図３Ｂ～３Ｃ）。対照的に、Ｓ－Ｍ－マウスの血中ではＩＬ－４／ＩＬ－５産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度が著しく低かった。ＩＬ－５は好酸球の分化、遊走およびエフェクター機能に関与しているため、血中の好酸球の割合を評価した。好酸球は、Ｓ－Ｍ－マウスよりもＳ＋Ｍ－マウスの血中において有意に多く遊走していた（図３Ｄ）。好酸球はＴｈ２サイトカイン刺激に応答して成熟し、活性化に伴いより多くのＩＬ－４およびシグネチャー遺伝子であるＳｉｇｌｅｃ－Ｆを発現する。Ｓｉｇｌｅｃ－Ｆはアポトーシスを誘導し、負のフィードバック様式で好酸球の過剰増加を抑制する。Ｓ＋Ｍ－マウスの組織浸潤性成熟好酸球ではＳｉｇｌｅｃ－Ｆが増加しており、Ｓ－Ｍ－マウスの２倍以上ＩＬ－４を発現していた（図３Ｅおよび３Ｆ）。というよりむしろ、Ｓ－Ｍ－マウスの好酸球では、Ｓ＋Ｍ－マウスおよびＳ＋Ｍ＋野生型マウスの好酸球と比較してＩＬ－４産生能が低下していた。Ｓ＋Ｍ－マウスにおいてＩＬ－４／ＩＬ－５産生ＣＤ４＋Ｔ細胞および循環好酸球が増加していることは、エオタキシン（ＣＣＬ１１）、ＣＣＬ２２およびＣＣＬ２４（これらはＴｈ２サイトカインにより増加し、Ｔｈ１サイトカインにより減少する）のレベルがＳ－Ｍ－マウスと比較してＳ＋Ｍ－マウスにおいて有意に高かったという観察結果と一致する（図３Ｇおよび３Ｈ）。この結果は、炎症下のＴｈ２サイトカインの増加とＴｈ１サイトカインの抑制により、Ｔｈ２、ＩＬ－４産生好酸球および更なるＴｈ２サイトカインの循環が増加することを示唆している。次いで、Ｔｈ２や好酸球が集積しやすい肺の肺胞マクロファージの表現型を評価した。Ｓ＋Ｍ－マウスの肺胞マクロファージではＣＤ２０６の発現が有意に増加しており、Ｍ２様の表現型を示していた。この結果から、Ｓ＋Ｍ－マウスでは、腹腔だけでなく、肺においてもＭ２マクロファージへの分化偏向が見られた（図３Ｉ）。
　Ｓ＋Ｍ－とＳ－Ｍ－マウスのマクロファージの表現型の差異が、単にＴｈ２サイトカインの発現の差異によるものであるのか否かを調べた。Ｓ－Ｍ－マウスから単離した脾臓マクロファージをインビトロにおいてＩＬ－４およびＩＬ－１０で処理すると、マクロファージのＣＤ８０が減少し、ＣＤ２０６が増加した（図３Ｊ）。この結果は、Ｓ＋Ｍ－マウスから単離したＣＤ１１ｂ＋細胞がＣＤ８０ｌｏｗおよびＣＤ２０６ｈｉｇｈの表現型を示した観察結果と一致する。最後に、ＩＬ－４／ＩＬ－５を過剰産生するＩＬＣ２（２型自然リンパ球）、好塩基球またはマスト細胞が、Ｓ＋Ｍ－マウスにおいて増加していた可能性を排除するために、これらの細胞の２型免疫応答を促進するＩＬ３３／ＴＳＬＰ血中濃度と細胞の割合について評価した。血清ＩＬ－３３およびＴＳＬＰはＳ＋Ｍ－マウスおよびＳ－Ｍ－マウスの両方において抑制され（図３Ｋおよび３Ｌ）、Ｓ＋Ｍ－マウスの血中および腸間膜中のＬｉｎ－ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋　ＩＬＣ（自然リンパ球の共通マーカー）の割合は減少しており（図３Ｍおよび３Ｎ：Ｓ＋Ｍ－マウスのＧＡＴＡ３＋ＩＬＣ細胞は検出できなかった）、Ｓ＋Ｍ－マウスの好塩基球またはｃ－ｋｉｔ＋細胞は増加していなかった（図３Ｏ）
　これらのデータは、炎症下でＩＬ－４／ＩＬ－５産生Ｔｈ２細胞の増加およびＩＬ－４ｈｉｇｈ浸潤性好酸球の増加が、マクロファージの表現型変化に影響を与えることを示唆している。
ｓＣＴＬＡ－４はＴｈ１とＴｈ２の分化偏向に作用する
