JP2007501243A - 可溶性ｃｔｌａ４分子を用いる心臓血管疾患の治療方法 - Google Patents

可溶性ｃｔｌａ４分子を用いる心臓血管疾患の治療方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、それらのリガンドの結合によって内因性のＢ７分子を遮断する可溶性のＣＴＬＡ４分子を患者に投与することによって、心臓血管系疾患を治療するための組成物および方法に関する。

Description

発明の詳細な説明
本出願を通して、種々の刊行物を引用する。それらのすべてを引用するこれらの刊行物の開示は、本発明に関連する技術状況を充分に記載するために本明細書に引用する。
（技術分野）
本発明は、概して心臓血管疾患の分野に関する。特に、本発明は、可溶性ＣＴＬＡ４分子を単独で、または他の治療剤と組み合わせた有効量を、患者に投与することによって、心臓血管疾患を治療または予防するための方法および組成物に関する。
（技術背景）
約６２００万人の米国人は、心臓冠状動脈疾患（ＣＨＤ）を伴う、１またはそれ以上のタイプの心臓血管疾患を有し、合衆国だけで１７００万人以上の患者（参照：米国心臓協会。２００２年心臓および発作の最新の統計、ダラス、テキサス州。：米国心臓協会；２００１年）が、発作に苦しんでいる。多くの治療の選択および技術進歩にもかかわらず、これらの疾患での死亡症例は、非常に高く；実際に、心臓血管疾患は、５人に２人が命を落とす合衆国で主要な死因である。それ故、心臓血管疾患の治療および予防のために、新しい方法が必要である。
ＣＨＤの主な原因であるアテローム性動脈硬化症の概念は、動脈壁において、脂質の受動蓄積の過程であり、結果として、もはや防御できない症候性の心臓血管疾患の進行に導く（参照：サイエンティフィックアメリカン 2002 (May): 46-55）。この仮説は、心臓血管疾患が慢性的な炎症過程（参照：Circulation 2002; 105:1135-43）を示す証拠によって替わりつつある。潜在的および先行する急性冠状動脈または脳血管の徴候が、「損傷を受けやすい」（またはハイリスク）動脈硬化性プラークであることが提案されてきた。炎症は、不安定狭心症（ＵＡ）および急性心筋梗塞（ＡＭＩ）に導く、プラークの不安定性および破裂への主要因であると考えられる。損傷を受けやすいプラークは、単独（要員の原因）の障害（参照：Circulation 2003;107:2072-2075）とかなり隔てた多くの解剖学的に区別された場所で、しばしば現れることが示されてきた。損傷を受けやすいプラークの多発性は、病理解剖系列および血管造影法、血管内超音波法（ＩＶＵＳ）、視鏡的、またはサーモグラフィー技術を用いた研究において、実証されてきた。さらにこれらの仮説を支持する臨床指標データ（例えば、死亡、心筋梗塞、発作）は、疫学的データ、完了した臨床試験の過去の仮説が生ずる解析および臨床試験で予測する評価から生じる（下記にまとめる）。
医師による健康調査からの疫学的データは、炎症マーカー（例えば、Ｃ反応性蛋白質［ＣＲＰ］、フィブリノーゲン、インターロイキン−６、可溶性細胞内接着分子−１［ｓＩＣＡＭ−１］）が、ＡＭＩ（参照：Circulation 1999;100:1148-1150）の進行の将来的なリスク予測である、説得力のある証拠を提供する。続いて、十数人以上に基づく疫学的研究は、同様の観察（参照：Circulation 2002; 105:1135-43）を報告してきた。ＣＲＰ（および高感受性ＣＲＰ［ｈｓ−ＣＲＰ］）は、これらの疫学的研究にわたって、最もよく研究された炎症性マーカーである。ＣＲＰは、一次予防および二次予防の両方の患者分布において、次に起こる心臓血管の徴候（ＡＭＩ、死亡）の独立した予測の判断材料であることが明らかである。
実験的および臨床的証拠は、炎症の減少が臨床徴候の減少に導くという概念を支持する。アスピリンは、ＣＲＰによって測定される炎症の減少に関連するとして、医師による健康調査で示され、冠状動脈の徴候（参照：Circulation 1999;100:1148-1150）に付随する減少に関連する。アスピリンの抗血小板効果に対する抗炎症性効果／ＣＲＰの減少が、明らかに健康な人の分布において、どの程度までこの結果に影響を及ぼすかはわかっていない。ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素阻害剤（「スタチン類」；例えば、プラバスタチン、シンバスタチン、アトルバスタチン、フルバスタチン、およびロバスタチン）は、抗炎症性を有する既存の治療の二次的な具体例として提供する。血清脂質でのそれらの効果に加えて、スタチンは、ＣＲＰも減少する（参照：Circulation 2002; 105:1135-43）。コレステロールおよび再発の徴候（ＣＡＲＥ）の研究において、プラバスタチンは、スタチン治療が低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）または高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）コレステロールに関連しない様式において、ＣＲＰを低くする最初の臨床的証拠を提供した。この超コレステロールの母集団において、後に起こる心臓血管の徴候に対する相対的なリスク減少の規模は、炎症の証拠（参照：Circulation 1999;100:230-235）が無いそれらと比較すると、炎症（すなわち、ＣＲＰ上昇）の証拠も有する患者間で大きくなる。この観察は、プラバスタチンの炎症とＣＲＰへの影響（ＰＲＩＮＣＥ）の研究において、予測的に確認され、多様なスタチン（参照：Circulation 2002; 105:1135-43）を用いて、いくつか他の試験の解析においても報告される。
コレステロールの上昇に伴うそれらからＣＲＰが上昇する患者において、スタチン治療の利点と分離する証拠は、エアーフォース／テキサスの冠状動脈におけるアテローム性動脈硬化症の予防研究（ＡＦＣＡＰＳ／ＴｅｘＣＡＰＳ；参照：New Engl J Med 2001;344:1959-1965）に由来する。本研究は、心臓血管のリスクを低く抑える母集団において、ロバスタチンを用いる初期の予防研究であった。本研究において、プラセボと比較して、ロバスタチンによって与えられるリスク軽減の規模は、高レベルのＬＤＬ／低レベルのＣＲＰのそれらと比較する低レベルのＬＤＬ／高レベルのＣＲＰを有する患者において、ほぼ同じ大きさであった。
上記の結果は、炎症が標準的治療法において、治癒の標準として、現在取り組まれていない新規なリスクカテゴリーを示すことを示唆する。すべての心臓発作の約半分が、標準的なコレステロールレベルを持つ母集団に生じるので、新たに同定された危険因子の同定および調節は、心臓血管の死亡症例を減少するための重要な方法である。低ＬＤＬ／高ＣＲＰのこの集団に適する母集団は、約２５００万人の米国人（参照：Circulation 2002; 105:1135-43）がいると見積もられる。ＣＲＰの上昇は、心臓血管の徴候後に生じるリスクと一致する段階的な様式で生じるのが明らかである。具体的には、上昇したＣＲＰ（＞３ｍｇ／ｄＬ）は、健康な個体の１０％に見出されるが、ＵＳＡで起こった慢性的な安定狭心症、不安定狭心症（ブラウンヴァルドクラスＩＩＩｂ）、およびＡＭＩのそれぞれが、ある患者の＜２０％、＞６５％、および＞９０％に上昇する（参照：Circulation 2002; 105:1135-43）。それ故、炎症マーカーは、心臓血管の徴候の進行におけるリスクでの母集団において、同定および薬理学的介入の機会を示す。
他の炎症マーカーの出現により、ＣＲＰ測定の有用性に取って代わるか、または増加しうる。最近、可溶性ＣＤ４０リガンド（ｓＣＤ４０Ｌ）の増加および血清インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）濃度の減少を含む、新規な炎症マーカーは、増加する心臓血管の死亡症例と関連してきた。証拠は、ＣＤ４０Ｌが動脈硬化性プラークの不安定化において重要であることを示唆する。刺激されたリンパ球から発するＣＤ４０Ｌは、炎症性サイトカインおよび接着分子の上方調節を引き起こす、炎症促進性である。さらに、ＣＤ４０Ｌは、マクロファージおよび内皮細胞において、組織因子の発現を含むことによって、凝固も促進し、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（参照：Proc. Natl. Acad. Sci. 1997;94:1931-1936；Nature 1998;394:200-203；Circulation 2002;106:896-899）も活性化する。
上昇した血清ｓＣＤ４０Ｌ濃度を実証した女性の健康研究からの疫学的証拠は、心臓血管のリスク（参照：Circulation 2001;104:2266-2268）において、段階的および継続的な上昇と関連する。心臓血管のリスクにおける上昇は、最も高いｓＣＤ４０Ｌ濃度を持つ女性との間で、ほぼ１２倍高い。同様の結果は、難治性不安定狭心症（ＣＡＰＴＵＲＥ）研究（参照：NEJM 2003;348:1104-1111）でのｃ７Ｅ３ Ｆａｂ抗血小板治療でも観察された。本研究において、心臓血管のリスク（死亡または非致命的な心筋梗塞）での段階的および継続的な上昇は、ｓＣＤ４０Ｌの基準の五分位点に基づいて、プラセボ処置した患者間で起こっていることに気づいた。心臓血管のリスクにおけるこの違いは、初期（２４時間）および後期（６ヶ月）の両方を終点にして決定すると明らかであった。抗炎症性サイトカインＩＬ−１０を調査するＣＡＰＴＵＲＥ試験からの同様の解析は、高レベルのＩＬ−１０（すなわち、高い抗炎症性サイトカインレベル）を持つプラセボ処置した患者が、死亡リスク（参照：Circulation 2003; 107:2109-2114）を減少することを明らかにした。該抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の血清濃度の最も高い四分位における患者は、血清ＩＬ−１０レベルの最も低い四分位において、それらの患者と比較する死亡率を＞５０％減少させた。さらに、退院時の患者分布において、ＩＬ−１０レベルが高いか、または低いかのどちらかに二分されるなら、高い（抗炎症性）ＩＬ−１０レベルを持つ、好意の患者の６ヶ月において、死亡率の比が０．３８（すなわち、相対的に６２％のリスクが軽減）に調節された危険因子を観察した。
要約すると、脂質沈着のみによって介在される受動過程として起こる心臓血管疾患の概念は、古くなっている。心臓血管疾患が、慢性炎症過程の発現であることを示唆し、本炎症での介入が患者の死亡症例を減少しうる実験的および臨床的証拠において、実質的に増加している。しかしながら、現在、これらの過程での細胞性および分子メディエーターが、解明されているだけである。これらの過程の解明は、急性冠状動脈症候群（ＡＣＳ）のための適当な前臨床モデルの不足が障害となる。これらの正確な機構の知識不足にかかわらず、スタチンの抗炎症効果は、上昇する炎症マーカーを有する患者の薬理学的介入が、心臓血管の死亡症例の減少に導くという概念を立証するように考える。とりわけ、これらの利点は、スタチンの予期せぬ多面的な抗炎症活性によって得られる。さらに、細胞性および分子過程の理解は、さらにこれらの患者における心臓血管の死亡症例を減少する具体的およびより有効な抗炎症剤の開発に導きうる。
一般的に、Ｔ細胞応答の規模は、Ｔ細胞表面分子およびそれらのリガンド（ミューラーの文献：1989 Ann. Rev. Immunol. 7:445-480）との相互作用によって、誘発される刺激応答により決定される。重要な共刺激シグナルは、抗原提示細胞（リンスリーおよびレッドベターの文献：J. 1993 Ann. Rev. Immunol. 11:191-212）上で、Ｔ細胞表面レセプター、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４、ならびにＢ７関連分子であるＣＤ８０（すなわち、Ｂ７−１）およびＣＤ８６（すなわち、Ｂ７−２）のようなそれらのリガンドとの相互作用によって提供される。共刺激を含まないＴ細胞活性化は、免疫系が刺激に対して非応答になるアネルギーＴ細胞応答（シュバルツの文献：1992 Cell 71:1065-1068）を生じる。
ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４の可溶型は、ＣＤ２８ＩｇおよびＣＴＬＡ４Ｉｇで生じる免疫グロブリン（Ｉｇ）定常ドメインに対するＣＤ２８およびＣＴＬＡ４の可変（Ｖ）様細胞外ドメインを融合することによって構築されてきた。ＣＴＬＡ４Ｉｇのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、＋１位のメチオニンまたは−１位のアラニンで始まり、＋３５７位のリジンで終わる蛋白質と一緒に図２４に示す。ＣＴＬＡ４Ｉｇは、ＣＤ２８Ｉｇ（リンスリーの文献：1994 Immunity 1:793-80）よりも強いＣＤ８０陽性およびＣＤ８６陽性細胞の両方と結合する。多くのＴ細胞依存性の免疫応答は、インビトロおよびインビボの両方で、ＣＴＬＡ４Ｉｇによって遮断されることが見出されてきた（リンスリーの文献：1991b, 上記；リンスリーの文献：1992a Science 257:792-795；リンスリーの文献：1992b J. Exp. Med. 176:1595-1604；レンショウの文献：1992 Science 257:789-792；タンの文献：1992 J. Exp. Med. 177:165-173；ツルカの文献：1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11102-11105）。
Ｂ７、可溶性ＣＴＬＡ４Ｉｇの融合分子のような天然リガンドに対する結合親和性を変えるために、該分子のＣＴＬＡ４部分において、アミノ酸の突然変異によって修飾した。突然変異するとき、Ｂ７リガンドに対する該結合親和性または結合活性を変更するＣＴＬＡ４の領域は、相補性決定領域１（米国特許第６０９０９１４号、第５７７３２５３号、第５８４４０９５号；同時係属の米国特許出願番号第６０／２１４０６５号；およびピーチの文献：1994. J. Exp. Med., 180:2049-2058 に記載されたＣＤＲ−１）および相補性決定領域３（ＣＤＲ−３）様領域（ＣＤＲ−３は、米国特許第６０９０９１４号、第５７７３２５３号および第５８４４０９５号で記載されたＣＴＬＡ４細胞外ドメインの保存領域；同時係属の米国特許出願番号第６０／２１４０６５号；およびピーチの文献：J Exp Med 1994 180:2049-2058；該ＣＤＲ−３様領域は、ＣＤＲ−３領域を含み、ＣＤＲ−３モチーフのいくつかのアミノ酸、上流および／または下流によって拡張する）を含む。ヘキサペプチドモチーフＭＹＰＰＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２０）を含む、該ＣＤＲ−３様領域は、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４ファミリーのすべてにおいて、高度に保存される。ＣＴＬＡ４での該ヘキサペプチドモチーフ、およびＣＤ２８Ｉｇにおいて選択された残基でのアラニン走査型突然変異誘発は、ＣＤ８０（ピーチの文献：J Exp Med 1994 180:2049-2058；米国特許第５４３４１３１号；米国特許第６０９０９１４号；米国特許第５７７３２５３号）との結合を減少するか、または中止した。
さらに修飾は、ＣＴＬＡ４およびＣＤ２８の相同領域を相互変換することによって、可溶性ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子に行った。これらのキメラＣＴＬＡ４／ＣＤ２８相同物の突然変異分子は、ＣＴＬＡ４とＣＤ８０の結合親和力の増加に関与する領域（ピーチの文献：1994 J Exp Med 180:2049-2058）として、ＣＴＬＡ４およびＣＤ２８、ならびにＣＴＬＡ４のＣＤＲ−１およびＣＤＲ−３様領域において、特定の非保存アミノ酸残基に共通しているＭＹＰＰＰＹのヘキサペプチドモチーフを同定した。
上記のＣＴＬＡ４Ｉｇ、ＣＴＬＡ４の突然変異分子またはキメラＣＴＬＡ４／ＣＤ２８相同物の突然変異体のような可溶性ＣＴＬＡ４分子は、心臓血管疾患を治療するための治療薬の新規な群として紹介する。
（発明の概要）
本発明は、Ｂ７とＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８の相互作用を遮断する分子を患者に投与し、それによりＴ細胞上でＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８と結合するＢ７陽性細胞の内因性のＢ７分子を阻害することによって、心臓血管疾患を治療するための組成物および方法を提供する。本発明の方法に使用する可溶性ＣＴＬＡ４分子は、ＣＴＬＡ４Ｉｇおよび可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子であるＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇを含む。
本発明は、Ｂ７陽性細胞上でＢ７分子と結合する可溶性ＣＴＬＡ４分子を患者に投与し、それによりＴ細胞上でＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８と結合する内因性のＢ７分子を阻害することによって、心臓血管疾患を治療するための組成物および方法を提供する。本発明の方法で使用する可溶性ＣＴＬＡ４分子は、ＣＴＬＡ４Ｉｇおよび可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子であるＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇを含む。
本発明は、ＣＴＬＡ４Ｉｇおよび／または可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子であるＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよび／または可溶性ＣＴＬＡ分子のいずれかの混合物のような可溶性ＣＴＬＡ４分子を心臓血管疾患の症状がある患者に投与することによって、心臓血管疾患を治療する（例えば、症状を軽減する）ための方法も提供する。例えば、＋１位のメチオニンまたは−１位のアラニンで始まり、＋３５７位のリジンで終わる、図１９で示されるようなＣＴＬＡ４Ｉｇおよび該ＣＴＬＡ４の突然変異分子であるＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、本発明の方法の使用に好ましい。
本発明は、医薬的に許容される担体および可溶性ＣＴＬＡ４分子のような生物学的に有効な薬剤を単独または他の治療薬との組み合わせを含む、心臓血管を治療するための医薬組成物も提供する。
心臓血管疾患の治療の医薬組成物を含むキットも、本発明に含まれる。一態様として、本発明の１またはそれ以上の該医薬組成物を含むキットは、心臓血管疾患を治療するために使用する。例えば、可溶性ＣＴＬＡ４分子の有効量を含む該医薬組成物は、Ｂ７陽性細胞上のＢ７分子に結合し、それによってＴ細胞上のＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８との結合から該Ｂ７分子を遮断する。さらに、該キットは、本発明の医薬組成物と組み合わせて使用する１またはそれ以上の他の治療剤を含みうる。
（発明の詳細な説明）
（定義）
本明細書で使用する、すべての科学および技術用語は、特に指示しない限り、当該技術分野で一般的に使用される意味を有する。本明細書において、以下の語または句は、特定の意味を有する。
本明細書において、「リガンド」とは、例えば、ＣＴＬＡ４のリガンドが、Ｂ７分子であるような別の分子を特に認識し結合する分子を意味する。さらに具体例として、該Ｂ７分子のリガンドは、ＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８分子である。分子およびそのリガンドの相互作用は、本発明の組成物によって制御されうる。例えば、そのリガンドＢ７とＣＴＬＡ４の相互作用は、ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子の投与によって遮断される。また、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のリガンドは、そのレセプターであるＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲ）と相互作用し、エタネルセプト（etanercept）または他のＴＮＦ／ＴＮＦＲを遮断する分子の投与によって遮断される。
本明細書において、「野生型ＣＴＬＡ４」または「非突然変異のＣＴＬＡ４」とは、ＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ４（例えば、内因性のＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ４）の結合を遮断するようなＢ７を認識し結合するか、またはＢ７を妨害する自然発生のアミノ酸配列である、図２３で示す全長ＣＴＬＡ４（本明細書にすべてを引用する米国特許第５４３４１３１号、第５８４４０９５号、および第５８５１７９５号にも記載される）、またはいずれかの部分もしくはその誘導体を意味する。特定の態様において、野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは、図２３で示すとおり、＋１位のメチオニンで始まり、＋１２４位のアスパラギン酸で終わるか、または野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは、−１位のアラニンで始まり、＋１２４位のアスパラギン酸で終わる。野生型ＣＴＬＡ４は、Ｎ末端の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＣ末端の細胞質ドメインを有する細胞表面蛋白質である。該細胞外ドメインは、Ｂ７分子のような標的分子と結合する。細胞において、該自然発生の野生型ＣＴＬＡ４蛋白質は、Ｎ末端でのシグナルペプチドを含む、未成熟ポリペプチドとして翻訳される。該未成熟ポリペプチドは、未熟型のＮ末端とは異なる新たに生成したＮ末端を有する、ＣＴＬＡ４開裂生成物を生成するシグナルペプチドの開裂および除去を含む、翻訳後過程を引き起こす。当業者は、該ＣＴＬＡ４開裂生成物の新たに生じたＮ末端から１またはそれ以上のアミノ酸を除去する追加の翻訳後過程が起こりうることを理解する。また、該シグナルペプチドは、一般的な出発アミノ酸であるメチオニンの前で開始する生成分子を完全に除去できない。従って、該未熟のＣＴＬＡ４蛋白質は、＋１位のメチオニンまたは−１位のアラニンで開始しうる。該ＣＴＬＡ４分子の未熟型は、Ｂ７と結合する細胞外ドメインまたはそのいずれかの部分を含む。
本明細書において、「ＣＴＬＡ４の突然変異分子」とは、突然変異または多発性突然変異（好ましくは、野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン）を有する図２３またはそのいずれかの部分またはその誘導体を示す野生型ＣＴＬＡ４を意味する。ＣＴＬＡ４の突然変異分子は、同様であるが、野生型ＣＴＬＡ４分子の配列と同一ではない配列を有するが、さらにＢ７と結合する。該突然変異は、保存性（例えば、ロイシンをイソロイシンに置換する）または非保存性（例えば、グリシンをトリプトファンに置換する）の構造または化学的性質を有するアミノ酸で置換された１またはそれ以上のアミノ酸残基、アミノ酸欠損、付加、フレームシフト、または切断を含みうる。ＣＴＬＡ４の突然変異分子は、その中またはそれに結合された非ＣＴＬＡ４分子を含みうる。突然変異分子は、可溶性（すなわち、循環）または細胞表面に結合される。さらに、ＣＴＬＡ４の突然変異分子は、米国特許出願番号０９／８６５３２１、６０／２１４０６５および６０／２８７５７６；米国特許番号第６０９０９１４号、第５８４４０９５号および第５７７３２５３号に記載されるもの；およびピーチの文献：J Exp Med 180:2049-2058 (1994) に記載されるものを含む。ＣＴＬＡ４の突然変異分子は、合成的または複製的に製造され得る。
「ＣＴＬＡ４Ｉｇ」とは、Ｂ７と結合する野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン、またはその一部分、免疫グロブリン定常領域（Ｉｇ）に結合されるか、またはその一部分を含む、可溶性融合蛋白質である。ある態様として、＋１位のメチオニンから始まり、＋１２４位のアスパラギン酸で終わるか、または−１位のアラニンから始まり、＋１２４位のアスパラギン酸で終わる野生型ＣＴＬＡ４（図２３で示す）の細胞外ドメイン；＋１２５位のグルタミンアミノ酸残基との結合；および＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリジン（ＣＴＬＡ４ＩｇをコードするＤＮＡは、１９９１年５月３１日、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託し、ブタペスト条約の規定下で１０８０１ Ｂｌｖｄ大学、マナッサス、ＶＡ２０１１０−２２０９、およびＡＴＣＣ受入番号ＡＴＣＣ６８６２９を受けた；リンスリーの文献：1994 Immunity 1:793-80）で包括的な免疫グロブリン部を含む。ＣＴＬＡ４Ｉｇを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である、ＣＴＬＡ４Ｉｇ−２４は、ＡＴＣＣ識別番号ＣＲＬ−１０７６２を持つ１９９１年５月３１日に寄託した。該方法で使用する可溶性ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子および／または本発明のキットは、シグナル（リーダー）ペプチド配列を含みうるか、または含み得ない。具体的には、該方法および／または本発明のキットにおいて、該分子は、シグナルペプチド配列を含まない。
「Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ」とは、アミノ酸Ａ２９Ｙ（２９位のアラニンで置換するチロシンアミノ酸残基）およびＬ１０４Ｅ（＋１０４位でロイシンに置換するグルタミン酸アミノ酸残基）を変更するか、またはＢ７分子と結合するその一部分、Ｉｇの尾部（図１９に含まれる；Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇをコードするＤＮＡが、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−２１０４で２０００年６月２０日に寄託；同時係属の米国特許出願番号０９／５７９９２７、６０／２８７５７６および６０／２１４０６５は、本明細書に引用する）に結合する野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを含む、可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子である融合蛋白質である。本発明の方法および／またはキットで使用する該可溶性Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ分子は、シグナル（リーダー）ペプチド配列を含みうるか、または含み得ない。具体的には、本発明の該方法および／またはキットにおいて、該分子は、シグナルペプチド配列を含まない。
本明細書において、「可溶性」とは、細胞に結合または接着しない、すなわち循環する、そのいずれかの分子またはフラグメントおよび誘導体を意味する。例えば、ＣＴＬＡ４、Ｂ７またはＣＤ２８は、ＣＴＬＡ４、Ｂ７またはＣＤ２８のそれぞれの細胞外ドメインに免疫グロブリン（Ｉｇ）部を接着することによって可溶化され得る。別法として、ＣＴＬＡ４のような分子は、その膜貫通ドメインを除去することによって可溶化され得る。具体的には、本発明の該方法、組成物および／またはキットで使用する可溶化分子は、シグナル（またはリーダー）配列を含まない。
本明細書において、「可溶性ＣＴＬＡ４分子」とは、これに限らないが、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインが融合分子の可溶化させる、例えば、ＩｇＣγ１（ＩｇＣガンマ１）、ＩｇＣγ２（ＩｇＣガンマ２）、ＩｇＣγ３（ＩｇＣガンマ３）、ＩｇＣγ４（ＩｇＣガンマ４）、ＩｇＣμ（ＩｇＣミュウ）、ＩｇＣα１（ＩｇＣアルファ１）、ＩｇＣα２（ＩｇＣアルファ２）、ＩｇＣδ（ＩｇＣデルタ）またはＩｇＣε（ＩｇＣイプシロン）のような免疫グロブリン（Ｉｇ）部分、またはそのフラグメントおよび誘導体で縮合され；パピローマウイルスＥ７遺伝子産物（ＣＴＬＡ４−Ｅ７）、黒色腫関連抗原ｐ９７（ＣＴＬＡ４−ｐ９７）またはＨＩＶエンベロープ蛋白質（ＣＴＬＡ４エンベロープｇｐ１２０）（米国特許第５８４４０９５号に記載され、すべての記載をここに引用する）、またはそのフラグメントおよび誘導体のような生物活性または化学的に活性な蛋白質の部分で融合されるか、または結合するＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを有する蛋白質；ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４Ｉｇ（米国特許第５４３４１３１号に記載され、すべての記載をここに引用する）、またはそのフラグメントおよび誘導体のような混成（キメラ）融合蛋白質；該蛋白質の可溶性（オークスの文献：2000 Cellular Immunology 201:144-153、すべての記載をここに引用する）を提供するために除去する膜貫通ドメインを有するＣＴＬＡ４分子、またはそのフラグメントおよび誘導体である、ＣＴＬＡ４Ｉｇ融合蛋白質（例えば、ＡＴＣＣ受入番号６８６２９で寄託したＤＮＡをコードする）を含む、Ｂ７と結合する非細胞表面結合（すなわち、循環）されたＣＴＬＡ４分子またはＣＴＬＡ４分子のいずれかの機能部分を意味する。「可溶性ＣＴＬＡ４分子」とは、ＣＴＬＡ４結合活性を有する、フラグメント、その部分または誘導体、および可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子も含む。本発明の方法で使用する可溶性ＣＴＬＡ４分子は、シグナル（リーダー）ペプチド配列を含みうるか、または含まない。具体的には、本発明の該方法、組成物および／またはキットにおいて、該分子は、シグナルペプチド配列を含まない。
本明細書において、「ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン」とは、Ｂ７分子のようなＣＴＬＡ４リガンドを認識し、結合するＣＴＬＡ４の部分である。例えば、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは、＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸（図２３）までを含む。また、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは、−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸まで（図２３）を含む。該細胞外ドメインは、Ｂ７分子と結合するＣＴＬＡ４のフラグメントまたは誘導体を含む。図２３で示す、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは、Ｂ７分子に対するＣＴＬＡ４分子の結合親和性を変化する突然変異も含む。
本明細書において、用語「突然変異」とは、野生型分子のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化、例えば、該野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインのＤＮＡおよび／またはアミノ酸のような配列の変化を意味する。ＤＮＡ中の突然変異は、該アミノ酸配列の変化を導くコドンを変化する。ＤＮＡの変化は、置換、欠損、挿入、選択的スプライシング、または切断を含みうる。アミノ酸の変化は、該蛋白質の置換、欠損、挿入、付加、切断、または処理または開裂誤差を含みうる。また、ヌクレオチド配列での突然変異は、当該技術分野でよく理解されるアミノ酸配列において、サイレント突然変異を生じうる。それに関して、特定のヌクレオチドコドンは、同一のアミノ酸をコードする。具体例は、アミノ酸であるアルギニン（Ｒ）をコードするヌクレオチドコドンＣＧＵ、ＣＧＧ、ＣＧＣ、およびＣＧＡ；またはコドンＧＡＵ、および該アミノ酸であるアスパラギン酸（Ｄ）をコードするＧＡＣを含む。従って、蛋白質は、それらの特異的なヌクレオチド配列と異なる１またはそれ以上の核酸分子によってコードされ得るが、さらに、同一の配列を有する蛋白質分子をコードする。配列をコードするアミノ酸は、以下の通りである：
Figure 2007501243
該突然変異分子は、１またはそれ以上の突然変異を起こしうる。
本明細書において、「非ＣＴＬＡ４蛋白質配列」または「非ＣＴＬＡ４分子」とは、Ｂ７と結合しないいずれかの蛋白質分子を意味し、その標的へのＣＴＬＡ４の結合を妨害しない。ＣＴＬＡ４分子の細胞外ドメインに付着する非ＣＴＬＡ４分子は、該ＣＴＬＡ４分子の溶解性または親和性を修正することができる。具体例は、これに限らないが、免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域またはその一部分を含む。好ましくは、Ｉｇ定常領域は、ヒトまたはサルのＩｇ定常領域、例えば、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含むヒトＣ（ガンマ）１である。該Ｉｇ定常領域は、そのエフェクター機能（米国特許第５６３７４８１号、第５８４４０９５号および第５４３４１３１号）を減少するために突然変異され得る。
本明細書において、「フラグメント」または「部分」は、例えば、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８のような分子のいずれかの部分または断片であり、好ましくは、例えば、Ｂ７分子のようなその標的を認識し、結合するＣＴＬＡ４またはＣＤ２８もしくはその部分または断片における該細胞外ドメインのような分子である。
本明細書において、「Ｂ７」は、これに限らないが、ＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８を認識し、結合するＢ７−１（ＣＤ８０）（フリーマンの文献：1989, J Immunol. 143:2714-2722 は、すべての記載をここに引用する）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）（フリーマンの文献：1993, Science 262:909-911、すべての記載をここに引用し；アズマの文献：1993, Nature 366:76-79 は、すべての記載をここに引用する）を含む、分子のＢ７ファミリーを意味する。Ｂ７分子は、活性化されたＢ細胞で発現されうる。
本明細書において、「ＣＤ２８」とは、米国出願番号第５５８０７５６号および第５５２１２８８号（すべての記載をここに引用する）に記載する、Ｂ７を認識し結合する分子を意味する。
本明細書において、「Ｂ７陽性細胞」とは、細胞表面で発現するＢ７分子の１またはそれ以上の型を有するいずれかの細胞である。
本明細書において、「誘導体」とは、その親分子の配列相同性および活性を共有する分子である。例えば、ＣＴＬＡ４の誘導体は、野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインに対して、少なくとも７０％の相同性のあるアミノ酸配列を有する可溶性ＣＴＬＡ４分子を含み、例えば、ＣＴＬＡ４Ｉｇまたは可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子であるＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのようなＢ７を認識し結合する。誘導体は、例えば、アミノ酸アナログのようなアミノ酸配列および／またはアミノ酸の化学的性質へのいずれかの変化を意味する。
本明細書において、「制御する」とは、免疫応答が、活性化、刺激、上方制御、阻害、遮断、下方制御、または免疫応答の修正をすることである。本明細書に記載される心臓血管疾患は、免疫応答、例えば、機能的なＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８陽性細胞とＢ７陽性細胞との相互作用を制御することによって治療されうる。例えば、可溶性ＣＴＬＡ４／Ｂ７複合体、内因性のＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８分子と該Ｂ７分子の反応によって妨害する可溶性ＣＴＬＡ４分子を形成するために、Ｂ７陽性細胞を本発明の可溶性ＣＴＬＡ４分子に付着することを含む、免疫応答を制御する方法。
本明細書において、レセプター、シグナルまたは分子を「遮断する」または「阻害する」とは、技術が認識されている試験によって検出される該レセプター、シグナルまたは分子の活性化を妨害することを意味する。例えば、細胞介在性の免疫応答の遮断は、免疫疾患に関連する症状の軽減を決定することによって検出され得る。遮断または阻害は、部分または全体であり得る。
本明細書において、「Ｂ７相互作用を遮断する」とは、例えばＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ４のようなそのリガンドに対するＢ７の結合を妨害することを意味し、それ故、Ｔ細胞およびＢ７陽性細胞の相互作用を妨害する。Ｂ７とＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８の相互作用を遮断する分子の具体例は、これに限らないが、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８またはＢ７分子（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２）のいずれかを認識し結合する抗体（またはその部分もしくは誘導体）のような分子；可溶性ＣＴＬＡ４のような分子の可溶化型（または、その部分もしくは誘導体）；該ＣＴＬＡ４／ＣＤ２８／Ｂ７介在性の相互作用により該細胞シグナルを妨害するために設計されるペプチドフラグメントまたは他の小分子を含む。好ましい態様として、該遮断剤は、例えば、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＡＴＣＣ６８６２９）またはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（ＡＴＣＣＰＴＡ−２１０４）のような可溶性ＣＴＬＡ４分子、ＣＤ２８Ｉｇ（ＡＴＣＣ６８６２８）のような可溶性ＣＤ２８分子、Ｂ７Ｉｇ（ＡＴＣＣ６８６２７）のような可溶性Ｂ７分子、抗Ｂ７モノクローナル抗体（例えば、ＡＴＣＣ ＨＢ−２５３、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２２３、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２２６、ＡＴＣＣ ＨＢ−３０１、ＡＴＣＣ ＨＢ−１１３４１およびアンダーソンの米国特許第６１１３８９８号またはヨコイチの文献：1982. J. Immun., 128(2)823-827）に記載されたモノクローナル抗体、抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体（例えば、ＡＴＣＣ ＨＢ−３０４、および参照８２−８３に記載されたモノクローナル抗体）および／または抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（例えば、ハンセンの文献：1980. Immunogenetics 10: 247-260 またはマーチンの文献：1984. J. Clin. Immun., 4(1):18-22）に記載されたＡＴＣＣ ＨＢ １１９４４およびｍＡｂ ９．３）である。また、Ｂ７とＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８の相互作用を遮断する小分子も含まれる。Ｂ７相互作用を遮断することは、免疫疾患（例えば、心臓血管疾患）または炎症性疾患関連する症状の軽減を定量する、Ｔ細胞／Ｂ７細胞相互作用の減少を定量することによって、またはＢ７とＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８の相互作用において、減少を定量することのような技術が認識された試験によって検出されうる。遮断は部分または全体であり得る。
本明細書において、分子の「有効量」とは、そのリガンドで該分子の相互作用を遮断する量として定義される。例えば、Ｂ７とＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８の相互作用を遮断する分子の有効量は、Ｂ７陽性細胞でＢ７分子と結合するとき、ＣＴＬＡ４およびＣＤ２８のような内因性リガンドの結合からＢ７分子を阻害する分子の量として定義される。また、Ｂ７とＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８の相互作用を遮断する分子の有効量は、Ｔ細胞上のＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８分子と結合するとき、ＣＴＬＡ４およびＣＤ２８のような内因性リガンドの結合からＢ７分子を阻害する分子の量として定義されうる。阻害または遮断は、部分または完全であり得る。
本明細書において、疾病を「治療する、処置する」とは、医薬品または他の治療によって、疾患を管理することを意味する。疾患の治療は、疾患の症状の改善または軽減、疾患の重症度の減少、疾患の進行の過程を修正または予防、疾患の発生予防、および／または基礎疾患の問題を改善または軽減もしくは治癒しうる。心臓血管疾患の症状は、これに限らないが、律動異常；胸痛；心筋虚血；狭心症；運動負荷の減少；疲労；労作性呼吸困難；発作性夜間呼吸困難；跛行；一過性脳虚血発作および生活の質を含む。例えば、心臓血管疾患を治療することは、免疫応答を制御する（例えば、Ｂ７陽性細胞で機能的なＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８陽性細胞相互作用を阻害する）ことによって達成されうる。別の方法として、心臓血管疾患を治療することは、本明細書に記載の組成物の使用による発生または進行から疾患を予防することによって、達成されうる。
本明細書において、「心臓血管疾患」とは、該分野において一般的に使用される意味を持ち、これに限らないが、以下の疾患または症状：心室内の心臓動脈血管血栓塞栓性障害、心臓静脈血管血栓塞栓性障害、および血栓塞栓性障害を含む、血栓塞栓性障害；アテローム性動脈硬化症；再狭窄；末梢動脈疾患；冠状動脈バイパス手術；頸動脈疾患；動脈炎；心筋炎；心臓血管炎症；血管炎症；心臓冠状動脈疾患（ＣＨＤ）；不安定狭心症（ＵＡ）；難治性不安定狭心症；安定狭心症（ＳＡ）；慢性安定狭心症；急性冠状動脈症候群（ＡＣＳ）；初期または再発心筋梗塞；急性心筋梗塞（ＡＭＩ）；心筋梗塞；非Ｑ波心筋梗塞；非ＳＴＥ心筋梗塞；冠状動脈疾患；心虚血；虚血；虚血性突然死；一過性脳虚血発作；発作；アテローム性動脈硬化症；末梢動脈閉塞性疾患；静脈血栓症；深部静脈血栓症；静脈血栓症；動脈塞栓症；冠状動脈血栓症；脳動脈血栓症；脳塞栓症；腎臓塞栓症；肺塞栓症；（ａ）人工弁または他の移植片、（ｂ）留置カテーテル、（ｃ）ステント、（ｄ）心肺バイパス、（ｅ）血液透析、または（ｆ）血液が血栓症を促進する人工物表面に曝される他の方法で生じる血栓症；アテローム性動脈硬化症、手術または手術時の合併症から生じる血栓症、持続性の固定化、動脈細動、先天性血栓形成傾向、癌、糖尿病、薬物治療またはホルモンの効果、および妊娠時の合併症；上室性不整脈、心房性不整脈、心房粗動、心房細動を含む、心不整脈；ダグラス、ピーター等の書籍：Heart Disease：A Textbook of Cardiovascular Medicine, 2 Volume Set, 6th Edition, 2001, Eugene Braunwald で挙げられる他の疾患を含む。
好ましい心臓血管疾患は、アテローム性動脈硬化症；心臓冠状動脈疾患（ＣＨＤ）；再狭窄；末梢動脈疾患；冠状動脈バイパス手術；頸動脈疾患；動脈炎；心筋炎；心臓血管炎症；血管炎症；不安定狭心症（ＵＡ）；難治性不安定狭心症；安定狭心症（ＳＡ）；慢性安定狭心症；急性冠状動脈症候群（ＡＣＳ）；心筋梗塞；初期または再発心筋梗塞、非Ｑ波心筋梗塞、非ＳＴ上昇心筋梗塞、およびＳＴ−部分上昇心筋梗塞を含む、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）である。
より好ましい心臓血管疾患は、アテローム性動脈硬化症；心臓冠状動脈疾患（ＣＨＤ）；不安定狭心症（ＵＡ）；難治性不安定狭心症；安定狭心症（ＳＡ）；慢性安定狭心症；急性冠状動脈症候群（ＡＣＳ）；心筋梗塞；初期または再発性心筋梗塞、非Ｑ波心筋梗塞、および非ＳＴ部分上昇心筋梗塞、およびＳＴ上昇心筋梗塞を含む、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）である。
本明細書において、「遺伝子治療」とは、遺伝子操作によって、疾患を治療する方法である。遺伝子治療は、核酸分子を細胞に導入し、遺伝子産物を発現する細胞が該核酸分子によって、コード化することを含む。例えば、当業者によって周知であるような核酸分子を細胞に導入することは、例えば、沈殿リン酸カルシウム、ジエチルアミノエチルデキストラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、電気穿孔法、直接注射、リポフェクションまたはウイルス感染（サムブルックの書籍：Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)；クリーガーの書籍：Gene Transfer ad Expression: A Laboratory Manual (W. H. Freeman and Co, New York, N.Y., 1993) およびウーの書籍：Methods in Enzymology (Academic Press, New York, 1993) のそれぞれを本明細書に引用する）を含む多様な方法によって、生体外またはインビトロで目的の核酸分子を含んだ発現ベクターを細胞に導入することによって実施されうる。別の方法として、目的のヌクレオチド配列は、多様なベクターを用い、例えば、核酸を患者に直接投与し（ウイリアムスの文献：1991 PNAS 88:2726-2730）；または核酸分子をウイルスベクターに組み入れ、組み換えウイルスまたはウイルス粒子の産生、および組み換えウイルスによる患者の感染（バトルマンの文献：1993 J Neurosci 13:94-951；キャロルの文献：1993 J Cell Biochem 17E:241；レブコウスキーの米国特許第５３５４６７８号；ダビソンおよびエリオットの書籍：分子ウイルス学：実践的なアプローチ(IRL Press, New York, 1993)）を含む、多様な方法によって、生体内で細胞に導入され得る。生体内で転移のために使用される他の方法は、患者にリポソームへの核酸のカプセル化、およびリポソームの直接導入、または赤血球凝集センダイウイルスと結合したリポソームを含む（本明細書に引用する米国特許第５８２４６５５号）。形質転換または感染細胞は、疾患または疾患の症状を改善するために核酸によってコード化される蛋白質生成物を発現する。
本明細書において、「軽減する」とは、これに限らないが、律動異常；胸痛；心筋虚血；狭心症；運動負荷の減少；疲労；労作性呼吸困難；発作性夜間呼吸困難、跛行；一過性脳虚血発作および生活の質を含む、１またはそれ以上の心臓血管疾患の症状のような１またはそれ以上の疾患の症状の重症度の緩和または低下させることを意味する。
本明細書に記載する発明が充分理解されるために、下記で説明する。
本発明の組成物および方法
