CN102786433B - 一种延胡索酰胺类化合物提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药化学领域，公开了一种延胡索酰胺类化合物提取物、化合物及其制备方法和应用。这种延胡索酰胺类化合物提取物中含有50％～55％式(I)结构的化合物，其中主要的化合物为2‑氨基戊酰胺‑5‑乙酸酯和丁酰胺‑4‑乙酸酯。上述延胡索酰胺类化合物提取物可用于制备治疗冠心病、心绞痛或心肌梗塞的药物。
Description
技术领域
本发明涉及医药化学领域，公开了一种延胡索酰胺类化合物提取物及其制备方法和应用。
背景技术
中药延胡索是罂粟科紫堇属植物延胡索(Corydalis yanhusuo W.T.Wang)的干燥块茎，性味辛、苦、温，归肝、脾经，具有活血、利气、止痛的功效。主要用于胸胁脘腹疼痛、经闭、痛经、产后瘀阻、跌扑肿痛等。
关于延胡索的化学成分，文献报道多见为生物碱类化合物，其他成分报道的很少，没有酰胺类化合物的报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种延胡索酰胺类化合物提取物。该提取物从传统中药延胡索中提取而得，提取物中酰胺类化合物的含量为50％-90％。
在该延胡索酰胺类化合物提取物中，酰胺类化合物的结构通式如式(I)，R为含有羰基，羟基，酯基或氨基的烷基。其中主要的化合物为2-氨基戊酰胺-5-乙酸酯和丁酰胺-4-乙酸酯，结构分别如式(II)和(III)所示。
式(Ⅰ)
式(II)
式(III)
在该延胡索酰胺类化合物提取物中，以重量百分比计算，式(Ⅰ)化酰胺类合物的含量为50％～55％，其中2-氨基戊酰胺-5-乙酸酯的含量为20％～40％，丁酰胺-4-乙酸酯等的含量为15％～35％。
本发明还提供了上述延胡索酰胺类化合物提取物的制备方法及其在制备治疗冠心病、心绞痛或心肌梗塞的药物中的应用。
该延胡索酰胺类化合物提取物的制备方法包括以下步骤：
(1)将延胡索药材的乙醇提取物过大孔树脂柱，收集纯水洗脱部位；大孔树脂为中等极性和非极性大孔树脂柱，包括D101、HPD100、X-5、DA201、D301和AB-8中的任意一种；
延胡索药材与大孔树脂柱用量比为1kg∶15～20L；所用纯水与大孔树脂柱体积比为3～5；
(2)收集步骤(1)洗脱液，浓缩至相对密度为1.1～1.2，用1/4～1/2倍乙酸乙酯萃取2～5次，收集萃取后水层；
(3)取步骤2所得的水层溶液，用1/4～1/2倍体积正丁醇萃取2～5次，收集正丁醇层，浓缩干燥即得酰胺类化合物的组分，其中酰胺类化合物含量为50％-90％。
制备方法的步骤(1)中，延胡索药材的乙醇提取物制备方法为：将干燥的10～100目延胡索药材粗粉用5～8倍重量乙醇溶液提取2～4次，浓缩至相对密度1.1～1.2，0～10℃下静置10～48小时，取上清液；乙醇溶液体积浓度为60％～80％。
通过该方法制备的延胡索酰胺类化合物提取物得率为0.06％-0.2％，经过质谱和核磁共振等光谱技术鉴定，其中酰胺类化合物的含量达到了50％-90％，并且通过异羟肟酸铁反应显阳性。
对该延胡索酰胺类化合物提取物进一步研究分析，通过硅胶正相柱色谱柱和反相C18柱色谱柱组合进行分离，得到两个高含量的化合物，用核磁共振进行分子检测，证实这两个化合物为2-氨基戊酰胺-5-乙酸酯和丁酰胺-4-乙酸酯，通过对这两个化合物的含量检测，2-氨基戊酰胺-5-乙酸酯在延胡索酰胺类化合物提取物中的含量为20％～40％，丁酰胺-4-乙酸酯等的含量为15％～35％。
硅胶正相柱色谱柱条件：色谱柱为Hypersil柱(200mm×4.6mm)，流动相为乙腈-醋酸乙酯-甲醇-0.5M NaH2PO4溶液(37∶10∶10∶60，加1％三乙胺，磷酸调pH至3.5)，柱温室温。
反相C18柱色谱柱条件：色谱柱为YMC-液相色谱ODS反相柱(C18柱)，流动相为甲醇∶水∶乙酸＝7∶3∶∶0.1，1∶9∶0.1，PH调至6.5，柱温室温。
根据本发明制备的延胡索酰胺类化合物提取物，经动物试验证实具有抗心肌缺血作用，，加入药剂学接受的辅料后，可以制备各种成药学上可接受的药用制剂，如液体制剂(注射剂、口服液)，固体制剂(片、胶囊剂，胶丸剂)等。