　ｓＣＴＬＡ－４によって制御される利用可能なＣＤ８０／８６分子の量が、Ｔｈ１およびＴｈ２の分化に影響を与えるか否かを評価した。まずは、ＣＤ８０／８６共刺激の一方または両方を阻害する抗体を用いると、Ｔｈ１分化はフリーのＣＤ８０／８６分子の数に大きく依存していたが、Ｔｈ２の分化は依存しないことが分かった（図４Ａおよび４Ｂ）。面白いことに、ＣＤ８６をブロックすることによってＴｈ２の分化が有意に促進された（図４Ｂ）。ｓＣＴＬＡ－４が生体内においてＴｈ１とＴｈ２の割合を変化させているという仮説に基づいて、Ｔｈ細胞分化におけるｓＣＴＬＡ－４の生理的役割を明らかにするために、野生型のｓＣＴＬＡ－４組換えタンパク質およびＣＤ８０／８６に結合できない変異型ｓＣＴＬＡ－４　Ｙ１３９Ａ組換えタンパク質を作製した。抗ＣＤ８０／８６抗体と同様に、インビトロでの組換えｓＣＴＬＡ－４の添加はＴｈ１分化を用量依存的に阻害し、逆に高い濃度では有意にＴｈ２分化を促進した（図４Ｃ～４Ｆ）。以上から、ｓＣＴＬＡ－４は抗ＣＤ８０／８６抗体と同様の機能を有しており、ｓＣＴＬＡ－４によるＣＤ８０／８６分子のブロックはＴｈ１分化を抑制する。また、ｓＣＴＬＡ－４は、十分なＴＣＲ刺激下ではＴｈ２分化に影響しないどころか、Ｔｈ２分化を促進することが示唆された。最後に、Ｓ＋Ｍ－マウスで増加したｓＣＴＬＡ－４が単球／マクロファージを直接作用してＭ２マクロファージに分化させた可能性を排除するために、単球／マクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７をｓＣＴＬＡ－４で処理した。その結果、ｓＣＴＬＡ－４自体は、ＩＬ－４およびＩＬ－１０とは異なり、Ｍ２マクロファージの分化に有意な影響を与えなかった（図４Ｇ）。
　以上から、ｓＣＴＬＡ－４はＴＣＲの刺激が十分であってもＴｈ１分化を抑制し、Ｔｈ２分化を促進する機能を有しており、Ｍ２マクロファージの分化を間接的に促進すると結論付けた。
ｓＣＴＬＡ－４は腸内および腫瘍環境においてＴｈ１炎症を妨げる
　腸間膜リンパ節およびパイエル板中のＣＤ４＋Ｔ細胞は健常状態において他の体表リンパ節（鼠径リンパ節など）と比較してｓＣＴＬＡ－４を２倍以上発現していた（図５Ａ）。さらに、ｓＣＴＬＡ－４を欠損したＳ－Ｍ－マウスは、Ｓ＋Ｍ－マウスと比較して３週齢において大腸が有意に短く、体重が著しく減少しており、大腸組織にリンパ球浸潤性の小病巣が発生していた（図５Ｂ～Ｄおよび図１Ｉ）。このことから、ｓＣＴＬＡ－４が生体内で腸間膜リンパ節中のＴｈ１細胞および大腸マクロファージの分化制御に影響を与えているか否かを調べた。Ｓ－Ｍ－マウスの腸間膜リンパ節中のＴｈ１細胞およびＴｈ１７細胞の数は、ｓＣＴＬＡ－４の欠失により有意に増加していた（図５Ｅ）。さらに、Ｓ－Ｍ－マウスから単離した大腸マクロファージは、ＩＦＮγ産生Ｔｈ１の増加に伴ってｉＮＯＳおよびＩＬ－６が高発現しており（これはＭ１様の表現型を示している）、Ｓ＋Ｍ－マウスから単離した大腸マクロファージではＣＤ２０６およびＦｉｚｚ１が高く発現していた（これはＭ２様の表現型を示している）（図５Ｆ）。この結果から、同じｍＣＴＬＡ－４欠損により生じた自己免疫病マウスでも、ｓＣＴＬＡ－４を有していると、腸管でのＴｈ１やＭ１マクロファージの分化が抑制されることが示唆された。また、Ｓ＋Ｍ－マウスでは、腹腔や肺だけでなく、腸管においてもＭ２マクロファージへの分化偏向が起きていることが分かった。
　ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＣＤ４＋　Ｔ細胞をＳＣＩＤマウスに養子移入することで誘導される炎症性腸疾患（ＩＢＤ）はエフェクターＴｈ１細胞の分化が関与している。Ｓ＋Ｍ－