本発明は、Ｂ７とＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８の相互作用を遮断する分子の有効量を患者に投与することによって、心臓血管疾患を治療するための組成物および方法を提供する。例えば、リガンドは、可溶性ＣＴＬＡ４分子（例えば、ＣＴＬＡ４Ｉｇ、ＣＴＬＡ４−Ｅ７、ＣＴＬＡ４−ｐ９７、ＣＴＬＡ４エンベロープｇｐ１２０、およびＣＴＬＡ４／ＣＤ２８Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＬＩｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＴＩｇおよび／またはＬ１０４ＥＡ２９ＷＩｇのような突然変異ＣＴＬＡ４分子）、可溶性ＣＤ２８分子、可溶性Ｂ７−１分子、可溶性Ｂ７−２分子、およびＢ７、ＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ４（例えば、抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体、抗Ｂ７−１モノクローナル抗体または抗Ｂ７−２モノクローナル抗体）を認識し、結合するモノクローナル抗体を含む。
Ｂ７とＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８の相互作用を遮断する分子の有効量は、Ｂ７陽性細胞のＢ７分子と結合するとき、ＣＴＬＡ４およびＣＤ２８のような内因性リガンドの結合によって、Ｂ７分子を阻害する抗Ｂ７モノクローナル抗体、可溶性ＣＴＬＡ４および／または可溶性ＣＤ２８分子の量として定義されうる。該阻害は、部分または全部であり得る。
また、ＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８とのＢ７相互作用を遮断する分子の有効量は、Ｔ細胞上で、ＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８分子と結合するとき、ＣＴＬＡ４およびＣＤ２８のような内因性リガンドの結合からＢ７分子を阻害する、抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体または可溶性Ｂ７（Ｂ７−１またはＢ７−２）分子の量として定義されうる。該阻害は、部分的または全部であり得る。
ＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８とのＢ７相互作用を遮断する、分子の有効量は、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）の量である。別の態様として、該有効量は、約０．５〜１００ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、０．５〜５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、０．１〜５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約５〜１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１０〜１５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１５〜２０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約２０〜２５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約２５〜３０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約３０〜３５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約３５〜４０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約４０〜４５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約４５〜５０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約５０〜５５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約５５〜６０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約６０〜６５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約６５〜７０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約７０〜７５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約７５〜８０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約８０〜８５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約８５〜９０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約９０〜９５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、または約９５〜１００ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）の量である。
ある態様として、Ｂ７とＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８の相互作用を遮断する分子の有効量は、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）の量である。好ましい量は、１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）である。別の態様として、該有効量は、約０．１〜４ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）の量である。別の態様として、該有効量は、約０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約０．５〜１．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１．０〜１．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１．５〜２．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約２．０〜２．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約２．５〜３．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約３．０〜３．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約３．５〜４．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約４．０〜４．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約４．５〜５．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約５．０〜５．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約５．５〜６．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約６．０〜６．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約６．５〜７．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約７．０〜７．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約７．５〜８．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約８．０〜８．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約８．５〜９．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約９．０〜９．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約９．５〜１０．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）の量である。
別の態様として、該有効量は、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）の量である。別の態様として、該有効量は、約０．１〜２ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約２〜４ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約４〜６ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約６〜８ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約８〜１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１０〜１２ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１２〜１４ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１４〜１６ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１６〜１８ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）または約１８〜２０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）の量である。
別の態様として、該有効量は、約２ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）である。さらに別の態様として、該有効量は、患者の体重の約１０ｍｇ／ｋｇである。
具体的な態様として、Ｂ７とＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８の相互作用を遮断する分子は、可溶性ＣＴＬＡ４分子であって、可溶性ＣＴＬＡ４分子の有効量は、約２ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）である。別の具体的な態様として、可溶性ＣＴＬＡ４分子の有効量は、約１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）である。別の具体的な態様として、可溶性ＣＴＬＡ４の有効量は、６０ｋｇ以下の重量の患者に対して５００ｍｇ、６０〜１００ｋｇの重量の患者に対して７５０ｍｇ、および１００ｋｇ以上の重量の患者に対して１０００ｍｇである。
Ｂ７とＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８の相互作用を遮断する分子が可溶性ＣＴＬＡ４である有効量は、必要に応じて時／日／週／月／年あたり、単回または数回で毎日、毎週、毎月および／または毎年、患者へ投与され得る。例えば、一態様として、該分子は、最初の１ヶ月間は、２週ごとに１回、次いで、その後は毎月１回投与される。
好ましい態様として、心臓血管疾患は、アテローム性動脈硬化症；心臓冠状動脈疾患（ＣＨＤ）；不安定狭心症（ＵＡ）；難治性不安定狭心症；安定狭心症（ＳＡ）；慢性安定狭心症；急性冠状動脈症候群（ＡＣＳ）；初期または再発性の心筋梗塞；急性心筋梗塞（ＡＭＩ）；心筋梗塞；非Ｑ波心筋梗塞；または非ＳＴＥ心筋梗塞である。
本明細書（実施例３〜７）は、心臓血管疾患の予防または治療において、ＣＤ２８−Ｂ７相互作用を遮断する分子の使用を支持する臨床データを示す。ＲＡについての臨床研究において、ＣＴＬＡ４Ｉｇは、ＣＲＰ、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−α、心臓血管疾患とも相関するすべての炎症マーカーを低下させる。これらの結果は、ＣＤ２８−Ｂ７経路を遮断するという新規な作用機構が、心臓血管疾患を治療するのに有用であり得ることを示唆する。さらに研究は、実施例８および９で議論される。Ｂ７とＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８の相互作用を遮断する分子の有効量を患者に投与することによって、心臓血管疾患を治療するための方法の発明として示す。
心臓血管疾患を治療する新規方法のために、本明細書で議論される添付資料は、刊行された医学文献から生じているものの、我々の発明は、衰えていない。免疫学／炎症が、心臓血管疾患において重要な役割を果たし得るという考えは、相対的に最近のことであり、不完全なパラダイムシフトである。心臓学、免疫学、および感染症にまたがる研究の広さは、かなり広く、一分野でのそのような発見は、これらの学問の区別を通して一体とならない。逆に、一度新規な発見をすると、その結果を処理して、完成した作用機構は、すぐに研究者／科学者に明らかとはなり得ない。さらに、合衆国での患者において、優性Ｔ細胞個体群は、ＣＤ４+ＣＤ２８null細胞（参照：Circulation 2000;102:2883-2888）であったとする研究で報告された。この結果は、ＣＤ２８−Ｂ７介在シグナルの阻害が、ＵＡ患者において、有効ではないことを示唆する。
例えば、ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇによるようなＣＤ２８−Ｂ７相互作用の阻害によって、心臓血管による死亡症例の減少、または心臓血管機能改善および生活の質を新しくする。心臓血管疾患領域にかかる、これらの薬剤の使用は、（１）関節リウマチ（ＲＡ）患者とアテローム性動脈硬化症/不安定狭心症患者の細胞性および生化学的相同性；（２）心臓血管疾患において、介入に適当であると思えるＣＴＬＡ４ＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの作用機構；（３）本明細書で示す動物モデルおよび臨床研究において、ＣＴＬＡ４Ｉｇおよび／またはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの抗炎症効果；（４）アテローム性動脈硬化症において、Ｂ７−ＣＤ２８相互作用の重要性についての最近報告された結果によって支持される。これらのデータの多くは、本質的に異なる前臨床研究（細胞性および動物モデル）、ならびに本明細書で示す臨床研究に存在し、以下でまとめる。
（１）関節リウマチおよびアテローム性動脈硬化症/不安定狭心症の患者における細胞性および生化学的相同性。
これら二つの病理学的過程（表Ｉ）において、生化学的および細胞性の相同性がある。さらに、ＲＡ患者の早期の死は、最近、急性冠状動脈症候群と関連づけられてきた（参照：J Rheumatology 1999;26:2562-2571; Rheumatology 1999;38:668-674）。
表Ｉ．関節リウマチおよびアテローム性動脈硬化症/不安定狭心症の細胞性および生化学的相同性
Figure 2007501243
注記：パセリ等の文献（参照：Circulation 1999;100:2124-2126）から適用。記号０は、コントロール個体群からのパラメーターにおいて、感知できる増加または減少が無いことを意味する；↑は、コントロール個体群からのパラメーターにおいて、上昇を意味する；報告は、医学文献で入手可能な根拠となる証拠があることを意味する。
これらの相同性は、各々これらの疾患の基礎となる従来の病態生理学方法であり得ることを示唆する。
（２）ＣＴＬＡ４ＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの作用機構は、心臓血管疾患における介入に関連するように思われる。
Ｔ細胞は、初期のアテロームおよび不安定／破裂プラークに存在する。
Ｔ細胞の活性化は、アテローム性動脈硬化症から急性プラーク破裂までの心臓血管疾患の範囲に渡って、重要であるという考えを根拠とする一連の証拠である。Ｔ細胞は、ヒトアテローム硬化性障害（参照：New Engl J Med 1999; 340:115-126）に存在する最も一般的な細胞にあって、初期障害および不安定または破裂プラークの両方に存在する。不安定または破裂プラークの病理学研究は、Ｔ細胞（ほとんどＣＤ４+）が、アテローム硬化性障害の肩領域から組織浸食（参照：Am. J. Cardiol. 1991;68:36B-50B. Circulation 1994;89:36-44）の一番近い部位に存在し局在することを示してきた。
Ｔ細胞によって産生されるサイトカインは、炎症およびプラークの破裂を促進する用意をする。
Ｔ細胞は、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）；ＴＮＦα、およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）（参照：Atherosclerosis 1986;6:131-138. J Clin Invest 1985;76:125-131）を含む、炎症性サイトカインを分泌することが知られる。アテローム硬化性プラークでのＴ細胞の作用は、二要素であると考えられる。第一に、Ｔ細胞は、次々に消化酵素を放出するように考えられ、被膜基質および平滑筋層を破裂し、プラークの破裂を促進するマクロファージの作用を制御することができる。第二に、Ｔ細胞は、血管平滑筋細胞へＩＦＮ−γを分泌することによって、アテロームの線維性被膜内でコラーゲン合成の減少を直接産生することができる。まとめると、これらのＴ細胞の活性化は、アテローム硬化性プラークの不安定性および破裂を促進する、協調過程を示すように考えられる。
アテロームに関して、Ｔ細胞は、重度の臨床的症状と匹敵するように、ある程度は系内で活性化される。
Ｔ細胞は、アテローム内に存在するだけでなく、それらが、これらの障害における系内での活性化についての証拠ともなる。ファンデルワールらの冠状動脈アテロームのＴ細胞活性化の研究において、Ｔ細胞が、ＩＬ−２レセプター（ＩＬ−２ｒ）の発現およびＩＬ−２分泌（参照：Heart 1998;80:14-18）によって証明されるとおり活性化されることをアテローム切除術の実例から示されてきた。本研究において、ＩＬ−２ｒのＴ細胞発現の上昇は、アテローム切除術を受ける患者の臨床症状の重症度に比例した。図８７は、アテローム切除術の実例において、活性化されたＴ細胞のパーセントを示す。
ＨＳＰ６０または他の新規抗原は、心臓血管の炎症を直接促進しうる。
研究によって、感染因子および心臓血管疾患の組織との間に可能な関連性があることが示唆されてきた。多くの感染因子は、クラミジア肺炎（Ｃｐ）、ヘリコバクターピロリ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、数種のヘルペスウイルス、および多様な歯周感染が、ＣＨＤと関連してきたことを含むことを示唆した。しかし、冠状動脈アテローム性動脈硬化症に関するこれらの因子との因果関係を立証する証拠は、多種多様である。ヒト呼吸器病原菌であるＣ．肺炎は、ＣＨＤとの関連性において、頻繁に見出されてきた。
ＣＲＰの持続性の上昇の役割、およびＣ．肺炎（Ｃｐ）に対する抗体またはヒトＨＳＰ６０（ｈｕ−ＨＳＰ６０）に対する抗体の存在は、ヘルシンキ心臓研究（参照：Circulation 2003;107:2566-2570）のコホート内症例対照研究において、研究されてきた。期待される二重盲検プラセボ対照初期予防試験である本研究は、４０８１人の患者を無作為に選び、２４１人の観察された冠状動脈の徴候（冠状動脈死または非致命的なＭＩ）を８．５年かけて検証した。後の冠状動脈の徴候における予測のために、持続性の血清反応陽性（冠状動脈の徴候の指標より前の基準および３〜６ヶ月の両方において、ＣＲＰ、Ｃｐに対する血清抗体またはｈｕ−ＨＳＰ６０に対する血清抗体の上昇によって定義される）の重要性を研究した（表ＩＩ）。
表ＩＩ．ヘルシンキ心臓研究において、危険因子の持続性を有する冠状動脈死または非致命的なＭＩの進行のためのオッズ比（ＯＲ）
Figure 2007501243
これらのデータは、冠状動脈の心臓疾患に罹ったことのない中高年の男性の個体群において、血清反応陽性のＣＲＰの上昇があるとき、Ｃｐまたはｈｕ−ＨＳＰ６０における持続的に上昇した後の冠状動脈の徴候（表２）を予測することを示す。注記のうち、持続的にＣＲＰ＋、Ｃｐ＋、およびｈｕ−ＨＳＰ６０＋である患者は、後の冠状動脈の徴候の進行のために、１６．８７（２．０６〜１３７．９）の調整されたＯＲを有した。１／１３８のコントロール患者だけは、すべて３つのマーカーにおいて、持続的な上昇のためのこの基準を満たし、１７人が初発症例で同定された。これらの結果は、進行する心臓血管の徴候の危険性において、個々の予測検証のために新規な抗原性の危険因子の存在を示唆する。
最近、別々の研究において、クラジミア熱ショック蛋白質６０（Ｃｐ−ＨＳＰ６０）は、ＡＣＳ（参照：Biasucci, et. al.Circulation 2003;107:3015-3017）と強く関連することが報告された。ヘルシンキ心臓研究における症候性の患者と違って、本研究は、ＣＨＤスペクトルの対極部分における患者を研究した。本研究において、ＵＡ（ブラウンワルド分類ＩＩＩｂ）またはＡＭＩのどちらかがある冠状疾患集中治療室（ＣＣＵ）に入った２１９人の患者を、健康な患者または安定狭心症（ＳＡ）がある患者と比較した。Ｃｐ−ＨＳＰ６０（抗Ｃｐ−ＨＳＰ６０）に対する患者の抗体応答の存在は、１００人のコントロール患者、ＳＡがある４０人の患者、ＵＡがある１７９人の患者、およびＡＭＩ（表ＩＩＩ）がある４０人の患者を測定した。
表ＩＩＩ．ビアスッキ等によって報告された研究個体群の血清学的特徴
Figure 2007501243
注記：本研究において、ＨＳＰ６０血清反応陽性測定に使用される抗体は、Ｃｐ−ＨＳＰ６０およびｈｕ−ＨＳＰ６０を識別しない。具体的には、この欠如のため、これらのデータは、直接関連のある抗ＨＳＰ６０応答および感染を支持しない。
上記の結果は、特異的な抗原応答が、ＵＡおよびＡＭＩのある患者に存在するという考えを支持する。これらの二つの研究は、心臓血管疾患の範囲において、両極端な患者分布を示す。ヘルシンキ心臓研究は、心臓冠状動脈（または他の主要な）疾患の病歴のない患者が、ＣＲＰの上昇に基づく冠状動脈死または非致命的なＭＩの増加する危険性およびＣｐまたはｈｕ−ＨＳＰ６０への持続的な抗体応答を有するとみなすことを示す。しかし、健康的な初期予防の個体群において、これらの危険因子の患者数は低かった。全く対照的に、ビアスッキ等による研究の患者は、ＨＳＰ６０の血清反応陽性が、ＵＡまたはＡＭＩのある患者において、ほとんど普遍的特性であることを示す。さらに、安定狭心症がある患者において、ＨＳＰ６０に対する２０％の血清反応陽性であることは、段階的な関係が、ＨＳＰ−６０および心臓血管徴候に対する抗体との間に、存在しうることを示唆する。
ＨＳＰ６０に対する抗原応答は、ＣＤ２８−Ｂ７相互作用によって介在される。
動物モデルにおいて、マクロファージ（ヒトアテロームにおける通常の細胞型）は、マウスまたはｈｕ−ＨＳＰ６０（参照：Int. Immunol. 2002;14:1247-1253）のどちらかの投与におけるＴ細胞のＩＦＮ−γの主な誘導因子として同定されてきた。この過程は、ＣＤ２８−Ｂ７経路を含むＴ細胞活性化のために、古典的な「二つのシグナル」モデルによって起こるように思われる。このモデルにおいて、マウスまたはｈｕ−ＨＳＰ６０のどちらかによって、Ｔ細胞の活性化は、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（参照：Int. Immunol. 2002;14:1247-1253）の投与によって遮断される。ヒト、マウス、クラジミアおよび細菌性熱ショック蛋白質において、高度な配列相同性を得られるとき、この結果は、種を越えて保存されうる。実際に、分子模倣物を介して、自己免疫を促進する役目を果たす感染因子のＨＳＰおよびｈｕ−ＨＳＰとの間には高度な相同性がある。
ＣＤ２８−Ｂ７を介するＨＳＰ６０シグナルは、ヒト疾患の介入のための機会を提供しうる。
前臨床モデル周辺のＨＳＰ６０および上記の臨床試験（ビアスッキ等のヘルシンキ心臓研究）との間に多くの相同性があるように思う。第一に、マウスモデルは、最大の自己免疫応答（すなわち、自己ＨＳＰ６０に対するＴ細胞増殖および抗体産生）が、マウス（自己）ＨＳＰ６０およびＣｐ−ＨＳＰ６０（参照：Infection and Immunity 1997;65:1669-1674）の両方の併用投与によってのみ達成されることを示してきた。無関係の動物モデルにおいて、この前臨床の結果は、ヘルシンキ心臓研究での最も高い危険性のある群で観察される結果と非常に似ている。注目すべきは、ヒトアテローム硬化性プラークでのＣｐ−ＨＳＰ６０およびｈｕ−ＨＳＰ６０の共局在化が報告された（参照：Circulation 1998;98:300-307. J Infect Dis 1997:176:292-295）。これらのプラークにおいて、ＨＳＰ６０は、その後、ＴＮＦ−αの制御、マトリックスメタロプロテイナーゼ発現、および内皮および平滑筋細胞（参照：Circulation 2003;107:3015-3017）を活性化しうる。さらに、この動物モデルでのマウスのＨＳＰ６０およびＣｐ−ＨＳＰ６０の両方の同時投与は、リンパ球のＩＬ−１０産生を６倍減少し、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−１０産生の比を１２倍増加する。ＩＬ−１０レベルでの同時に起こる減少は、低い血清ＩＬ−１０濃度が、臨床的に重要な観察が、ＡＭＩ（参照：ヒースチェンの文献：Circulation 2003; 107:2109-2114）後の死の濃度依存的な危険性と関連していたので、臨床的に意味のある観察となりうる。これらの動物研究および臨床試験からのデータとの類似点を考えると、ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの使用を介するＣＤ２８−Ｂ７のシグナルの阻害は、心臓血管疾患の予防および／または治療ための特異的な機構に関連する介入を示しうる。
心臓血管疾患の予防および／または治療のためのＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの使用は、ＨＳＰ６０に限定されない。
ＨＳＰ６０は、心臓血管疾患の予防および／または治療において、ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの機構的な関連性のための仮説モデルとして提供する。しかしながら、ＨＳＰ６０は、ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ治療によって遮断される単独の抗原性刺激を示さない。例えば、女性の健康研究（参照：Circulation 2001;104:2266-2268）からの最近の疫学的証拠およびＣＡＰＴＵＲＥ研究（参照：NEJM 2003;348:1104-1111）から観察されるデータは、血清ｓＣＤ４０Ｌレベルに基づく心臓血管の危険性（死または非致命的な心筋梗塞）で、段階的および継続的な上昇の存在を独自に示してきた。それ故、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用は、心臓血管疾患において、重要な炎症メディエーターとして認識されるようになる。不安定狭心症がある患者において、ＣＤ２８−Ｂ７経路およびＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ経路との相互作用を示唆するという証拠でもある。具体的には、（ＣＤ４０Ｌ＋）Ｔ細胞を発現するＣＤ４０Ｌは、アテローム硬化性障害（参照：Proc. Natl. Acad. Sci. 1997;94:1931-1936）に存在することを示してきた。インビトロで、アテローム関連細胞におけるＣＤ４０の結紮は、前炎症性サイトカイン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、接着分子、および組織因子（参照：Nature 1998;394:200-203）の産生を増加することを示してきた。他のモデル系において、抗原提示細胞（ＡＰＣ）におけるＣＤ４０ＬとＣＤ４０の相互作用は、ＣＤ２８介在性Ｔ細胞活性化（J. Immunol. 2000;165:3506-3518）のためのＢ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）刺激分子の発現を増加する。さらに、ＣＤ３およびＣＤ２８に対する刺激抗体を用いて、不安定狭心症がある患者からＴ細胞の生体外の治療は、ｓＣＤ４０Ｌ（参照：Circulation 1999;100:614-620）の放出を刺激する。同時にこれらの観察は、ＣＤ２８−Ｂ７およびＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌシグナル経路が、動脈硬化性プラークの発達および破裂を生じやすくする状態を促進するために共同で作用することを示唆しうる。さらに、ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの使用を介して、この過程の妨害は、治療的に有益であり得る。最終的に、他の未だ発見されていないＣＤ２８−Ｂ７が介在する過程（おそらく新規な虚血関連抗原を経由する、以下参照）は、心臓血管疾患において、重要な役割を有し；これらの過程でのＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇに使用は、臨床的に有用である。
（３）動物モデルおよび臨床研究でのＣＴＬＡ４Ｉｇおよび／またはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの抗炎症性効果
腎臓虚血動物モデルにおいて、ＣＤ２８−Ｂ７シグナルの阻害は、新規な自己抗原が、虚血に重要であることを示唆する。
虚血／再灌流の損傷の阻害におけるＣＴＬＡ４Ｉｇの効果は、ラットモデル（参照：J Clin Invest 1997;100:1199-1203）で評価されてきた。このモデルにおいて、ラットは、片側の腎摘出を受けて、反対側の腎臓を４５分間虚血にさせた。ＣＴＬＡ４Ｉｇの共投与は、コントロールの免疫グロブリンだけでなく、ＣＤ４＋Ｔ細胞、マクロファージ、および主要な組織適合性（ＭＨＣ）ＩＩ細胞の虚血腎臓への浸潤を大部分遮断した。この結果と一致して、炎症性「Ｔｈ１」サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ２ｒ）、マクロファージ関連サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、および誘導型一酸化窒素シンセターゼ）および化学誘引物質／成長因子（ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＧＦβ）の減少であった。これらの結果に加えて、ＣＴＬＡ４Ｉｇは、初期（すなわち、血漿クレアチニンの上昇）または後期（すなわち、尿蛋白測定）の腎機能障害をほとんど完全に抑制する。この観察について、特に特筆すべきことは、同種抗原を欠いているモデルにおいて、この過程を阻害するＣＴＬＡ４Ｉｇの能力である。別に記載するとおり、腎虚血の非移植モデルにおいて、ＣＤ２８−Ｂ７相互作用の阻害は、ＣＴＬＡ４Ｉｇ投与によってすることができ、ＣＤ２８−Ｂ７経路を介して作用する新規な自己抗原は、虚血性障害において重要であることを示唆する。この動物モデルにおける有効性は、おそらくいくつか類似の生理機能を有する冠状動脈虚血モデルにおいて、ＣＴＬＡ４Ｉｇの使用のための役割を支持する。
ＣＴＬＡ４ＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの抗炎症性の態様は、ＣＶ疾患の予防および／または治療において、それらの使用と一致する。
ＲＡがある患者において、ＣＴＬＡ４ＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９Ｉｇの臨床開発のための本明細書（実施例３〜７）で示されるデータは、炎症マーカーを好ましいように変更することに関して奨励している。ＲＡがある患者およびアテローム性動脈硬化症またはＵＡがある患者は、多くの生化学的、細胞性、および抗原同一性（上記参照、表１）を有することが顕著である。ＲＡのフェーズＩＩ臨床開発プログラムにおいて、ＵＡがある患者に共有されるいくつかの炎症マーカー（ＣＲＰ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α）を測定した。ＲＡ患者において、２ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのどちらかでのＣＴＬＡ４Ｉｇの投与は、プラセボと比較して１８０日でＣＲＰ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αの投与依存性の減少を生じた。図５２、５５、および５６を参照。この効果は、耐久性があるように思われ、ＣＴＬＡ４Ｉｇの治療の３６０日間を通じて、持続することを示した。図８５、８６Ａ、および８６Ｂを参照する。さらなる研究は、実施例８および９で議論する。
（４）アテローム性動脈硬化症において、Ｂ７−ＣＤ２８相互作用の重要性について新規に報告された研究成果
この特許出願は、優先権を主張するための特許出願なので、２つの報告が、アテローム硬化性障害の発達、進行、および不安定性において、ＣＤ２８−Ｂ７相互作用の役割を強く支持することを科学文献で明らかにした。第一に、ブオノの文献（Circulation 2004; 109:2009-2015）は、低密度リポ蛋白質レセプター（ＬＤＬＲ）不足（Ｌｄｌｒ-/-）マウスモデルにおいて、アテローム硬化性障害の発達および進行およびプラーク抗原特異性Ｔ細胞応答の特性を示した。Ｌｄｌｒ-/-マウスは、コレステロール豊富な食事を与えるとき、アテローム性動脈硬化症を促進させるように発達する。本研究において、Ｌｄｌｒ-/-マウスは、Ｂ７−１-/-Ｂ７−２-/-マウスを異種交配して、次いで、該子孫は、ＣＤ８０およびＣＤ８６を完全に欠いている突然変異のＢ７−１-/-Ｂ７−２-/- Ｌｄｌｒ-/-系統化合物を生成するように交雑受精を行った。この独特のモデルは、アテローム性動脈硬化症を発現する傾向がある動物モデルにおいて、Ｂ７−ＣＤ２８相互作用の役割の研究を可能にした。期待したとおり、これらの動物が、コレステロール豊富な食事を与えられるとき、Ｌｄｌｒ-/-およびＢ７−１-/-Ｂ７−２-/- Ｌｄｌｒ-/-マウスの両方は、コントロールの食事を与えたＬｄｌｒ-/-マウスと比較すると、コレステロールが大きく上昇した。しかしながら、重要なことに、コレステロール豊富な食事を与えたＢ７−１-/-Ｂ７−２-/- Ｌｄｌｒ-/-マウスとコレステロール豊富な食事を与えたＬｄｌｒ-/-マウスとの比較において、コレステロールレベル間で観察される違いはなかった。これらのマウスのアテローム硬化性障害を３つの群の各々からコンピューター画像解析を用いて、大動脈弓および下行大動脈から決定した。８週間において、コントロールの食事を取ったＬｄｌｒ-/-マウスの中で、最小のアテローム性動脈硬化症であった。しかしながら、コレステロール豊富な食事を取ったＬｄｌｒ-/-マウスは、大動脈弓および下行大動脈の両方において、アテローム硬化性障害が著しく増加した。対照的に、コレステロール豊富な食事を取ったＢ７−１-/-Ｂ７−２-/- Ｌｄｌｒ-/-マウスは、コレステロール豊富な食事を取ったＬｄｌｒ-/-マウスと比較するとアテローム硬化性障害を著しく減少させた。２０週間後、すべて３つの治療群において、アテローム性動脈硬化症の進行があり、該Ｌｄｌｒ-/-マウスおよびＢ７−１-/-Ｂ７−２-/- Ｌｄｌｒ-/-マウスとの間で観察された大きな違いが幾分弱まった。それにもかかわらず、大動脈弓でのＬｄｌｒ-/-マウスおよびＢ７−１-/-Ｂ７−２-/- Ｌｄｌｒ-/-マウスとのアテローム性動脈硬化症において、統計的に充分な減少が２０週まで持続した。
これらの形態学的な観察に加えて、Ｌｄｌｒ-/-マウスおよびＢ７−１-/-Ｂ７−２-/- Ｌｄｌｒ-/-マウスからのＴ細胞との機能的な違いもあるように思われる。具体的には、Ｌｄｌｒ-/-マウスおよびＢ７−１-/-Ｂ７−２-/- Ｌｄｌｒ-/-マウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞の生体外アッセイは、ｍＨＳＰ６０で刺激されるとき、コレステロール豊富な食事を与えたＬｄｌｒ-/-マウスのみ、実質的に（〜５倍高い）ＩＦＮ−γの量を産生することを説明する。この結果は、高コレステロール血症およびアテローム性動脈硬化症の条件下、Ｌｄｌｒ-/-マウスからのＴ細胞は、自己ＨＳＰ６０に対する応答を刺激したことを示唆する。
第二の刊行物において、アフェクの文献（Experimental and Molecular Pathology 2004; 76:219-223）は、アポリポ蛋白Ｅノックアウト（ＡｐｏＥ-/-）マウスのアテローム内のＣＤ８０およびＣＤ８６の発現を特徴づけるために免疫組織化学的方法を利用する。ＡｐｏＥ-/-マウスは、それらの成熟年齢によって、アテローム性動脈硬化症を発現する。これらの研究者は、成熟の種々の段階で、アテローム硬化性障害内のＣＤ８０およびＣＤ８６の存在を評価した。このモデルにおいて、ＣＤ８０およびＣＤ８６陽性の免疫染色は、初期およびより進行したアテローム硬化性障害の両方に存在した。さらに、ＣＤ８０およびＣＤ８６染色は、酸化ＬＤＬ−Ｔ細胞活性化のための推定上の自己抗原で共局在化されることを見出した。
まとめると、これらの二つの文献の報告は、特許出願の優先事項において、すでに存在する材料を支持し拡張する。第一に、Ｔ細胞が、アテローム内に存在し、系内で活性化されるという考えは、初期および進行したアテロームの両方にＣＤ８０およびＣＤ８６の共局在化という結果によって強調される。第二に、該Ｂ７−１-/-Ｂ７−２-/- Ｌｄｌｒ-/-マウスから得られたデータは、Ｂ７−ＣＤ２８シグナルの妨害が、アテローム性動脈硬化症の充分認められたモデルにおいて、アテローム硬化性疾患の発展および進行に影響することをはっきりと的確に説明する。最終的に、ｍＨＳＰ６０からのＣＤ４＋Ｔ細胞の生体外刺激によって、実質的なＩＦＮ−γ産生を生じるという観察結果は、ＨＳＰ６０が、Ｂ７−ＣＤ２８依存過程を介して、心臓血管炎症およびプラークの不安定性（すなわち、マトリックスメタロプロテイナーゼおよびコラーゲン合成において、ＩＦＮ−γの影響によって）を促進するために新規な抗原としての働きをする、以前の仮説を支持する。
組成物
本発明は、例えば、Ｂ７と可溶性ＣＴＬＡ４分子のようなＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８の相互作用を遮断する分子を含む、心臓血管疾患を治療するための組成物を提供する。可溶性ＣＴＬＡ４の具体例は、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（図２４）およびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図１９）のような可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子、Ｌ１０４ＥＡ２９ＬＩｇ（図２０）、Ｌ１０４ＥＡ２９Ｔｉｇ（図２１）、およびＬ１０４ＥＡ２９ＷＩｇ（図２２）を含む。
突然変異または野生型の配列を持つＣＴＬＡ４分子は、ＣＴＬＡ４膜貫通セグメント（オークスの文献：2000 Cellular Immunology 201:144-153）を除去することによって、可溶化され得る。
別法として、突然変異または野生型配列を持つ可溶性ＣＴＬＡ４分子は、ＣＴＬＡ４分子が、該ＣＴＬＡ４分子を可溶化する免疫グロブリン（Ｉｇ）分子のような非ＣＴＬＡ４部分と融合される融合蛋白質であり得る。例えば、ＣＴＬＡ４融合蛋白質は、ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子（図２４）（リンスリーの文献：1994 Immunity 1:793-80）に生じる免疫グロブリンの定常領域と融合されるＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを含みうる。ＣＴＬＡ４と融合されうる免疫グロブリンドメインの具体例は、これらに限らないが、ＩｇＣγ１（ＩｇＣガンマ１）、ＩｇＣγ２（ＩｇＣガンマ２）、ＩｇＣγ３（ＩｇＣガンマ３）、ＩｇＣγ４（ＩｇＣガンマ４）、ＩｇＣμ（ＩｇＣミュー）、ＩｇＣα１（ＩｇＣアルファ１）、ＩｇＣα２（ＩｇＣアルファ２）、ＩｇＣδ（ＩｇＣデルタ）またはＩｇＣε（ＩｇＣイプシロン）を含む。
臨床プロトコルにおいて、免疫グロブリン部分は、患者の有害な免疫応答を発現させないのが好ましい。好ましい部分は、ヒトまたはサルの免疫グロブリン定常領域を含む、該免疫グロブリン定常領域である。適当な免疫グロブリン領域のある具体例は、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を介在するＦｃレセプターへの結合のようなエフェクター機能を介在するか、または抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を介在することができるヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む、ヒトＣγ１である。該免疫グロブリン部分は、突然変異がＦｃレセプターへの免疫グロブリンの結合能力を増加または減少することによって、そのリガンドへの免疫グロブリンの結合能力を調節する、１またはそれ以上の突然変異（例えば、ＣＤＣまたはＡＤＣＣのようなエフェクター機能を減少するための該ＣＨ２ドメインにおいて）を有しうる。例えば、該免疫グロブリン部分での突然変異は、例えば、＋１３０、＋１３６、および＋１３９位のシステインは、セリンで置換されるようなヒンジ領域のありとあらゆるそのシステイン残基の変化を含みうる（図２４）。該免疫グロブリン部分は、図２４で示すとおり、セリンで置換された＋１４８位のプロリンも含みうる。さらに、該免疫グロブリン部分での突然変異は、フェニルアラニンで置換された＋１４４位のロイシン、グルタミン酸で置換された＋１４５位のロイシン、またはアラニンで置換された＋１４７位のグリシンを有することを含みうる。
可溶性ＣＴＬＡ４分子または可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子において、使用するための追加の非ＣＴＬＡ４部分は、これに限らないが、ｐ９７分子、エンベロープｇｐ１２０分子、Ｅ７分子、およびｏｖａ分子（ダッシュの文献：1994 J. Gen. Virol. 75 (Pt 6):1389-97; イケダの文献：1994 Gene 138(1-2):193-6; フォークの文献：1993 Cell. Immunol. 150(2):447-52; フジサカの文献：1994 Virology 204(2):789-93)を含む。他の分子も、(ジェラードの文献：1994 Neuroscience 62(3):721; バイルンの文献：1989 63(10):4370; スミスの文献：1987 Science 238:1704; ラスキーの文献：1996 Science 233:209)可能である。
本発明の可溶性ＣＴＬＡ４分子は、該分子のＣＴＬＡ４部分の細胞外ドメインのＮ末端と結合するシグナルペプチド配列を含む。該シグナルペプチドは、オンコスタチンＭ（マリックの文献：(1989) Molec. Cell. Biol. 9: 2847-2853）からのシグナルペプチド、またはＣＤ５（ジョーンズの文献：(1986) Nature 323:346-349）、または細胞外蛋白質のいずれかからのシグナルペプチドを含む、分子の分泌を許容する配列のいずれかである。本発明の可溶性ＣＴＬＡ４分子は、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインのＮ末端で結合するオンコスタチンＭシグナルペプチド、およびＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン（野生型または突然変異）のＣ末端に結合するヒト免疫グロブリン分子（例えば、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３）を含む。本分子は、＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸までを有するアミノ酸配列、結合アミノ酸残基の＋１２５位のグルタミン、および＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリジンまでを有するアミノ酸配列を含む、該免疫グロブリン部分を含む、−２６位のメチオニンから−１位のアラニンまでを有するアミノ酸配列、ＣＴＬＡ４部分を含む、オンコスタチンＭシグナルペプチドを含む。
具体的には、下記の突然変異したＣＴＬＡ４配列を含む、本発明の可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子は、ヒトＩｇ、例えば、突然変異したＣＴＬＡ４フラグメントと融合したＩｇＣ（ガンマ）１（すなわち、ＩｇＣγ１）部分を含む、融合分子であり得る。
一態様として、可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子は、細胞外ドメインでの単一部位の突然変異からなるＣＴＬＡ４の細胞外ドメインと融合されるＩｇＣγ１（ＩｇＣガンマ１）を含む。ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは、＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸まで（例えば、図２３）を含む。該ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは、−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸まで（例えば、図２３）を含みうる。単一部位の突然変異の具体例は、＋１０４位のロイシンを他のいずれかのアミノ酸に変化させる下記を含む：
Figure 2007501243
さらに、本発明は、ＩｇＣγ１（ＩｇＣガンマ１）部分と融合する、二つの突然変異を持つＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを有する突然変異分子を提供する。具体例は、＋１０４位のロイシンを別のアミノ酸（例えば、グルタミン酸）および＋１０５位のグリシン、＋２５位のセリン、＋３０位のスレオニンに変化させるか、または＋２９位のアラニンを他のいずれかのアミノ酸に変化させる下記を含む：
Figure 2007501243
さらにまた、本発明は、ＩｇＣγ１（ＩｇＣガンマ１）部分と融合する３つの突然変異からなるＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを有する突然変異分子を提供する。具体例は、＋１０４位のロイシンを別のアミノ酸（例えば、グルタミン酸）に変化させ、＋２９位のアラニンを別のアミノ酸（例えば、チロシン）に変化させて、＋２５位のセリンを別のアミノ酸に変化させる下記を含む：
Figure 2007501243
可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子は、該ＣＴＬＡ４部分および該分子のＩｇ部分との間に局在化される結合アミノ酸残基を有しうる。該結合アミノ酸は、グルタミンを含むアミノ酸のいずれかである。該結合アミノ酸は、当該技術分野で公知の分子または化学合成方法によって導入されうる。