　ＴｒｅｇまたはＳ－Ｍ－　Ｔｒｅｇ（両者の差異はｓＣＴＬＡ－４の有無）を、ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈナイーブＣＤ４＋　Ｔ細胞とともにＳＣＩＤマウスに移入することで、ｓＣＴＬＡ－４の生体内でのＴｈ１抑制機能を検証した。Ｓ＋Ｍ－　Ｔｒｅｇの同時移入ではマウスを大腸炎の発症から保護できたが、Ｓ－Ｍ－　Ｔｒｅｇの同時移入は、大腸炎を抑制できなかった（図５Ｇ～Ｉ）。このＳ－Ｍ－　Ｔｒｅｇの同時移入マウスは著しい体重減少、顕著な大腸上皮細胞過形成および大腸炎疾患スコアの上昇を示した（図５Ｇ～５Ｉ）。次に、野生型ｓＣＴＬＡ－４または変異型ｓＣＴＬＡ－４　Ｙ１３９Ａを分泌するＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞株を作製した。ｓＣＴＬＡ－４　Ｙ１３９Ａを分泌するＢ１６Ｆ１０黒色腫株はＣＤ８０／８６分子をブロックする能力を持たない。これらのＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞株をＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスに皮下投与し、ｓＣＴＬＡ－４が、ＩＦＮγ依存的抗腫瘍免疫に影響を与えるか評価した。腫瘍微小環境でＴｒｅｇにより分泌されるｓＣＴＬＡ－４を模倣したｓＣＴＬＡ－４産生黒色腫は、ヌードマウス（Ｔ細胞欠損マウス）を用いた試験と同様に、急速な腫瘍増殖を示した（図５Ｊおよび５Ｋ）。この結果は、ｓＣＴＬＡ－４産生黒色腫がＴ細胞依存的抗腫瘍免疫を抑制したことを示唆している。この結果と一致して、腫瘍環境中のｓＣＴＬＡ－４はＩＦＮγ産生を有意に抑制していたことが分かった（図５Ｌ）。ＩＦＮγの抑制は、腫瘍組織中のＣＤ２０６ｈｉｇｈ　Ｍ２様腫瘍マクロファージ（ＴＡＭ）の顕著な増加を伴っていた（図５Ｍ）。
　以上から、生体内炎症環境におけるｓＣＴＬＡ－４のＴｈ１阻害は、Ｍ２マクロファージの分化を促進していた。
ｓＣＴＬＡ－４は健常状態においてＩＦＮγ産生Ｔ細胞の自発的な分化および自己抗体の産生を防ぐ
　より健常状態に近い状態におけるｓＣＴＬＡ－４の機能を調べるために、Ｓ－Ｍ＋（ｓＣＴＬＡ－４　ＫＯ）マウスを作製した（図６Ａ）。このマウスは、ｍＣＴＬＡ－４のみ（ｍＣＴＬＡ－４　ｍＲＮＡおよびタンパク質）を野生型マウスと同じレベルで発現する（図６Ｂおよび６Ｃ）。ＣＤ４４＋ＣＤ８＋エフェクター・メモリー型Ｔ細胞の割合は、脾臓およびリンパ節において齢とともに徐々に増加し、２４週齢では８週齢の２倍以上となり（図６Ｄ）、ＣＤ４４＋ＣＤ４＋エフェクター・メモリー型Ｔ細胞の割合はリンパ節で増加していたことから（図６Ｅ）、３０週齢において野生型マウスと比較することにした。ｍＣＴＬＡ－４を欠損したマウスと比較して、Ｓ－Ｍ＋マウスは正常な外観を示し、３０週齢においても脾臓およびリンパ節の肥大を示さなかった（図６Ｆ～６Ｈ）。しかし、３０週齢Ｓ－Ｍ＋マウスは脂肪組織に異所性リンパ節構造を示し、肺組織に白血球浸潤が認められた（図６Ｉ）。また、Ｓ－Ｍ＋マウスでは、３０週齢において自己抗体である抗ｄｓＤＮＡ　ＩｇＧ、抗胃壁細胞ＩｇＧ、ＩＬ－６およびＴＮＦ－αのレベルがＳ＋Ｍ＋マウスよりも著しく高かった（図６Ｊ）。さらに、Ｓ－Ｍ＋マウスの腹腔から単離したマクロファージは、ｉＮＯＳおよびＩＬ－６を有意に高発現していた（図６Ｋ）。この結果は、Ｓ－Ｍ＋マウスの腹腔マクロファージがＭ１様の表現型を有していることを示している。上述の観察と一致するように、ｓＣＴＬＡ－４の欠損は、脾臓、腸間膜リンパ節および体表リンパ節におけるＩＦＮγ産生ＣＤ８＋　Ｅｏｍｅｓ＋エフェクター／メモリーＴ細胞およびＩＦＮγ産生ＣＤ４＋　Ｔｈ１細胞の顕著な増加をもたらした（図６Ｌおよび６Ｍ）。この結果は、ｓＣＴＬＡ－４の欠損が加齢に伴って１型免疫の制御異常を引き起こし、前臨床的な自己免疫をもたらすことを示唆している。
　炎症促進性のＭ１から炎症抑制性のＭ２マクロファージの表現型移行を阻害すると、組織修復に好ましくない結果となる。このため、炎症時の１型免疫（Ｔｈ１、Ｍ１型）の抑制および２型免疫（Ｔｈ２、Ｍ２型）の促進に対するｓＣＴＬＡ－４の寄与が、皮膚切除創傷モデルを用いた創傷治癒プロセスを促進できるか評価した。１２週齢Ｓ－Ｍ＋マウスは、創傷後１、３および５日目においてＳ＋Ｍ＋対照マウスと比較して創傷閉鎖が一貫して遅延していた（図６Ｎ）。外傷の観察と一致するように、１２週齢Ｓ－Ｍ＋マウスでは、創傷下の（表皮基底層に位置する）Ｋ１４＋ケラチノサイトの遊走を伴う再上皮化プロセスが有意に障害されていた（図６Ｏ）。一方、ｓＣＴＬＡ－４を有する対照マウスでは、創傷は創傷後５日目には再上皮化によりほとんど閉鎖していた（図６Ｎおよび６Ｏ）。自己免疫を伴う３０週齢のＳ－Ｍ＋マウスと、Ｓ＋Ｍ＋マウスの比較によっても同様の観察を得て、ｓＣＴＬＡ－４の組織修復プロセスへの重要性を確認した（図６Ｐおよび６Ｑ）。上述しているとおり、３０週齢のＳ－Ｍ＋マウスではＴｈ１およびＩＦＮγ＋ＣＤ８＋細胞が著しく増加していたため、１２週齢と３０週齢のＳ－Ｍ＋マウスの創傷閉鎖をさらに比較した。創傷後１日目および３日目の創傷部に大きな差はなかったが、５日目では１２週齢のＳ－Ｍ＋マウスと比較して３０週齢のＳ－Ｍ＋マウスにおいて創傷閉鎖が有意に遅延していた（図６Ｒ）。これらの結果から、ｓＣＴＬＡ－４は炎症の終焉に重要な組織修復およびリモデリングを促進していた。
　以上から、Ｓ－Ｍ＋マウスのデータおよび皮膚創傷後の創傷閉鎖および再上皮化プロセスのｓＣＴＬＡ－４による促進は、ｓＣＴＬＡ－４がＴｈ１分化の抑制およびマクロファージ分化の偏向（Ｍ１→Ｍ２）に作用していると言う結論を支持している。
ｓＣＴＬＡ－４は、Ｔｆｈとアレルゲン反応性Ｔｈ２の分化およびＩｇＥの産生を抑制する
　Ｓ－Ｍ＋マウスでは、ＩｇＥの値が高レベルであった（図７Ａ）が、Ｓ－Ｍ＋マウスのリンパ節にＩＬ－４産生Ｔｈ２細胞は検出されなかった（データは示していない）。Ｔｈ２ではなくＴｆｈ細胞由来のＩＬ－４がＩｇＥのクラススイッチに重要であることが報告されている。また、Ｔｆｈは、分化のためにＣＤ８０／８６要求性が高いことが報告されている。そこで、ｓＣＴＬＡ－４が生体内でＴｆｈ分化に影響を与えているのか否かを調べた。ｓＣＴＬＡ－４の欠損は、パイエル板および腸間膜リンパ節におけるＢｃｌ６＋ＰＤ１＋ＣＸＣＲ５＋Ｔｆｈ細胞の割合を増加させ、腸間膜リンパ節におけるＣＤ３８－ＧＬ７＋ＩｇＤ－ＩｇＭ－胚中心（ＧＣ）Ｂ細胞の割合を増加させた（図７Ｂおよび７Ｃ）。この結果は、ｓＣＴＬＡ－４が健常状態でパイエル板および腸間膜リンパ節において高レベルで発現していることを考慮すると、ｓＣＴＬＡ－４はＴｆｈ細胞の分化制御に重要な役割を果たしていることが示唆される（図５Ａ）。
　ｓＣＴＬＡ－４は炎症状態ではＴｈ１分化を抑制することでＴｈ２分化を促進し、健常状態ではＴｈ１やＴｆｈ細胞の自発的な分化と増加を抑制していた。アレルゲン反応性Ｔｈ２細胞に依存する喘息実験モデルを用いてｓＣＴＬＡ－４がアレルギーの進行に抑制的に働くか否か調べた。８週齢の健常な（ＩＦＮγ＋産生Ｔ細胞が増加していない）Ｓ－Ｍ＋マウスまたはＳ＋Ｍ＋マウスをＯＶＡとアジュバント混合物の腹腔内投与（ｉ．ｐ．）により感作し、次にＯＶＡ溶液を外科的気管内注入（ｉ．ｔ．）し、ＯＶＡ反応性Ｔｈ２細胞を刺激することで喘息を誘導した。Ｓ－Ｍ＋マウスは、Ｓ＋Ｍ＋マウスと比較して肺組織により多くのＴｈ２細胞、好酸球およびＭ２肺胞マクロファージを有していた（図７Ｄ～７Ｇ）。これは、健常状態下の早期炎症において、ｓＣＴＬＡ－４がのＴｈ２分化の促進物ではなく、アレルゲン反応性ナイーブＴ細胞の活性化閾値（Ｔｈ２への分化を抑制する力）として機能していることを示唆している。重要なことは、Ｍ２マクロファージの分化は、ｓＣＴＬＡ－４の非存在下においても、Ｔｈ２および好酸球の増加により促進されていた（図７Ｆ）。これらの結果により、非炎症状態でＣＤ８０／８６の量が少ない場合（健常状態では抗原提示細胞の数も少なくＣＤ８０／８６の発現も低い）、ｓＣＴＬＡ－４はＣＤ８０／８６を十分にブロックでき、Ｔｈ２細胞の分化をも妨げることが分かった。これはｓＣＴＬＡ－４を有するＳ＋Ｍ＋マウスで観察されたように、ｓＣＴＬＡ－４はアレルギーの発症を遅延もしくは抑制出来ることを示唆する。