本発明の可溶性ＣＴＬＡ４の蛋白質、およびそのフラグメントは、化学合成方法によって生成されうる。ポリペプチドの固相化学合成の原理は、当該技術分野において周知であって、この領域（デュガスおよびペニーの書籍：1981 Bioorganic Chemistry, pp 54-92, Springer-Verlag, New York）に関連する一般的なテキストで見出されうる。該可溶性ＣＴＬＡ４蛋白質は、アプライドバイオシステムズの４３０Ａペプチド合成機（アプライドバイオシステムズ社、フォスター市、カリフォルニア）およびアプライドバイオシステムズ社で供給される合成サイクルを用いる固相方法によって合成されうる。ｔ−ブトキシカルボニル保護したアミノ酸のような保護アミノ酸および他の試薬は、多くの化学卸売商から市販品として入手可能である。
本発明は、該突然変異分子のＣＴＬＡ４部分の細胞外ドメインのＮ末端と結合するシグナルペプチド配列を含む、ＣＴＬＡ４の突然変異分子を提供する。該シグナルペプチドは、オンコスタチンＭ（マリックの文献：1989 Molec. Cell. Biol. 9: 2847-2853）からのシグナルペプチド、またはＣＤ５（ジョーンズの文献：1986 Nature 323:346-349）、もしくは細胞外蛋白質のいずれかからのシグナルペプチドを含む、該突然変異分子の分泌を許容するいずれかの配列であり得る。
本発明は、＋１０４位のロイシンが、それぞれグルタミン酸またはセリンで置換されるように、Ｌ１０４ＥＩｇおよびＬ１０４ＳＩｇが、それらのＣＴＬＡ４配列において、突然変異される場合、例えば、Ｌ１０４ＥＩｇ（図１８で含まれる）またはＬ１０４ＳＩｇのようなＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン内に単一部位の突然変異を含む、可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子を提供する。該単一部位の突然変異分子は、さらに＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸までを含むＣＴＬＡ４部分、＋１２５位の結合アミノ酸残基のグルタミン、および＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリジンまでを含む免疫グロブリン部分を含む。該突然変異分子の免疫グロブリン部分はまた、＋１３０、＋１３６、および＋１３９位のシステインが、セリンで置換され、＋１４８位のプロリンがセリンで置換されるように突然変異されてもよい。また、該単一部位の可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子は、−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸までを含むＣＴＬＡ４部分を有しうる。
本発明は、＋１０４位のロイシンが、グルタミン酸で置換され、＋２９位のアラニンをそれぞれチロシン、ロイシン、スレオニンおよびトリプトファンに変化させる場合、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＬＩｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＴＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＷＩｇのようなＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン内に二重部位の突然変異を含む、可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子を提供する。＋１位のメチオニンで始まり、＋３５７位のリジンで終わるＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＬＩｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＴＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＷＩｇの配列に加えて、シグナル（リーダー）ペプチド配列をそれぞれ図１９〜２２で示す。該二重部位の突然変異分子は、さらに、＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸までを含むＣＴＬＡ４部分、結合アミノ酸残基の＋１２５位のグルタミン、および＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリジンまでを含む免疫グロブリン部分を含む。該突然変異分子の免疫グロブリン部分も、＋１３０、＋１３６、および＋１３９位のシステインが、セリンで置換され、＋１４８位のプロリンがセリンで置換されるように突然変異される。また、これらの突然変異分子は、−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸までを含む、ＣＴＬＡ４部分を有することができる。
本発明は、＋１０４位のロイシンが、グルタミン酸で置換され、＋１０５位のグリシンが、フェニルアラニン、トリプトファンおよびロイシンで、それぞれ置換されるＬ１０４ＥＧ１０５ＦＩｇ、Ｌ１０４ＥＧ１０５ＷＩｇおよびＬ１０４ＥＧ１０５ＬＩｇのようなＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン内に二重部位の突然変異を含む、可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子を提供する。該二重部位の突然変異分子は、さらに＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸までを含むＣＴＬＡ４部分、結合アミノ酸残基の＋１２５位のグルタミン、および＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリジンまでの部分を含む免疫グロブリン部分を含む。該突然変異分子の免疫グロブリン部分は、＋１３０、＋１３６、および＋１３９位のシステインが、セリンで置換され、＋１４８位のプロリンが、セリンで置換されるように突然変異され得る。また、これらの突然変異分子は、−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸までを含む、ＣＴＬＡ４部分を有することができる。
本発明は、＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含むＣＴＬＡ４部分、結合アミノ酸残基である＋１２５位のグルタミン、および＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリジンまでを含む免疫グロブリンからなる二重部位の突然変異分子である、Ｌ１０４ＥＳ２５ＲＩｇを提供する。ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを有する部分は、＋２５位のセリンが、アルギニンで置換され、＋１０４位のロイシンが、グルタミン酸で置換されるように突然変異される。また、Ｌ１０４ＥＳ２５ＲＩｇは、−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸までを含む、ＣＴＬＡ４部分を有することができる。
本発明は、＋１０４位のロイシンが、グルタミン酸で置換され、＋３０位のスレオニンは、それぞれグリシンおよびアスパラギンで置換される場合、Ｌ１０４ＥＴ３０ＧＩｇおよびＬ１０４ＥＴ３０ＮＩｇのようなＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン内に二重部位の突然変異を含む、可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子を提供する。該二重部位の突然変異分子は、さらに＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸までを含むＣＴＬＡ４部分、結合アミノ酸残基である＋１２５位のグルタミン、および＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリジンまでを含む免疫グロブリン部分を含む。該突然変異分子の免疫グロブリン部分は、＋１３０、＋１３６、および＋１３９位のシステインが、セリンで置換され、＋１４８位のプロリンが、セリンで置換されるように突然変異されてもよい。また、これらの突然変異分子は、−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸までを含むＣＴＬＡ４部分を有することができる。
本発明は、＋１０４位のロイシンが、グルタミン酸で置換され、＋２９位のアラニンが、チロシンで置換され、＋２５位のセリンが、リジン、アスパラギンおよびアルギニンでそれぞれ置換されるＬ１０４ＥＡ２９ＹＳ２５ＫＩｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＳ２５ＮＩｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＳ２５ＲＩｇのようなＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン内に三重部位の突然変異を含む、可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子を提供する。該三重部位の突然変異分子は、さらに＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸までを含むＣＴＬＡ４部分、結合アミノ酸残基である＋１２５位のグルタミン、および＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリジンまでを含む免疫グロブリン部分を含む。該突然変異分子の免疫グロブリン部分は、＋１３０、＋１３６、および＋１３９位のシステインが、セリンで置換され、＋１４８位のプロリンが、セリンで置換されるように突然変異され得る。また、これらの突然変異分子は、−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸までを含むＣＴＬＡ４部分を有することができる。
可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子のさらなる態様として、Ｂ７（ピーチの文献：1994 J Exp Med 180:2049-2058）と結合するキメラＣＴＬＡ４／ＣＤ２８相同物の突然変異分子を含む。これらのキメラＣＴＬＡ４／ＣＤ２８の突然変異分子の具体例は、ＨＳ１、ＨＳ２、ＨＳ３、ＨＳ４、ＨＳ５、ＨＳ６、ＨＳ４Ａ、ＨＳ４Ｂ、ＨＳ７、ＨＳ８、ＨＳ９、ＨＳ１０、ＨＳ１１、ＨＳ１２、ＨＳ１３およびＨＳ１４（米国特許第５７７３２５３号）を含む。
本発明の好ましい態様は、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（＋１位のメチオニンで始まり、＋３５７位のリジンで終わる図２４で示される）および可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（＋１位のメチオニンから始まり、＋３５７位のリジンで終わる、図１９で示される）のような可溶性ＣＴＬＡ４分子である。
本発明は、さらに本発明の可溶性ＣＴＬＡ４分子に対応するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子を提供する。一態様として、該核酸分子は、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）またはその雑種である。例えば、ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子は、図２４で示される＋４９〜＋５１位のヌクレオチド部分で、アラニンをコードするＧＣＴまたはＧＣＣコドンを含むことができる。別の実施例において、ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子は、図２４で示される、＋４３６〜＋４３８位のヌクレオチドで、グリシンをコードするＧＧＴまたはＧＧＧコドンを含むことができる。さらに別の態様として、ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子は、図２４で示される＋６３１〜＋６３３位のヌクレオチドで、アルギニンをコードするＣＧＧまたはＣＧＴコドンを含むことができる。ＣＴＬＡ４ＩｇをコードするＤＮＡ（図２４）は、１９９１年５月３１日、１０８０１ Ｂｌｖｄ．大学、ヴァージニア州、マナッサス、２０１１０−２２０９の米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣの受入番号ＡＴＣＣ６８６２９が付与された。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図１９に含まれる配列）をコードするＤＮＡは、２０００年６月１９日、ＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−２１０４を付与された。また、該核酸分子は、ＲＮＡまたはその雑種である。
本発明の核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、およびアンチセンス分子と異なる核酸分子の誘導体も含む。誘導体分子は、塩基対依存性様式（ザメクニックの文献：1978 Proc. Natl. Acad. Sci. 75:280284；グッドチャイルドの文献：1986 Proc. Natl. Acad. Sci. 83:4143-4146）において、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡと結合する、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、およびメチルホスホネート分子を含む、ペプチド核酸（ＰＮＡ）および非核酸分子を含む。ペプチド核酸分子は、リジンのようなアミノ酸残基およびアミノ基が加えられる核酸オリゴマーを含む。これらの小分子は、核酸（ニールセンの文献：1993 Anticancer Drug Des 8:53-63）のそれらの相補（鋳型）鎖に結合することによって、転写伸長を停止する抗遺伝子剤も指定される。ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらのアナログ合成のための方法の総説は、エックステインの書籍：Oligonucleotide and Analogues, 1991, IRL Press, New York; Oligonucleotide Synthesis, ゲイトの書籍：1984, IRL Press, Oxford, England 中に見出されうる。さらに、アンチセンスＲＮＡ技術法は、米国特許第５１９４４２８号および第５１１０８０２号に記載される。当業者は、すぐに本明細書に記載された可溶性ＣＴＬＡ４のポリヌクレオチド配列を用いて、核酸分子のこれらの分類を獲得することができ、例えば、エグホルムの書籍：Innovative and Perspectives in Solid Phase Synthesis(1992), pp325-328. または米国特許第５５３９０８２号を参照する。
また、本発明は、本発明の該ヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。用語「ベクター」は、これに限らないが、プラスミド、コスミド、およびファージミドを含む。一態様として、該ベクターは、適当な宿主細胞内で、ｒＤＮＡの複製を命令するレプリコンを含むベクターを自己複製することができる。また、該ベクターは、組み換えベクターを宿主細胞への組み込みを命令することができる。種々のウイルスベクターは、例えば、多くの周知レトロウイルスおよびアデノウイルスベクター（バークナーの文献：1988 Biotechniques 6:616-629）のようなものも使用され得る。
ベクターは、原核生物または真核生物の宿主細胞中で、可溶性ＣＴＬＡ４転写またはポリペプチド配列の発現を許容することができる。ベクターは、挿入された可溶性ＣＴＬＡ４の核酸配列を転写することができ、適当な宿主細胞内で、実施可能な関連可溶性ＣＴＬＡ４の配列の発現（例えば、転写および／または翻訳）を制御するために使用され得るプロモーターの配列のような発現制御要素からなる発現ベクターを含む。発現制御要素は、当該技術分野で公知であって、これに限らないが、誘導プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、エンハンサー、転写停止剤、および他の転写制御要素を含む。翻訳中に含まれる他の発現制御要素は、当該技術分野で公知であって、シャイン−ダルガノ配列（例えば、原核生物の宿主細胞）、および開始および停止コドンを含む。
具体的な開始シグナルは、可溶性ＣＴＬＡ４配列の有効な翻訳に必要であり得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。該可溶性ＣＴＬＡ４開始コドンおよび上流配列が、適当な発現ベクターに挿入される場合、追加の翻訳制御シグナルは、必要とはされない。しかしながら、コード化する配列のみ、またはその部分が挿入される場合、該ＡＴＧ開始コドンを含む外因性転写制御シグナルは、提供され得る。さらに、開始コドンは、全体の挿入部分の翻訳を確実にするために正確な読み枠内であるべきである。外因性転写要素および開始コドンは、天然および合成共に様々な基源であり得る。発現の有効性は、シャーフの文献：1994 Results Probl. Cell. Differ. 20:125-62；ビットナーの文献：1987 Methods in Enzymol. 153:516-544 の使用において、細胞系に適合するエンハンサーの包含によって強められ得る。
真核生物の宿主細胞において、該可溶性ＣＴＬＡ４配列の発現のための好ましいベクターは、昆虫細胞中の発現のためのバクロウイルスポリヘドリンプロモーターのような発現制御要素を含む。他の発現制御要素は、植物細胞（例えば、熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯ、保存蛋白質遺伝子）のゲノムに由来するプロモーターまたはエンハンサー、ウイルスプロモーターまたはリーダー配列または植物ウイルス由来、および哺乳類遺伝子由来または哺乳類ウイルス由来のプロモーターまたはエンハンサーを含む。
好ましいベクターは、アンピシリンまたはテトラサイクリンに耐性するような薬剤耐性ができる遺伝子産物をコードする少なくとも一つの選択可能なマーカー遺伝子を含む。該ベクターは、外因性ＤＮＡ配列の好都合な挿入ができる多発性エンドヌクレアーゼ制御サイトも含む。本発明の可溶性ＣＴＬＡ４蛋白質をコード化する組み換え発現ベクターを生成する方法は、当該技術分野で周知であって、サムブルックの書籍（Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd edition, Sambrook, Fritch, and Maniatis 1989, Cold Spring Harbor Press）およびアウスベルの書籍（1989 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York N.Y.）で見出すことができる。
可溶性ＣＴＬＡ４転写および／またはコードされた可溶性ＣＴＬＡ４ポリペプチドを生成するための好ましい発現ベクターは、原核宿主細胞と適合する発現ベクターである。原核細胞発現ベクターは、当該技術分野で周知であって、いくつかの商業的供給源で入手可能である。例えば、ｐＥＴベクター（例えば、ｐＥＴ−２１、ノヴァルゲン社）、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（ストラタジーン社、ラホーヤ、カリフォルニア州）、ｐＳＰＯＲＴ（ギブコＢＲＬ社、ロックビル、メリーランド州）、またはｐｔｒｐ−ｌａｃ雑種は、細菌性の宿主細胞内で、可溶性ＣＴＬＡ４ポリペプチドを発現するために使用され得る。
別法として、可溶性ＣＴＬＡ４転写および／またはコード化された可溶性ＣＴＬＡ４ポリペプチドを生成するための好ましい発現ベクターは、真核宿主細胞と適合する発現ベクターである。より好ましいベクターは、脊椎動物細胞と適合するものである。真核細胞発現ベクターは、当該技術分野で周知であって、いくつかの商業的供給源から入手可能である。具体的には、該ベクターは、所望のＤＮＡ部分の挿入のために好都合な制限サイトを含むことを提供する。該ベクターの具体例は、ＰＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（ファルマシア社）、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ（インターナショナルバイオテクノロジース社）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ、＃３１２５５）、および類似の真核生物の発現ベクターである。
発現ベクターの具体例は、これに限らないが、哺乳類の宿主細胞（例えば、ＢＰＶ−１、ｐＨｙｇ、ｐＲＳＶ、ｐＳＶ２、ｐＴＫ２（マニアチス社）；ｐＩＲＥＳ（クローンテック社）；ｐＲｃ／ＣＭＶ２、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＳＦＶ１（ライフテクノロジーズ社）；ｐＶＰａｋｃベクター、ｐＣＭＶベクター、ｐＳＧ５ベクター（ストラタジーン社））、レトロウイルスベクター（例えば、ｐＦＢベクター（ストラタジーン社））、ｐＣＤＮＡ−３（インビトロジェン社）またはその改良型、アデノウイルスベクター；アデノ関連ウイルスベクター、バクロウイルスベクター、酵母ベクター（例えば、ｐＥＳＣベクター（ストラタジーン社））を含む。
宿主ベクター系も提供される。該宿主ベクター系は、適当な宿主細胞中の本発明のベクターを含む。適当な宿主細胞の具体例は、これに限らないが、原核および真核細胞を含む。本発明の実施に従い、真核細胞は、適当な宿主細胞でもある。真核細胞の具体例は、原発性または不死化されたいずれかの動物細胞、酵母（例えば、サッカロマイセス・セレヴィシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、およびピキア・パストリス）、および植物細胞を含む。具体的な動物細胞は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ、サル(monkey)およびサル(ape)由来の細胞を含む。骨髄腫、ＣＯＳおよびＣＨＯ細胞は、宿主として使用され得る動物細胞の具体例である。特に、ＣＨＯ細胞は、これに限らないが、ＤＧ４４（チャシンの文献：1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12:555-556；コルケカーの文献：1997 Biochemistry 36:10901-10909）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−６１）、ＣＨＯ−Ｋ１ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞株（クローンテック社）、ＥＣＡＣＣ８５０５０３０２を指定したＣＨＯ（ＣＡＭＲ社、ソールベリー、ウィルトシャー州、英国）、ＣＨＯクローン１３（ＧＥＩＭＧ社、ジェノバ、イタリア）、ＣＨＯクローンＢ（ＧＥＩＭＧ社、ジェノバ、イタリア）、ＥＣＡＣＣ９３０６１６０７を指定したＣＨＯ−Ｋ１／ＳＦ（ＣＡＭＲ社、ソールベリー、ウィルトシャー州、英国）、およびＥＣＡＣＣ９２０５２１２９を指定したＲＲ−ＣＨＯＫ１（ＣＡＭＲ社、ソールベリー、ウィルトシャー州、英国）を含む。具体的な植物細胞は、植物全体、細胞培養液、またはカルス、タバコ由来、とうもろこし、大豆、およびイネ細胞を含む。とうもろこし、大豆、およびイネ種子も許容される。
本発明のＣＴＬＡ４の突然変異分子は、自然発生のポリペプチド、または天然、合成、半合成または組み換えのいずれかの原料由来として単離されうる。従って、該ＣＴＬＡ４突然変異ポリペプチド分子は、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ、および好ましくはヒトを含む、いずれかの種、特に、哺乳類由来の自然発生の蛋白質として単離され得る。また、該ＣＴＬＡ４突然変異ポリペプチド分子は、原核生物または真核生物の宿主細胞で発現される組み換えポリペプチドとして単離されるか、または化学合成されたポリペプチドとして単離され得る。
当業者は、すぐに単離されたＣＴＬＡ４突然変異分子を得るための標準的な単離方法を用いることが可能である。単離の性質および程度は、原料および単離された分子の対象とされた使用に依存する。
ＣＴＬＡ４突然変異分子およびフラグメントまたはその誘導体は、組み換え方法によって生成されうる。従って、野生型のＣＴＬＡ４分子をコードする単離されたヌクレオチド配列は、該ＣＴＬＡ４突然変異のポリペプチド分子をコードするヌクレオチド配列を生じる突然変異を導入するために処置されうる。例えば、ＣＴＬＡ４突然変異分子をコードするヌクレオチド配列は、プライマーおよびＰＣＲ増幅を用いる部位特異的な突然変異誘発方法によって生じさせてもよい。該プライマーは、所望の突然変異を誘導するために設計された特異的な配列を含むことができる。別法として、該プライマーは、ランダム突然変異を誘導するためにランダム化または半ランダム化された配列を含むことを設計することができる。標準的な組み換え方法（分子クローニング；実験マニュアル、第２版、サムブルック、フリッチ、およびマニアチス著１９８９年、コールドスプリングハーバープレス）およびＰＣＲ技術（米国特許第４６０３１０２号）は、ＣＴＬＡ４突然変異ポリペプチドをコード化するＣＴＬＡ４突然変異ポリヌクレオチドを生成し単離するために使用され得る。
本発明は、Ｂ７と可溶性ＣＴＬＡ４分子、ＣＤ２８分子、Ｂ７（Ｂ７−１またはＢ７−２）分子、抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体または抗Ｂ７（Ｂ７−１またはＢ７−２）モノクローナル抗体のようなＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８の相互作用を遮断する分子の医薬的に有効な量を含む、医薬組成物を含む。本発明の医薬組成物は、心臓血管疾患の治療に有用である。ある態様として、心臓血管疾患は、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４／Ｂ７相互作用によって介在される。該可溶性ＣＴＬＡ４分子は、好ましくは、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインで１またはそれ以上の突然変異を有する野生型の配列および／または可溶性ＣＴＬＡ４分子を持つ可溶性ＣＴＬＡ４分子が良い。該医薬組成物は、分子をコード化する可溶性ＣＴＬＡ４蛋白質分子および／または核酸分子、および／またはベクターを含むことができる。好ましい態様として、可溶性ＣＴＬＡ４分子は、図２４または１９（それぞれ、ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９Ｙ）で示されるＣＴＬＡ４の細胞外ドメインのアミノ酸配列を有する。さらにより好ましくは、可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子は、本明細書で開示されたＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇである。
本発明の組成物は、さらに１またはそれ以上の追加の、他の、または二番目の治療剤を含みうる。「組み合わせて投与される」または「併用療法」とは、本発明の化合物および１またはそれ以上の追加の治療剤が、治療される哺乳類に両方とも投与することを意味する。併用で投与されるとき、各成分は、同時または異なった時点で任意の順序にて連続的に投与され得る。従って、各成分は、分けて投与されるが、所望の治療効果を提供するために、充分近接した時間内で投与され得る。
本発明の分子と組み合わせて用いるとき、追加の治療剤は、例えば、医師用処方薬参考書（Physicians' Desk Reference）（ＰＤＲ）で示されるか、または別の方法で当業者によって決定される量で使用され得る。
追加の、他の、または二番目の治療剤は、抗凝血性または凝固阻害剤、抗血小板または血小板阻害剤、血栓阻害剤、ビタミンＫアンタゴニスト、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａレセプターアンタゴニスト、血栓溶解または線維素溶解剤、抗不整脈剤、抗高血圧剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥ−Ｉ）、アンジオテンシンレセプター遮断薬（ＡＲＢ）、β遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬（Ｌ−タイプおよびＴ−タイプ）、強心配糖体、利尿薬、鉱質コルチコイドレセプターアンタゴニスト、ホスホジエステラーゼ阻害剤、コレステロール／脂質低下剤および脂質プロフィール治療、抗糖尿病剤、抗抑制剤、抗炎症剤（ステロイド性および非ステロイド性）、抗骨粗鬆症剤、ホルモン補充療法、経口避妊薬、抗肥満剤、抗不安薬、抗増殖剤、抗癌剤、抗潰瘍および逆流性食道炎薬、成長ホルモンおよび／または成長ホルモン分泌促進剤、甲状腺模倣薬（甲状腺レセプターアンタゴニストを含む）、抗感染剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、および抗真菌剤を含む。
本発明の組成物と組み合わせて使用する抗凝血性剤（または凝固阻害剤）は、ワーファリンおよびヘパリン（非分画ヘパリンまたは市販品として入手可能な低分子量ヘパリンのいずれか）、合成五糖類、ヒルジンおよびアルガトロバンならびにＸａ因子阻害剤を含む直接作用する血栓阻害剤を含む。
本明細書において、用語「抗血小板剤（または血小板阻害剤）」とは、例えば、凝集、接着または血小板の顆粒分泌を阻害することによって、血小板機能を阻害する薬剤を意味する。薬剤は、これに限らないが、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、スリンダック、インドメタシン、メフェナム酸、ドロキシカム、ジクロフェナク、スルフィンピラゾン、ピロキシカムのような種々の公知の非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、およびその医薬的に許容される塩またはプロドラッグを含む。ＮＳＡＩＤのうち、アスピリン（アセチルサリチル酸またはＡＳＡ）およびピロキシカムが好ましい。他の適当な血小板阻害剤は、ＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト（例えば、チロフィバン、エプチフィバチド、およびアブシキシマブ）、トロンボキサンＡ２レセプターアンタゴニスト（例えば、イフェトロバン）、トロンボキサンＡ２シンセターゼ阻害剤、ＰＤＥ−ＩＩＩ阻害剤（例えば、ジピリダモール）、およびその医薬的に許容される塩またはプロドラッグを含む。
本明細書において、用語「抗血小板剤（または血小板阻害剤）」とは、ＡＤＰ（アデノシン二リン酸）レセプターアンタゴニストを含むことも意味し、好ましくは、プリン作動性レセプターＰ2Ｙ1およびＰ2Ｙ12のアンタゴニスト、さらにより好ましくは、Ｐ2Ｙ12と一緒に用いるのがよい。好ましいＰ2Ｙ12レセプターアンタゴニストは、その医薬的に許容される塩またはプロドラッグを含む、チクロピジンおよびクロピドグレルを含む。クロピドグレルは、さらにより好ましい薬剤である。それらは使用中、消化管が穏やかであることが公知であるので、チクロピジンおよびクロピドグレルも好ましい化合物である。
本明細書において、用語「トロンビン阻害剤（または抗トロンビン剤）」とは、セリンプロテアーゼトロンビン阻害剤を意味する。トロンビンを阻害することによって、トロンビン介在性血小板活性化（すなわち、例えば、血小板凝集および／またはプラスミノーゲン活性化阻害剤１の該顆粒分泌および／またはセロトニン）および／またはフィブリン形成のような種々のトロンビン介在過程は、妨害される。多くのトロンビン阻害剤は、当業者によって公知であって、これらの阻害剤は、本化合物と組み合わせて使用することを意図する。該阻害剤は、これに限らないが、その医薬的に許容される塩およびプロドラッグを含む、ボロアルギニン誘導体、ボロペプチド、ヘパリン、ヒルジン、アルガトロバン、およびメラガトランを含む。ボロアルギニン誘導体およびボロペプチドは、リジン、オルニチン、アルギニン、ホモアルギニンおよび対応するそのイソチオウロミウムアナログのα−アミノボロン酸誘導体のＣ末端のようなボロン酸のＮ−アセチルおよびペプチド誘導体を含む。本明細書において、用語「ヒルジン」とは、ヒルジンの適当な誘導体またはアナログ、ジスルファトヒルジンのようなヒルログとしての意味を持つ。本明細書において、用語「血栓溶解または線維素溶解剤（または血栓溶解または線維素溶解）」とは、血餅（血栓）を溶解する薬剤を意味する。該薬剤は、その医薬的に許容される塩またはプロドラッグを含む、組織プラスミノーゲン活性剤（天然または組み換え）およびその修飾型、アニストレプラーゼ、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、テネクテプラーゼ（ＴＮＫ）、ラノテプラーゼ（ｎＰＡ）、ＶＩＩａ因子阻害剤、ＰＡＩ−１阻害剤（すなわち、組織プラスミノーゲン活性化阻害剤の不活性化剤）、α２−抗プラスミン阻害剤、およびアニソイル化プラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化剤複合体を含む。本明細書において、用語「アニストレプラーゼ」とは、例えば、本明細書によって、引用して開示されるＥＰ０２８４８９に記載されるアニソイル化プラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化剤複合体を意味する。本明細書において、用語「ウロキナーゼ」とは、二本および一本鎖ウロキナーゼの両方を意味し、後者は、プロウロキナーゼとしても意味する。
本化合物と組み合わせて使用するための適当な抗不整脈剤の具体例は、クラスＩ薬（例えば、プロパフェノン）；クラスＩＩ薬（例えば、カルバジオールおよびプロプラノロール）；クラスＩＩＩ薬（例えば、ソタロール、ドフェチリド、アミオダロン、アジミリドおよびイブチリド）；クラスＩＶ薬（例えば、ジルチアゼムおよびベラパミル)；ＩAch阻害剤およびＩKur阻害剤（例えば、ＷＯ０１／４０２３１で公開されたような化合物）のようなＫ+チャネル開口薬を含む。
本発明化合物と組み合わせて使用するための適当な抗高血圧剤の具体例は、αアドレナリン遮断薬；βアドレナリン遮断薬；カルシウムチャネル遮断薬（例えば、ジルチアゼム、ベラパミル、ニフェジピン、アムロジピンおよび ミベフラジル）；利尿薬（例えば、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、フルメチアジド、ヒドロフルメチアジド、ベンドロフルメチアジド、メチルクロロチアジド、トリクロロメチアジド、ポリチアジド、ベンズチアジド、エタクリン酸トリクリナフェン、クロルタリドン、フロセミド、ムソリミン、ブメタニド、トリアムトレネン、アミロリド、スピロノラクトン）；レニン阻害剤；ＡＣＥ阻害剤（例えば、カプトプリル、ゾフェノプリル、フォシノプリル、エナラプリル、セラノプリル、シラゾプリル、デラプリル、ペントプリル、キナプリル、ラミプリル、リシノプリル）；ＡＴ−１レセプターアンタゴニスト（例えば、ロサルタン、イルベサルタン、バルサルタン）；ＥＴレセプターアンタゴニスト（例えば、シタクスセンタン、アトルセンタンおよび米国特許番号第５６１２３５９号および第６０４３２６５号で公開された化合物）；デュアルＥＴ／ＡＩＩアンタゴニスト（例えば、ＷＯ００／０１３８９で公開された化合物）；天然エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）阻害剤；バソペプシダーゼ阻害剤（デュアルＮＥＰ−ＡＣＥ阻害剤）（例えば、オマパトリラート、ゲモパトリラートおよびニトレート）を含む。
本発明化合物と組み合わせて使用するための適当なカルシウムチャネル遮断薬（Ｌ−タイプまたはＴ−タイプ）の具体例は、ジルチアゼム、ベラパミル、ニフェジピン、アムロジピンおよびミベフラジルを含む。
本発明化合物と組み合わせて使用するための適当な強心配糖体の具体例は、ジギタリスおよびウアバインを含む。
本発明化合物と組み合わせて使用するための適当な利尿薬の具体例は、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、フルメチアジド、ヒドロフルメチアジド、ベンドロフルメチアジド、メチルクロロチアジド、トリクロロメチアジド、ポリチアジド、ベンズチアジド、エタクリン酸トリクリナフェン、クロルタリドン、フロセミド、ムソリミン、ブメタニド、トリアムトレネン、アミロリド、およびスピロノラクトンを含む。
本発明化合物と組み合わせて使用するための適当な鉱質コルチコイドレセプターアンタゴニストの具体例は、スピロノラクトンおよびエプレレノンを含む。
本発明化合物と組み合わせて使用するための適当なホスホジエステラーゼ阻害剤の具体例は、ＰＤＥＩＩＩ阻害剤（例えば、シロスタゾール）；およびＰＤＥＶ阻害剤（例えば、シルデナフィル）を含む。
本発明化合物と組み合わせて使用するための適当なコレステロール／脂質低下剤および脂質プロフィール治療の具体例は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（例えば、プラバスタチン、ロバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、ＮＫ−１０４（別名、イタバスタチン、またはニスバスタチン（nisvastatin）またはニスバスタチン（nisbastatin））およびＺＤ−４５２２（別名、ロスバスタチン、またはアタバスタチンまたはビサスタチン））；スクアレン合成酵素阻害剤；フィブラート；胆汁酸抑制薬（例えば、クエストラン）；ＡＣＡＴ阻害剤；ＭＴＰ阻害剤；リポキシゲナーゼ阻害剤；コレステロール吸収阻害剤；およびコレステロールエステル輸送蛋白質阻害剤（例えば、ＣＰ−５２９４１４）を含む。
本発明化合物と組み合わせて使用するための適当な抗糖尿病薬の具体例は、ビグアニド（例えば、メトホルミン）；グルコシダーゼ阻害剤（例えば、アカルボース）；インスリン（インスリン分泌促進薬またはインスリン増感剤を含む）；メグリチニド（例えば、レパグリニド）；スルホニル尿素（例えば、グリメピリド、グリブリドおよびグリピジド）；ビグアニド／グリブリド併用（例えば、グルコバンス）、チオゾリジンジオン（例えば、トログリタゾン、ロシグリタゾンおよびピオグリタゾン）、ＰＰＡＲ−αアゴニスト、ＰＰＡＲ−γアゴニスト、ＰＰＡＲα／γデュアルアゴニスト、ＳＧＬＴ２阻害剤、例えば、ＷＯ００／５９５０６で公開された脂肪酸結合蛋白質（ａＰ２）阻害剤、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、およびジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰ４）阻害剤を含む。
本発明化合物と組み合わせて使用するための適当な抗抑制薬の具体例は、ネファゾドンおよびセルトラリンを含む。
本発明化合物と組み合わせて使用するための適当な抗炎症剤の具体例は、プレドニゾンおよびデキサメタゾンを含むコルチコステロイドおよびグルココルチコイドのようなステロイド化合物；エタネルセプト（エンブレル（登録商標））；インフリキシマブ（レミケード（登録商標））；蛋白質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）阻害剤；シクロオキシゲナーゼ阻害剤（ＮＳＡＩＤ、およびＣＯＸ−１および／またはＣＯＸ−２阻害剤を含む）；アスピリン；インドメタシン；イブプロフェン；プリオキシカム；ナプロキセン；セレコキシブ；および／またはロフェコキシブを含む。
本発明化合物と組み合わせて使用するための適当な抗骨粗鬆症剤の具体例は、アレンドロネートおよびラロキシフェンを含む。
本発明化合物と組み合わせて使用するための適当なホルモン補充療法の具体例は、エストロゲン（例えば、共役エストロゲン）およびエストラジオールを含む。
本発明化合物と組み合わせて使用するための適当な抗凝血薬の具体例は、ヘパリン（例えば、エノキサパリンおよびダルテパリンのような非分画および低分子量ヘパリン）を含む。
本発明化合物と組み合わせて使用するための適当な抗肥満薬の具体例は、オルリスタットおよびａＰ２阻害剤（例えば、ＷＯ００／５９５０６で公開されたもの）を含む。
本発明化合物と組み合わせて使用するための適当な抗不安薬の具体例は、ジアゼパム、ロラゼパム、ブスピロン、およびパモ酸ヒドロキシジンを含む。
本発明化合物と組み合わせて使用するための適当な抗増殖剤の具体例は、シクロスポリンＡ、パクリタキセル、アドリアマイシン；エポチロン、シスプラチン、およびカルボプラチンを含む。
本発明化合物と組み合わせて使用するための適当な抗潰瘍および逆流性食道炎薬の具体例は、ファモチジン、ラニチジン、およびオメプラゾールを含む。
追加の治療剤は、コラーゲン、ｄｎａＪ、ＴＮＦ機能（例えば、ペグスネルセプト）を遮断する分子、サイトカイン機能（例えば、ＡＭＧ７１９）を遮断する分子、ＬＦＡ−１機能（例えば、エファリズマブ）を遮断する分子および幹細胞移植も含む。これらの他の治療は、関節リウマチに対する有効性を決定するために、臨床試験（www.clinicaltrials.gov）を現在実施している。
例えば、ウシＩＩコラーゲンの形態において、コラーゲンは、１またはそれ以上の心臓血管疾患の症状を軽減するために、心臓血管疾患を患う患者に経口投与されうる。
ｄｎａＪは、心臓血管疾患がある多くの患者において、遺伝子内に含まれる蛋白質を模倣する小ペプチドである。該ペプチドは、大腸菌バクテリア熱ショック蛋白質由来である。ｄｎａＪは、１またはそれ以上の心臓血管疾患の症状を軽減するために、心臓血管疾患を患う患者に経口投与されうる。
ＴＮＦは、関節リウマチおよびおそらく心臓血管疾患がある患者の炎症応答が含まれる分子である。あるいは、例えば、ＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲ）と結合するＴＮＦを遮断することによって、ＴＮＦ機能を遮断するいずれかの分子は、心臓血管疾患の進行を緩和する助けをし、その症状を幾分軽減する。インフリキシマブおよびエタネルセプトのようないくつかのＴＮＦ遮断薬は、心臓血管疾患を治療するのに有効であることを示してきた。ペグスネルセプトのような他のＴＮＦ遮断薬が開発されて、心臓血管疾患の治療において、それらの有効性を試験している（フェーズＩＩ臨床試験）。
例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）のようなサイトカインは、免疫応答の介在において、含まれる細胞分泌型分子である。あるいは、例えば、そのレセプターとＩＬ−１の相互作用を遮断することによって、サイトカイン機能を遮断するいずれかの分子は、心臓血管疾患の進行を緩和する助けをし、１またはそれ以上のその症状を軽減する。ＩＬ−１とそのレセプター（ＩＬ−１Ｒ）の相互作用を遮断する組み換え蛋白質である、アナキンラは、心臓血管性関節炎の治療において、有効であることが示されてきた。ＩＬ−１阻害剤であるＡＭＧ７１９が開発され、関節リウマチの治療において、その有効性を試験している（フェーズＩＩ臨床試験）。
リンパ球機能関連分子１（ＬＦＡ−１）は、内皮のような種々の細胞型にリンパ球の接着を介在することによって機能するＣＤ１１ａおよびＣＤ１８の二つのサブユニットからなる分子である。あるいは、ＬＦＡ−１機能妨害は、心臓血管疾患の進行を緩和する助けをし、１またはそれ以上のその症状を軽減する。抗ＬＦＡ−１抗体であるエファリズマブが開発され、関節リウマチの治療において、その有効性を試験している（フェーズＩＩ臨床試験）。
おそらく治療分子によって、それらのリガンドに対するＴＮＦ、サイトカインまたはＬＦＡ−１の相互作用の遮断は、当業者に公知のいくつものアッセイによって決定されうる。例えば、競合アッセイは、分子がＴＮＦＲに結合するＴＮＦと競合するために、ＴＮＦ／ＴＮＦＲ結合対に曝されうる所望の分子によって遮断を試験するために使用されうる。別法として、機能的アッセイは、例えば、分子が炎症カスケード、またはサイトカインによって引き起こされた腫れ、発赤または痛みのような炎症反応のいずれかの部分を阻害するための能力を試すような遮断を試験するために実施されうる。
追加の治療剤は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤、可溶性ｇｐ３９（ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ１５４、Ｔ−ＢＡＭ、ＴＲＡＰとしても公知である）、可溶性ＣＤ２９、可溶性ＣＤ４０、可溶性ＣＤ８０（例えば、ＡＴＣＣ６８６２７）、可溶性ＣＤ８６、可溶性ＣＤ２８（例えば、ＡＴＣＣ受入番号６８６２８）、可溶性ＣＤ５６、可溶性Ｔｈｙ−１、可溶性ＣＤ３、可溶性ＴＣＲ、可溶性ＶＬＡ−４、可溶性ＶＣＡＭ−１、可溶性ＬＥＣＡＭ−１、可溶性ＥＬＡＭ−１、可溶性ＣＤ４４、ｇｐ３９と反応する抗体（例えば、ＡＴＣＣ ＨＢ−１０９１６、ＡＴＣＣ ＨＢ−１２０５５およびＡＴＣＣ ＨＢ−１２０５６）、ＣＤ４０と反応する抗体（例えば、ＡＴＣＣ ＨＢ−９１１０）、Ｂ７と反応する抗体（例えば、ＡＴＣＣ ＨＢ−２５３、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２２３、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２２６、ＡＴＣＣ ＨＢ−３０１、ＡＴＣＣ ＨＢ−１１３４１等）、ＣＤ２８と反応する抗体（例えば、ＡＴＣＣ ＨＢ−１１９４４またはマーチンの文献：（J. Clin. Immun. 4(1):18-22, 1980）に記載されるｍＡｂ９．３、ＬＦＡ−１と反応する抗体（例えば、ＡＴＣＣ ＨＢ−９５７９およびＡＴＣＣ ＴＩＢ−２１３）、ＬＦＡ−２と反応する抗体、ＩＬ−２と反応する抗体、ＩＬ−１２と反応する抗体、ＩＦＮ−γと反応する抗体、ＣＤ２と反応する抗体、ＣＤ４８と反応する抗体、いずれかのＩＣＡＭと反応する抗体（例えば、ＩＣＡＭ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２５２）、ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３）、ＣＴＬＡ４と反応する抗体（例えば、ＡＴＣＣ ＨＢ−３０４）、Ｔｈｙ−１と反応する抗体、ＣＤ５６と反応する抗体、ＣＤ３と反応する抗体、ＣＤ２９と反応する抗体、ＴＣＲと反応する抗体、ＶＬＡ−４と反応する抗体、ＶＣＡＭ−１と反応する抗体、ＬＥＣＡＭ−１と反応する抗体、ＥＬＡＭ−１と反応する抗体、ＣＤ４４と反応する抗体も含む。ある態様として、モノクローナル抗体が好ましい。他の態様として、抗体フラグメントが好ましい。当業者はすぐに理解するように、組合せは、本発明の可溶性ＣＴＬＡ４分子および他の薬剤；可溶性ＣＴＬＡ４分子と他の二つの薬剤；可溶性ＣＴＬＡ４分子と他の３つの薬剤などを含むことができる。最適の組合せおよび投与量の決定は、当該技術分野で周知の方法を用いて決定され、最適化される。
共投与のための具体的な組合せは、以下の：ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＣＤ８０モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）；ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＣＤ８６ｍＡｂｓ；ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、ＣＤ８０ｍＡｂｓ、およびＣＤ８６ｍＡｂｓ；ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびｇｐ３９ｍＡｂｓ；ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＣＤ４０ｍＡｂｓ；ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＣＤ２８ｍＡｂｓ；ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、ＣＤ８０およびＣＤ８６ｍＡｂｓ、およびｇｐ３９ｍＡｂｓ；ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、ＣＤ８０およびＣＤ８６ｍＡｂｓおよびＣＤ４０ｍＡｂｓ；およびＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、抗ＬＦＡ１ｍＡｂ、および抗ｇｐ３９ｍＡｂを含む。ｇｐ３９ｍＡｂの具体例は、ＭＲ１である。他の組合せは、当業者によって、すぐに評価され理解される。