　結論として、ｓＣＴＬＡ－４は非炎症状態および炎症状態の両方においてナイーブＴ細胞およびエフェクターＴ細胞の活性化閾値を上昇させ、ヘルパーＴ細胞とマクロファージの分化偏向のバランスを調節する。健常状態において自己免疫およびアレルギーを抑制し、炎症状態において　Ｔｈ２・Ｍ２マクロファージ分化および組織修復／リモデリングを促進することで炎症を軽減または鎮静化する。
　本明細書に記載の通り、ｓＣＴＬＡ－４はＣＤ８０／８６を介したナイーブＴ細胞のエフェクターＴ細胞への分化を制限し、炎症時の持続的な共刺激（ＣＤ２８－ＣＤ８０／８６相互作用）を妨げることにより、ヘルパーＴ細胞の分化偏向を調節するという特有の能力を有する。また、ｓＣＴＬＡ－４が炎症状態におけるＭ２マクロファージの分化に重要な役割を果たしており、炎症の鎮静化に関与することも実証された。さらに、ｓＣＴＬＡ－４が豊富な腫瘍環境では大量のＭ２腫瘍マクロファージとともに腫瘍増殖が促進されたが、健常な状態ではｓＣＴＬＡ－４はリンパ組織における自発的な自己抗体産生ならびにＴｈ１、Ｔｆｈ、Ｔｈ１７およびＴｈ２の異常分化を妨げた。これらの結果は、ｓＣＴＬＡ－４の機能障害または過剰産生が自己免疫疾患、腫瘍およびアレルギーなどの様々な病態に幅広く関与することを示している。これらの知見は、ｓＣＴＬＡ－４組換えタンパク質もしくは阻害物質が治療物質として有用であることを支持する。
（炎症性腸疾患の治療）
　ＩＢＤなどの炎症性腸疾患を、ＳＣＩＤマウスにＣＤ４５ＲＢ高陽性のナイーブＴ細胞を養子移入することで誘導する。観察期間中、リコンビナント分泌型ＣＴＬＡ－４を定期的に腹腔投与し、炎症性腸疾患の進行や程度を複数のパラメーターで測定する。体重は週ごとに測定する。観察期間が終わった後、大腸を病理組織学的に解析し、病理スコアで分泌型ＣＴＬＡ－４の効果を評価する。また同時に、腸管リンパ節におけるＩＦＮγ産生型ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞の増殖がどの程度あったかをＦＡＣＳにより測定し、分泌型ＣＴＬＡ－４の効果を評価する。分泌型ＣＴＬＡ－４の効果が見られた場合、体重減少の抑制、病理スコアの低下、そしてＩＦＮγ産生型ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞の増殖抑制が見られる。
（アレルギー疾患の治療）
　喘息アレルギー疾患を、マウスに卵白アルブミンを用い、感作・誘導する。観察期間中、リコンビナント分泌型ＣＴＬＡ－４を定期的に腹腔投与し、最終的なアレルギーの進行や程度を複数のパラメーターで測定する。分泌型ＣＴＬＡ－４が、Ｔｈ２分化や好酸球の集積を遅らせるか評価するために、肺組織懸濁液や気管支肺胞洗浄液のＦＡＣＳ解析、および肺の病理組織学的解析を行う。分泌型ＣＴＬＡ－４の効果が見られた場合、上記のＴｈ２分化や好酸球の集積が抑制される。
（創傷治癒）
　マウスの背部に生検パンチを用い、傷を作成する。観察期間中、リコンビナント分泌型ＣＴＬＡ－４を定期的に創傷部位に塗布または腹腔投与し、創傷治癒の進行や程度を複数のパラメーターで測定する。傷の大きさは、毎日測定する。加えて創傷後の再上皮化プロセスを、Ｋ１４＋表皮基底角化細胞がどれだけ創傷部位を覆ったかによって再上皮化を定量する。分泌型ＣＴＬＡ－４の効果が見られた場合、創傷治癒が促進され、創傷部位がより早く小さくなることに加えて、再上皮化プロセスも促進される。
　（注記）
　以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、日本国特許庁に２０２１年１２月１６日に出願された特願２０２１－２０４３７１に対して優先権主張をするものであり、その内容はその全体があたかも本願の内容を構成するのと同様に参考として援用される。