追加の治療剤は、例えば、シクロスポリンＡまたはＦＫ５０６のようなカルシニューリン阻害剤；例えば、ラパマイシンまたはその誘導体（例えば、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチル−ラパマイシン）のような免疫抑制マクロライド；例えば、ＦＴＹ７２０またはそのアナログのようなリンパ球ホーミング剤；コルチコステロイド；シクロホスファミド；アザチオプレン；メトトレキサートのようなジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤；レフルノミドまたはそのアナログ；ミゾリビン；ミコフェノール酸；ミコフェノレート モフェチル；１５−デオキシスペルグアリンまたはそのアナログ；例えば、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８、ＣＤ７、ＣＤ２５、ＣＤ２７、Ｂ７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５８、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭ）、ＯＸ４０、４−１ＢＢまたはそれらのリガンド等の白血球レセプターに対するモノクローナル抗体のような免疫抑制モノクローナル抗体；または例えば、ＣＴＬＡ４／ＣＤ２８−Ｉｇのような他の免疫調節化合物、または例えば、ｍＡｂｓまたはＬＦＡ−１アンタゴニスト、セレクチンアンタゴニストおよびＶＬＡ−４アンタゴニストを含む低分子量の阻害剤のような他の接着分子阻害剤も含む。該化合物は、とりわけ、例えば、ＣＤ４０に対する抗体およびＣＤ４０−Ｌに対する抗体のようなＣＤ４０およびそのリガンドを妨害する化合物との組み合わせに有用である。
少なくとも一つの追加の治療剤（すなわち、二番目の治療剤）と組み合わせる本発明化合物（すなわち、最初の治療剤）の投与は、好ましくは該化合物および薬剤のみよりも有利な有効性を与え、好ましくは、それぞれ（すなわち、相乗的な組合せ）より低用量の使用を許容にしながらが良い。低用量は、副作用の可能性を最小限にし、それ故、安全域を増加させる。少なくとも一つの治療剤が、副治療の投与量で投与されることが好ましい。該治療剤のすべてが、副治療の投与量で投与されることが、さらにより好ましい。副治療とは、それ自体では、治療される状態または疾患のために所望の治療効果を与えない治療剤の量を意味する。相乗的な組合せは、併用で観察される効果が、単独で投与される個別の薬剤の量よりも多くなることを意味する。
可溶性ＣＴＬＡ４を含む医薬組成物は、Ｂ７とＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８の相互作用を遮断するため、または心臓血管疾患を治療するための方法に使用される。該医薬組成物中の可溶性ＣＴＬＡ４の有効量は、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）の範囲である。別の態様として、該有効量が、約０．５〜１００ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、０．５〜５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約５〜１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１０〜１５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１５〜２０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約２０〜２５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約２５〜３０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約３０〜３５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約３５〜４０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約４０〜４５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約４５〜５０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約５０〜５５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約５５〜６０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約６０〜６５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約６５〜７０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約７０〜７５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約７５〜８０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約８０〜８５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約８５〜９０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約９０〜９５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、または約９５〜１００ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）の量である。
ある態様において、可溶性ＣＴＬＡ４の有効量は、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）の量である。別の態様として、該有効量は、約０．１〜４ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）の量である。別の態様として、該有効量は、約０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約０．５〜１．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１．０〜１．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１．５〜２．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約２．０〜２．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約２．５〜３．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約３．０〜３．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）または約３．５〜４．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）の量である。別の態様として、該有効量は、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）の量である。別の態様として、該有効量は、約０．１〜２ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約２〜４ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約４〜６ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約６〜８ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約８〜１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１０〜１２ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１２〜１４ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１４〜１６ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１６〜１８ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）または約１８〜２０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）の量である。ある態様として、該有効量が、２ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）である。別の態様として、該有効量が、約１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）である。
具体的な態様として、可溶性ＣＴＬＡ４の有効量は、６０ｋｇ以下の重量である患者に対して５００ｍｇ、６０〜１００ｋｇの重量である患者に対して７５０ｍｇおよび１００ｋｇ以上の重量である患者に対して１０００ｍｇである。
本発明は、例えば、ＣＴＬＡ４Ｉｇおよび許容される担体または当該技術分野で公知の補助剤のような本発明分子を含む医薬組成物も提供する。該医薬組成物は、好ましくは、本発明分子（例えば、ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９Ｙのような可溶性ＣＴＬＡ４分子）と組み合わせるとき、分子の活性を維持し、患者の免疫系に反応しないいずれかの原料を含む、適当な担体および補助剤を含む。これらの担体および補助剤は、これに限らないが、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンのような血清蛋白質、ホスフェートのような緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的なグリセリド混合物、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、乳液（例えば、油／水乳液）、硫酸プロタミンのような塩または電解質、硫酸水素ジナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダル・シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースをベースにした物質およびポリエチレングリコールを含む。他の担体は、滅菌溶液；コーティングされた錠剤およびカプセルを含む錠剤も含みうる。具体的には、該担体は、デンプンのような賦形剤、ミルク、砂糖（例えば、スクロース、グルコース、マルトース）、あるタイプの粘土、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、ステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム、タルク、植物性脂肪または油、ゴム、グリコール、または他の公知の賦形剤を含む。該担体は、香料および着色添加剤または他の成分も含みうる。該担体を含む組成物は、周知の従来法によって製剤化される。該組成物は、例えば、ポリマー微小球のようなリポソームならびに種々のポリマー組成物のような種々の脂質組成物でも製剤化されうる。
本発明のさらなる態様として、本発明は、Ｂ７とそのリガンドの相互作用を遮断および／または心臓血管疾患を治療するために有用である本発明分子を含む、キット（すなわち、説明書と併せて、試薬の組合せをパッケージした）を提供する。
該キットは、１またはそれ以上の薬剤、例えば、可溶性ＣＴＬＡ４分子単独、または二つ目の薬剤と一緒、および許容される担体または補助剤、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液のような医薬的に許容される緩衝剤を含む医薬組成物を含むことができる。他の緩衝剤、希釈剤、濾過器、注射針、シリンジ、および使用のための説明書と共にパッケージ挿入物を含む、市販品および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含みうる。該薬剤は、溶解することによって賦形剤が、適当な濃度を有する試薬溶液を提供することを含む、通常凍結乾燥される乾燥粉末として提供されうる。
二番目の薬剤は、抗凝血性または凝固阻害剤、抗血小板または血小板阻害剤、トロンビン阻害剤、血栓溶解または線維素溶解剤、抗不整脈剤、抗高血圧剤、カルシウムチャネル遮断薬（Ｌ−タイプおよびＴ−タイプ）、強心配糖体、利尿薬、鉱質コルチコイドレセプターアンタゴニスト、ホスホジエステラーゼ阻害剤、コレステロール／脂質低下剤および脂質プロフィール療法、抗糖尿病薬、抗抑制剤、抗炎症剤（ステロイド性および非ステロイド）、抗骨粗鬆症剤、ホルモン補充療法、経口避妊薬、抗肥満薬、抗不安薬、抗増殖剤、抗腫瘍剤、抗潰瘍および逆流性食道炎薬、成長ホルモンおよび／または成長ホルモン分泌促進薬、甲状腺模倣物（甲状腺レセプターアンタゴニストを含む）、抗感染剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、および抗真菌剤のような追加の薬剤として上記のものを含む。
該キットは、ラベルおよび／または説明書と共に容器を含む。適当な容器は、例えば、ビン、バイアル、および試験管を含む。容器は、ガラスまたはプラスチックのような多様な原料から作られうる。容器は、滅菌点検口（例えば、該容器は、貫通可能な皮下注射針のような針によって、ストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルである）を有することができる。容器は、Ｂ７とそのリガンドの相互作用を遮断および／または心臓血管疾患を治療するために有効である薬剤を有する医薬組成物のような医薬組成物に保つことができる。
該キットは、本明細書に記載された１またはそれ以上の二番目の薬剤および／またはリン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液およびおよびデキストロース溶液のような医薬的に許容される緩衝液を含む、二番目の容器も含むことができる。さらに、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、注射針、注射器、および使用のための説明書と一緒にパッケージ挿入物を含む、商業および使用者の観点から好ましい他の原料も含みうる。
該キットは、ラベルおよび／または容器の説明書または関連するものを適当に含みうる。該ラベルは、例えば、乾燥粉末を溶解するような薬剤の調製を実行するため、および／または具体的な心臓血管疾患のための治療のための指示を提供する。該ラベルおよび／または説明書は、本発明組成物および二番目の薬剤の投与が同時に投与されるか、または異なった時点で、連続的に任意の順序で投与され得ることを示す。
ラベルおよび／または説明書は、医薬組成物をインビボまたはインビトロのどちらかで使用するための指示を示すことができる。該ラベルおよび／または説明書は、該医薬組成物が、単独または二番目の薬剤と組み合わせて使用されることを示すことができる。
該ラベルは、本発明分子について、適当な投与量を示す。例えば、該ラベルは、Ｂ７とそのリガンドの相互作用を遮断および／または心臓血管疾患を治療するのに有効である分子の投与量が、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約０．５〜１００ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、０．５〜５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約５〜１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１０〜１５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１５〜２０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約２０〜２５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約２５〜３０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約３０〜３５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約３５〜４０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約４０〜４５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約４５〜５０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約５０〜５５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約５５〜６０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約６０〜６５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約６５〜７０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約７０〜７５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約７５〜８０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約８０〜８５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約８５〜９０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約９０〜９５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約９５〜１００ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約２〜１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約０．１〜４ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約０．５〜１．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１．０〜１．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１．５〜２．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約２．０〜２．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約２．５〜３．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約３．０〜３．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約３．５〜４．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約４．０〜４．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約４．５〜５．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約５．０〜５．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約５．５〜６．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約６．０〜６．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約６．５〜７．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約７．０〜７．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約７．５〜８．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約８．０〜８．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約８．５〜９．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約９．０〜９．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約９．５〜１０．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約０．１〜２ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約２〜４ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約４〜６ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約６〜８ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約８〜１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１０〜１２ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１２〜１４ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１４〜１６ ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１６〜１８ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１８〜２０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約０．５ｍｇ／ｋｇ該（患者の体重）、２ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約０．５〜１００ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、６０ｋｇ以下の患者の体重には約５００ｍｇ、６０〜１００ｋｇの間の重量の患者には７５０ｍｇまたは１００ｋｇ以上の重量の患者には１０００ｍｇであることを示すことができる。
該ラベルおよび／または説明書は、医薬組成物が選択された状態、例えば、心臓血管疾患を治療するために、単独または二番目の薬剤と組み合わせて、同時または異なった時点で、連続的に任意の順序で使用され得ることを示すことができる。
本発明の具体的な態様として、該キットは、最初の薬剤がＢ７と可溶性ＣＴＬＡ４分子、ＣＤ２８分子、Ｂ７（Ｂ７−１またはＢ７−２）分子、抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体または抗Ｂ７（Ｂ７−１またはＢ７−２）モノクローナル抗体のようなＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８の相互作用を遮断する分子である場合、医薬的に許容される担体および最初の薬剤の有効量を含む、医薬組成物を含む。好ましい態様として、可溶性ＣＴＬＡ４分子は、図２４または１９（それぞれ、ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９Ｙ）のどちらかで示されるＣＴＬＡ４の細胞外ドメインのアミノ酸配列を有する。
方法
本発明は、機能的なＣＴＬＡ４およびＣＤ２８陽性細胞とＢ７陽性細胞の相互作用を制御するための方法を提供する。該方法は、例えば、内因性のＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８分子とＢ７分子の反応を用いて妨害することによって、機能的なＣＴＬＡ４およびＣＤ２８陽性細胞とＢ７陽性細胞の相互作用を制御するために、Ｂ７陽性細胞と本発明の可溶性ＣＴＬＡ４分子が接触することを含む。本発明の方法で使用するための可溶性ＣＴＬＡ４の適当な量は、上に記載される。
本発明は、さらに心臓血管疾患を治療するための方法を提供する。該方法は、例えば、本発明の可溶性ＣＴＬＡ４分子のような本発明の治療組成物を、患者に心臓血管疾患に関連する少なくとも一つの症状を軽減するための有効な量で投与することを含む。可溶性ＣＴＬＡ４の具体例は、例えば、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのようなＣＴＬＡ４Ｉｇおよび可溶性ＣＴＬＡ４突然変異分子を含む。心臓血管疾患の症状は、これに限らないが、律動異常；虚血；狭心症；運動負荷の減少；疲労；労作性呼吸困難；および一過性脳虚血発作を含む。さらに、本発明は、Ｔ細胞／Ｂ７陽性細胞の相互作用を遮断することによって、心臓血管疾患のための長期間治療を提供し、それによりＣＤ２８に結合するＢ７のような共刺激性のシグナルによるＴ細胞活性化／刺激を遮断し、Ｔ細胞アネルギーまたは耐性の誘導を導くことを提供しうる。
心臓血管疾患は、これに限らないが、以下の疾患または症状：動脈心臓血管血栓塞栓性障害、静脈心臓血管血栓塞栓性障害、および心室内での血栓塞栓性障害を含む血栓塞栓性障害；アテローム性動脈硬化；再狭窄；末梢動脈疾患；冠状動脈バイパス手術；頸動脈疾患；動脈炎；心筋炎；心臓血管炎症；血管炎症；冠状動脈心臓疾患（ＣＨＤ）；不安定狭心症（ＵＡ）；難治性不安定狭心症；安定狭心症（ＳＡ）；慢性安定狭心症；急性冠状動脈症候群（ＡＣＳ）；初期または再発性心筋梗塞；急性心筋梗塞（ＡＭＩ）；心筋梗塞；非Ｑ波心筋梗塞；非ＳＴＥ心筋梗塞；冠状動脈疾患；心虚血；虚血；虚血性突然死；一過性脳虚血発作；発作；アテローム性動脈硬化症；末梢閉塞性動脈疾患；静脈血栓症；深部静脈血栓症；静脈血栓症；動脈塞栓症；冠状動脈血栓症；脳動脈血栓症；脳塞栓症；腎臓塞栓症；肺塞栓症；（ａ）人工弁または他の移植片、（ｂ）留置カテーテル、（ｃ）ステント、（ｄ）心肺バイパス、（ｅ）血液透析、または（ｆ）血液が、血栓症を促進する人工物表面に曝される他の方法から生じる血栓症；アテローム性動脈硬化症、手術または手術の合併症、長期の固定化、動脈細動、先天性血栓形成傾向、癌、糖尿病、薬品またはホルモンの影響、および妊娠合併症から生じる血栓症；上室性不整脈、心房性不整脈、心房粗動、心房細動を含む心不整脈；心臓疾患に挙げられる他の疾患：A Textbook of Cardiovascular Medicine, 2 Volume Set, 6th Edition, 2001, Eugene Braunwald, Douglas P. Zipes, Peter Libby, Douglas D. Zipes を含む。
好ましい心臓血管疾患は、アテローム性動脈硬化症；冠状動脈心臓疾患（ＣＨＤ）；再狭窄；末梢動脈疾患；冠状動脈バイパス手術；頸動脈疾患；動脈炎；心筋炎；心臓血管炎症；血管炎症；不安定狭心症（ＵＡ）；難治性不安定狭心症；安定狭心症（ＳＡ）；慢性安定狭心症；急性冠状動脈症候群（ＡＣＳ）；心筋梗塞；初期または再発性心筋梗塞、非Ｑ波心筋梗塞、非ＳＴ上昇心筋梗塞およびＳＴ上昇心筋梗塞を含む急性心筋梗塞（ＡＭＩ）である。
より好ましい心臓血管疾患は、アテローム性動脈硬化症；冠状動脈心臓疾患（ＣＨＤ）；不安定狭心症（ＵＡ）；難治性不安定狭心症；安定狭心症（ＳＡ）；慢性安定狭心症；急性冠状動脈症候群（ＡＣＳ）；心筋梗塞；初期または再発性心筋梗塞、非Ｑ波心筋梗塞、非ＳＴ上昇心筋梗塞およびＳＴ上昇心筋梗塞を含む急性心筋梗塞（ＡＭＩ）である。
好ましい心臓血管疾患は、Ｔ細胞とＢ７陽性細胞の相互作用によって介在される心臓血管疾患である。
さらに好ましくは、少なくとも一つの炎症マーカーと関連する心臓血管疾患である。炎症マーカーと関連することによって、マーカー（存在、非存在または特有の濃度）が、疾患の今後の進展のリスク、または疾患再発のリスク、もしくは疾患の活動性の現在のレベルで統計的に相関があることを意味する。炎症マーカーは、これに限らないが、ＣＲＰ、ｈｓＣＲＰ、ＩＬ−１０、ＣＤ４０Ｌ、ｓＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−６、ｓＩＣＡＭ−１、ＴＮＦ−α、白血球数、フィブリノーゲン、および血清アミロイドＡを含む。好ましい炎症マーカーは、ＣＲＰ、ｈｓＣＲＰ、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−αであり；最も好ましくは、ｈｓＣＲＰである。高ＣＲＰ、高ｈｓＣＲＰ、低ＩＬ−１０、高ｓＣＤ４０Ｌ、高ＩＬ−６、高ｓＩＣＡＭ−１、高ＴＮＦ−α、高白血球数、高フィブリノーゲン、および高血清アミロイドＡは、炎症の指示薬として公知である。
本発明の可溶性ＣＴＬＡ４分子は、生体内で阻害剤としての性質を示す。例えば、Ｔ細胞／Ｂ細胞相互作用のようなＴ細胞／Ｂ７陽性細胞の相互作用がＴ細胞およびＢ７陽性細胞との接触の結果として起こる条件下で、例えば、Ｂ細胞のようなＢ７陽性細胞と反応するために導入されたＣＴＬＡ４分子の結合は、免疫応答の制御を生じるＴ細胞／Ｂ７陽性細胞の相互作用を妨害、すなわち、阻害しうる。
本発明の好ましい態様として、機能的なＣＴＬＡ４およびＣＤ２８陽性細胞とＢ７陽性細胞の相互作用を制御、再発性の心臓血管の徴候（例えば、心筋梗塞）を含む心臓血管疾患を治療または予防、および／または免疫応答を下方制御するためにＣＴＬＡ４Ｉｇまたは可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子であるＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの使用を含む。本発明のＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、少なくとも二つのアミノ酸の変化、＋１０４位のロイシン（Ｌ）をグルタミン酸（Ｅ）に、＋２９位のアラニン（Ａ）をチロシン（Ｙ）に変化すること（図１９）を含む可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子である。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ分子は、本明細書にさらに二つ以上の突然変異を含みうる。
Ｂ７とＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８の相互作用を遮断するために使用される分子の適量は、上で記載される。Ｂ７／ＣＴＬＡ４相互作用を遮断するために使用される分子は、ＣＴＬＡ４Ｉｇ、ＣＴＬＡ４Ｉｇ／ＣＤ２８ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのような可溶性ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８Ｉｇのような可溶性ＣＤ２８、Ｂ７Ｉｇのような可溶性Ｂ７（Ｂ７−１またはＢ７−２）、抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体または抗Ｂ７モノクローナル抗体であり得る。
本発明によって提供される症状緩和の量は、病態において、症状緩和を測定および記録するために確立されたいずれかの一般に認められた基準を用いて測定されうる。症状緩和を測定するための一般に認められた基準は、狭心症；再発性狭心症；不安定狭心症；虚血時間；心臓血管が原因のための入院；急性心筋梗塞；再発性の心筋梗塞；緊急の血管再生の必要性；経皮冠状動脈処置の必要性；すべての死亡原因；心臓血管死亡率；一過性脳虚血発作；および発作を含みうる。
本発明によって治療される患者は、ヒト、サル（monkey）、サル（ape）、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、ウサギ、ネズミおよびラットを含む、哺乳類の患者を含む。
本発明は、可溶性ＣＴＬＡ４分子単独または追加の治療剤との組み合わせのような本発明の治療組成物を局所または全身に投与するための種々の方法を提供する。該方法は、静脈内、筋肉内、腹腔内、経口、吸入および皮下の方法、ならびに移植可能なポンプ、継続的注入、ボーラス注入、遺伝子治療、リポソーム、坐薬、局所接触、ベシクル、カプセル、生体分解性ポリマー、薬剤溶出ステント、ヒドロゲル、放出制御パッチおよび注射の方法を含む。担体と調合される治療剤は、保存のために通常、凍結乾燥され、投与前に水または中性のｐＨ（約ｐＨ７〜８、例えば、ｐＨ７．５）の緩衝溶液で再調製される。
可溶性ＣＴＬＡ４分子のような本発明の治療組成物は、追加の治療剤を同時に投与され得るか、または異なった時点で連続的な任意の順序で投与され得る。
当該技術分野で標準的な治療として、本発明組成物は、医薬的に許容される形態のいずれかで患者に投与され得る。
本発明の治療によって、該方法は、ＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ４陽性細胞とＢ７陽性細胞の相互作用を制御するために、本発明の可溶性ＣＴＬＡ４分子を患者に投与することを含む。Ｂ７陽性細胞は、可溶性ＣＴＬＡ４／Ｂ７複合体を形成するために、本発明の可溶性ＣＴＬＡ４分子、またはそのフラグメントまたは誘導体の有効量と接触させる。可溶性ＣＴＬＡ４の適量は、上に記載する。該複合体は、Ｂ７ファミリー分子と内因性のＣＴＬＡ４およびＣＤ２８分子との間の相互作用を妨害する。
可溶性ＣＴＬＡ４分子は、患者において、それら個別のリガンドとの結合によって、内因性のＢ７分子を遮断するのに充分な量および時間（例えば、時間の長さおよび／または多重時間）で患者に投与されうる。内因性のＢ７／リガンド結合の遮断は、それによってＢ７陽性細胞とＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ４陽性細胞との相互作用を阻害する。ある態様として、可溶性ＣＴＬＡ４は、必要に応じて、日／週／月／年あたり単独または多重時間において、毎日、毎週、毎月および／または毎年、患者に投与され得る。例えば、一態様として、該分子は、最初の１ヶ月間では２週ごとに１回、次いで、その後１月ごとに１回投与され得る。
治療剤の投与量は、これに限らないが、影響を与える組織のタイプ、治療される心臓血管疾患のタイプ、疾病の重症度、患者の健康および薬剤を用いる治療に対する応答を含む、多くの要因に依存している。従って、薬剤の投与量は、各患者および投与様式に依存して変化することができる。可溶性ＣＴＬＡ４分子は、１日あたり約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）の量で投与され得る。可溶性ＣＴＬＡ４の適量は、上で記載される。
本発明は、心臓血管疾患を治療するために、他の治療剤または医薬剤と一緒に、本発明組成物の使用も含む。例えば、心臓血管疾患は、これに限らないが、本発明組成物の議論の中で、上で挙げられる追加の治療剤と組み合わせて、本発明分子で治療されうる。
本発明の可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子が、例えば、上で特定したような他の薬剤と組み合わせて投与される場合、共投与される薬剤の投与量は、もちろん用いる併用薬のタイプ、用いる特定の薬剤、治療される症状などに依存して変化する。
前述に従い、さらなる態様として、本発明は、遊離形態または医薬的に許容される塩において、例えば、ＣＴＬＡ４Ｉｇおよび／またはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのような本発明の可溶性ＣＴＬＡ４分子および二番目の医薬品成分（該二番目の医薬品成分とは、例えば、上で示したような免疫抑制、免疫調節または抗炎症性薬である）の治療上の有効量を、例えば、同時または任意の順序で連続的（すなわち、同時または異なった時点で連続的に任意の順序）な共投与からなる上と同義である方法で提供する。
さらに、例えば、キットのような治療上の組合せを別の治療剤を含む少なくとも一つの医薬組成物と一緒に、同時または任意の順序で連続的に（すなわち、同時または異なった時点で連続的な任意の順序）使用するために、遊離形態または医薬的に許容される塩の形態での可溶性ＣＴＬＡ４分子を含むことを提供する。該キットは、その投与のための説明書を含みうる。本発明のキットは、本発明のいずれかの方法で使用され得る。
本発明は、本発明の可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子を産生するための方法も提供する。可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子の発現は、原核細胞または真核細胞で起こり得る。
原核生物は、最も高頻度で種々のバクテリアの菌株によって表される。該バクテリアは、グラム陽性またはグラム陰性である。具体的には、大腸菌のようなグラム陰性菌が好ましい。他の細菌の菌株も使用され得る。可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子をコードする配列は、大腸菌のような原核細胞で外部配列を発現するために設計されるベクターに挿入され得る。これらのベクターは、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（ｌａｃ）プロモーター系（チャンの文献：(1977) Nature 198:1056）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（ゲーデルの文献：(1980) Nucleic Acids Res. 8:4057）およびＰLプロモーターおよびＮ遺伝子リボソーム結合部（シマタケの文献：(1981) Nature 292:128）から生じたラムダのような通常使用されるプロモーターを含む、リボソーム結合部の配列と一緒に適宜オペレーターを持ち、転写開始のためのプロモーターを含む、本明細書で定義される通常使用された原核生物のコントロール配列を含むことができる。
アンピシリンまたはカナマイシンのような抗生物質の存在中で成長するとき、該ベクターが、バクテリア中で複製し、プラスミドを運ぶ細胞が選択できるように、該発現ベクターは、抗生物質に対する耐性を与えるβ−ラクタマーゼまたはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のような複製の原型および選択可能なマーカーも含む。
該発現プラスミドは、これに限らないが、ＣａＣｌ2ショック（コーヘンの文献：(1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110, およびサムブルックの書籍：Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, (1989)）および電気穿孔法を含む多様で標準的な方法によって、原核細胞に導入することができる。
本発明の実施において、真核細胞は、適当な宿主細胞でもある。真核細胞の具体例は、いすれかの動物細胞、原発性または不死化された酵母（例えば、出芽酵母、シゾサッカロミセスポンベ、およびピキアパストリス）、および植物細胞を含む。骨髄腫、ＣＯＳおよびＣＨＯ細胞は、宿主として使用され得る動物細胞の具体例である。特定のＣＨＯ細胞は、これに限らないが、ＤＧ４４（チャシンの文献：1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12:555-556；コルケカーの文献：1997 Biochemistry 36:10901-10909）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−６１）、ＣＨＯ−Ｋ１ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞株（クローンテック社）、ＥＣＡＣＣ８５０５０３０２を指定されたＣＨＯ（ＣＡＭＲ社、ソールベリー、ウィルトシャー州、英国）、ＣＨＯクローン１３（ＧＥＩＭＧ社、ジェノバ、イタリア）、ＣＨＯクローンＢ（ＧＥＩＭＧ社、ジェノバ、イタリア）、ＥＣＡＣＣ９３０６１６０７を指定されたＣＨＯ−Ｋ１／ＳＦ（ＣＡＭＲ社、ソールベリー、ウィルトシャー州、英国）、およびＥＣＡＣＣ９２０５２１２９を指定されたＲＲ−ＣＨＯＫ１（ＣＡＭＲ社、ソールベリー、ウィルトシャー州、英国）を含む。具体的な植物細胞は、タバコ（植物全体、細胞培養液、またはカルス）、トウモロコシ、大豆、およびイネ細胞を含む。トウモロコシ、大豆、およびイネ種子も許容される。
ＣＴＬＡ４の突然変異分子をコードする核酸配列は、原核生物の宿主において、外部配列を発現するために指定されるベクターにも挿入されうる。該ベクターの制御要素は、特定の原核生物の宿主に応じて変化することができる。
発現ベクターで使用するための通常使用される原核生物のコントロール配列は、例えば、ＣＭＶプロモーター（ＣＤＭ８ベクター）およびトリ肉腫ウイルス（ＡＳＶ）(πＬＮベクター）のような哺乳類細胞と対応するプロモーターおよびコントロール配列を含む。他の通常使用されるプロモーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（フィアースの文献：(1973) Nature 273:113）由来の初期および後期のプロモーター、またはポリオーマ、アデノウイルス２、およびウシ乳頭腫ウイルスから由来するもののような他のウイルスプロモーターを含む。ｈＭＴＩＩ（カリンの文献：(1982) Nature 299:797-802）のような誘導プロモーターも用いられ得る。
原核生物において、ＣＴＬＡ４の突然変異分子を発現するためのベクターは、エンハンサー領域と呼ばれる配列も運びうる。これらは、最適化する遺伝子発現に重要であり、プロモーター領域の上流または下流のどちらかで見出される。
原核生物の宿主細胞のための発現ベクターの具体例は、これに限らないが、哺乳類の宿主細胞（例えば、ＢＰＶ−１、ｐＨｙｇ、ｐＲＳＶ、ｐＳＶ２、ｐＴＫ２（マニアチス社）；ｐＩＲＥＳ（クローンテック社）のためのベクター；ｐＲｃ／ＣＭＶ２、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＳＦＶ１（ライフテクノロジー社）；ｐＶＰａｋｃベクター、ｐＣＭＶベクター、ｐＳＧ５ベクター（ストラタジーン社））、レトロウイルスベクター（例えば、ｐＦＢベクター（ストラタジーン社））、ｐＣＤＮＡ−３（インビトロジェン社）またはその修飾型、アデノウイルスベクター；アデノ関連ウイルスベクター、バクロウイルスベクター、酵母ベクター（例えば、ｐＥＳＣベクター（ストラタジーン社））を含む。
ＣＴＬＡ４の突然変異分子をコードする核酸配列は、原核生物の宿主細胞のゲノムに組み込み、宿主のゲノムを複製することができる。別法として、ＣＴＬＡ４の突然変異分子を運ぶベクターは、染色体外複製を可能にする複製の原型を含むことができる。
出芽酵母中で核酸配列を発現するために、内因性の酵母プラスミドからの複製の原型である２μサークルが使用され得る（ブローチの文献：(1983) Meth. Enz. 101:307）。また、自主的な複製を促進することができる酵母ゲノム由来の配列が用いられる（参照、例えば、スティンチコムの文献：(1979) Nature 282:39）；ツチェンパーの文献：(1980) Gene 10:157；およびクラークの文献：(1983) Meth. Enz. 101:300）。
酵母ベクターの転写コントロール配列は、糖分解酵素（ヘスの文献：(1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7:149；ホランドの文献：(1978) Biochemistry 17:4900）の合成のためのプロモーターを含む。当該技術分野で公知の他のプロモーターは、ＣＤＭ８ベクター（トヤマおよびオカヤマの文献：(1990) FEBS 268:217-221）；３−ホスホグリセレートキナーゼのためのプロモーター（ヒチェマンの文献：(1980) J. Biol. Chem. 255:2073）、および他の糖分解酵素のためのものを提供するＣＭＶプロモーターを含む。
それらは、周囲の刺激または細胞の成長媒体によって制御されうるので、他のプロモーターを誘導する。これらの誘導プロモーターは、熱ショック蛋白質、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素異化に関連する酵素、およびマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素のための遺伝子から由来するものを含む。
調節配列は、コードする配列の３’末端でも認識され得る。これらの配列は、メッセンジャーＲＮＡを安定化するために作用する。該ターミネーターは、いくつかの酵母由来および哺乳類遺伝子において、以下のコードする配列である３’非翻訳領域内で見出される。
植物および植物細胞についての具体的なベクターは、これに限らないが、アグロバクテリウムＴiプラスミド、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、およびトマトゴールデンモザイクウイルス（ＴＧＭＶ）を含む。
哺乳類細胞の宿主系の変換の一般的な態様は、アクセル社（１９８３年８月１６日に発行された米国特許第４３９９２１６号）によって記載されている。哺乳類細胞は、これに限らないが、リン酸カルシウム存在下での遺伝子導入、ミクロ注入法、電気穿孔法、またはウイルスベクターを用いる形質導入を経由することを含む方法によって変換されうる。
植物および酵母ゲノムを含む外部ＤＮＡ配列を原核生物のゲノムに導入するための方法は、（１）単一細胞または原形質体へのＤＮＡのミクロ注入法、ＤＮＡ存在下でガラスビーズを持つ細胞をボルテックスするか、またはＤＮＡコーティングしたタングステンまたは金の球体を細胞または原形質体に発射する機械的な方法；（２）ポリエチレングリコール治療によるマクロ分子または患者に高圧電位パルス（電気穿孔法）を透過させる細胞膜を調製することによって、ＤＮＡを導入する；または（３）細胞膜を融合するリポソーム（ｃＤＮＡ含有）の使用を含む。
本発明のＣＴＬＡ４の突然変異分子が、いったん発現すれば、それらは、細胞溶解（例えば、超音波処理、リゾチームおよび／または洗浄剤）および例えば、親和性クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーのような標準的な精製手段を用いて実施される蛋白質探索のような当該技術分野で周知の方法によって、実質的にピュアな生成物（スコープの書籍：Protein Purification, Principles and Practice, Third Edition, Springer-Verlag (1994)；サムブルックの書籍：Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, (1989)）を得るために調達される。ＣＴＬＡ４の突然変異分子の発現は、当該技術分野で公知の方法によって検出される。例えば、該突然変異分子は、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびＣＴＬＡ４を結合する抗体を用いる免疫ブロット法によって検出され得る。
（実施例）
以下の実施例は、本発明を説明するため、および同一物の製造および使用において当業者の助けとなるために提供する。実施例は、本発明の範囲を他に制限することを意図しない。
実施例１
下記は、本発明のＣＴＬＡ４分子をコードするヌクレオチド配列を生成するために使用する方法の記載を提供する。
プラスミドをコードするＣＴＬＡ４Ｉｇは、最初に構築され、米国特許第５４３４１３１号、第５８８５５７９号および第５８５１７９５号に記載されるＣＴＬＡ４Ｉｇ分子を発現することを示す。次いで、単一部位の突然変異分子（例えば、Ｌ１０４ＥＩｇ）は、配列をコードするＣＴＬＡ４Ｉｇから生成し、発現して種々のＢ７分子の結合速度を試験した。Ｌ１０４ＥＩｇヌクレオチド配列（図１８に示される配列を含む）は、蛋白質を発現し、結合速度を試験する二重部のＣＴＬＡ４の突然変異配列（図１９〜２２で示される配列中に含まれる）を生成するための鋳型として使用した。二重部のＣＴＬＡ４の突然変異配列は、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＬＩｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＴＩｇ、およびＬ１０４ＥＡ２９ＷＩｇを含む。三重部位の突然変異も生成された。
ＣＴＬＡ４Ｉｇの構造
ＣＴＬＡ４およびＩｇＣγ１ドメインの細胞外ドメインを含むＣＴＬＡ４Ｉｇをコードする遺伝子構造は、米国特許第５４３４１３１号、第５８４４０９５号および第５８５１７９５号に記載されたとおり構築され、内容を本明細書に引用する。ＣＴＬＡ４遺伝子の細胞外ドメインは、刊行物に記載された配列（ダリアバックの文献：Eur. Journ. Immunol. 18:1901-1905 (1988)）に対応する合成オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによってクローン化された。
ＣＴＬＡ４についてのシグナルペプチドが、ＣＴＬＡ４遺伝子内で同定されなかったために、ＣＴＬＡ４の予想された配列のＮ末端は、オリゴヌクレオチドの重複部分を用いて、２工程でオンコスタチンＭ（マーリックの文献：Mol. and Cell. Biol. 9:2847 (1989)) のシグナルペプチドと融合した。第１工程として、該オリゴヌクレオチドCTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC (SEQ ID NO:1)（コードしたオンコスタチンＭシグナルペプチドからＣ末端の１５番目のアミノ酸をＣＴＬＡ４のＮ末端７番目のアミノ酸と融合した）は、順方向プライマーとして、およびTTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGG CACGGTTG (SEQ ID NO: 2)（該アミノ酸配列をコードしているＣＴＬＡ４レセプターの１１９〜１２５位のアミノ酸残基をコードし、Ｂｃｌ Ｉ制限酵素部位を含む）を逆方向プライマーとして使用した。この工程の鋳型は、Ｈ３８細胞（サラフジンおよびベセスダらによって提供されたＴ細胞白血球細胞株で感染したＨＴＬＶ ＩＩ）由来の全ＲＮＡの１μｇから合成されたｃＤＮＡであった。最初の工程由来のＰＣＲ生成物の一部分は、オンコスタチンＭのシグナルペプチドのＮ末端部分をコードし、ＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部である、CTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTG TACTGCTCACACA-GAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC (SEQ ID NO: 3)を含む重複する順方向プライマー、および同一の逆方向プライマーを用いて、再増幅した。ＰＣＲ反応の生成物は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｃｌ Ｉで消化され、ＩｇＣ（ガンマ）１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域に対応するアミノ酸配列を発現ベクターが切断されたＨｉｎｄＩＩＩ／Ｘｂａ Ｉ、発現ベクターであるパイＬＮ（πＬＮとしても知られる）が切断されたＣＤＭ８またはＨｉｎｄＩＩＩ／Ｘｂａ ＩにコードするｃＤＮＡフラグメントが切断されたＢｃｌ １／Ｘｂａ Ｉと一緒に結紮した。
ＣＴＬＡ４Ｉｇに対応するアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、１９９１年、５月３１日に、ブタペスト条約下でＡＴＣＣに寄託し、ＡＴＣＣ受入番号６８６２９を付与された。
突然変異誘発に基づくＣＴＬＡ４Ｉｇコドン
突然変異誘発およびスクリーニング方法は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６分子、すなわち、改良された結合能力からゆっくりとした解離速度（「オフ」速度）を有する突然変異のＣＴＬＡ４Ｉｇ分子を確認するために開発した。本態様において、突然変異は、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインのＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２（Ｃ’ストランドとしても公知である）、および／またはＣＤＲ−３領域において、該残基内および／または外で実施した（米国特許第６０９０９１４号、第５７７３２５３号および第５８４４０９５号に記載された；同時係属の米国特許出願番号６０／２１４０６５；およびピーチの文献：J Exp Med 1994 180:2049-2058. ＣＤＲ様領域は、ＣＤＲモチーフのいくつかのアミノ酸、上流および／または下流によって各ＣＤＲ領域を包含し、拡張する。）。これらの部位は、キメラのＣＤ２８／ＣＴＬＡ４融合蛋白質（ピーチの文献：J. Exp. Med., 1994, 180:2049-2058）の研究、およびアミノ酸残基の側鎖が溶媒暴露され、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４の特定の位置で、アミノ酸残基の同一性または相同性の欠損があると予測されるモデルに基づいて選択された。また、確認された残基に空間的に接近（５〜２０Åユニット）する残基のいずれかは、本発明の一部であると見なされる。
Ｂ７分子（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６）に対して変化した親和性を持つ可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子の合成およびスクリーニングをするために、二工程の方法を適用した。実験は、ＣＴＬＡ４の細胞外部分の特定のコドンで、突然変異のライブラリーを最初に生成させて、次いで、Ｂ７に変更した反応性を持つ突然変異を確認するために、ビアコア社（BIAcore）の解析によって、これらをスクリーニングした。該ビアコアアッセイ系（ファルマシア社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）は、検出器に局在するデキストランコーティングしたセンサーチップへのＣＤ８０ＩｇまたはＣＤ８６Ｉｇのどちらかとの実質的な共有結合を含む、表面プラスモン共鳴検出器システムを使用する。試験分子は、次いで、該センサーチップを含むチャンバーに注入し結合する相補的蛋白質の量は、該センサーチップのデキストランコーティングした側に物理的に関連する分子量の変化に基づいて評価され；分子量の変化は、検出器のシステムによって測定される。
具体的には、単一部位の突然変異のヌクレオチド配列は、テンプレートとして突然変異されない（例えば、野生型）ＣＴＬＡ４Ｉｇ（米国特許第５４３４１３１号、第５８４４０９５号；第５８５１７９５号；および第５８８５７９６号；ＡＴＣＣ受入番号６８６２９）をコードするＤＮＡを用いて生成した。突然変異オリゴヌクレオチドのＰＣＲプライマーは、該コドンの１および２位でいずれかの塩基を許容し、３位（ＸＸＧ／ＴまたはＮＮＧ／Ｔとしても記載される）でグアニンまたはチミンで許容しないことによる特定のコドンのランダム突然変異誘発を予定した。この方法で、アミノ酸をコードする特定のコドンは、２０個のアミノ酸のそれぞれについてコードするためにランダムに突然変異され得る。それに関して、ＸＸＧ／Ｔ突然変異誘発は、２０個のアミノ酸のそれぞれをコードする３２個の可能なコドンを与える。ＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＭＹＰＰＰＹ）のＣＤＲ３様のループの近接位で、突然変異をコードするＰＣＲ生成物は、ＳａｃＩ／ＸｂａＩで消化し、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（図２４に含まれる）のπＬＮ発現ベクターを同様に切断するためにサブクローン化した。この方法は、単一部位でのＣＴＬＡ４突然変異分子である、Ｌ１０４ＥＩｇ（図１８に含まれる）を生じるために使用した。
ＣＴＬＡ４ＩｇのＣＤＲ−１様ループの近傍での突然変異誘発において、無変化のＮｈｅＩ制限部位は、最初ＰＣＲプライマー定方向突然変異誘発によって、このループの５’位に導入された。ＰＣＲ生成物は、ＮｈｅＩ／ＸｂａＩで消化され、ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＩｇ発現ベクターを同様に切断するためにサブクローン化された。この方法は、二重部ＣＴＬＡ４の突然変異分子であるＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図１９に含まれる）を生じるために使用した。特に、単一部のＣＴＬＡ４の突然変異分子をコードする核酸分子であるＬ１０４ＥＩｇは、二重部のＣＴＬＡ４の突然変異分子であるＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇを生ずるテンプレートとして使用された。
Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｂｌｖｄ大学、マナッサス、ヴァージニア州２０１１０−２２０９に２０００年６月１９日に寄託し、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−２１０４を付与された）のようなＣＴＬＡ４突然変異分子をコードする二重部の突然変異ヌクレオチド配列は、鋳型として、Ｌ１０４ＥＩｇを用いる上記の突然変異誘発方法を繰り返すことによって生成した。この方法は、ＣＴＬＡ４分子をコードするＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図１９で示す配列を含む）、Ｌ１０４ＥＡ２９ＬＩｇ（図２０で示す配列を含む）、Ｌ１０４ＥＡ２９ＴＩｇ（図２１で示す配列を含む）、およびＬ１０４ＥＡ２９ＷＩｇ（図２２で示す配列を含む）のような多くの二重部位の突然変異のヌクレオチド配列を使用した。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＳ２５ＫＩｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＳ２５ＮＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＳ２５ＲＩｇをコードするような三重部位の突然変異も生じた。
該可溶性ＣＴＬＡ４分子は、ヌクレオチド配列から発現して、下記の実施例３に記載されたフェーズＩＩ臨床研究に使用した。
当業者が理解するとおり、とりわけ、ＰＣＲ増幅による核酸配列の複製は、容易にＤＮＡストランドへの塩基変化を導入する。しかしながら、ヌクレオチド変化は、必ずしも同一のアミノ酸を重複してコードするいくつかのコドンとして、アミノ酸変化を翻訳するとは限らない。無変化（すなわち、翻訳されたアミノ酸において、変化を引き起こさない）あるいはその反対で、本明細書で明記しない原型または野生型の配列由来のヌクレオチドのいずれかの変化は、本発明の範囲に含まれる。
実施例２
下記の実施例は、突然変異しないＣＴＬＡ４Ｉｇ分子と比較するとＢ７分子に対して高い結合活性を示す、実施例１に記載された構築から発現した単一および二重部位の突然変異のＣＴＬＡポリペプチドを確認するために使用されるスクリーニング方法の説明を提供する。
現在のインビトロおよびインビボ研究は、それ自身によって、ＣＴＬＡ４Ｉｇは、抗原特異的に活性化されたＴ細胞のプライミングを完全に遮断することはできないことを示す。ＣＴＬＡ４Ｉｇを用いるインビトロ研究およびＴ細胞増殖の阻害を測定するＣＤ８０またはＣＤ８６に対して、特異的なモノクローナル抗体のそれぞれは、抗ＣＤ８０モノクローナル抗体が、ＣＴＬＡ４Ｉｇ阻害を増加しないことを示す。しかしながら、抗ＣＤ８６モノクローナル抗体は、ＣＴＬＡ４ＩｇがＣＤ８６相互作用を遮断する位置で有効ではないことを示す、該阻害を増加する。これらのデータは、ＣＤ８６介在応答よりも約１００倍低いＣＴＬＡ４Ｉｇ濃度が必要なＣＤ８０介在細胞応答の阻害を示す、リンスリーの文献（Immunity, (1994), 1:793-801）による初期の結果を支持する。これらの結果に基づいて、野生型のＣＴＬＡ４よりＣＤ８６に対して、より高い結合活性を有する可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子は、ＣＴＬＡ４Ｉｇよりも抗原特異的に活性化された細胞のプライミングを遮断することがより良くできることを推測した。
このために、上記実施例１の該可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子は、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対して結合活性を改良するＣＴＬＡ４の細胞外ドメインにおいて、いくつかの突然変異を確認するために新規なスクリーニング方法を用いてスクリーニングした。このスクリーニング方法は、「オフ」速度の決定が独立した濃度であるので（オシャネッシーの文献：(1993) Anal. Biochem., 212:457-468）、蛋白質精製または定量には必要でない明らかにゆっくりとした「オフ」速度を持つ突然変異を直接確認するために有効な方法を提供した。
ＣＯＳ細胞は、精製されたプラスミドＤＮＡを個別にミニプレップ法を用いて、形質転換し数日間繁殖させた。３日コンディショニングした培養液を可溶性ＣＤ８０ＩｇまたはＣＤ８６Ｉｇでコーティングしたビアコアバイオセンサーチップ（ファルマシアバイオテックＡＢ社、ウップサーラ、スウェーデン）に適用した。突然変異蛋白質の特異的な結合および解離を表面プラスモン共鳴（オシャネッシーの文献：1997 Anal. Biochem. 212:457-468）によって測定した。すべての実験は、２５℃で、ビアコア（登録商標）またはビアコア（登録商標）２０００バイオセンサーにて実施した。リガンドは、標準的なＮ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドＮ−ヒドロキシスクシイミドカップリング（ジョンソンの文献：(1991) Anal. Biochem. 198: 268-277；キルコの文献：(1993) J. Biol. Chem 268:5425-15434)を用いて研究グレードのＮＣＭ５センサーチップ（ファルマシア）で固定化した。
スクリーニング方法
２４ウェルの組織培養プレートで成長させたＣＯＳ細胞を突然変異のＣＴＬＡ４Ｉｇで一時的に形質転換した。分泌型の可溶性の突然変異ＣＴＬＡ４Ｉｇを含む培養液は、３日後回収した。
コンディショニングしたＣＯＳ細胞培養液をＣＤ８６ＩｇまたはＣＤ８０Ｉｇ（グリーンの文献：1996 J. Biol. Chem. 271:26762-26771）で誘導体化されたビアコアバイオセンサーチップを通過させて、突然変異分子は、野生型のＣＴＬＡ４Ｉｇで観察されるより遅いオフ速度を確認した。選択された培養液サンプルに対応するＤＮＡは、ＣＴＬＡ４Ｉｇ突然変異蛋白質を調製し、続いて培養液の蛋白質Ａの精製から大量スケールのＣＯＳ細胞トランスフェクションを実施するために調製された配列およびＤＮＡであった。
ビアコア解析条件および平衡結合データ解析は、グリーンの文献：1996 J. Biol. Chem. 271:26762-26771 および本明細書に引用する米国特許出願番号第０９／５７９９２７号、および第６０／２１４０６５号に記載のとおり行った。
ビアコアデータ解析
センサーグラムのベースラインは、解析の前にゼロ応答ユニット（ＲＵ）で標準化された。サンプルは、溶液間のバルク屈折率の違いのためバックグラウンドのＲＵ値を決定するために模倣誘導体化したフローセルに流した。平衡解離定数（Ｋd）は、Ｃに対するＲeqのプロットから計算し、Ｒeqは、定常状態の応答から模倣誘導体チップの応答を引いたものであり、Ｃは、解析物のモル濃度である。結合曲線は、市販の非直線性曲線適合ソフトウェア（プリズム、グラフパッドソフトウェア）を用いて解析した。
実験データは、最初に、単一レセプター（１部位モデル、すなわち、単純ラングミュア系、Ａ＋Ｂ⇔ＡＢ）に結合する単一リガンドのためのモデルに適合させて、平衡解離定数（Ｋd＝［Ａ］・［Ｂ］／［ＡＢ］）は、式：Ｒ＝Ｒmax・Ｃ／（Ｋd＋Ｃ）から計算された。続いて、データは、リガンド結合（すなわち、式：Ｒ＝Ｒmax1・Ｃ／（Ｋd1＋Ｃ）＋Ｒmax2・Ｃ／（Ｋd2＋Ｃ）によって記載されるとおり、二つの相互作用しない独立した結合部位を有するレセプター）の最も単純な２部位モデルに適合させた。
これら二つのモデルの適合度は、実験データとの比較によって視覚的に、二乗和のＦテストによって統計的に解析した。該二部位モデルが、著しく（ｐ＜０．１）適合しない限り、より単純な一部位モデルを最高の適合であるとして選択した。
結合および解離解析は、ＢＩＡ評価ソフト２．１（ファルマシア社）を用いて、実施した。結合速度定数は、ｋonは、均一な単一部位の相互作用および平行的な二部位の相互作用の両方を仮定する二つの方法で計算された。単一部位の相互作用である、ｋon値は、式：Ｒt＝Ｒeq（１−ｅｘｐ-ks(t-t0)）に従い、計算され、Ｒtは、所定の時間ｔでの応答；Ｒeqは、定常状態の応答；ｔ0は、挿入の開始時間；およびｋs＝ｄＲ／ｄｔ＝ｋon・Ｃｋoffであり、Ｃは、単量体結合部に関して計算された解析物の濃度である。二部位の相互作用ｋon値は、式：Ｒt＝Ｒeq1（１−ｅｘｐ-ks1(t-t0)）＋Ｒeq2（１−ｅｘｐks2(t-t0)）に従って計算した。各モデルにとって、ｋonの値は、Ｃに対するｋsのプロットの計算された勾配（約７０％最大結合）から決定した。
解離データは、一部位（ＡＢ＝Ａ＋Ｂ）または二部位（ＡｉＢｊ＝Ａｉ＋Ｂｊ）モデルに従い解析して、速度定数（ｋoff）を最高の適合曲線から計算した。該結合部位モデルは、二つの結合部モデルが用いられる場合において、残存が機械のバックグラウンド（２−１０ＲＵ、機械による）より大きいときを除いて、使用した。レセプター占有の半減期は、ｔ1/2＝０．６９３／ｋoffの関係を用いて計算した。
フローサイトメトリー
マウス ｍＡｂ Ｌ３０７．４（抗ＣＤ８０）は、ベクトンディキンソン社（サンジョセ、カリフォルニア州）から、ＩＴ２．２（抗Ｂ７−０［ＣＤ８６としても知られる］）は、ファーミンゲン社（サンディエゴ、カリフォルニア州）から購入した。免疫染色において、ＣＤ８０陽性および／またはＣＤ８６陽性ＣＨＯ細胞は、１０ｍＭのＥＤＴＡを含んだリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、インキュベーションによってそれらの培養器から除去した。ＣＨＯ細胞（１〜１０×１０5）は、最初に１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ中で、ｍＡｂｓまたは免疫グロブリン融合蛋白質と一緒にインキュベートし、次いで、洗浄して、フルオレセインイソチオシアネート共役したヤギの抗マウスまたは抗ヒト免疫グロブリンの二次試薬（タゴ社（Tago）、バーリンゲーム、カリフォルニア州）とインキュベートした。細胞は、最後の洗浄を行い、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトンディキンソン社）で解析した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィー
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、トリス／グリシン４〜２０％アクリルアミドゲル（ノベックス社、サンディエゴ、カリフォルニア州）で実施した。解析ゲルは、クーマシーブルーで染色し、ウェットゲルの画像をデジタルスキャニングによって得た。ＣＴＬＡ４Ｉｇ（２５μg）およびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（２５μｇ）は、１．０ｍＬ／分の流速で、０．０２％のＮＡＮ3を含む、リン酸緩衝生理食塩水で平衡にした、ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３００ ＳＷXLカラム（７．８×３００ｍｍ、トソハース、モンゴメリーバレー、ペンシルバニア州）を用いて、サイズ排除クロマトグラフィーによって解析した。
ＣＴＬＡ４ＸC120SおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＸC120S
単鎖のＣＴＬＡ４ＸC120Sは、前記（リンスリーの文献：(1995) J. Biol. Chem., 270:15417-15424）のとおり調製した。つまり、順方向プライマーである、GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG (SEQ ID NO:4) を鋳型として使用される、オンコスタチンＭのＣＴＬＡ４（ＯＭＣＴＬＡ４）発現プラスミドは、該ベクターにおいて、配列を適合させて；ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインの最後の７つのアミノ酸（すなわち、アミノ酸１１８〜１２４）に対応する該逆方向プライマーである、GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC (SEQ ID NO:5)、および制限酵素部位、および停止コドン（ＴＧＡ）を含む。逆方向プライマーは、Ｃ１２０Ｓ（１２０位のシステインからセリン）の突然変異を指定した。特に、上で示した逆方向プライマーのヌクレオチド配列のＧＣＡ（ヌクレオチドの３４〜３６）は、次のヌクレオチド配列：ＡＧＡ、ＧＧＡ、ＴＧＡ、ＣＧＡ、ＡＣＴ、またはＧＣＴのうち一つで置換される。当業者が理解するとおり、該ヌクレオチド配列のＧＣＡは、システインのコドンＴＧＣの逆の相補的配列である。同様に、該ヌクレオチド配列のＡＧＡ、ＧＧＡ、ＴＧＡ、ＣＧＡ、ＡＣＴ、またはＧＣＴは、セリンに対するコドンの逆の相補的な配列である。ポリメラーゼ連鎖反応生成物は、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩで消化し、発現ベクターであるπＬＮ（ブリストルマイヤーズスクイブ社、プリンストン、ニュージャージー州）で、一方向性にてサブクローン化した。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＸC120Sは、同一の方法で調製した。各作成物は、ＤＮＡ配列によって変化させた。
高結合活性を持つ突然変異の同定および生化学的特性
２４個のアミノ酸は、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ；上記の通り）によって結合するＣＤ８６Ｉｇに対してアッセイされた突然変異誘発および生じる〜２３００の突然変異蛋白質について選択した。各部位での突然変異誘発の主要な効果を下記の表ＩＩにまとめる。ＣＤＲ−１領域内（Ｓ２５−Ｒ３３）のいくつかのアミノ酸のランダム突然変異誘発は、明らかにリガンド結合を改良しなかった。Ｅ３１およびＲ３３ならびにＭ９７−Ｙ１０２残基の突然変異誘発は、明らかにリガンド結合の減少を生じた。Ｓ２５、Ａ２９、およびＴ３０、Ｋ９３、Ｌ９６、Ｙ１０３、Ｌ１０４、およびＧ１０５残基の突然変異誘発は、遅い「オン」および／または遅い「オフ」速度を持つ蛋白質を生じた。これらの結果は、ＣＤＲ−１（Ｓ２５−Ｒ３３）領域内の残基、およびＭ９７−Ｙ１０２内または近傍の残基がリガンド結合（ピーチの文献：(1994) J. Exp. Med., 180:2049-2058）に影響するこれまでの結果を支持する。
Ｓ２５、Ｔ３０、Ｋ９３、Ｌ９６、Ｙ１０３、およびＧ１０５部位の突然変異誘発は、ＣＤ８６Ｉｇ由来のより遅い「オフ」速度を有するいくつかの突然変異蛋白質と同一のものを生じる。しかしながら、これらの場合において、遅い「オフ」速度は、野生型のＣＴＬＡ４Ｉｇで見られるものと明らかに同様であるＣＤ８６Ｉｇに対して、全体的な結合活性を持つ突然変異蛋白質を生じる遅い「オン」速度によって損なわれた。さらに、Ｋ９３の突然変異誘発は、観察された速度変化に関与している著しい凝集を生じる。
Ｌ１０４のランダム突然変異誘発は、固定化したＣＤ８６Ｉｇにおける培養液サンプルのＳＰＲによるＣＯＳ細胞の形質移入およびスクリーニングに続いて、その結果、野生型のＣＴＬＡ４Ｉｇよりおよそ２倍遅い「オフ」速度を持つ突然変異蛋白質を含む６つの媒体サンプルを得た。これらの突然変異に対応するｃＤＮＡが配列されたとき、それぞれグルタミン酸の突然変異（Ｌ１０４Ｅ）へロイシンをコードすることを見出した。明らかに、１０４位のロイシンをアスパラギン酸（Ｌ１０４Ｄ）への置換は、ＣＤ８６Ｉｇ結合に影響しなかった。
突然変異誘発は、次いで、上記の通りＰＣＲの鋳型として、野生型のＣＴＬＡ４Ｉｇの代わりにＬ１０４Ｅを用いる今回は、表ＩＩに挙げた各部位で繰り返した。再び固定化したＣＤ８６Ｉｇを用いるＳＰＲ解析は、野生型のＣＴＬＡ４Ｉｇよりおよそ４倍遅い「オフ」速度を有する蛋白質の２９位のアラニンの突然変異誘発由来の６個の培養液サンプルを同定した。最も遅い二つは、チロシン置換（Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙ）であり、二つは、ロイシン（Ｌ１０４ＥＡ２９Ｌ）であって、一つは、トリプトファン（Ｌ１０４ＥＡ２９Ｗ）、および一つは、スレオニン（Ｌ１０４ＥＡ２９Ｔ）であった。明らかに、遅くない「オフ」速度の突然変異は、２９位のアラニンが、ランダムに突然変異されたとき、野生型のＣＴＬＡ４Ｉｇにおいて、単独で確認された。
精製したＬ１０４ＥおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの相対分子量および凝集状態は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって評価した。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（〜１μｇ；レーン３）およびＬ１０４ＥＩｇ（〜１μｇ；レーン２）は、明らかに、減少（〜５０ｋＤａ；＋βＭＥ；＋２−メルカプトエタノール）および非減少（〜１００ｋＤａ；−βＭＥ）条件下で（図２５Ａ）、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（〜１μｇ；レーン１）と同一の電気泳動移動度であった。サイズ排除クロマトグラフィーは、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図２５Ｃ）は、明らかに二量体のＣＴＬＡ４Ｉｇ（図２５Ｂ）と同一の移動度を有することを示した。主要なピークは、図２５Ｂで、より早く溶出するマイナーピークが、高分子量の凝集体を示すと同時に、蛋白質二量体を意味する。ＣＴＬＡ４Ｉｇのおよそ５．０％は、高分子量の凝集体が存在したが、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇまたはＬ１０４ＥＩｇの凝集の証拠はなかった。それ故、Ｌ１０４ＥＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇで見られるＣＤ８６Ｉｇのより強い結合が、突然変異誘発によって誘導される凝集に起因されることはない。
平衡および速度論的結合解析
平衡および速度論的結合解析は、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）を用いる精製したＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＩｇ、およびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの蛋白質Ａで実施した。結果は、以下の表Ｉに示す。観察された平衡解離定数（Ｋd；表Ｉ）は、濃度（５．０〜２００ｎＭ）の範囲にかけて、生じる結合曲線から計算した。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、Ｌ１０４ＥＩｇまたはＣＴＬＡ４Ｉｇの結合よりも強くＣＤ８６Ｉｇに結合する。Ｌ１０４ＥＩｇ（６．０６ｎＭ）またはＣＴＬＡ４Ｉｇ（１３．９ｎＭ）より低い、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（３．２１ｎＭ）のＫdは、ＣＤ８６Ｉｇに対するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのより高い結合活性を示す。Ｌ１０４ＥＩｇ（４．４７ｎＭ）またはＣＴＬＡ４Ｉｇ（６．５１ｎＭ）より低いＫdを持つＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（３．６６ｎＭ）は、ＣＤ８０Ｉｇに対するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの高い結合活性を示す。
速度論的結合解析は、ＣＤ８６Ｉｇ（表Ｉ）に対する「オン」速度と同様にＣＤ８０に結合するＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＩｇ、およびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇについて、比較の「オン」速度は、同一であることが明らかになった。しかしながら、これらの分子に対する「オフ」速度は、同等ではなかった（表Ｉ）。ＣＴＬＡ４Ｉｇと比較すると、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、ＣＤ８０Ｉｇよりおよそ２倍遅い「オフ」速度、およびＣＤ８６Ｉｇよりおよそ４倍遅い「オフ」速度を有した。Ｌ１０４Ｅは、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＣＴＬＡ４Ｉｇとの中間の「オフ」速度であった。これらの突然変異の導入は、あまり「オン」速度に影響しないので、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇで観察されたＣＤ８０ＩｇおよびＣＤ８６Ｉｇに対する結合活性の上昇は、おそらく最初に「オフ」速度が減少するためである。
ＣＤ８６ＩｇおよびＣＤ８０Ｉｇに対するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの結合活性の上昇は、各モノマーが二量体と関連する方法に影響する突然変異のためであるかどうか、または各モノマーに導入する構造変化が結合活性を強めるかどうかを決定するために、ＣＴＬＡ４およびＬ１０４ＥＡ２９Ｙの細胞外ドメインの単鎖の構築は、リンスリーの文献：(1995) J. Biol. Chem., 270:15417-15424 (84)によって、上記の通り１２０位のシステインからセリンへの以下の突然変異誘発を調製した。精製した蛋白質ＣＴＬＡ４ＸC120SおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＸC120Sは、それらのリガンド結合特性が、ＳＰＲによって解析される前に、ゲル浸透クロマトグラフィー（リンスリーの文献：(1995)、上記）によってモノマーであることを示した。ＣＤ８６Ｉｇに対するモノマー蛋白質の両方の結合親和性を示す結果は、それら個別の二量体（表Ｉ）で見られるよりもおよそ３５〜８０倍低かった。これは、ＣＴＬＡ４の二量化が、高結合活性のリガンド結合（グリーンの文献：(1996) J. Biol. Chem., 271:26762-26771）に必要であることを評価する以前に刊行されたデータを支持する。
Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＸC120Sは、ＣＤ８０ＩｇおよびＣＤ８６Ｉｇの両方に対して、ＣＴＬＡ４ＸC120Sよりおよそ２倍高い親和性で結合した。上昇した親和性は、両方のリガンドよりおよそ３倍遅い解離速度のためであった。それ故、Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙによるより強いリガンド結合は、おそらく、分子が二量化される変化よりもはるかに各モノマー鎖に導入される結合活性を強める構造変化のためであった。
結合活性を強める突然変異の部位および構造解析
ＣＴＬＡ４の細胞外ＩｇＶ様ドメインの溶液構造は、ＮＭＲスペクトル（メツラーの文献：(1997) Nature Struct. Biol., 4:527-531）によって、最近決定された。これは、３次元の折り畳み（図２６の左右に図示）において、１０４位のロイシンおよび２９位のアラニンの正確な位置を可能にした。１０４位のロイシンは、高度に保存されたＭＹＰＰＰＹアミノ酸配列の近くに位置した。２９位のアラニンは、ＣＤＲ−１（Ｓ２５−Ｒ３３）領域のＣ末端近くに位置し、ＭＹＰＰＰＹ領域に空間的に隣接している。これら二つの領域のふもとの残基の相互作用が充分であると同時に、それらは、蛋白質内で連続した疎水コアの部分を両方含むが、Ｌ１０４およびＡ２９の直接的な相互作用は、明らかにない。二つの結合活性を強める突然変異の構造の重要性はモデリングによって評価した。該Ａ２９Ｙの突然変異は、ＣＤＲ−１（Ｓ２５−Ｒ３３）領域およびＭＹＰＰＰＹ領域との間の間隙内で容易に適用され、該ＭＹＰＰＰＹ領域のコンフォメーションを安定化させうる。野生型のＣＴＬＡ４において、Ｌ１０４は、ＭＹＰＰＰＹ領域近くのＬ９６およびＶ９４と広範囲の疎水性相互作用を形成する。グルタミン酸の突然変異は、二つの理由で、Ｌ１０４と同様のコンフォメーションを採用する可能性が極めて低い。第一に、ＣＤＲ−１（Ｓ２５−Ｒ３３領域）への充分な摂動無しに構造内で、長いグルタミン酸側鎖を適合させるのに充分な空間がない。第二に、該疎水性領域内で、グルタミン酸側鎖の負の電荷を変化するエネルギーコストが、大きいからである。その代わり、モデル研究では、該グルタミン酸側鎖は、その電荷が溶媒和によって安定化されうる場合、表面上で反転することを予測する。そのようなコンフォメーション変化は、領域内で、他の残基との最小の歪みを持つＧ１０５によって容易に適合される。
ＣＤ８０またはＣＤ８６を発現するＣＨＯ細胞に対する高親和性の突然変異の結合
ＣＤ８０＋およびＣＤ８６＋ＣＨＯ細胞を安定に形質転換するためのＣＴＬＡ４Ｉｇおよび突然変異分子の結合のＦＡＣＳ解析（図２７）は、本明細書に記載の通り実施した。ＣＤ８０陽性およびＣＤ８６陽性ＣＨＯ細胞は、ＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、またはＬ１０４ＥＩｇの増加する濃度でインキュベートし、次いで洗浄した。結合免疫グロブリン融合蛋白質は、フルオレセインイソチオシアネート共役ヤギ抗ヒト免疫グロブリンを用いて検出した。
図２７に示したとおり、ＣＤ８０陽性またはＣＤ８６陽性ＣＨＯ細胞（１．５×１０5）は、２３℃で２時間、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（■）、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（○）、またはＬ１０４ＥＩｇ（△）で示した濃度にてインキュベートし、洗浄して、フルオレセインイソチオシアネート共役ヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体でインキュベートした。合計５０００個の生存細胞の結合は、ＦＡＣＳキャン（FACScan）で解析（一回測定）して、平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ＰＣ−ＬＹＳＹＳを用いるデータヒストグラムから決定した。データは、二次試薬のみ（ＭＦＩ＝７）でインキュベートした細胞を測定したバックグラウンドの蛍光で補正した。コントロールのＬ６ ｍＡｂ（８０μｇ／ｍｌ）は、ＭＦＩ＜３０を与えた。これらの結果は、４つの独立した実験で表される。
ヒトＣＤ８０形質転換ＣＨＯ細胞へのＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、Ｌ１０４ＥＩｇ、およびＣＴＬＡ４Ｉｇの結合は、ほとんど同等である（図２７Ａ）。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＬ１０４ＥＩｇは、ＣＴＬＡ４ＩｇよりもヒトＣＤ８６を用いて、安定に形質転換するＣＨＯ細胞に強く結合する（図２７Ｂ）。
機能アッセイ
ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞を、免疫磁性陰性選択（リンスリーの文献：(1992) J. Exp. Med. 176:1595-1604）によって単離した。単離したＣＤ４陽性Ｔ細胞は、阻害剤の滴定濃度の存在下、ＣＤ８０陽性またはＣＤ８６陽性ＣＨＯ細胞を加えたホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）で刺激した。ＣＤ４陽性Ｔ細胞（８〜１０×１０4／ウェル）は、放射線照射したＣＨＯ細胞刺激剤の有無で、１ｎＭのＰＭＡの存在下にて培養した。増殖性応答は、７２時間培養の最後の７時間、１μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］チミジンの添加によって測定した。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＣＴＬＡ４Ｉｇによって、Ｔ細胞を刺激したＣＤ８０陽性ＣＨＯ、またはＣＤ８６陽性ＣＨＯを加えたＰＭＡの阻害を実施した。該結果は、図２８に示す。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（図２８Ａ）以上にＣＤ８０陽性ＰＭＡ処理したＣＨＯ細胞の増殖を阻害する。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、ＣＤ８６陽性ＰＭＡ処理したＣＨＯ細胞の増殖を阻害することにおいても、ＣＴＬＡ４Ｉｇより有効である（図２８Ｂ）。それ故、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、Ｔ細胞のＣＤ８０およびＣＤ８６介在性副刺激の両方の強力な阻害剤である。
図２９は、上で調製した同種刺激したヒトＴ細胞のＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＣＴＬＡ４Ｉｇによる阻害を示し、ＣＤ８０およびＣＤ８６（３．０×１０4／ウェルでのＴ細胞および８．０×１０3／ウェルでのＰＭ）を発現するＰＭと呼ばれるヒトＢリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）でさらに同種刺激した。一次的同種刺激は、６日間起こり、次いで、該細胞は、放射性ラベルの導入を決定する前に、３Ｈ−チミジンで７時間パルスした。
二次的な同種刺激を以下の通り実施した。７日の一次的な同種刺激したＴ細胞は、リンパ球分離媒体（ＬＳＭ）（ＩＣＮ社、アウロラ、ＯＨ）で回収し、２４時間静置した。Ｔ細胞は、次いで、滴定量のＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの存在下、上記の通り同じ比でＰＭを加えることにより再刺激（二回目）した。刺激は、３日間起こり、次いで、該細胞は、上記の通り放射性ラベルでパルスし回収した。一次的な同種刺激したＴ細胞でのＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの効果は、図２９Ａに示す。二次的同種刺激したＴ細胞でのＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの効果は、図２９Ｂに示す。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、ＣＴＬＡ４Ｉｇより良い一次的および二次的なＴ細胞増殖性応答の両方を阻害する。
サイトカイン産生（図３０）を測定するために、二重の二次的な同種刺激プレートを組み立てた。３日後、培養液を製造業者によって推奨される条件を用いるＥＬＩＳＡキット（バイオソース社、カマリロ、ＣＡ）を用いて、アッセイした。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、二次的な同種刺激に続くＴ細胞ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびγ−ＩＦＮ（ガンマ−ＩＦＮ）サイトカイン産生を遮断において、ＣＴＬＡ４Ｉｇよりも強力であることがわかった（図３０Ａ〜Ｃ）。
サルリンパ球応答（ＭＬＲ）に混合させたサルのＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＣＴＬＡ４Ｉｇの効果は、図３１に示す。２匹のサルからの末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ’Ｓ；各サルから３．５×１０4細胞／ウェル）は、リンパ球分離媒体（ＬＳＭ）によって精製し、２μｇ／ｍｌの植物性血球凝集素（ＰＨＡ）と混合した。該細胞を３日間刺激し、次いで、回収前の１６時間放射性ラベルでパルスした。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、ＣＴＬＡ４ＩｇよりよくサルＴ細胞増殖を阻害した。
平衡およびみかけの速度定数は、以下の表（値は、３つの異なった実験からの平均±標準偏差）に与える。
Figure 2007501243
 リストされた部位でのＣＴＬＡ４Ｉｇの突然変異誘発によって、結合するＣＤ８６Ｉｇの効果を上述のＳＰＲによって決定した。優れた効果は、「＋」印で示した。
Figure 2007501243
実施例３
下記は、膨張関節、圧痛関節、炎症、朝のこわばり、および痛みの減少を含む、関節リウマチに関連する少なくとも一つの症状を軽減するために、可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子であるＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩＧまたはＬＥＡとしても知られる）またはＣＴＬＡ４Ｉｇを投与したヒト患者のフェーズＩＩ臨床研究の記載を提供する。本明細書で使用したＣＴＬＡ４Ｉｇ分子は、＋１位のメチオニン（または別法として、−１位のアラニン）で始まり、図２４で示す通り＋３５７位のリジンで終わる。ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子の実施態様をコードするＤＮＡは、ＡＴＣＣ６８６２９として寄託した。本明細書で使用されたＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ分子は、＋１位のメチオニン（または別法として、−１位のアラニン）で始まり、図１９で示す通り＋３５７位のリジンで終わる。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ分子の実施態様をコードするＤＮＡは、ＡＴＣＣ ＰＴＡ２１０４として寄託された。
さらに、下記は、赤血球沈降速度、およびＣ反応性蛋白質および／またはＩＬ２レセプターの血清レベルの減少を含む、関節リウマチに関連する少なくとも一つの生物的代理マーカーを軽減するためにＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇまたはＣＴＬＡ４Ｉｇを投与したヒト患者の記載を提供する。
患者コホート
５４人の男性および１６０人の女性を含む、合計２１４人の患者が、研究に参加した（図１Ａ、１Ｂ）。基準の患者は、平均して、３．４（±２．０）年の疾患期間であって、少なくとも一つの疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）で失敗していた。安定な非ステロイド性抗炎症性薬（ＮＳＡＩＤ）またはステロイド（≦１０ｍｇ／日）は、許容され、併用のＤＭＡＲＤを禁止した。該患者は、治療群あたり２５〜３２人の患者のグループに任意抽出した。３２人の患者は、プラセボを受け、９２人は、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇを受けて、９０人は、ＣＴＬＡ４Ｉｇを受けた。プロトコル指針に従い、５７日より前に中止しなかった患者は、１、１５、２９、および５７日のそれぞれ１回注入し、合計４回の静脈内注入を受けた。すべての患者は、１、１５、２９、４３、５７、７１、および８５日に評価した。投与された投与量は、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図１Ａ−１Ｅ中のそれぞれＬＥＡ．５、ＬＥＡ２およびＬＥＡ１０を意味する）またはＣＴＬＡ４Ｉｇ（図１Ａ−１ＥのそれぞれＣＴＬＡ．５、ＣＴＬＡ２およびＣＴＬＡ１０を意味する）の０．５、２．０、または１０．０ｍｇ／ｋｇを含んだ。
すべての患者は、可能な有害反応を聴くアンケートに答えることによって、周囲注入の有害反応および広範囲の安全性をモニタした。患者は、注入後２４時間以内に起こりうる、可能な有害反応について質問した。さらに、患者は、彼らが経験する有害反応のいずれかを自発的に報告するように努めた。医師は、例えば、サイトカイン（ＴＮＦ、ＩＬ−６）、トリプターゼおよび補体のような炎症応答メディエーターのレベル等を評価する血液化学および血液学の異常による患者からの検査サンプルを定期的にモニターした。主要評価項目は、８５日でのＡＣＲ２０基準での患者との打ち合わせの一部であった。
試験材料の保存
ＣＴＬＡ４ＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、２００ｍｇ／バイアルのＣＴＬＡ４Ｉｇまたは１００ｍｇ／バイアルのＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇをそれぞれ含む単回使用のガラスバイアルで提供した。注入より前に、ＣＴＬＡ４ＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、注射用（ＳＷＦＩ）の滅菌水で最終濃度２５ｍｇ／ｍｌまで希釈した。
投与プロトコル
すべての注入は、１時間以上かけて静脈内に投与した（図１〜１７）。すべての患者は、研究の薬物投与のうち、少なくとも一つの注入を受けた。
群１：３２人の患者、ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇに適合しているプラセボ
群２：２６人の患者；０．５ｍｇ／ｋｇ投与量のＣＴＬＡ４Ｉｇ
群３：３２人の患者；２．０ｍｇ／ｋｇ投与量のＣＴＬＡ４Ｉｇ
群４：３２人の患者；１０．０ｍｇ／ｋｇ投与量のＣＴＬＡ４Ｉｇ
群５：３２人の患者；０．５ｍｇ／ｋｇ投与量のＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ
群６：２９人の患者；２．０ｍｇ／ｋｇ投与量のＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ
群７：３１人の患者；１０．０ｍｇ／ｋｇ投与量のＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ
臨床モニタリング
患者をいずれかの注入を受ける前に疾患活動性の基準の症状を評価した。これらの基準の評価は、膨張関節、圧痛関節、炎症、朝のこわばり、患者および医師ならびに健康アンケート評価（ＨＡＱ）によって評価される身体障害（図１Ｃ内の身体的機能のスコアとして報告される）によって評価される疾患活動性、および痛みを含む（図１Ａ〜１Ｄ）。さらに、基準評価は、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）および可溶性ＩＬ−２レセプター（ＩＬ−２ｒ）の赤血球沈降速度（ＥＳＲ）、および血清レベルを含んだ（図１Ｃおよび１Ｄ）。