　本開示の医薬組成物は様々な自己免疫疾患、アレルギー、創傷などの炎症性疾患の治療や予防のために用いることができる。また本開示の医薬組成物は、生体に適用した場合にも、副作用がなく、安全に免疫抑制を誘導することができ、医療分野への応用が期待できる。
配列番号１：sCTLA-4特異的アミノ酸のペプチド配列
配列番号２～３：マウスsCTLA-4のフォワードおよびリバースプライマー配列
配列番号４：TaqManプローブ（FAMNFQ-MGB）
配列番号５～６：マウスmCTLA-4のフォワードおよびリバースプライマー配列
配列番号７：TaqManプローブ（FAMNFQ-MGB）
配列番号８～９：ヒトsCTLA-4のフォワードおよびリバースプライマー配列
配列番号１０～１１：ヒトmCTLA-4のフォワードおよびリバースプライマー配列
配列番号１２～１３：ヒトHPRT1のフォワードおよびリバースプライマー配列
配列番号１４：ＭＹＰＰＰＹモチーフ
配列番号１５：変異ＭＹＰＰＰＹモチーフ
配列番号１６：WTsCTLA-4のアミノ酸配列

Claims (25)

  1. 　創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物。
  2. 　前記ＣＴＬＡ－４が分泌型ＣＴＬＡ－４、及び膜型ＣＴＬＡ－４からなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　前記ＣＴＬＡ－４が分泌型ＣＴＬＡ－４を含む、請求項１または２に記載の医薬組成物。
  4. 　局所的に投与される、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  5. 　全身投与される、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  6. 　抗生物質、抗真菌薬、または抗ウイルス薬と組み合わせて投与される、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  7. 　創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための、ＣＴＬＡ－４と抗生物質とを含む組み合わせ物。
  8. 　疾患、障害または症状を治療または予防するための、分泌型ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物。
  9. 　前記機能的等価物が、ＣＴＬＡ－４遺伝子のＥｘｏｎ２にコードされるＭＹＰＰＰＹモチーフ領域を含むタンパク質またはペプチド、及び該タンパク質またはペプチドの二量体または多量体を含む、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 　前記機能的等価物は、ＣＴＬＡ－４遺伝子のＥｘｏｎ１にコードされるシグナル配列が、同種または異種由来の他のシグナル配列に置換されて発現されたタンパク質を含む、請求項８または９に記載の医薬組成物。
  11. 　局所的に投与される、請求項８～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  12. 　全身投与される、請求項８～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  13. 　抗生物質、抗真菌薬、または抗ウイルス薬と組み合わせて投与される、請求項８～１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  14. 　免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を治療または予防するための、分泌型ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物。