臨床応答研究は、米国リウマチ学会（ＡＣＲ）で評価される基準に基づいた。圧痛および膨張関節数において、２０％の改善があり、患者および医師の広範囲の疾患の変化、痛み、身体障害、および急性期反応物質（フェルソンの文献：1993 Arthritis and Rheumatism 36:729-740；フェルソンの文献：1995 Arthritis and Rheumatism 38:1-9）のような測定される残存症状の５分の３において、２０％の改善があるなら、患者はＡＣＲ２０基準を満たした。同様に、圧痛および膨張関節数のそれぞれに５０または７０％の改善があり、患者および医師の広範囲の疾患の変化、痛み、身体障害、および例えば、ＣＲＰまたはＥＳＲのような急性期反応物質等の測定した残存症状の５分の３において、それぞれ５０または７０％の改善があるなら、患者は、ＡＣＲ５０またはＡＣＲ７０基準を満たした。
バイオマーカー
疾患活動性の可能なバイオマーカー（リウマチ因子、ＣＲＰ、ＥＳＲ、可溶性ＩＬ−２Ｒ、可溶性ＩＣＡＭ−１、可溶性Ｅ−セレクチン、およびＭＭＰ−３）も評価した。酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）で立証した方法は、ＩＬ−２ｓＲα、ｓＩＣＡＭ−１、ｓＥ−セレクチンおよびＭＭＰ−３の血清濃度を決定するために使用した。必要なら、ＴＮＦαおよびＩＬ−６は、注入の前および２時間後で評価した。
ＩＬ−２ｓＲα、ｓＩＣＡＭ−１、およびｓＥ−セレクチンは、Ｒ＆Ｄシステムズ社（ミネアポリス、ＭＮ）から市販品として入手可能な比色ＥＩＡキットを用いて測定した。定量の上限および下限は、それぞれ３１２〜２００００ｐｇ／ｍＬ、４０〜９０７ｎｇ／ｍＬおよび１０〜２０６ｎｇ／ｍＬであった。アッセイ間の変動係数の範囲は、それぞれ４．４８〜８．４％、３．８〜５．０％および５．５〜９．０％であった。キット製造業者によれば、通常の血清値は、それぞれ６７６〜２１３２ｐｇ／ｍＬの範囲であった。
ＭＭＰ−３は、アメルシャムファルマシアバイオテック社（ピスカタウェイ、ＮＪ）からの市販品として入手可能な比色ＥＩＡキットを用いて測定した。定量の下限および上限は、３０〜７６８０ｎｇ／ｍＬであった。アッセイ間の変動係数は、６．３〜１０．６％の範囲であった。キット製造業者によれば、通常の血清値は、２８〜９９ｎｇ／ｍＬの範囲であった。
ＩＬ−６およびＴＮＦαは、Ｒ＆Ｄシステムズ社（ミネアポリス、ＭＮ）からの市販品として入手可能な化学発光ＥＩＡキットを用いて測定した。定量の下限および上限は、それぞれ０．３〜３０００ｐｇ／ｍＬおよび０．７〜７０００ｐｇ／ｍＬであった。アッセイ間の変動係数は、それぞれ３．１〜５．７％および６．４〜２０．７％の範囲であった。キット製造業者によれば、通常の血清値は、＜０．３〜１２ｐｇ／ｍＬおよび＜０．７〜７．５ｐｇ／ｍＬの範囲であった。
抗体試験
血清サンプルは、１日目の投与前、およびおよそ１５、２９、５７、８５および１６９日に薬物特異的抗体の評価を得た。分子の免疫グロブリン（Ｉｇ）部分を対象とする既存の滴定濃度が高いために、Ｉｇ定常領域の無いＣＴＬＡ４ＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩＧに対する特異的な抗体形成も評価した。
９６ウェルのイムロンＩＩ ＥＬＩＳＡプレート（ダイネックス社、チャンティリー、ヴァージニア州）は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、それぞれ２、４、２、または１μｇ／ｍｌのＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｉｇ定常領域を含まないＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩＧ、またはＩｇ定常領域を含まないＬ１０４ＥＡ２９ＹＩＧでコーティングし、２〜８℃で終夜インキュベートした。該プレートは、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄し、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳで、３７℃にて１時間遮断した。次いで、該プレートを洗浄し、試験血清または品質管理（ＱＣ）血清の連続希釈法を適当なウェルに加え、３７℃で２時間インキュベートした。血清は、１：１０の希釈比で開始する０．２５％のＢＳＡを含むＰＢＳおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で３倍に希釈した。プレートを洗浄し、アルカリ性リン酸共役ヤギ抗ヒトκおよびλ（サザンバイオテクノロジーアソシエイツ社、バーミンガム、アラバマ州）抗体カクテルを加えた。３７℃で１時間インキュベーションに続いて、該プレートを洗浄し、ジエタノールアミン緩衝液中、１ｍｇ／ｍｌのパラ−ニトロフェニルリン酸を各ウェルに加えた。２５℃で３０分後、該反応を３ＮのＮａＯＨで停止し、吸収（二波長：４０５ｎｍおよび５５０ｎｍ）を記録した。結果は、終点滴定濃度（ＥＰＴ）で表し、平均のプレートバックグラウンド吸収より５倍大きいか、等しい吸収測定値を生じる高希釈溶液の逆数と定義した。プレートのバックグラウンドは、血清非存在下で、記録された吸収測定値として定量した。もし、それらが少なくとも二つの連続希釈法（９倍）または前投与のＥＰＴ値と比較して大きいなら、値は、セロコンバージョンに対して正であるとみなした。ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩＧのどちらかに特異的な抗体に対して、陽性である血清ＱＣサンプルは、免疫化されたサルから生じた。適当なＱＣサンプルのアリコートは、各解析中ずっとアッセイした。解析の実施は、ＱＣサンプルがアッセイ許容基準内にあるときのみ許容された。
結果
ＣＴＬＡ４ＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、すべての投与量レベルで、おおむね血行動態が安定していた。注入周囲の有害反応は、頭痛を除く、すべての投与量群を通して同様であった。８５日での患者の頭痛応答は、０．５、２．０、および１０．０ｍｇ／ｋｇで、それぞれＣＴＬＡ４Ｉｇ処置した患者の２３％、４４％、および５３％、ならびにＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ処置した患者の３４％、４５％、および６１％の投与依存性が増加した。対照的に、プラセボを投与した患者の３１％は、頭痛を経験した。
関節性紅斑および他の有害反応のために臨床研究を中止した患者のパーセントを図２にまとめた。プラセボにおける患者のかなり高いパーセントは、関節性紅斑のために治療を中止した。該ＣＴＬＡ４Ｉｇ処置した患者は、増加する投与量より低い投与量で治療を中止した。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇで処置した患者は、ほとんど治療を中止しなかった。これらの結果は、ＣＴＬＡ４Ｉｇに対するかなり反対の投与依存性応答、およびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ治療でのより強い治療応答を示す。
８５日でのＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、またはプラセボで処置した患者のＡＣＲ−２０、５０、および７０応答を図３Ａにまとめた。同様に、図３ＢおよびＣは、９５％信頼限界でのＡＣＲ−２０応答を記載する。該応答は、患者の体重あたり１０ｍｇ／ｋｇで、明らかに重要な応答を持つ投与依存性であることがわかる。
ＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、またはプラセボでの治療に対して、応答を示さない患者と膨張および圧痛関節数が減少してきた患者を比較したパーセントを図４ＡおよびＢに示す。該治療応答は、明らかに投与依存性である。患者のより多くの割合は、両方の生成物について、２および１０ｍｇ／ｋｇの群で２０、５０、７０、およびさらに１００％の改善を示す。
ＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、またはプラセボでの平均スコア群を患者および医師によって評価した痛みを軽減してきた患者、疾患活動性のパーセントを図５Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに示す。ライカートスケールによってモニターするとき、治療応答は、８５日でのプラセボと比較するとき、活性のある治療群を支持して投与依存性であることが明らかである。該ライカートスケールは、症状（関節リウマチの臨床試験のための疾患活動性の測定の米国リウマチ学会機関誌コアセット：Arthritis and Rheumatism, June 1993, 36(6):729-740）のランクに対する形容詞を用いて確認された口頭式評価スケールである。
ＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、またはプラセボでの処置から生じる少なくとも２ユニットによる基準からの疾患活動性変化の患者および医師の評価を図６ＡおよびＢで示す。応答は、活性薬物のより高い投与量に対する著しい改善を有する明らかに投与依存性である。
ＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、またはプラセボで処置された患者のＣ反応性蛋白質（ＣＲＰ）レベルのパーセントの減少を図７ＡおよびＢに示す。該応答は、２および１０ｍｇ／ｋｇで活性な治療群に対して、明らかな減少を伴う投与依存性であることが明らかである。さらに、図７Ｂは、９５％信頼区間でプラセボと比較する差がかなり重要であることを示した。図７Ｃは、８５日での基準からの血清レベル変化での変化を示す。
ＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、またはプラセボで処置した患者の血清の可溶性ＩＬ−２レセプターの量は、図８に示す。可溶性ＩＬ−２レセプターレベルの減少は、投与依存性であることが明らかである。
ＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、またはプラセボで処置した患者の血清の可溶性ＩＣＡＭ−１および可溶性Ｅ−セレクチンの量を図３３に示す。可溶性のＩＣＡＭ−１および可溶性のＥ−セレクチンレベルの減少は、投与依存性であることが明らかである。
経時的なＣＴＬＡ４Ｉｇまたはプラセボで処置した患者の圧痛関節数の中央値および平均値を図９ＡおよびＢに示す。基準からの変化（例えば、圧痛関節の減少）は、プラセボまたは０．５ｍｇ／ｋｇ群より、２および１０ｍｇ／ｋｇで処置した群において、重要であることが明らかである。
経時的なＣＴＬＡ４Ｉｇまたはプラセボで処置した患者の膨張関節数の中央値および平均値を図１０ＡおよびＢに示す。基準からの変化（例えば、膨張関節の減少）は、プラセボまたは０．５ｍｇ／ｋｇ群より２および１０ｍｇ／ｋｇで処置した群の方が重要であることが明らかである。
ＣＴＬＡ４Ｉｇまたはプラセボで処置した患者の経時的な痛みの評価スコアの平均値を図１１に示す。基準からの変化（例えば、痛みの減少）は、プラセボまたは０．５ｍｇ／ｋｇの群より２および１０ｍｇ／ｋｇで処置した群の方が重要であることが明らかである。
ＣＴＬＡ４Ｉｇまたはプラセボで処置した患者において、経時的に患者または医師によって評価された疾患活動性の評価スコアの平均値を図１２ＡおよびＢに示す。基準からの変化（例えば、疾患活動性の減少）は、プラセボまたは０．５ｍｇ／ｋｇ群より２および１０ｍｇ／ｋｇで処置した群の方がより重要であることが明らかである。
Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図中のＬＥＡを意味する）またはプラセボで処置した患者の圧痛関節数の中央値および平均値を図１３ＡおよびＢに経時的に示す。基準からの変化（例えば、圧痛関節の減少）は、投与依存性であることが明らかである。
Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図中のＬＥＡを意味する）またはプラセボで処置した患者の膨張関節数の中央値および平均値を経時的に図１４ＡおよびＢに示す。基準からの変化（例えば、膨張関節の減少）は、プラセボまたは０．５ｍｇ／ｋｇ群より２および１０ｍｇ／ｋｇで処置した群の方が重要であることが明らかである。
Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図中のＬＥＡを意味する）またはプラセボで処置した患者の痛みの評価スコアの平均値を経時的に図１５に示す。基準からの変化（例えば、痛みの減少）は、投与依存性であることが明らかである。
Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図中のＬＥＡを意味する）またはプラセボで処置した患者において、患者または医師によって評価された疾患活動性の評価スコアの平均値を経時的に図１６ＡおよびＢに示す。基準からの変化（例えば、疾患活動性の減少）は、投与依存性であることが明らかである。
ＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、またはプラセボで処置した患者において、８５日でのＨＡＱによって評価された身体障害の割合の改善を図１７（健康評価アンケート（ＨＡＱ）；フリースの文献：1982 J. of Rheumatology 9:789-793）に示す。このパラメーターによって、明らかに投与依存性の改善がある。
可溶性ＩＬ−２ｒおよびＣ反応性蛋白質レベルのための基準からの変化は、両方の治療群において、投与依存性であった。治療後、可溶性ＩＬ−２ｒレベルは、プラセボの＋３％と比較すると、０．５、２．０、および１０．０ｍｇ／ｋｇにおいて、それぞれＣＴＬＡ４Ｉｇでは、−２％、−１０％、および−２２％であり、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇでは−４％、−１８％、および−３２％であった。Ｃ反応性蛋白質レベルは、プラセボに対して＋２０％を比較すると、０．５、２．０、および１０．０ｍｇ／ｋｇにおいて、それぞれＣＴＬＡ４Ｉｇに対して、＋１２％、−１５％、および−３２％であり、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇに対して、＋４７％、−３３％、および−４７％であった（図７Ａ）。
定期的な血液検査、高用量での両方の薬剤でＩｇＡおよびＩｇＧレベルの僅かな抑制を除いて試験する化学的検査、身体所見、または生命徴候の評価に関する臨床的に顕著な結果は、全く観察されなかった。特に、薬物治療は、薬剤特異的な抗体を誘導しなかった。
実施例４
以下の実施例は、確認されたＸ線撮影スケールを用いる骨または関節の浸食を含む、構造損傷の減少または予防するために、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇを投与するヒト患者のフェーズＩＩ臨床研究を記載する。構造損傷の減少または予防の改善は、臨床パラメーターによって測定された臨床的改善に沿っている。
骨構造の状態は、ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの治療の前にヒト患者の何人かにおいて、モニターされる。これらの患者は、それらの長期にわたる治療改善を維持するため、慢性的に２〜１２週間ごと（単独または他の薬剤と併用）に０．５〜２０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇを投与した。患者の手および足のＸ線写真は、ＦＤＡガイドラインによって推奨されるとおり、所定の間隔である６ヶ月次いで毎年撮影された。ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの治療が、骨の老化の進行を減少するなら、これらの患者は、測定するために６および１２ヶ月後の長期間、次いで、毎年モニターする。該患者は、当該技術分野における標準的な技術（ラーセンの文献：1977 Acta. Radiol. Diag. 18:481-491；シャープの文献：1985 Arthritis and Rheumatism 28:1326-1335）による、Ｘ線および／または磁気共鳴画像（ＭＲＩ）を含むＸ線撮影法によってモニターする。Ｘ線撮影データの結果は、関節空間の狭窄を伴う骨の老化および軟骨損傷の遅延および／または新規な老化の予防を含む、構造損傷の予防のために評価した。
実施例５
メトトレキサートを受けながら、活動性の関節リウマチの患者の静脈内に投与するＣＴＬＡ４Ｉｇの二つの異なる投与量での安全性および臨床有効性を評価するための研究
関節リウマチ（ＲＡ）治療は、有効性およびより高い成功率のより大きな上昇を達成するため、挑戦的な治療を使用するためにさらなる意欲を持って、急激に変化している。最終的なゴールは、治療および許容される安全性を持つ有利さを維持するために、主要で完全な臨床応答の速度を上げることによって、より集中的な方法で患者の症状を改善することである。
メトトレキサートは、ＲＡ治療に依然として不可欠である。ＲＡを治療するために用いる古典的なＤＭＡＲＤ（例えば、金、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン）と比較すると作用初期の開始、優れた有効性および耐用性が実証された最初の薬剤であった。臨床的な利点は、早ければ治療開始から３週間後に見られ、最大限の改善は、一般的に６ヶ月までに達成される。しかしながら、メトトレキサートは、多くの制限がある。例えば、その増加する耐用性に関わらず、有効性および肝毒性の範囲がかなり狭い。メトトレキサートで処置される患者は、注意深いモニタリングが必要であって、許容されない毒性がしばしば治療の中止の理由となる。
メトトレキサートは、疾患の進行または関節の老化を有効にコントロールすることも明らかではない。ある患者において、医師は、増加する毒性リスクにもかかわらず、有効性が上昇する願いを持ち、２回目のＤＭＡＲＤを加えることを強いるように感じる。別法として、サイトカイン炎症カスケードの上流にある自己免疫機構を標的とするメトトレキサートおよび共刺激遮断薬（例えば、ＣＴＬＡ４ＩｇのようなＣＤ８０およびＣＤ８６遮断薬）を用いる共治療も、有効性を上昇しうる。
上記の実施例３に記載するとおり、疾患活動性の代用マーカーにおいて、重要な臨床応答および減退は、良い耐用性プロファイルを持つ２および１０ｍｇ／ｋｇの投与量で、ＣＴＬＡ４Ｉｇにおいて観察された。上記の実施例３で用いたＣＴＬＡ４Ｉｇの組成物は、全く副作用を誘導しない事も確認した。結果として、フェーズＩＩＢで、関節リウマチのためのＣＴＬＡ４Ｉｇの臨床開発を継続することを決定した。
下記は、メトトレキサートで可溶性のＣＴＬＡ４分子を投与する、ヒト患者のフェーズＩＩＢ臨床研究の説明および６ヶ月後の研究結果を提供した。
この実施例は、主要な有効性が６ヶ月の治療を完了後、または治療を中止したすべての患者を評価した１２ヶ月の研究を記載する。有効性、安全性、および疾患の進行も、研究の継続時間を通して評価した。
該研究は、任意抽出、二重盲検法、プラセボコントロール、パラレル投与量デザインを用いた。該研究は、ＣＴＬＡ４Ｉｇの二つの投与量：２または１０ｍｇ／ｋｇの安全性、臨床活動性、免疫原生および薬物動態を評価するために設計した。活動性のＲＡを持ち、メトトレキサートを受ける合計約３３０人の患者の３人に１人を任意抽出して、投薬治療群：２ｍｇ／ｋｇ（Ｎ＝１１０）、１０ｍｇ／ｋｇ（Ｎ＝１１０）のＣＴＬＡ４Ｉｇおよびプラセボコントロール群（Ｎ＝１１０）に、１２ヶ月間、１月に１回の注入を行った。すべての群は、毎週、メトトレキサートの治療（毎週１０〜３０ｍｇ）（図５７〜６２）を継続した。
ＣＴＬＡ４Ｉｇまたはプラセボは、１５日目も投与した。研究での薬物投与の各投与量を約３０分以上かけて静脈内に投与した。主要な有効性の終点は、６ヶ月後のＡＣＲ２０の応答率であった。
最初の６ヶ月間、患者は、コルチコステロイド、グルココルチコイドまたはＮＳＡＩＤのそれらの投与量を変更することはしなかった。メトトレキサートの増加も、最初の６ヶ月間は認めなかった。メトトレキサートの減少は、毒性を引き起こすことが考えられたときのみ認めた。患者は、少なくとも６ヶ月間、およびＣＴＬＡ４Ｉｇまたはプラセボの最初の治療前の２８日間は、不変の投与量でメトトレキサートを処置した。メトトレキサート以外のＤＭＡＲＤは、認めなかった。低投与量の安定なコルチコステロイドの使用（毎日１０ｍｇまたはそれ以下で）および／またはアセチルサリチル酸（ＡＳＡ）を含む安定な非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の使用を許容した。ＡＳＡまたはＮＳＡＩＤを含まない鎮痛薬は、基準および研究の投薬によって、正確にコントロールできない痛みを経験する患者には、関節を評価する前の１２時間を除いて認めた。ＮＳＡＩＤの減少は、消化管毒性のような有害反応のためにのみ認めた。
治療の試験生成物、投与量および投与様式、持続時間
２ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇでのＣＴＬＡ４Ｉｇを、最初の１ヶ月間は２週間ごとに、その後１２ヶ月間は１月に１度注入した。すべての患者は、任意抽出の前の少なくとも６ヶ月間、毎週メトトレキサート（１０〜３０ｍｇ）の投与を受け、試験の最初の６ヶ月間は登録投与量で維持した。投与量は、最初の６ヶ月間、毒性のためにのみ減らすことがあり得る。
評価のための基準
研究の最初の段階での主要評価項目は、１８０日（６ヶ月）での２０％改善（ＡＣＲ２０）における米国リウマチ学会の基準を満たす患者の比率であった。改善のＡＣＲ２０の定義は、圧痛および膨張関節数、および以下の５個のコアセットの測定：痛みについて患者の包括的な評価、疾患活動性について患者の包括的な評価、疾患活動性について医師の包括的な評価、身体機能について患者の評価および急性期反応物質値（Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ））のうち３個において、基準から２０％改善することである。５０％改善（ＡＣＲ５０）および７０％改善（ＡＣＲ７０）に対する評価は、以下同様である。有効性（すなわち、ＲＡの悪化）の欠如のために研究を中止した患者は、その時点から、ＡＣＲ非回答者としてみなした。他の理由で脱落したすべての患者について、中止した時点でのＡＣＲの回答は、繰り越した。
統計的方法
ＣＴＬＡ４Ｉｇ（２ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）の二つの投与量をプラセボコントロール群と比較した。すべての患者は、メトトレキサートと同一の不変の接種量で維持した。主要な解析は、プラセボとＣＴＬＡ４Ｉｇの１０ｍｇ／ｋｇの比較であった。サンプルサイズは、有意性の５％レベル（両側）に基づいた。発表された研究に基づいて、６ヶ月でのプラセボにメトトレキサートを加えたコントロールのＡＣＲ２０応答速度は、約２５％であった。治療群あたり１０７人の患者（見込まれる１５％の脱落を調整した）のサンプルは、５％レベル（両側）で、２５％の差を検出する９４％検出力を得るために測定した。同様に、該サンプルは、ＡＣＲ５０およびＡＣＲ７０において、それぞれ２０％および１４％の差を検出するために、９５％および９０％検出力を得るために測定した。１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇおよびプラセボとの比較が、ＡＣＲ２０に関して重要であるなら、ＣＴＬＡ４Ｉｇの２ｍｇ／ｋｇおよびプラセボの比較を実施した。この２番目の試験は、８８％検出力であった。カイ二乗検定に基づいたこの連続した拒否的な手順は、ＡＣＲ５０およびＡＣＲ７０応答における差を試験するためにも使用した。
すべての有効な解析は、研究の薬物投与のうち、少なくとも一つの投与量を受けたすべての患者から入手可能な評価を含むデータ集に基づいた。基準からのパーセントの変化は、ＡＣＲの個別の要素に対しても報告した。中止した患者の最後の観察は、繰り越した。
結果
人口統計および基準特性
Figure 2007501243
 人口統計および基準の臨床的特徴は、治療群との間で同様であった。患者の６３〜７５％は女性であり、８７％が白人であった。参加者の疾患の平均継続時間は、１０、２ｍｇ／ｋｇおよびコントロール群において、それぞれ９．７±９．８、９．７±８．１、および８．９±８．３年であった。ｋｇでの平均重量は、４０．１〜１８６．８ｋｇの範囲で、７７．８および７９．９ｋｇとかなり似ていた（表ＩＩＩ）。
６ヶ月後、活性な治療群；１０および２ｍｇ／ｋｇで処置した群のそれぞれ１３．９％および２１．９％よりもコントロール群（３５．５％）の方が中止した患者が多かった。主な理由は、有効性の不足：２および１０ｍｇ／ｋｇの群において、それぞれ１２．４％および１０．４％が中止したのに対して、コントロール群で２４．３％が中止した。有害反応のための中止率は、２ｍｇ／ｋｇおよびコントロール群はそれぞれ６．７％および５．９％であるが、１０ｍｇ／ｋｇ群では、１．７％と低かった。
最初の３〜４ヶ月間、中止は、活性な治療群と比較したコントロール群において、より早い速度で現れた。１２０日後、すべての治療群の中止は、最初の治療期間（６ヶ月）の持続時間を安定化した。
Figure 2007501243
 基準において、平均圧痛および膨張関節数は、３つ治療群の中で比較した。１０ｍｇ群において、圧痛関節および膨張関節数の平均は、それぞれ３０．８±１２．２および２１．３±８．４であった。２ｍｇ群において、圧痛関節および膨張関節数の平均は、それぞれ２８．２±１２．０、および２０．２±８．９であった。コントロール群において、圧痛関節および膨張関節数の平均は、それぞれ２９．２±１３．０、および２１．８±８．８であった。これらの評価およびすべての他の臨床評価は、すべての治療群（表ＩＶ）の中で同様であった。
ＡＣＲ応答およびコア構成要素
Figure 2007501243
 メトトレキサートコントロール群に対して、６ヶ月での１０ｍｇ／ｋｇの治療群において、ＡＣＲ２０、５０、および７０の応答率の改善は、統計的に重要であった（図３４〜３８、４０）。２ｍｇ／ｋｇの群において、ＡＣＲ５０およびＡＣＲ７０の改善も、統計的に重要であった。２ｍｇ／ｋｇ群およびコントロール群とＡＣＲ２０の応答の差は、６．６％であった。この差は、ｐ＝０．３１で、統計的には重要ではなかった（表５、図４９）。
図３４〜３７は、１日〜１８０日でのＡＣＲ応答率を示す。図３８および４０は、種々の治療群において、１８０日でのＡＣＲ２０、５０および７０の応答率を示す。ＡＣＲ５０およびＡＣＲ７０の応答率は、最大の有効性が１０ｍｇ／ｋｇで達成されなかった可能性を示唆した。
図３９は、メトトレキサート単独またはＣＴＬＡ４Ｉｇ（２または１０ｍｇ／ｋｇ患者の体重で投与した）の併用治療後、研究１８０日での新しい圧痛および膨張関節の比率を示す。
図４６は、ＨＡＱによって測定された基準からの身体機能の改善の平均パーセントを示す。
Figure 2007501243
 ２および１０ｍｇ／ｋｇの投与量群は、唯一の例外である２ｍｇ／ｋｇ投与量群の患者の包括的な評価を除いて、ＡＣＲ応答基準（表６；図４１〜４５、４７〜４８）の臨床的要素のすべてにおける有効度を示した。圧痛および膨張関節の減少は、投与依存性であることが明らかである。圧痛関節数は、１０ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇおよびコントロール群において、５９．９％、４３．３％および３２．１％まで減少した。同様のパターンは、１０ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇおよびコントロール群において、それぞれ５４．９％、４５．１％および３３．４％の減少を伴う膨張関節数を観察した。コントロール群に対して最も大きな違いは、コントロール群の８．４％と比較して、１０ｍｇおよび２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇの基準に対して、それぞれ４６．４％および２２．７％減少した痛みの評価を観察した。平均のＣＲＰは、コントロール群の２３．６％の増加と比較して、１０および２ｍｇ／ｋｇ群の基準に対して、３１．５％および１６．２％減少した。
健康関連ＱＯＬ
健康関連ＱＯＬ（ＨＲＱＯＬ）において、ＣＴＬＡ４Ｉｇの効果を医学アウトカム研究ショートフォーム−３６（ＳＦ−３６）によって測定した。ＳＦ−３６は、９０および１８０日での基準において、すべての患者に投与した。該ＳＦ−３６は、８個の領域（身体機能、身体の役割、身体の痛み、一般健康、活力、社会機能、感情の役割、および心の健康）に及ぶ３６個の項目からなる。これらの個別の領域は、身体および心の要素の概要を０〜１００の範囲のスコアに誘導するために使用され、より高いスコアがより良い生活の質を示す。ＳＦ−３６のスコアにおいて、５またはそれ以上の絶対的な差は、臨床的に意義があるとみなした。
プラセボで処置した患者と比較すると、ＣＴＬＡ４Ｉｇの１０ｍｇ／ｋｇ群の患者は、ＳＦ−３６のすべて８個の領域において、統計的に重要なより大きな改善も経験した（図５０〜５１）。ＣＴＬＡ４Ｉｇの２ｍｇ／ｋｇで処置した患者において、改善は、プラセボで処置したヒトよりも大きかったが、有意差は、統計的にあまりなかった（図５０〜５１）。
基準のＳＦ−３６のスコアは、３つの治療群で比較した。生活の質において、改善は、治療６ヶ月後に明らかな投与依存傾向を示す。ＣＴＬＡ４Ｉｇの１０ｍｇ／ｋｇの治療群の患者は、ＳＦ−３６のすべて８個の領域において、臨床的および統計的に重要な改善を示した。最大の効果は、身体の役割、身体の痛み、および感情の役割の領域に示された。この陽性結果は、有効性の結果と一致した。ＣＴＬＡ４Ｉｇの２ｍｇ／ｋｇで処置した患者において、基準からの改善は、メンタルヘルスを除く、すべてのドメインに対して、統計的にも重要であった。
薬物動態
Figure 2007501243
 ＣＴＬＡ４Ｉｇの薬物動態は、６０および９０日までの投与日の時間データに対する血清濃度に由来した。サンプルは、６０日の投与前、６７、７４、８１日の投与後、０．５および４時間、および９０日の投与前に採取した。予備データは、ＣｍａｘおよびＡＵＣ値の両方が投与量の増分に相当する割合が上昇することを示す。１：５の比で上昇するごく僅かの投与量において、ＣｍａｘおよびＡＵＣ値の両方が、それぞれ１：５．０４および１：４．９２の比で増加した。Ｔ−ＨＡＬＦ、ＣＬＴ、およびＶｓｓ値は、同等であり、投与依存性であることが明らかである。
平均Ｖｓｓ値は、両方の投与量レベルで、０．０７Ｌ／ｋｇであって、血漿量のおよそ１．６倍であった。
薬力学
Figure 2007501243
 薬力学バイオマーカーの血清レベルは、研究期間中、いろいろな時に解析した。基準値は、表８に示す。基準に対する１８０日の値は、図５２〜５６に示す。
ＣＲＰレベルは、コントロール群以上にＣＴＬＡ４Ｉｇで処置した群の両方において、１０ｍｇ／ｋｇの投与量群（参照、図４７、４８および５２）で観察された減少よりも大きく、基準から減少した。
リウマチ因子レベルは、コントロール群以上にＣＴＬＡ４Ｉｇで処置した群の両方において、１０ｍｇ／ｋｇの投与量群（参照、図５３）で観察された減少よりも大きく、基準から減少した。
可溶性のＩＬ−２ｒレベルは、コントロール群以上にＣＴＬＡ４Ｉｇで処置した群の両方において、１０ｍｇ／ｋｇの投与量群（参照、図５４）で観察された減少よりも大きく、基準から減少した。
血清ＩＬ−６レベルは、コントロール群（参照、図５５）以上にＣＴＬＡ４Ｉｇで処置した群の両方より減少した。
血清ＴＮＦαレベルでのＣＴＬＡ４Ｉｇの効果は、決定的ではなかった。コントロール群（参照、図５６）に対して、２ｍｇ／ｋｇ群は上昇し、１０ｍｇ／ｋｇ群は減少した。
安全性
ＣＴＬＡ４Ｉｇは、すべての投与量で充分耐容性を示した。ＣＴＬＡ４Ｉｇを受けた患者のいずれかにおいて、死亡、悪性または日和見感染は全くなかった。重度の有害反応（ＳＡＥ）および重度でない有害反応（ＮＳＡＥ）は、コントロール群と比較する活性な治療群において、同様または頻度が低かった。
１０ｍｇ／ｋｇ群において、コントロール群に比べて有害反応のために中止した患者は、ほとんどいなかった（それぞれ、１．７％：５．９％）。２ｍｇ／ｋｇにおいて、有害反応のための中止は、コントロール群と同様であった（それぞれ、６．７％：５．９％）。ＳＡＥｓは、有害反応のための中止と同様の形式となった。
１０ｍｇ／ｋｇの投与量群において、該研究医薬品と関係すると考えられる重度の有害反応はなかった。
免疫原生
抗薬剤の抗体応答は、ＣＴＬＡ４Ｉｇの両方の投与量レベルで、１８０日を通して、検出されなかった。
ＣＴＬＡ４Ｉｇは、ＡＣＲ応答基準によって評価されるとき、メトトレキサートを受ける患者で、関節リウマチの徴候および症状を充分減少した。ＣＴＬＡ４Ｉｇの効果は、投与量レベルに比例して上昇することがわかる。すべてのＡＣＲコア要素において、基準からの改善は、２ｍｇ／ｋｇ群より１０ｍｇ／ｋｇ群の方が高い。１０ｍｇ／ｋｇの投与量のＣＴＬＡ４Ｉｇは、ＳＦ−３６のすべて８個の領域で、臨床的および統計的に十分改善していることを示した。評価したすべての薬物動態バイオマーカーは、ＴＮＦαを除いて、ＣＴＬＡ４Ｉｇの投与量レベルと比例して減少していることがわかった。ＣＴＬＡ４Ｉｇは、メトトレキサートを受けている関節リウマチ患者に安全で充分耐容性があった。両方のＣＴＬＡ４Ｉｇ投与量における有害反応プロファイルは、コントロール群と同様であった。
実施例６
ＣＴＬＡ４Ｉｇを活動性のある関節リウマチ患者にエタネルセプトと組み合わせて、毎月与える共刺激遮断薬の研究
以下の実施例は、活動性のある関節リウマチ患者を治療するためにエタネルセプトと組み合わせるＣＴＬＡ４Ｉｇ投与の説明を与える。
インフリキシマブと共に用いるエタネルセプトは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を標的とする関節リウマチ薬の新世代を含む。エタネルセプトは、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ１）のＦｃ部分に結合するＴＮＦレセプターの細胞外部分を有する二量化融合蛋白質である。ＴＮＦと結合するこの融合蛋白質は、細胞表面ＴＮＦレセプターとのその相互作用を遮断し、生物学的に不活性なＴＮＦ分子にさせる。
この実施例は、６ヶ月の治療を完了したか、または治療を中止したすべての患者の後の有効性を評価した１２ヶ月の研究を記載する。有効性、安全性および疾患の進行も、研究継続期間中ずっと評価した。
該研究は、無作為、二重盲検、プラセボコントロール、平行した投与設計を用いた。活動性のＲＡがあり、エタネルセプト（２５ｍｇを１週間に２回）を受けているおよそ１４１人の患者の合計は、２個の投与量群のうち１個に任意抽出した：１）２ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝９４）でＣＴＬＡ４Ｉｇ＋エタネルセプトを受けている群または２）エタネルセプトのみを受けているプラセボ群（ｎ＝４７）。
試験生成物、投与量および投与様式、治療の継続時間
すべての患者は、治療前の少なくとも３ヶ月間、エタネルセプト（２５ｍｇを１週間に２回）を受けた。
ＣＴＬＡ４Ｉｇの注入は、１、１５、３０日目、その後、毎月６ヶ月間（初期治療相）与えた。研究の薬物治療の各投与量を約３０分間、静脈内に注入した。
研究の初期治療相は、治療の最初の６ヶ月間行われた。この期間、患者は、エタネルセプト（２５ｍｇを毎週２回）の安定な投与量でとどめる必要があった。エタネルセプト以外のＤＭＡＲＤを認めなかった。アセチルサリチル酸（ＡＳＡ）を含む、低用量の安定なコルチコステロイド（１０ｍｇを毎日またはそれ以下）および／または安定な非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の使用は、認めた。。鎮痛薬（ＡＳＡまたはＮＳＡＩＤを含まない）は、関節の評価前の１２時間を除いて、基準線および研究の薬物治療によって正確にコントロールされなかった痛みを経験する患者には認めた。
評価のための基準
この研究の主要評価項目は、６ヶ月後の２０％の改善（ＡＣＲ２０）のための改良した米国リウマチ学会（ＡＣＲ）基準を満たす患者の比率に関するデータを収集した。改良したＡＣＲ２０の基準は、この研究の患者分布において、低いＣＲＰレベルに適応するために使用した。改良したＡＣＲ基準は、１）圧痛および膨張関節数の２０％の改善より大きい、２）残りの４個のコアデータ（広範囲の痛み、医師、患者、機能評価）の集合の測定のうち２つにおいて、２０％の改善より大きいと定義した。一般的に、標準ＡＣＲコアデータ集合の一部分であるＣＲＰは、エタネルセプトのようなＴＮＦ遮断薬を用いる患者において、低レベルのＣＲＰのために改良したＡＣＲ基準に含まれなかった。標準のＡＣＲ基準、および二つの別の基準（ＳＦ−３６の肉体の健康およびＳＦ−３６の精神の健康）も、二次的な指標として評価した。
統計的な方法
ＣＴＬＡ４Ｉｇの２ｍｇ／ｋｇとエタネルセプトを組み合わせた患者の治療群は、プラセボ＋エタネルセプトで処置したコントロール群と比較した。同様の患者分布でのエタネルセプトを用いた以前の研究に基づいて、６ヶ月での改良したＡＣＲ２０応答率（評価のために改良した基準）は、コントロール群の３５％であることが推測された。これが、エタネルセプト治療に対して、正確に応答しなかった患者間で期待された応答率であった。２：１の無作為化を用いて、１４１人（１０％の脱落者が見込まれるために調整した）の患者（４７人のコントロール／９４人のＣＴＬＡ４Ｉｇ）サンプルは、有意性の５％レベルで３０％の差を検出するための９０％検出力を得る（連続修正のための調整しないカイ二乗検定に基づく、両側であった）。
同様に、サンプルは、ＡＣＲ５０および７０において、それぞれ３０および２５％の差を検出するために９１％および８３％の検出力を得るように決定した。しかしながら、ゆっくりした記録のために、１２２人の患者のみを任意抽出し、１２１人を処置し、解析した（１人の患者を任意抽出したが、治療を受けていなかった）
人口統計および基準特性
１８０日での患者の傾向
Figure 2007501243
 *治療を受けなかった１人の患者を除いた
６ヶ月後、中止した合計の比率は、ＣＴＬＡ４Ｉｇ＋エタネルセプト群（２０％）と比較して、プラセボ＋エタネルセプト治療群の方が高い（３９％）。該差は、プラセボ＋エタネルセプト群の有効性の欠如のために中止した割合が高くなったことによる（表９）。
人口統計の特徴は、治療群と同様であった。患者のほとんどが、女性および白人であった。疾患の継続期間の平均は、１３年で、年齢の平均は、５２歳であった。（表１０）。
基準の人口統計および臨床的特徴の平均
Figure 2007501243
基準の臨床特性は、２９の圧痛関節および２０の膨張関節数の平均を含む治療群と同様であった。より低かったＣＲＰ値を除いて、基準特性は、活動性の関節リウマチおよび臨床研究に登録された患者に具体的であった（表１０）。
ＡＣＲ応答およびコア要素
ＣＴＬＡ４Ｉｇ＋エタネルセプト群において、ＡＣＲ２０およびＡＣＲ７０応答の改善は、ＣＴＬＡ４Ｉｇ＋プラセボ群と統計的に有意差があった（表１１および図６３）。
１８０日での改良したＡＣＲ応答−患者数（％）*
Figure 2007501243
 *評価のための基準参照
**ｐ＜０．０５（ＣＴＬＡ４Ｉｇ＋エタネルセプト対プラセボ＋エタネルセプトのＡＣＲ応答の確率）
***ＣＴＬＡ４Ｉｇ＋エタネルセプト：およびプラセボ＋エタネルセプトそれぞれについて、Ｎ＝８５およびＮ＝３６
治療の２ヶ月までに、ＡＣＲ基準のすべての要素において、数的に高い応答は、ＣＴＬＡ４Ｉｇ＋エタネルセプト群で観察された。７つのＡＣＲ要素のうち３つを図６４Ａ〜Ｃに示す。
１８０日のＡＣＲ基準の個別の要素において、改善の平均は、プラセボ＋エタネルセプト群と比較して、ＣＴＬＡ４Ｉｇ＋エタネルセプト治療群は常に大きくなった（表１２）。
１８０日の個別のＡＣＲ要素における改善パーセント（ＳＥ）の平均
Figure 2007501243
生活の質
基準と比較して、ＣＴＬＡ４Ｉｇ＋エタネルセプト群の患者は、プラセボ＋エタネルセプト群の患者の中で、一つのみ（身体機能）と比較して、ＳＦ−３６のすべての８個の下位尺度において、１８０日で統計的な改善の有意差を示した。ＨＲＱＯＬの下位尺度の絶対的な変化が臨床的に重要であると考えられた。
プラセボ＋エタネルセプト群と比較して、ＣＴＬＡ４Ｉｇ＋エタネルセプト群の患者は、ＳＦ−３６の４つの下位尺度：日常役割機能、体の痛み、活力、および社会生活機能のより統計的な有意差のある大きな改善を経験した（図６５）。他の４つの下位尺度における改善は、プラセボ＋エタネルセプト群よりも大きいが、それらは統計的に有意差がなかった。
安全性
本研究の最初の６ヶ月間で、死亡または日和見感染は起こらなかった。報告された中で、最も頻繁に有害反応、頭痛、呼吸器系の感染、筋／骨格の痛み、悪心／嘔吐、高血圧、および下痢が、プラセボ＋エタネルセプト群と比較して、ＣＴＬＡ４Ｉｇ＋エタネルセプト群で高い割合で生じた。その上、洞性異常および発疹は、ＣＴＬＡ４Ｉｇ＋エタネルセプト群で僅かに高かった。
ＣＴＬＡ４Ｉｇ＋エタネルセプト群の患者の多くが、エタネルセプト＋プラセボ群（２．８％）よりも重篤な有害反応（ＳＡＥ）（７．１％）を経験した。しかしながら、ＳＡＥは、研究薬と関連しているとは考えられなかった。
ＣＴＬＡ４Ｉｇおよびエタネルセプトを受けた二人の患者は、皮膚悪性腫瘍となった。一人の患者は、基底細胞癌となり、１５０日に達した後、摘出した。他の患者は、扁平上皮細胞癌が既存の障害であり、該患者は、１２０日に達した後、除去することを決心した。血管性浮腫となった別の患者は、アジスロマイシンへの薬剤反応であると治験責任医師によって考えられた。
中止へと導くすべての有害反応（ＡＥ）は、穏やかまたは適度な強度のいずれかであった。振戦のためにＣＴＬＡ４Ｉｇ＋エタネルセプト群の中止は、重篤な有害反応とみなした。
免疫原生
ＣＴＬＡ４Ｉｇを受けた患者は、ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＣＴＬＡ４−Ｔ特異的抗体に対して、抗体陽転しなかった。ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＣＴＬＡ４−Ｔ特異的抗体に対するＧＭＴの有意差のある変化は観察されなかった。
ＣＴＬＡ４Ｉｇ／エタネルセプトおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ／メトトレキサートのＡＣＲ応答の比較
Figure 2007501243
 a 改良したＡＣＲ。評価のための基準参照
b 標準ＡＣＲ基準
c プラセボ＋バックグラウンド治療（エタネルセプトまたはメトトレキサート）
d ＡＣＲ応答とプラセボ＋バックグラウンド治療の比較の差として、ｐ＜０．０５
２ｍｇ／ｋｇでのＣＴＬＡ４Ｉｇ＋エタネルセプトの有効性は、ＣＴＬＡ４Ｉｇ＋メトトレキサート治療と同じ投与量を受けた患者に観察されたのと同様であった（実施例５）。しかしながら、メトトレキサート試験（実施例５）の評価のための基準は、コア要素の中のＣＲＰを含む標準的なＡＣＲであるが、エタネルセプト試験（実施例６）の評価のための基準は、ＣＲＰを除く改良したＡＣＲであった。
まとめ
６ヶ月での該研究の予備試験の評価は、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（２ｍｇ／ｋｇ）とエタネルセプトの組合せが、エタネルセプト単独で用いた場合と比較すると関節リウマチの徴候および症状を減少したことがわかった。改良したＡＣＲ２０およびＡＣＲ７０アッセイでの増加は、統計的に有意差があった。ＣＴＬＡ４Ｉｇ＋エタネルセプト治療の有効性は、治療開始１月以内に観察された。エタネルセプト治療単独の場合と同様に安全性プロファイルを有するエタネルセプトと併用で投与するとき、ＣＴＬＡ４Ｉｇは、一般に安全で充分な耐容性があった。ＣＴＬＡ４Ｉｇは、６ヶ月の試験期間中、免疫原生はなかった。さらに、エタネルセプトと併用するＣＴＬＡ４Ｉｇ治療の有効性（実施例６）は、メトトレキサートと用いるＣＴＬＡ４Ｉｇと同じ投与量を用いたときと同様であった（実施例５）。
実施例７
メトトレキサートを受けながら、活動性がある関節リウマチ患者の静脈内に投与する二つの異なった投与量のＢＭＳ−１８８６６７の安全性および臨床的な有効性を評価するためのフェーズＩＩＢ、多施設、任意抽出、二重盲検、プラセボ対照研究の１年の結果
以下の実施例は、活動性がある関節リウマチ（ＲＡ）患者を治療するためにメトトレキサートと併用するＣＴＬＡ４Ｉｇの２つの異なった投与量の投与の安全性および臨床的な有効性を評価するためのフェーズＩＩＢ、多施設、任意抽出、二重盲検、プラセボ対照臨床研究から１年の結果を提供する。本実施例に示す研究は、実施例５で示される６ヶ月研究の続きである。
上記の実施例３から生じる予備的な有効性に基づいて、ＲＡの治療でＭＴＸに他の治療を加える標準的な技術である本研究は、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ−１８８６６７）とＭＴＸの併用が、ＭＴＸ治療にもかかわらず、活動性の疾患を未だに有するＲＡ患者において、ＭＴＸ＋プラセボと比較するとき、臨床的な有効性が大きくなるという仮説を試験するために計画した。
本臨床研究の報告で示す結果は、すべての患者が６ヶ月の治療を完了した後、およびまたすべての患者が１２ヶ月の治療を完了した後に実施した解析からのデータに基づいている。
本実施例を通して、１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ＋ＭＴＸ群は、１０ｍｇ／ｋｇ群を意味し、２ｍｇ／ｋｇ＋ＭＴＸ群は、２ｍｇ／ｋｇ群を意味し、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ１８８６６７）プラセボ＋ＭＴＸ群は、プラセボ群を意味する。
研究方法
本研究は、６ヶ月および１２ヶ月間隔において、ＡＣＲによって評価するとおり活動性があるＲＡ患者のＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ−１８８６６７）とメトトレキサート（ＭＴＸ）、またはＭＴＸ＋プラセボとの組合せの二つの異なった投与量（１０および２ｍｇ／ｋｇ）の臨床的な有効性を比較した。本研究は、ＭＴＸに対する不十分な応答を有する活動性があるＲＡの成人患者を登録した。
静脈内投与した活動性がある関節リウマチ患者をモニタリングした一年後の結果：１）メトトレキサートと２ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量のＣＴＬＡ４Ｉｇ、２）メトトレキサートと１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量のＣＴＬＡ４Ｉｇ、または３）プラセボ＋メトトレキサート（以下、プラセボという）を本明細書に示す。
本研究のための封入／排除の基準を満たすＭＴＸを用いる治療にもかかわらず、活動性があるＲＡ患者は、ＭＴＸ治療のバックグラウンドにおいて、以下の治療：１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ−１８８６６７）、２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ−１８８６６７）、またはプラセボのうち一つを受けるために１：１：１にランダム化した。患者は、１日目より前の２８日間で安定な投与量において、少なくとも６ヶ月間、ＭＴＸ（毎週１０ｍｇ〜３０ｍｇ）で治療してきた。
治療群：患者は、３つの治療群のうち１つに１：１：１となるようにランダム化した：
１）群１：静脈内注入による１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ−１８８６６７）
２）群２：静脈内注入による２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ−１８８６６７）
３）群３：静脈内注入によるＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ−１８８６６７）プラセボ
注入投与量は、１日目の前にすぐに治療前の来診での患者の体重（ＭＴＸ単独治療の患者について、重量をスクリーニングの来診で得て；ＭＴＸの併用治療［他のＤＭＡＲＤとの組合せ］の患者について、該重量を２日目の処置の来診で得た）に基づいた。注入投与量は、１日目から３６０日目まで修正しなかった。
注入は、研究を通じて、１日のほぼ同じときに行った。研究の薬物投与のすべての投与量は、約３０分以上かけて定速で、７５ｍＬに固定した量を投与した。点滴バッグおよびラインは、各注入の最後に２５ｍＬのデキストロース５％水溶液（Ｄ５Ｗ）で洗い流した。すべての静脈内注入は、座位で患者に投与した。患者は、各注入（投与前、１５、３０、４５、６０、７５、９０、１２０分）の開始および注入開始から最低２時間後での有害反応（Ａｅｓ）および生命徴候（血圧、心拍数、体温）の変化を観察した。臨床的に望ましければ、観察期間は、延長されうる。
選択された薬物投与の該研究の最初の期間（１日目から１８０日目）、同時投与が許容された。許容された薬物投与は、以下を含む:
・ＭＴＸ：現在の投与量の使用を継続した（増加しない、毒性に関してのみ減少する）
・全身性（非局所）コルチコステロイド：但し、投与量は安定し、合計投与量は、プレドニゾン１０ｍｇ／日の相当量より少ないか同じであった。関節内注射は、避けるべきであるが；必要なら、２本の関節内注射まで許容した。注意：関節内注射を受けた関節は、すべて後の評価／査定において、「活動性」として計算した。
・ＡＳＡを含むＮＳＡＩＤ：提供した投与量は不変であった。
・アセトアミノフェン、アセトアミノフェンおよび麻酔鎮痛薬（すなわち、アセトアミノフェンとリン酸コデイン、アセトアミノフェンとナプシル酸プロキシフェン、アセトアミノフェンと塩酸オキシコドン、アセトアミノフェンとオキシコドン二酒石酸塩など）、またはトラマドールを含む併用生成物：患者が経験する痛みを基準または研究の薬物投与（関節評価の１２時間前を除いて）によって、正確にコントロールできなかった。
表１４は、研究手順および評価の計画表である。
Figure 2007501243
 a 胸部Ｘ線およびＥＣＧは、６ヶ月以内に実施しないか、記録しないなら実施した。
b もし、患者がメトトレキサート治療の最初にＤＭＡＲＤで治療され、最初の登録基準を満たしていないなら、該ＤＭＡＲＤは、１日目より前の少なくとも２８日間で断念しなければならない。
c 患者が、ＭＴＸ治療中の場合に限り、この来診は必要であった。
d 妊娠の可能性があるすべての女性に対して、投与前４８時間以内に尿または血清の妊娠テストを実施した。血清の妊娠テストは、局所的に行った。
e 中止した患者は、「期限前の契約解除」で来診させなければならない。この来診での評価は、３６０日目で実施した評価と同一であった。この来診のための評価は、中止の日に計画されてきたことに置き換えた。現在のＤＭＡＲＤ、ステロイド、またはＮＳＡＩＤ治療の変更は、これらの評価を実施した後まで認めなかった。患者は、安全性データ（有害反応）を取得するために中止３０日後に連絡を取った。
f それぞれの患者についての評価を完了した同じ評価人を保証させる努力をしなければならない。
g 最近の重量は、研究薬剤の投与量を計算するために使用されるべきである。研究期間に投与した全投与量は、この重量に基づいた。
h １５日間、＋／−３日の来診時期を認めた。次の来診は、＋／−７日の来診時期を認めた。
i 身体検査のみ行う。
j すべての評価は、特に指示しない限り、研究の薬剤投与の前に実施または投与されるべきである。
k すべての評価の結果は、ランダム化のための中央無作為化システム(Central Randomization System)と接触する前に有資格の条件を再調査しなければならない。
l マンモグラフィーによる理論的解釈のためのプロトコルの項２．１．４．３．を参照。６ヶ月以内に実施しないなら、同意し署名する前に（文書を保管しなければならない）。１日目以後に研究を中止した患者は、スクリーニング期間に実施したマンモグラムの１年後に次のマンモグラムが必要であった。
m 患者の体重は、中央無作為化システムに提供した。
n Ｘ線写真の評価は、治療の最初の９ヶ月以内で中止した患者のための最後の来診では必要なかった。
o 早期に終了した患者は、有害反応を有し、同時に行う薬物投与は、研究の薬物投与の最後の投与後、３０および６０日に記録した。
有効性評価
臨床的な測定および応答
臨床応答は、米国リウマチ学会（ＡＣＲ）のコアデータセットおよび応答の定義を用いて評価した。この評価のために、データは、７つの要素：１）圧痛関節数（標準は、６８個の関節数）；２）膨張関節数（標準は、６６個の関節数）；３）患者の痛みの包括的な評価；４）患者の疾患活動性の包括的な評価；５）医師の疾患活動性の包括的な評価；６）患者の身体機能（ＭＨＡＱ）の評価；および７）急性期反応物質値ＣＲＰで集められた。
ＡＣＲ２０、ＡＣＲ５０、およびＡＣＲ７０の応答の定義は、圧痛および膨張関節（要素１および２）において、基準以上のそれぞれ２０％、５０％、または７０％の改善、および残り５つのうち３つのコアデータセットの測定（要素３〜７）において、それぞれ２０％、５０％、および７０％の改善に対応する。主要な臨床応答は、継続した６ヶ月以上のＡＣＲ７０の応答の維持として定義される。各要素のためのデータが集められた日に対する表１４を参照する。
主要な有効性の解析は、６ヶ月（１８０日目）において、二つのＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ−１８８６６７）治療群およびプラセボ群とのＡＣＲ２０応答の差について試験した。連続的な試験手順を用いた。最初に、カイ二乗検定を０．０５レベルの有意差において、１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群についてのデータとプラセボ群のためのデータを比較するために用いた。これが有意差であるなら、２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群のデータは、０．０５レベルにおいて、プラセボ群と比較した。この試験手順は、５％において、全般的にαレベルを維持した。同様の解析は、６ヶ月でのＡＣＲ５０およびＡＣＲ７０応答について実施した。それぞれＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ−１８８６６７）治療群およびプラセボ群とのＡＣＲ２０、ＡＣＲ５０およびＡＣＲ７０応答の違いを推定値および９５％信頼区間を用いてまとめた。有効性の欠如（すなわち、ＲＡの悪化）のために、研究を中止した患者は、後のすべての時点において、ＡＣＲ非応答者とみなした。他の理由で中止したすべての患者について、それらの最後のＡＣＲ応答は、繰り越した。
３６０日でのＡＣＲ２０、ＡＣＲ５０、およびＡＣＲ７０応答率は、有意差のダネット調整０．０２７（両側）レベルで、それぞれＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ−１８８６６７）治療群およびプラセボと比較した。
各時点で、ＡＣＲ２０応答に対する応答者の比率は、経時的にもプロットし、コクランマンテル−ヘンツェル試験（コクランの文献：1954, Some Methods of Strengthening the Common Chi-Square Test, Biometrics 10:417-451；マンテルおよびヘンツェルの文献：1959, Biostatistical Aspects of the Analysis of Data from Retrospective Studies of Disease, J Nat Cancer Inst, 22:719-748）は、プラセボ群に対するＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ−１８８６６７）群のそれぞれにおいて、ＡＣＲ２０応答に達する患者の頻度を比較するために用いた。
１５、３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２４０、３００、および３６０日でのＡＣＲ２０、ＡＣＲ５０、およびＡＣＲ７０応答は、二つのＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ−１８８６６７）群およびプラセボ群との間にも示された。ＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ−１８８６６７）群およびプラセボ群のＡＣＲ応答の差は、９５％信頼区間を用いてまとめた。経時的にプロットしたＡＣＲデータは、作用の発現を評価するため、および最大応答を決定するために使用した。
主要な臨床応答は、継続して６ヶ月間かけて、ＡＣＲ７０応答の維持として定義された。１２ヶ月の解析において、３つの群との間の主要な臨床応答に達した患者の割合をまとめた。
計画した解析の完全性を評価するために、いずれかの理由において、研究の薬物投与を受けた、および研究を中止したすべての患者は、中止後すべての研究計画の来診で、ＡＣＲ非応答者とみなした。
累計指数、ＡＣＲ−Ｎは、それぞれ続きの査定で評価され、該ＡＵＣは、６ヶ月および１２ヶ月まで評価した。台形の公式は、ＡＵＣを計算するのに用いた。該ＡＣＲ−Ｎ ＡＵＣは、６および１２ヶ月のデータにおける分散（ＡＮＯＶＡ）の解析に用いる二つのＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ−１８８６６７）治療群およびプラセボ群を比較した。これは研究を通して、患者の応答の評価を可能にさせた。これらの解析をＬＯＣＦデータセットで実施した。
ＡＣＲ−Ｎ ＡＵＣデータの正規性に関する分布仮説は、１０％レベルの有意差で、ＡＮＯＶＡモデルから標準残余のシャピロ−ウィルクス試験を用いてチェックした。
代理バイオマーカーをＣＴＬＡ４Ｉｇ＋ＭＴＸまたはプラセボ＋ＭＴＸ治療計画の有効性を評価するためにも使用した。ＲＡにおいて、免疫修飾または炎症のための可能なバイオマーカーは、ＣＲＰ、可溶性ＩＬ−２Ｒ、ＲＦ、可溶性ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、血清ＩＬ−６、およびＴＮＦαを含む。これらのパラメーターは、１８０日および３６０日までの基準から頻度および変化の平均を用いる治療群によってまとめられた。
有害反応（ＡＥ）は、因果関係にもかかわらず、研究過程の間、研究者によって記載される新規または悪化する病気のいずれか、症状の徴候または臨床的に重要な研究試験の異常として定義された。重篤な有害反応（ＳＡＥ）は、以下の基準：致命的であり；生命に関わる；入院させられるか延長する；持続または重要な障害または不能となる、癌、先天性異常／出生異常、過剰摂取を生じる、薬物依存または薬物乱用の進行を生じるか、または重要な医学的な徴候のいずれかを満たすＡＥとして定義された。
生命徴候の測定は、スクリーニング、研究の薬剤投与の間および後のそれぞれの研究の来診で得られた。生命徴候の測定（座位血圧、心拍数、および体温）は、平均を用いる治療群によってまとめられた。
二つのＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ−１８８６６７）治療群（１０および２ｍｇ／ｋｇ）を、プラセボ群と比較した。主要な解析は、前者に有意差がある限り、１０ｍｇ／ｋｇおよびプラセボ群における６ヶ月でのＡＣＲ応答率の比較に続いて、２ｍｇ／ｋｇとプラセボの比較であった。サンプルサイズは、５％レベル（両側）の有意差に基づいた。６ヶ月でプラセボ群のＡＣＲ２０応答率は、約２５％と推測した（ウェインブラット、クリーマー、バンクハーストの文献： A trial of etanercept, a recombinant TNF:Tc fusion protein in patients with RA receiving methotrexate. NEJM 1999; 340: 253-259）。治療群あたり１０７人の患者サンプル（可能な１５％の中止した割合に調整した）は、５％レベル（両側）での２５％の違いを検出する９４％検出力を得るために決定した。表１５に、６ヶ月でのＡＣＲ２０、ＡＣＲ５０、およびＡＣＲ７０応答において、具体的な治療の違いを検出するために必要な検出力をまとめる。
群あたり１０７a人の患者の応答比率および検出力
Figure 2007501243
 a サンプルサイズは、可能な１５％の中止比率に調整した；実際のサンプルサイズは、９１であった。
１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇとプラセボの最初の比較が重要であるなら、２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇとプラセボ群の比較において、試験の検出力は、６ヶ月のＡＣＲ２０、ＡＣＲ５０、およびＡＣＲ７０応答それぞれを含む比較のために少なくとも０．８８、０．９０、および０．８１であった（コッホ、ガンスキーの文献：Statistical considerations for multiplicity in confirmatory protocols. Drug Info Journal 1996; 30: 523 534）。
（統計的解析）
研究対象集団
患者の傾向
本研究に登録されている５２４人の患者のうち、３３９人の患者は、１０ｍｇ／ｋｇ群に１１５人；２ｍｇ／ｋｇ群に１０５人；およびプラセボ群に１１９人にランダム化した（図６８）。ランダム化されない最も多い理由は、包括および／または除外基準を満たすことに失敗するからであった。
初期段階（１〜１８０日）
合計２５６人の患者（ランダム化したうちの７５．５％）が、該研究の初期段階を完了した；８３人の患者が、この期間に中止した（表１６）。結局、中止は、１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群と比較したプラセボより２倍高い。有効性の欠如のための中止およびＡＥのための中止も１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群よりプラセボの方が２倍高かった。
Figure 2007501243
のべ中止数（１〜３６０日）
合計２３５人の患者（ランダム化されたうちの６９．３％）は、該研究の両方の段階で完了した；１０４人の患者が、３６０日までに中止した（表１７）。初期段階で記載した中止において、同一の一般的な形式（１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群と比較したプラセボより２倍高い発生率）は、全般的にも観察された（１〜３６０日）。この事は、全体的な中止率、有効性の欠如のための中止およびＡＥのための中止を含む。
Figure 2007501243
 a 中止のための他の理由は、コンプライアンスに関連した。
b ＡＥと報告された１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群の患者であるＩＭ１０１１００−３２−５は、該研究から中止となったとして記録されたが；この患者は、このテーブルには含まれていない。
最初の１２ヶ月間、いずれかの理由で中止した患者の累積した割合のカプラン−マイアープロットは、図６９に示し；有効性の欠如のために中止した患者の累積割合は、図７０に示す。治療からおよそ３０日後の両方のグラフにおいて、プラセボでの中止率は、両方のＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ−１８８６６７）群と継続的に高く比較されることを意味する。さらに、治療からおよそ１５０日後、２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群の中止率は、１０ｍｇ／ｋｇのそれらよりも高かった。
人口統計および患者の特徴
概して、基準の人口統計の特徴および臨床的ＲＡの基準となる特徴は、一般的に、３つの治療群にわたって比較され、臨床治療において、遭遇した相対的に進行したＲＡの特徴をよく示していた（表１８および表１９）。多くの患者は、約９〜１０年のＲＡの平均継続期間を持つ約５５歳の白人女性であり、相対的に多くの活動性の関節（約２９個の圧痛および２１個の膨張関節）および視覚的アナログ尺度（ＶＡＳ）が、およそ５９〜６５ｍｍ（１００ｍｍスケール）であった。
Figure 2007501243
 ＲＡの継続期間は、３人の患者について報告されなかった
ＡＣＲ基準の要素ではないが、朝のこわばりの持続時間も評価し、３つの群のそれぞれにおいて、ほぼ２時間であった。基準において、ＲＦに陽性の結果も評価し、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ１８８６６７）治療群は、ＲＦ（プラセボ群の７６％と比較して、１０ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群の両方について、８６％であった）に陽性と検査された患者より高いパーセントであった。
Figure 2007501243
研究薬の少なくとも一つの投与および有効性の欠如のために中止があった患者の全体的な比率の基準の人口統計およびＲＡの特徴は、一般的に全体研究の比率と比較されたが、この部分集団において、患者より大きな比率は、全体研究の比率（３４％）と比較して、＞１０年間（４５％）ＲＡで診察してきた。
病歴の所見および以前の薬物治療
本研究において、患者の病歴の所見は、相対的に進行したＲＡで一貫性があり、一般的に治療群間で同様であった。頻繁に起こる所見（患者の＞４０％）は、筋骨格の所見（ＲＡの症状を含まない；５９．３％）、消化管の所見（４５．１％）、および尿生殖器の所見（４２．２％）であった。他の重要な病歴の所見は、心臓血管疾患が、すべての治療群において、患者の約３９％および内分泌腺／代謝の所見が、すべての患者の約２９％を含んだ。
ＭＴＸ、全身（非局所）コルチコステロイド、ＤＭＡＲＤおよび研究前の生物学的ＲＡ薬の全体的な使用は、一般的に３つの治療群（表２０）にわたって比較した。すべての患者は、ＭＴＸを含む、リウマチ薬で以前に治療を受け、本研究に適格であった。ＭＴＸのそれまでの治療は、４人の患者について記録されなかった。ランダム化の前に使用する全身（非局所）コルチコステロイドは、１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群（６０．０％）の患者と比較して、全身（非局所）コルチコステロイド（〜６７−６８％）を受けた２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇおよびプラセボ群において、僅かに多い患者で３つの治療群間を比較した。本研究に参加する前の他のＤＭＡＲＤおよび生物学的ＲＡ薬の使用は、いずれかの治療群において、いずれも優勢ではない治療群にわたって、０〜１２％変化した。１日目のＭＴＸおよび全身（非局所）コルチコステロイドの平均投与量は、すべて３つの治療群（それぞれ、〜１５−１６ｍｇ／週、〜６−７ｍｇｓ／日）間で比較した。
Figure 2007501243
 a それまでのリウマチ薬のカテゴリーは、相互排他的であった。
b ＭＴＸの投与は、４人の患者について記録しなかった。
治療研究
３つの治療群のうち、１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群は、両方の研究相における曝露の平均持続時間が最も長く、プラセボ群は、両方の研究相（それぞれ、１８０日目：１６３日、１５６日、１４０日；３６０日目：２８６日、２６８日、および２３４日；１０ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、およびプラセボ）に対して、曝露の平均持続時間が最も短かった。
１８０日（初期段階の最終日）において、注入を受ける患者の比率は、２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群（７９％）およびプラセボ群（６６％）で比較した１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群（８５％）より高かった（表２１）。３３０日目（二次段階で最後に計画された注入日）において、注入を受ける患者の比率も、２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群（７０％）およびプラセボ群（５９％）と比較して、１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群（７８％）の方が高かった。
Figure 2007501243
メトトレキサート
患者は、１日目より前の２８日間、少なくとも６ヶ月間、ＭＴＸ（毎週１０〜３０ｍｇ）の「安定な」投与量で処置し続けた。４人の患者を除いて、すべての患者は、初期段階（１日〜１８０日）の期間、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ−１８８６６７）に加えて、毎週１０〜３０ｍｇのＭＴＸを受けた。二次段階（１８１〜３６０日）の期間、ＭＴＸの投与量は、毎週１０〜３０ｍｇの間を維持し調節して与えた。
治療コンプライアンスの測定
初期段階の期間、研究薬の注入をミスした数は、いずれかの時点で≦２であった（表２１）。二次段階の期間、プラセボ群の患者は、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ−１８８６６７）群の患者より僅かに多い注入のミスがあるのが明らかであった。しかし、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ−１８８６６７）より多くのプラセボ患者が、後の時点でこれらによって中止した（上記参照）。
Figure 2007501243
同時治療
全身（非局所）コルチコステロイドの使用は、一般的にスクリーニング／登録（５８〜６７％）期間および本研究の初期段階期間（６７〜７１％）をそれぞれ表２３および２４で、３つの群について比較した。コルチコステロイド使用は、３６０日目まで、すべて３つの治療群で減少しながら、１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群の多くの患者は、他の二つの治療群（２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇおよびプラセボ群について、それぞれ５３．３％および４５．４％)と比較して、全身（非局所）コルチコステロイド（６３．５％）を受けた。数人の患者（ＣＴＬＡ４Ｉｇ：０〜３％、プラセボ：０〜１０％）は、スクリーニング／登録期間で、ＭＴＸ以外のＤＭＡＲＤを受けた。
Figure 2007501243
 a 薬物のカテゴリーは、相互排他的であった。
Figure 2007501243
 a 薬物のカテゴリーは、相互排他的であった。
注：患者ＩＭ１０１１００−８３−３（１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ）は、メフロキンを受け、患者ＩＭ１０１１００−２８−７（プラセボ）は、１〜１８０日目にキニーネを受け；患者ＩＭ１０１１００−１８−１１（１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ）は、１８１〜３６０日目に抗マラリア薬として、キニーネを受け、重大なプロトコル違反とはみなさなかった。
有効性の結果
ＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ−１８８６６７）の１０ｍｇ／ｋｇ群は、１８０日目および３６０日目において、プラセボ群より有効であった。２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群において、いくつかの有効性パラメーターについての結果は、プラセボ群よりもかなり良く、他の多くの有効性パラメーターの結果は、プラセボより数的に高かった。
１８０日目のＡＣＲ応答
本研究において、重要な有効性の変化の解析は、１８０日目のＡＣＲ２０応答率は、１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群が、プラセボ（表２５、図７１Ａおよび図７１Ｂ）よりも充分有効（ｐ＜０．００１）であることを示した。
１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群における１８０日目のＡＣＲ５０およびＡＣＲ７０応答も、プラセボ群よりかなり高かった（表２５、図７１Ａおよび図７１Ｂ）。２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群における１８０日目のＡＣＲ５０およびＡＣＲ７０応答は、プラセボ群よりかなり高かった。２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群における１８０日目のＡＣＲ２０応答は、プラセボ群よりもわずかに高かったが；統計的な有意差は観察されなかった。
Figure 2007501243
 a ＢＭＳ−１８８６６７対プラセボの比較のための統計的な有意差
３６０日目のＡＣＲ応答
３６０日目の１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群におけるＡＣＲ２０、ＡＣＲ５０およびＡＣＲ７０応答は、プラセボ群よりかなり高かった（ｐ＜０．００１）（表２６、図７２Ａおよび図７２Ｂ）。２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群における同一の応答が、プラセボ群より数的に高かったけれども、これらの差は、統計的な有意差ではなかった。
Figure 2007501243
 a １０／ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群対プラセボの比較における統計的な有意差
来診によるＡＣＲ応答
１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群とプラセボ群の比較において、統計的に充分な改善は、９０日目までに、すべての３つの応答率（ＡＣＲ２０、ＡＣＲ５０、およびＡＣＲ７０）によって観察され、これらの値は、３６０日目（すべて３つのＡＣＲ応答率において、ｐ≦０．００８）までおよび含むすべての時点で、統計的な有意差のままであった（図７３Ａ、図７３Ｂ、および図７３Ｃ）。実際に、１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群におけるＡＣＲ５０およびＡＣＲ７０応答の統計的な有意差の改善は、３０日目と同じくらいに起こった（それぞれ、ｐ＝０．０３９およびｐ＝０．０４）。
２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群において、プラセボより統計的に有意な改良は、１８０日目（それぞれ、ｐ＝０．０２７およびｐ＝０．００５）のＡＣＲ５０およびＡＣＲ７０応答で観察された。３６０日目において、ＡＣＲ応答の改善は、プラセボ群より２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群より僅かに大きいが、統計的な有意差は全く観察されなかった。
コクラン−マンテル ヘンツェルテストを用いて来診のための調整後、ＡＣＲ２０応答の有意差が、１８０日目および３６０日目の両方で、プラセボ群と比較して、１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群に観察された。両方の時点で、２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇおよびプラセボ群における有意差は、全く観察されなかった。同様の結果は、両方の時点で、ＡＣＲ５０応答について得られた。両方の時点のＡＣＲ７０応答について、有意差は、プラセボ群と比較する両方のＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ−１８８６６７）治療群について観察された。
主要な臨床応答のまとめ
主要な臨床応答は、継続して６ヶ月以上のＡＣＲ７０応答の維持として定義された。３６０日目の主要な臨床応答に達した患者の割合は、プラセボ群（０．８％；それぞれ、ｐ＝０．００８および０．０３６）と比較するとき、１０ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇの両方のＣＴＬＡ４Ｉｇ群（それぞれ、７．８％および５．７％）でかなり高かった（表２７）。
Figure 2007501243
 a ＢＭＳ−１８８６６７対プラセボの比較のための統計的な有意差を示す
平均の数的ＡＣＲ（ＡＣＲ−Ｎ）およびＡＣＲ−Ｎの濃度曲線下面積（ＡＣＲ−Ｎ−ＡＵＣ）
概して、すべての治療群における平均の数的ＡＣＲ（ＡＣＲ−Ｎ）は、本研究の最初の６ヶ月間にかけて増加した（図７４）。２回目の６ヶ月間、平均のＡＣＲ−Ｎは、１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇで僅かに増加したが、２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇおよびプラセボでは、相対的に未変化ままであった。各研究の来診において、該ＡＣＲ−Ｎは、２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇおよびプラセボ群に比べて、１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群の方が、継続して高かった。
プラセボ群と比較して、１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群におけるＡＣＲ−Ｎ ＡＵＣ（濃度曲線下面積）のための値の差は、３６０日目まで、充分高かった（ｐ＜０．００１）。
１８０日目の基準からの改善率
１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群において、１８０日目のそれぞれ個別のＡＣＲ要素（圧痛および膨張関節数、ＣＲＰ、痛み、患者の包括的な評価、医師の包括的な評価、および身体機能）の改善は、プラセボ群の改善に比べて、統計的に有意であった（表２８）。
２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群において、プラセボ群と比較した統計的に充分な改善は、１８０日目の医師の包括的な評価およびＣＲＰを観察した。さらに、プラセボ群のＣＲＰレベルは、実際に１８０日目で悪化した。朝のこわばりの平均持続時間の基準からの変化は、１８０日目で、３つの治療群を比較した。
Figure 2007501243
 * ９５％のＣＩが、ゼロを含まないので、プラセボと比べて、ｐ＜０．０５を示す。
３６０日目の基準からの改善率
１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群において、３６０日のそれぞれ個別のＡＣＲ要素（圧痛および膨張関節数、ＣＲＰ、痛み、患者の包括的な評価、医師の包括的な評価、および身体機能）における改善は、プラセボ群の改善に比べて、統計的に有意差があった。基準日から３６０日目までの改善率の平均は、ＡＣＲ基準のすべての臨床的パラメーターにおいて、表２９に示す。
２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群において、プラセボ群と比べて統計的に十分な改善は、３６０日目の医師の包括的な評価およびＣＲＰを観察した。さらに、プラセボ群のＣＲＰレベルは、３６０日目に実際に悪化した。３６０日目において、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ−１８８６６７）治療群は、プラセボ群と比べて、朝のこわばりの持続時間の基準より大きく変化した。
Figure 2007501243
 * ９５％のＣＩが、ゼロを含まなかったので、プラセボと比べて、ｐ＜０．０５を示す。
新規な活動性の関節
新規な活動性の関節の比率は、スモーレンの文献（Smollen JS, Breedveld FC, Eberl G, Jones I et al. Validity and reliability of the twenty-eight-joint count for the assessment of RA activity. Arthritis & Rheum 1993; 38: 38-43）によって、提案された有効な２８個の関節数（６８個の全圧痛関節のうち、および６６個の全膨張関節のうち）を用いて決定した。１８０日目の新しい活動性の関節（圧痛および膨張の両方）の比率は、１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇを受けた患者において、最低であった（図７５）。
１８０日目において、新規な圧痛関節および新規な膨張関節を全く報告しない患者の割合は、１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群で最も高かった（図７６Ａ、図７７Ａ）。新規な圧痛関節および新規な膨張関節を全く報告しない患者の割合は、１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群で、それぞれ約５９％および５２％；２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群で、それぞれ３８％および４４％；およびプラセボ群で、それぞれ４１％および３７％であった。
３６０日目において、新規な活動性の関節（圧痛および膨張の両方）の比率は、１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇを受けた患者において、最低であった（図７８）。新規な活動性の関節の比率におけるこのパターンは、１８０日目で見られたパターンに酷似していた。
同様に、３６０日目において、新規な圧痛関節および新規な膨張関節を全く報告しない患者の比率は、１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群で最も高かった（図７６Ｂ、および図７７Ｂ）。新規な圧痛および新規な膨張関節を全く報告しない患者の割合は、１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群で、それぞれ約７１％および６１％；２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群で、それぞれ４１％および４４％；およびプラセボ群において、両方の数は４２％であった。
ＡＣＲ応答を用いた患者間の臨床的パラメーターの改良
ＡＣＲ２０、ＡＣＲ５０、およびＡＣＲ７０応答者において、ＡＣＲ基準のコア要素の改善は、プラセボと比べて、二つのＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ−１８８６６７）治療群より僅かに大きかった。
１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ投与量を受けた患者のための作用の開始は、約１５日後、≧６０日目で生じるＡＣＲ２０の改善、≧９０日目でのＡＣＲ５０、または≧３０日目でのＡＣＲ７０、およびどの場合にも３６０日目まで継続してかなりの増加を伴って起こった（図７３Ａ、図７３Ｂおよび図７３Ｃを参照）。
医療効果による質問票（Health Outcomes Short Form Questionnaire）における基準からの変化（ＳＦ−３６）
健康関連ＱＯＬにおけるＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ−１８８６６７）の影響は、医療効果による質問票ＳＦ−３６（より良いＱＯＬを示すより高いスコアを持つ０〜１００のスコアの範囲でまとめる）を用いて評価した。解析は、ＬＯＣＦ（時系列データの欠測の最直前のデータを補完すること）データセットならびに観察したデータセットで実行した。
１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群において、プラセボ群と比べて基準からの統計的に有意差のある改善は、１８０日目において、ＬＯＣＦ解析（すなわち、９５％ＣＩは、ゼロを含まなかった）を用いて、ＳＦ−３６のすべて４つの心の健康およびすべて４つの体の健康領域で観察された（図７９Ａ、７９Ｂ）。２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群において、１８０日目にプラセボと比べて、心の健康または体の健康領域での数的改善があったが、これらの改善は、統計的に有意差はなかった。
観察されたデータセットで実行した解析結果は、１８０日目での「精神状態の役割」領域が、観察されたとおりのデータセットを用いる、１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇおよびプラセボ群の比較において、充分に改良されなかった（しかし、数的には改良された）ことを除いて、ＬＯＣＦデータセットで観察されたものと同様であった。
１８０日目で測定した体の要素および心の健康の要素のまとめは、表３０に示す。
Figure 2007501243
３６０日目について、医療効果の結果は、１８０日で見られた結果と同様であった。１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群において、プラセボ群と比べて、基準からの統計的に有意な改善は、ＬＯＣＦ解析（すなわち、９５％ＣＩは、ゼロを含まなかった）を用いて、３６０日のＳＦ−３６のすべて４つの精神およびすべて４つの身体領域で観察された（図８０Ａ、および８０Ｂ）。２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群について、プラセボ群と比べて、３６０日の４つの身体領域のうち３つにおいて、３６０日の４つの精神領域のうち１つにおいて、統計的な有意差が観察された。
観察されたデータセットで実施した解析の結果は、ＬＯＣＦデータセットにおいて観察された結果と同様であった。
３６０日目の身体的要素および心の健康の要素の概要の測定は、表３１に示す。
Figure 2007501243
バイオマーカーおよび薬物動態データ
１８０日目の１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇの６個のうち５個のバイオマーカー／薬物動態（ＰＤ）パラメーター（可溶性のＩＬ−２ｒ、リウマチ因子（ＲＦ）、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチンおよびＩＬ−６）およびＴＮＦ−αの数的な減少において、有意な改善（減少）が見られた（表３２）。１８０日目の２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇの６個のうち３個のバイオマーカー／ＰＤパラメーター（可溶性のＩＬ−２ｒ、ＲＦおよびＩＬ−６）およびＩＣＡＭ−１の数的な改善において、有意な改善（減少）が見られた。１８０日目のプラセボでのバイオマーカー／ＰＤパラメーターのいずれかにおいて、有意な変化はなかった。バイオマーカー／ＰＤパラメーターにおいて、投与量依存と改善（減少）の相関があるように思える。
Figure 2007501243
概して、３６０日目のバイオマーカー／ＰＤデータの変化パターンは、１８０日目で見られたのと同様であった。３６０日目の１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇでの６個のうち５個のバイオマーカー／ＰＤパラメーター（可溶性ＩＬ−２ｒ、ＲＦ、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチンおよびＩＬ−６）に関して、有意差のある改善（減少）が見られ、ＴＮＦ−αにおいて、数的には有意差があったが、統計的には有意差がなかった改善を観察した（表３３）。３６０日目の２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４ＩｇでのＩＬ−６のみ有意差のある改善（減少）があったが、数的な改善は、ＲＦおよびＩＣＡＭ−１で見られた。３６０日目のプラセボでのバイオマーカー／ＰＤパラメーターのいずれかにおいて、有意差のある変化はなかった。１８０日目のデータで見られたとおり、バイオマーカー／ＰＤパラメーターの改善（減少）のすべては、投与量依存様式で生じることが明らかとなった。
１８０日目のバイオマーカー／ＰＤパラメーターの基準日後の平均と３６０日目のそれらの比較は、重要な傾向を明らかにする。１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群に関して、すべてのバイオマーカー／ＰＤの測定は、僅かに増加している可溶性ＩＬ−２ｒを除いて、減少し続けた。２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群に関して、バイオマーカー／ＰＤパラメーターのうち３個の平均値は、僅かに減少（ＩＣＡＭ−１、血清ＩＬ−６）または相対的に変わらず（Ｅ−セレクチン）であり、他の３個のバイオマーカー／ＰＤの測定平均値は、僅かに増加した（可溶性ＩＬ−２ｒ、ＲＦ、ＴＮＦα）。プラセボ群に関して、バイオマーカー／ＰＤパラメーターのすべてについての平均値は、相対的に未変化のままであったＴＮＦαを除いて、３６０日目でわずかに増加した。
３６０日目の薬物動態測定
ＣＴＬＡＩｇ（ＢＭＳ−１８８６６７）
Figure 2007501243
 データは、図８１〜８７までにおいて、これらのバイオマーカー／ＰＤ測定、ならびにＣＲＰレベルの変化に関して、図示する。
計画した解析の完全性を評価するために、研究の薬物投与を受けたおよびいずれかの理由で中止したすべての患者は、中止後の計画されたすべての研究の来診において、ＡＣＲ応答者とはみなさなかった。これらの解析の結果（表３４）は、すでに示した有効性の結果と一致した。１８０日目で、１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇを受けたおよびＡＣＲ２０、ＡＣＲ５０、またはＡＣＲ７０応答に達した患者の比率は、プラセボを受けた患者の比率に比べて、かなり高かった（ｐ＜０．００１）。２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群において、ＡＣＲ５０またはＡＣＲ７０応答のいずれかに達した患者の比率は、かなり高かった（ｐ≦０．００９）。
Figure 2007501243
 a ＢＭＳ−１８８６６７対プラセボの比較のための統計的な有意差を示す。
さらに、すべて初期の有効性の解析は、ＷＯＣＦ（繰り越しされた最悪の観察結果）データセットで実施した。ＷＯＣＦデータセットに基づくＡＣＲ応答は、表２６で報告されたものより僅かに低く、表３４で示す結果と比較した。これらの結果は、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ−１８８６６７）治療群において、ＡＣＲ応答率の一致を確認した。
同時に用いる抗リウマチ薬の投与量は、６および１２ヶ月において、これらの薬物の必要性を評価するために収集したが、入手したデータは、これらの解析を実行するために不適当であった。メトトレキサートおよび全身（非局所）コルチコステロイドの平均投与量の基準値のみを与えた。
有効性の結果
１０ｍｇ／ｋｇ（＋ＭＴＸ）で投与されたＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ−１８８６６７）は、１８０日および３６０日目で、プラセボ（＋ＭＴＸ）と比べて、有効性が優っていた。下記の有効性のパラメーターに関して、１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇの投与は、プラセボよりかなり良かった：
・初期の有効性の変化：１８０日目のＡＣＲ２０応答（ｐ＜０．００１）
・１８０日目のＡＣＲ５０およびＡＣＲ７０応答（ｐ＜０．００１）
・３６０日目のＡＣＲ２０、ＡＣＲ５０およびＡＣＲ７０応答（ｐ≦０．００３）
・３０日までに観察されたＡＣＲ５０およびＡＣＲ７０応答の統計的な有意差（ｐ＝０．０３９およびｐ＝０．０４）、９０日までに観察されたすべて３個の応答率（ＡＣＲ２０、ＡＣＲ５０およびＡＣＲ７０）の統計的な有意差；これらの値は、３６０日（ｐ≦０．００８）までおよび含む時点で、統計的に有意差があるままであった。
・患者の比率は、３６０日（ｐ＝０．００８）で、主要な臨床応答（継続して６ヶ月以上ＡＣＲ７０応答の維持）に達した。
・３６０日（ｐ＜０．００１）までのＡＣＲ−ＡＵＣの平均数
・１８０日および３６０日（ｐ＜０．０５、９５％ＣＩは、ゼロを含まなかった）において、それぞれ個別のＡＣＲ要素の平均比率を改善
・１８０日および３６０日の両方において（ｐ＜０．０５、９５％ＣＩは、ゼロを含まなかった）、医療効果の評価（ＳＦ−３６）のすべて４つの心およびすべて４つの身体領域における改善
上記の統計的な有意差に加えて、１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群は、１８０日および３６０日において、プラセボ群と比較して、より少ない新規な活動性の関節数および新規な活動性の圧痛および膨張関節が無いと報告される患者数であった。
プラセボと比べて、１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇの有意差のある改善は、大体の測定した薬物動態パラメーター（可溶性ＩＬ１２ｒ、ＲＦ、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチンおよびＩＬ−６）および１年までのＴＮＦ−αの数的な改善において、見られた。
２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ群に関して、いくつかの有効性のパラメーターは、プラセボ群と比べて、かなり良かった：
・１８０日目のＡＣＲ５０応答（ｐ＝０．０２７）
・１８０日目のＡＣＲ７０応答（ｐ＝０．００５）
・６０日目までに観察されたＡＣＲ７０の統計的な有意差（ｐ＝０．０３２）および１８０日目のＡＣＲ５０およびＡＣＲ７０の統計的な有意差（ｐ＝０．０２７およびｐ＝０．００５）
・３６０日目の主要な臨床応答（継続して６ヶ月以上のＡＣＲ７０応答の維持）に達した患者の比率（ｐ＝０．０３６）
・１８０日および３６０日目の個別のＡＣＲ要素のいずれかの平均改善率（ｐ＜０．０５、９５％ＣＩは、ゼロを含まなかった）
他の多くの有効性パラメーターに関して、２ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４Ｉｇは、プラセボよりも数的に良かった。
安全性の結果
概して、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＢＭＳ−１８８６６７）の安全性プロファイルは、プラセボと同様であった。重要な安全性の問題はなかった。
臨床検査の評価
全体的に、新規な安全性の項目は、検査値の変化の平均の評価に現れなかった。ヘモグロビン、ＷＢＣ、好中球、血小板、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＧＧＴおよび全蛋白質の値は、基準の標準的な範囲内であり、本研究の標準的な範囲内のままであった。一般的に、検査テストの結果は、研究の薬物投与に起因して、一定の範囲値から外れるか、または異常な傾向になるかは明らかではなかった。
安全性に関する生命徴候、身体所見、および観察
研究の薬物投与の日のそれぞれにおいて、生命徴候（体温、心拍数、および座位血圧）は、注入前および注入後１５、３０、４５、６０、７５、９０および１２０分でモニタリングした。概して、すべての生命徴候パラメーターに関する平均値は、すべての治療群における３６０日の研究期間を通して、標準的な範囲内であり、安定していた。
実施例８
ヒトの急性冠状動脈症候群を模倣する確立された動物モデルが、存在していなかったとはいえ、動物モデルのアテローム性動脈硬化症を阻害するためのＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの使用は、可能であり得る。マウスのＣＴＬＡ４Ｉｇを使用することは、高脂肪食を維持したアポリポ蛋白質Ｅ ｎｕｌｌ（アポＥ −／−）マウスで維持したアテローム性動脈硬化症を抑制する能力および炎症（すなわち、感染因子、サイトカイン投与）を促進する刺激の有無を調査する。ＣＴＬＡ４Ｉｇは、プラセボ（偽）注射を受けたマウスと比較すると、この動物モデルの動脈硬化性プラーク形成の減少を与えうることを予想した。
実施例９
ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの使用可能性は、さらにいくつかの患者分布において現れる。
不安定狭心症または非ＳＴ上昇心筋梗塞（非ＳＴＥＭＩ）および基礎的な炎症の証拠（すなわち、上昇したｈｓＣＲＰ）を有する入院患者は、プラセボまたはＣＴＬＡ４Ｉｇ／Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのどちらかを受けるためにランダム化する。患者は、標準的な薬物のバックグラウンドまたは倫理的な権限による介入治療を受け、最新の米国心臓協会／米国大学心臓ガイドラインと一致する。主要評価項目は、後の患者の死亡症例の減少および／またはｈｓＣＲＰ（または他の炎症マーカー）によって測定される後のリスク減少に影響する臨床的に複合したものである。