  15. 　前記免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状は、炎症を伴う免疫系疾患を含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 　前記免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状は、自己免疫疾患および／もしくはアレルギー、あるいはそれらに関連する疾患、障害または症状を含む、請求項１４または１５に記載の医薬組成物。
  17. 　前記免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状は、自己免疫疾患に関連する疾患、障害または症状を含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  18. 　前記免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状は、アレルギーに関連する疾患、障害または症状を含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  19. 　前記機能的等価物は、ＣＴＬＡ－４遺伝子のＥｘｏｎ２にコードされるＭＹＰＰＰＹモチーフ領域を含むタンパク質またはペプチド、及び該タンパク質またはペプチドの二量体または多量体を含む、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  20. 　前記機能的等価物は、ＣＴＬＡ－４遺伝子のＥｘｏｎ１にコードされるシグナル配列が、同種または異種由来の他のシグナル配列に置換されて発現されたタンパク質を含む、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  21. 　局所的に投与される、請求項１４～２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  22. 　全身投与される、請求項１４～２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  23. 　抗生物質、抗真菌薬、または抗ウイルス薬と組み合わせて投与される、請求項１４～２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  24. 　創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための物質をスクリーニングする方法であって、
    　細胞を候補物質と接触させる工程と、
    　該細胞中、または該細胞表面におけるＣＴＬＡ－４の発現量を測定する工程と、
    　該候補物質との接触前と比較して、該細胞中、または該細胞表面におけるＣＴＬＡ－４の量またはレベルを増加させる該候補物質を選択する工程と
    を含む、方法。
  25. 　免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を治療または予防するための物質をスクリーニングする方法であって、
    　細胞を候補物質と接触させる工程と、
    　該細胞中、または該細胞外における分泌型ＣＴＬＡ－４の発現量を測定する工程と、
    　該候補物質との接触前と比較して、該細胞中、または該細胞外における分泌型ＣＴＬＡ－４の量またはレベルを増加させる該候補物質を選択する工程と
    を含む、方法。
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