図１Ａは、患者母集団の人口統計データ。上記の実施例３で記載したとおり、性別、人種、および疾患の継続期間を含む人口統計データ。 図１Ｂは、患者母集団の人口統計データ。上記の実施例３に記載した患者および医師によって評価された性別、年齢、体重、および疾患活動性を含む、人口統計データ。 図１Ｃは、上記の実施例３に記載した患者母集団の人口統計学データ。疾患活動性、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）、身体機能（健康調査によって評価された身体障害）、およびＣ反応性蛋白質（ＣＲＰ）を含む、人口統計データ。 図１Ｄは、上記の実施例３に記載した患者母集団の人口統計データ。膨張関節、圧痛関節、朝のこわばり、および痛みを含む、人口統計データ。 図１Ｅは、上記の実施例３に記載した患者母集団の人口統計データ。治療前を含む人口統計データ。 図２は、上記の実施例３に記載した理由による８５日目の中止のまとめ。 図３Ａは、上記の実施例３に記載した８５日目のＡＣＲ応答：ＡＣＲ２０、５０、および７０応答。 図３Ｂは、上記の実施例３に記載したプラセボ応答を含む、８５日目のＡＣＲ−２０応答：９５％信頼限界を持つＡＣＲ−２０応答。 図３Ｃは、上記の実施例３に記載した８５日目のＡＣＲ−２０応答：９５％信頼区間に関する、ＡＣＲ−２０応答の差。 図４Ａは、上記の実施例３に記載した８５日目の患者の比率における膨張および圧痛関節数の基準（２０％改善）の臨床応答：基準の臨床応答、ＡＣＲ−２０。 図４Ｂは、上記の実施例３に記載した８５日目の患者の比率における膨張および圧痛関節数の臨床応答（改善の比率）：改善の比率における臨床応答の変化。 図５Ａは、上記の実施例３に記載した８５日目の患者の比率における痛みの応答（基準からの平均ユニット変化によるライカートスケール）：基準からの痛みのスコアの変化。 図５Ｂは、上記の実施例３に記載した８５日目の患者の比率における全体的な疾患の変化（基準からの平均ユニット変化によるライカートスケール）：患者の全体的な疾患活動性の変化。 図５Ｃは、上記の実施例３に記載した８５日目の患者の比率における医師の全体的な疾患の変化（基準からの平均ユニット変化によるライカートスケール）：医師の全体的な疾患活動性の変化。 図５Ｄは、上記の実施例３に記載した８５日目の患者の比率における痛み（基準からの平均ユニット変化によるライカートスケール）：基準からの痛みの変化。 図６Ａは、上記の実施例３に記載した８５日目の患者の２ユニットの範囲による基準からの疾患活動性変化の包括的な評価；疾患活動性の改善。 図６Ｂは、上記の実施例３に記載した８５日目の患者の２ユニットの範囲による基準からの疾患活動性変化の医師による包括的な評価；疾患活動性の改善。 図７Ａは、上記の実施例３に記載した８５日目のＣ反応性蛋白質（ＣＲＰ）レベルの減少率：基準からのＣＲＰレベルの減少率。 図７Ｂは、上記の実施例３に記載した８５日目のＣ反応性蛋白質（ＣＲＰ）レベルの減少差：９５％信頼区間でのＣＲＰレベルの減少率の差。 図７Ｃは、上記の実施例３に記載した８５日目のＣ反応性蛋白質（ＣＲＰ）レベル減少の平均：基準からの変化の平均。 図８は、上記の実施例３に記載した８５日目の可溶性ＩＬ−２レセプターレベルにおける減少：基準からの変化の平均。 図９Ａは、上記の実施例３に記載した時間以上の圧痛関節におけるＣＴＬＡ４Ｉｇの効果：基準からの差の中央値。 図９Ｂは、上記の実施例３に記載した時間以上の圧痛関節におけるＣＴＬＡ４Ｉｇの効果：基準からの差の平均。 図１０Ａは、上記の実施例３に記載した時間以上の膨張関節におけるＣＴＬＡ４Ｉｇの効果：基準からの差の平均。 図１０Ｂは、上記の実施例３に記載した時間以上の膨張関節におけるＣＴＬＡ４Ｉｇの効果：基準からの差の平均。 図１１は、上記の実施例３に記載した時間以上の痛みの評価におけるＣＴＬＡ４Ｉｇの効果：基準からの差の平均。 図１２Ａは、上記の実施例３に記載した時間以上の疾患活動性の患者の評価におけるＣＴＬＡ４Ｉｇの効果：基準からの差の平均。 図１２Ｂは、上記の実施例３に記載した時間以上の疾患活動性の医師の評価におけるＣＴＬＡ４Ｉｇの効果：基準からの差の平均。 図１３Ａは、上記の実施例３に記載した時間以上の圧痛関節におけるＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの効果：基準からの差の中央値。 図１３Ｂは、上記の実施例３に記載した時間以上の圧痛関節におけるＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの効果：基準からの変化の平均。 図１４Ａは、上記の実施例３に記載した時間以上の膨張関節におけるＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの効果：基準からの差の中央値。 図１４Ｂは、上記の実施例３に記載した時間以上の膨張関節におけるＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの効果：基準からの変化の平均。 図１５は、上記の実施例３に記載した時間以上の痛みの評価におけるＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの効果：基準からの変化の平均。 図１６Ａは、上記の実施例３に記載した時間以上の疾患活動性がある患者の評価におけるＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの評価：基準からの差の平均。 図１６Ｂは、上記の実施例３に記載した時間以上の疾患活動性がある医師の評価におけるＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの評価：基準からの差の平均。 図１７は、実施例３に記載したＣＴＬＡ４ＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ治療の８５日目の基準と比較した健康評価のアンケート（ＨＡＱ）によって評価された患者の身体障害の改善の比率。 図１８は、上記の実施例１に記載したＬ１０４ＥＩｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６〜７）ヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 図１９は、上記の実施例１に記載したＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８〜９）ヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 図２０は、上記の実施例１に記載したＬ１０４ＥＡ２９ＬＩｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０〜１１）ヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 図２１は、上記の実施例１に記載したＬ１０４ＥＡ２９ＴＩｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２〜１３）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 図２２は、上記の実施例１に記載したＬ１０４ＥＡ２９ＷＩｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４〜１５）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 図２３は、ＣＴＬＡ４レセプター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６〜１７）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 図２４は、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８〜１９）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 図２５Ａは、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（レーン１）、Ｌ１０４ＥＩｇ（レーン２）、およびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（レーン３Ａ）のためのＳＤＳゲル（図２５Ａ）；およびＣＴＬＡ４Ｉｇ（図２５Ｂ）およびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのサイズ排除クロマトグラフ（図２５Ｃ）。 図２５Ｂは、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（レーン１）、Ｌ１０４ＥＩｇ（レーン２）、およびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（レーン３Ａ）のためのＳＤＳゲル（図２５Ａ）；およびＣＴＬＡ４Ｉｇ（図２５Ｂ）およびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのサイズ排除クロマトグラフ（図２５Ｃ）。 図２５Ｃは、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（レーン１）、Ｌ１０４ＥＩｇ（レーン２）、およびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（レーン３Ａ）のためのＳＤＳゲル（図２５Ａ）；およびＣＴＬＡ４Ｉｇ（図２５Ｂ）およびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのサイズ排除クロマトグラフ（図２５Ｃ）。 図２６（左右の図）：ＮＭＲスペクトルによって決定された溶液構造から生じたＣＴＬＡ４の細胞外ＩｇＶ様折り畳みのリボン図。図２６（右図）は、突然変異、Ｌ１０４およびＡ２９の結合活性を強める位置および側鎖配向を示すＣＤＲ−１（Ｓ２５−Ｒ３３）領域およびＭＹＰＰＰＹ領域の拡大図を示す。 図２７Ａおよび２７Ｂは、上記の実施例２に記載したＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、Ｌ１０４ＥＩｇ、およびＣＴＬＡ４ＩｇとヒトＣＤ８０またはＣＤ８６形質転換ＣＨＯ細胞の結合を示すＦＡＣＳアッセイ。 図２７Ａおよび２７Ｂは、上記の実施例２に記載したＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、Ｌ１０４ＥＩｇ、およびＣＴＬＡ４ＩｇとヒトＣＤ８０またはＣＤ８６形質転換ＣＨＯ細胞の結合を示すＦＡＣＳアッセイ。 図２８Ａおよび２８Ｂは、上記の実施例２に記載したＣＤ８０陽性およびＣＤ８６陽性ＣＨＯ細胞の増殖阻害を示すグラフ。 図２８Ａおよび２８Ｂは、上記の実施例２に記載したＣＤ８０陽性およびＣＤ８６陽性ＣＨＯ細胞の増殖阻害を示すグラフ。 図２９Ａおよび２９Ｂは、上記の実施例２に記載したように、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが、初期および二次的なアロ刺激したＴ細胞の増殖を阻害するＣＴＬＡ４Ｉｇより有効であることを示すグラフ。 図２９Ａおよび２９Ｂは、上記の実施例２に記載したように、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが、初期および二次的なアロ刺激されたＴ細胞の増殖を阻害するＣＴＬＡ４Ｉｇより有効であることを示すグラフ。 図３０Ａ〜Ｃは、上記の実施例２に記載したＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが、アロ刺激されたヒトＴ細胞のＩＬ−２（図３０Ａ）、ＩＬ−４（図３０Ｂ）、およびガンマ（γ）−インターフェロン（図３０Ｃ）のサイトカイン産生を阻害するＣＴＬＡ４Ｉｇより有効であることを示すグラフ。 図３０Ａ〜Ｃは、上記の実施例２に記載したＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが、アロ刺激されたヒトＴ細胞のＩＬ−２（図３０Ａ）、ＩＬ−４（図３０Ｂ）、およびガンマ（γ）−インターフェロン（図３０Ｃ）のサイトカイン産生を阻害するＣＴＬＡ４Ｉｇより有効であることを示すグラフ。 図３０Ａ〜Ｃは、上記の実施例２に記載したＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが、アロ刺激されたヒトＴ細胞のＩＬ−２（図３０Ａ）、ＩＬ−４（図３０Ｂ）、およびガンマ（γ）−インターフェロン（図３０Ｃ）のサイトカイン産生を阻害するＣＴＬＡ４Ｉｇより有効であることを示すグラフ。 図３１は、上記の実施例２に記載したＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが、フィトヘマグルチン（ＰＨＡ）で刺激されたサルＴ細胞の増殖を阻害するＣＴＬＡ４Ｉｇより有効であることを説明するグラフ。 図３２は、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、Ｌ１０４ＥＩｇ、および野生型のＣＴＬＡ４ＩｇのＣＤ８６Ｉｇへの平衡結合解析を示すグラフ。 図３３Ａおよび３３Ｂは、実施例３に記載した８５日目の基準からの可溶性ＩＣＡＭ−１および可溶性Ｅ−セレクチンレベルの変化の平均における減少。 図３４は、上記の実施例５に記載したメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ治療（２および１０ｍｇ／ｋｇ）の応答において、来診日までにＡＣＲ２０応答の概要を示すグラフ。 図３５は、上記の実施例５に記載したメトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ治療（２および１０ｍｇ／ｋｇ）に応答する来診日までにＡＣＲ５０応答の概要を示すグラフ。 図３６は、上記の実施例５に記載したメトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ治療（２および１０ｍｇ／ｋｇ）に応答する来診日までにＡＣＲ７０応答の概要を示すグラフ。 図３７は、上記の実施例５に記載したメトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ治療（２および１０ｍｇ／ｋｇ）に応答する長期に渡る平均ＡＣＲ−Ｎを示すグラフ。 図３８は、上記の実施例５に記載した９５％信頼区間を用いて、１８０日目のメトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ治療（２および１０ｍｇ／ｋｇ）に応答するＡＣＲ応答を示すグラフ。 図３９は、上記の実施例５に記載した１８０日目のメトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ治療（２および１０ｍｇ／ｋｇ）に応答する新規の活動性がある関節の比率を示す棒グラフ。 図４０は、上記の実施例５に記載した１８０日目のメトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ治療（２および１０ｍｇ／ｋｇ）後のＡＣＲ応答を示す棒グラフ。 図４１は、実施例５に記載した基準からのメトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２および１０ｍｇ／ｋｇ）の平均改善率において、治療後の圧痛関節の改善比率を示すグラフ。 図４２は、実施例５に記載した、基準からのメトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２および１０ｍｇ／ｋｇ）平均改善率において、治療後の膨張関節の改善率を示すグラフ。 図４３は、実施例５に記載した、基準からのメトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２および１０ｍｇ／ｋｇ）平均改善率において、治療後の痛みの改善率を示すグラフ。 図４４は、上記の実施例５に記載した、基準からのメトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２および１０ｍｇ／ｋｇ）平均改善率において、治療後の患者によって、報告された疾患活動性に関する改善率を示すグラフ。 図４５は、上記の実施例５に記載した、基準からのメトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２および１０ｍｇ／ｋｇ）平均改善率において、治療後の医師によって報告された疾患活動性の改善率を示すグラフ。 図４６は、上記の実施例５に記載した、ＨＡＱによって測定された基準からのメトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２および１０ｍｇ／ｋｇ）平均改善率において、治療後の身体機能に関する改善率を示すグラフ。 図４７は、上記の実施例５に記載した、基準からのメトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２および１０ｍｇ／ｋｇ）平均改善率において、治療後のＣＲＰレベル機能の改善率を示すグラフ。 図４８は、上記の実施例５に記載した、基準からのメトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２および１０ｍｇ／ｋｇ）改善率の中央値において、治療後のＣＲＰレベル機能の改善率を示すグラフ。 図４９は、上記の実施例５に記載した、メトトレキサート（ＭＴＸ）単独（９５％信頼限界）で処置した群と比べて、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（２および１０ｍｇ／ｋｇ）治療後の二つの群において、１８０日目のＡＣＲ応答率の差を示すグラフ。 図５０は、上記の実施例５に記載した、メトトレキサート単独（９５％信頼限界）で処置した群と比べて、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（２および１０ｍｇ／ｋｇ)治療後の二つの群において、１８０日目のＳＦ−３６の身体の健康要素のための基準からの変化を示すグラフ。 図５１は、上記の実施例５に記載した、メトトレキサート単独（９５％信頼限界）で処置した群と比べて、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（２および１０ｍｇ／ｋｇ）治療後の二つの群において、１８０日目のＳＦ−３６の身体の健康要素のための基準からの変化を示すグラフ。 図５２は、上記の実施例５に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２および１０ｍｇ／ｋｇ）で治療後、１８０日目のＣＲＰレベルを示すグラフ。 図５３は、上記の実施例５に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２および１０ｍｇ／ｋｇ）で治療後、１８０日目のリウマチ因子レベルを示すグラフ。 図５４は、上記の実施例５に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２および１０ｍｇ／ｋｇ）で治療後、１８０日目のＩＬ−２ｒレベルを示す棒グラフ。 図５５は、上記の実施例５に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２および１０ｍｇ／ｋｇ）で治療後、１８０日目のＩＬ−６レベルで示すグラフ。 図５６は、上記の実施例５に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２および１０ｍｇ／ｋｇ）で治療後、１８０日目のＴＮＦαを示す棒グラフ。 図５７は、上記の実施例５に記載した、１０ｍｇ／ｋｇ体重でＣＴＬＡ４ＩｇのＢＭＳ１０で処置した治療群におけるスクリーニング／登録数での一変量のメトトレキサートの投与量の表。 図５８は、上記の実施例５に記載した、２ｍｇ／ｋｇ体重でＣＴＬＡ４ＩｇのＢＭＳ２処置した治療群におけるスクリーニング／登録数での一変量のメトトレキサート投与量の表。 図５９は、上記の実施例５に記載した、プラセボ群におけるスクリーニング／登録数での一変量のメトトレキサートの投与量の表。 図６０は、上記の実施例５に記載した、１０ｍｇ／ｋｇ体重でＣＴＬＡ４ＩｇのＢＭＳ１０処置した治療群における研究の１８０日目（同日を含む）までの一変量のメトトレキサートの表。 図６１は、上記の実施例５に記載した、２ｍｇ／ｋｇ体重でＣＴＬＡ４ＩｇのＢＭＳ２処置した治療群における研究の１８０日目（同日を含む）までの一変量のメトトレキサートの表。 図６２は、上記の実施例５に記載した、プラセボ群における研究の１８０日（同日を含む）までの一変量のメトトレキサートの表。 図６３は、上記の実施例６に記載した、エタネルセプト単独（週に２回、２５ｍｇ）またはＣＴＬＡ４Ｉｇ（２ｍｇ／ｋｇ)と併用での治療後の二つの群において、１８０日目の修正したＡＣＲ応答率の差を示す棒グラフ。 図６４ａ〜ｃは、上記の実施例６に記載した、エタネルセプト単独（週に２回、２５ｍｇ）またはＣＴＬＡ４Ｉｇ（２ｍｇ／ｋｇ）との併用での治療後、それぞれの来診日に評価する修正したＡＣＲ基準の個別の要素の改善率を示すグラフ。Ａ．圧痛関節数、Ｂ．膨張関節数、Ｃ．痛みの評価。 図６４ａ〜ｃは、上記の実施例６に記載した、エタネルセプト単独（週に２回、２５ｍｇ）またはＣＴＬＡ４Ｉｇ（２ｍｇ／ｋｇ）との併用での治療後、それぞれの来診日に評価する修正したＡＣＲ基準の個別の要素の改善率を示すグラフ。Ａ．圧痛関節数、Ｂ．膨張関節数、Ｃ．痛みの評価。 図６４ａ〜ｃは、上記の実施例６に記載した、エタネルセプト単独（週に２回、２５ｍｇ）またはＣＴＬＡ４Ｉｇ（２ｍｇ／ｋｇ）との併用での治療後、それぞれの来診日に評価する修正したＡＣＲ基準の個別の要素の改善率を示すグラフ。Ａ．圧痛関節数、Ｂ．膨張関節数、Ｃ．痛みの評価。 図６５は、実施例６に記載した、Ａ．エタネルセプト（２５ｍｇ、隔週）単独またはＣＴＬＡ４Ｉｇ（２ｍｇ／ｋｇ）との併用で治療後、二つの群において、１８０日目のＳＦ−３６の身体の健康要素のための基準からの変化を示すグラフ（９５％信頼限界）。Ｂ．上記の実施例６に記載した、エタネルセプト（２５ｍｇ、隔週）単独またはＣＴＬＡ４Ｉｇ（２ｍｇ／ｋｇ）との併用での治療後、二つの群において、１８０日目のＳＦ−３６の身体の健康要素のための基準からの変化を示すグラフ（９５％信頼限界）。 図６６は、シグナルペプチドをコードするＣＴＬＡ４Ｉｇのヌクレオチド配列；ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインの野生型のアミノ酸配列は、＋１位のメチオニンから始まり、＋１２４位のアスパラギン酸まで、または−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸；およびＩｇ領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２１）。 図６７は、シグナルペプチドを有するＣＴＬＡ４Ｉｇのアミノ酸配列；ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインの野生型のアミノ酸配列は、＋１位のメチオニンから始まり、＋１２４位のアスパラギン酸まで、または−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸まで；およびＩｇ領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２２）。 図６８は、上記の実施例７に記載した、３つの母集団の患者の性質を示す説明図。 図６９は、上記の実施例７に記載した、研究の最初の１２ヶ月間にいずれかの理由で中止した患者の統計的な比率のカプラン−マイアープロット。 図７０は、上記の実施例７に記載した、研究の最初の１２ヶ月間に有効性の欠如のために中止した患者の統計的な比率のカプラン−マイアープロット。 図７１Ａは、上記の実施例７に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２または１０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した患者の１８０日目のＡＣＲ応答を示すグラフ。 図７１Ｂは、上記の実施例７に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２または１０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した患者の１８０日目のＡＣＲ応答の差における９５％信頼区間を示すグラフ。 図７２Ａは、上記の実施例７に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２または１０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した患者の３６０日目のＡＣＲ応答を示すグラフ。 図７２Ｂは、上記の実施例７に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２または１０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した患者の３６０日目のＡＣＲ応答の差における９５％信頼区間を示すグラフ。 図７３Ａは、上記の実施例７に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２または１０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した患者において、一年間間隔を開けた期間の来診によるＡＣＲ２０応答をまとめたグラフ。 図７３Ｂは、上記の実施例７に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２または１０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した患者において、一年間間隔を開けた期間の来診によるＡＣＲ５０応答をまとめたグラフ。 図７３Ｃは、上記の実施例７に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２または１０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した患者において、一年間間隔を開けた期間の来診によるＡＣＲ７０応答をまとめたグラフ。 図７４は、上記の実施例７に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２または１０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した患者において、一年以上の期間を開けた来診による平均のＡＣＲ−Ｎを示すグラフ。 図７５は、上記の実施例７に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２または１０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した患者において、１８０日目の新規な活動性がある関節の比率を示すグラフ。 図７６Ａは、上記の実施例７に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２または１０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した患者において、１８０日目の新規な圧痛関節の頻度を示すグラフ。 図７６Ｂは、上記の実施例７に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２または１０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した患者において、３６０日目の患者あたりの新規な圧痛関節の頻度を示すグラフ。 図７７Ａは、上記の実施例７に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２または１０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した患者において、１８０日目の患者あたりの新規な膨張関節の頻度を示すグラフ。 図７７Ｂは、上記の実施例７に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２または１０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した患者において、３６０日目の患者あたりの新規な膨張関節の頻度を示すグラフ。 図７８は、上記の実施例７に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２または１０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した患者において、３６０日目の新規な活動性がある関節の比率を示すグラフ。 図７９Ａは、上記の実施例７に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２または１０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した患者において、Ａ）１８０日目の身体の健康領域における基準からの変化、およびＢ）１８０日目の心の健康領域の基準からの変化を示すグラフ。 図７９Ｂは、上記の実施例７に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２または１０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した患者において、Ａ）１８０日目の身体の健康領域における基準からの変化、およびＢ）１８０日目の心の健康領域の基準からの変化を示すグラフ。 図８０Ａは、上記の実施例７に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２または１０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した患者において、Ａ）３６０日目の身体の健康領域の基準からの変化、およびＢ）３６０日目の心の健康領域の基準からの変化を示すグラフ。 図８０Ｂは、上記の実施例７に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２または１０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した患者において、Ａ）３６０日目の身体の健康領域の基準からの変化、およびＢ）３６０日目の心の健康領域の基準からの変化を示すグラフ。 図８１は、上記の実施例７に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２または１０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した患者において、１８０および３６０日目の基準の可溶性ＩＬ−２ｒレベルを示すグラフ。 図８２は、上記の実施例７に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２または１０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した患者において、１８０および３６０日目の基準のリウマチ因子レベルを示すグラフ。 図８３は、上記の実施例７に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２または１０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した患者において、１８０および３６０日目の基準のＩＣＡＭ−１レベルを示すグラフ。 図８４は、上記の実施例７に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２または１０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した患者において、１８０および３６０日目の基準のＥ−セレクチンレベルを示すグラフ。 図８５は、上記の実施例７に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２または１０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した患者において、１８０および３６０日目の基準の血清ＩＬ−６を示すグラフ。 図８６Ａは、上記の実施例７に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２または１０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した患者において、１８０および３６０日目の基準のＣＲＰレベルを示すグラフ。 図８６Ｂは、上記の実施例７に記載した、メトトレキサート単独またはメトトレキサートおよびＣＴＬＡ４Ｉｇ（２または１０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した患者において、１８０および３６０日目の基準のＴＮＦαレベルを示すグラフ。 図８７は、アテローム切除術標本における活性化したＴ細胞の比率。

Claims (29)

  1. Ｂ７とＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８の相互作用を遮断する分子の有効量を患者に投与することを特徴とする、心臓血管疾患を治療する方法。
  2. Ｂ７とＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８の相互作用を遮断する分子が、可溶性ＣＴＬＡ４分子である、請求項１の方法。
  3. 該心臓血管疾患が、アテローム性動脈硬化症；心臓冠状動脈疾患（ＣＨＤ）；再狭窄；末梢動脈疾患；冠状動脈バイパス手術；頸動脈疾患；動脈炎；心筋炎；心臓血管炎；血管炎；不安定狭心症（ＵＡ）；難治性不安定狭心症；安定狭心症（ＳＡ）；慢性安定狭心症；急性冠状動脈症候群（ＡＣＳ）；心筋梗塞；初期または再発心筋梗塞を含む、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、非Ｑ波心筋梗塞、非ＳＴ上昇心筋梗塞およびＳＴ上昇心筋梗塞からなる群から選択される、請求項１の方法。
  4. 該心臓血管疾患が、アテローム性動脈硬化症；心臓冠状動脈疾患（ＣＨＤ）；不安定狭心症（ＵＡ）；難治性不安定狭心症；安定狭心症（ＳＡ）；慢性安定狭心症；急性冠状動脈症候群（ＡＣＳ）；心筋梗塞；初期または再発心筋梗塞を含む、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、非Ｑ波心筋梗塞、非ＳＴ上昇心筋梗塞およびＳＴ上昇心筋梗塞からなる群から選択される、請求項３の方法。
  5. 該心臓血管疾患が、Ｔ細胞とＢ７陽性細胞の相互作用によって介在される、請求項１の方法。
  6. 該心臓血管疾患が、少なくとも一つの炎症マーカーと関連する、請求項１の方法。
  7. 該炎症マーカーが、ＣＲＰ、ｈｓＣＲＰ、ＩＬ−１０、ＣＤ４０Ｌ、ｓＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−６、ｓＩＣＡＭ−１、ＴＮＦ−α、白血球数、フィブリノーゲン、および血清アミロイドＡからなる群から選択される、請求項６の方法。
  8. 該炎症マーカーが、ＣＲＰ、ｈｓＣＲＰ、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−αからなる群から選択される、請求項７の方法。
  9. 該可溶性ＣＴＬＡ４分子の有効量が、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約０．５〜１００ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、０．５〜５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約５〜１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１０〜１５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１５〜２０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約２０〜２５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約２５〜３０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約３０〜３５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約３５〜４０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約４０〜４５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約４５〜５０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約５０〜５５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約５５〜６０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約６０〜６５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約６５〜７０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約７０〜７５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約７５〜８０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約８０〜８５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約８５〜９０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約９０〜９５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約９５〜１００ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約２〜１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約０．１〜４ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約０．５〜１．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１．０〜１．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１．５〜２．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約２．０〜２．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約２．５〜３．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約３．０〜３．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約３．５〜４．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約４．０〜４．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約４．５〜５．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約５．０〜５．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約５．５〜６．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約６．０〜６．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約６．５〜７．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約７．０〜７．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約７．５〜８．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約８．０〜８．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約８．５〜９．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約９．０〜９．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約９．５〜１０．０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約０．１〜２ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約２〜４ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約４〜６ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約６〜８ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約８〜１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１０〜１２ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１２〜１４ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１４〜１６ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１６〜１８ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約１８〜２０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約０．５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、２ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約０．５〜１００ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、６０ｋｇ以下の患者に対して約５００ｍｇ、６０〜１００ｋｇの患者に対して７５０ｍｇ、または１００ｋｇ以上の患者に対して１０００ｍｇである、請求項２の方法。
  10. 該可溶性ＣＴＬＡ４分子が、活性化したＢ細胞で発現されたＢ７抗原と結合する、ＣＴＬＡ４分子の細胞外ドメイン、またはその一部分を含む、請求項２の方法。
  11. 該ＣＴＬＡ４分子の細胞外ドメインが、＋１位のメチオニンまたは−１位のアラニンで始まり、１２４位のアスパラギン酸で終わる、図２３で示すアミノ酸を含む、請求項１０の方法。
  12. 該可溶性ＣＴＬＡ４分子が、ＣＴＬＡ４融合分子である、請求項２の方法。
  13. 該ＣＴＬＡ４融合分子が、非ＣＴＬＡ４分子と結合した活性化されたＢ細胞で発現されるＢ７抗原と結合する、ＣＴＬＡ４分子の細胞外ドメインを含む、請求項１１の方法。
  14. 該ＣＴＬＡ４分子の細胞外ドメインが、＋１位のメチオニンまたは−１位のアラニンで始まり、１２４位のアスパラギン酸で終わる、図２３で示すアミノ酸を含む、請求項１３の方法。
  15. 該非ＣＴＬＡ４分子が、可溶性ＣＴＬＡ４分子の溶解性または親和性を変えるアミノ酸配列を含む、請求項１３の方法。
  16. 該溶解性または親和性を変えるアミノ酸配列が、免疫グロブリン部を含む、請求項１５の方法。
  17. 該免疫グロブリン部が、エフェクター機能を減少するために、１またはそれ以上の突然変異を含む、請求項１６の方法。
  18. 該免疫グロブリン部が、ヒンジを含み、該ヒンジ内のシステイン残基のいずれかまたはすべてがセリンで置換される、請求項１６の方法。
  19. 該免疫グロブリン部が、免疫グロブリンの定常領域またはその一部である、請求項１６の方法。
  20. 該免疫グロブリン定常領域またはその一部が、エフェクター機能を減少するために突然変異させる、請求項１９の方法。
  21. 該免疫グロブリン定常領域が、免疫グロブリン分子のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む、請求項１９の方法。
  22. 該免疫グロブリン定常領域またはその一部が、ヒトまたはサルの免疫グロブリン定常領域またはその一部である、請求項１９の方法。
  23. 該ＣＴＬＡ４融合分子が、ＣＴＬＡ４Ｉｇである、請求項１２の方法。
  24. 図２４で示されるＣＴＬＡ４Ｉｇが、＋１位のメチオニンまたは−１位のアラニンで始まり、＋３５７位のリジンで終わる、請求項２３の方法。
  25. 該可溶性ＣＴＬＡ４分子が、可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子である、請求項２の方法。
  26. 該可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子が、活性化されたＢ細胞で発現されたＢ７抗原と結合し、ＣＴＬＡ４分子の細胞外ドメイン内の突然変異を含む、請求項２５の方法。
  27. 該可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子が、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを含み、
    ａ）該ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインが、図２３で示すとおり、＋１位のメチオニンまたは−１位のアラニンで始まり、＋１２４位のアスパラギン酸で終わり、該ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインの＋１０４位のロイシンが、他のいずれかのアミノ酸で置換される、請求項２５の方法。
  28. 該可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子が、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを含み、
    ａ）該ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインが、図２３で示すとおり、＋１位のメチオニンまたは−１位のアラニンで始まり、＋１２４位のアスパラギン酸で終わり；
    ｂ）該ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインの＋１０４位のロイシンが、グルタミン酸で置換され；および
    ｃ）該ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインの＋２９位のアラニンが、チロシンで置換される、請求項２５の方法。
  29. 該可溶性ＣＴＬＡ４の突然変異分子が、図１９で示すとおり、＋１位のメチオニンまたは−１位のアラニンで始まり、＋３５７位のリジンで終わる、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇである、請求項２５の方法。
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