酰胺类化合物是在延胡索中新发现的胺类化合物，其结构和作用机理都不同于延胡索中已发现的主要有效成分生物碱类化合物。通过对酰胺类化合物的相关研究，发现其同样具有抗心肌缺血的作用，有可能成为续延胡索生物碱类化合物外新的延胡索有效成分，同时为全面阐释延胡索抗心肌缺血作用的物质基础及复杂作用机理提供科学依据。而由于生物碱类化合物作用强烈，并有一定的毒性，而本发明制备的延胡索酰胺类化合物提取物安全性良好，如经深入开发，将能够为企业开发出更加安全、有效和质量可控的有关延胡索相关产品，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1为实施例1中延胡索酰胺类化合物提取物的HPLC色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细、完整地说明：
实施例1
(1)干燥的延胡索药材粗粉(10～100目)1kg，加入6kg 80％(v/v)乙醇提取三次，浓缩至25℃下相对密度为115；
4℃下静置24小时，上清液过20L DA201大孔树脂；用80L纯水洗脱并收集纯水洗脱部位，浓缩至25℃下相对密度为1.1～1.2。
(2)水洗脱部位浓缩液加三分之一体积的乙酸乙酯萃取，连续萃取三次。
(3)乙酸乙酯萃取后水层加三分之一体积的正丁醇，连续萃取三次。收集正丁醇萃取液，浓缩干燥，即得延胡索酰胺类化合物提取物，其得率为0.19％。
(4)异羟肟酸比色法测定延胡索酰胺类化合物提取物中酰胺类化合物的含量为85％。
实施例2
按照实施例1步骤，其中步骤1中DA201大孔树脂柱用HPD100、X-5、DA201、D301或AB-8代替。结果延胡索酰胺类化合物提取物得率及酰胺类化合物的含量分别见下表：
| 树脂 | HPD100 | X-5 | DA201 | D301 | AB-8 |
| 得率 | 0.11％ | 0.07％ | 0.16％ | 0.08％ | 0.15 |
| 含量 | 80％ | 65％ | 56％ | 58％ | 76％ |
实施例3
将实施例1所得的提取物进行进一步分析，用硅胶正相柱色谱和反相柱色谱层析分离，具体如下：
相柱色谱柱条件∶色谱柱为Hypersil柱(200mm×4.6mm)，流动相为乙腈-醋酸乙酯-甲醇-0.5M NaH2PO4溶液(37∶10∶10∶60，加1％三乙胺，磷酸调pH至3.5)，柱温室温。
反相C18柱色谱柱条件：色谱柱为YMC-液相色谱ODS反相柱(C18柱)，流动相为甲醇∶水∶乙酸＝7∶3∶∶0.1，1∶9∶0.1，PH调至6.5，柱温室温。
收集其中含量最大的两个组分，并用核磁共振进行分子检测，确定两个化合物为2-氨基戊酰胺-5-乙酸酯(2-ammine pentanamide-5-yl acetate)，另一个化合物为丁酰胺-4-乙酸酯，化学结构式分别如式(II)和(III)，核磁数据分别见表1和表2。
表1丁酰胺-4-乙酸酯的1H NMR和13C NMR数据(CD3OD)(J in Hz)
表2 2-氨基戊酰胺-5-乙酸酯的1H NMR和13C NMR数据(D2O)(J in Hz)
实施例4
2-氨基戊酰胺-5-乙酸酯和丁酰胺-4-乙酸酯的含量检测。
1、仪器与材料
Agilent 1200液相色谱仪(Agilent公司)，乙腈为色谱纯，水为超纯水。
2、色谱条件
色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C8(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：乙腈-水(4∶96)；流速：1ml/min；柱温：25℃；检测波长：210nm
3、样品的制备
取实施例1制备的提取物、化合物1(丁酰胺-4-乙酸酯)和化合物2(2-氨基戊酰胺-5-乙酸酯)标准品1.0mg，精密秤定，置于1ml容量瓶，加纯水，稀释至刻度，即得。
4、酰胺组分HPLC分析
取化合物1和化合物2标准品溶液分别进样10μl，按照上述色谱条件测定各自的保留时间，实施例1制备的提取物样品溶液同法进样，其色谱图和化合物1、2的峰位如图1所示，用归一化法测定峰面积积分值。
5、结果
2-氨基戊酰胺-5-乙酸酯在延胡索酰胺类化合物提取物中的含量为27％，丁酰胺-4-乙酸酯的含量为22％。
用以上同样方法，分别测定实施例2中用不同树脂所得到的提取物中2-氨基戊酰胺-5-乙酸酯和丁酰胺-4-乙酸酯的含量，结果如表3：
表3
实施例5
实施例1所得提取物的药效试验
药理模型：Beagle犬离体腹主动脉环
1.仪器与材料
Beagle犬，雌雄兼用，体重12-15kg，广州医药工业研究院，SCXK(粤)2008-0007。氯化乙酰胆碱(Ach)，1g/支，上海三爱思试剂有限公司，批号：20060328；重酒石酸钠去甲肾上腺素注射液(NA)，2mg/ml，上海禾丰制药有限公司，批号100101。Medlab-U/4CS生物信号采集处理系统，南京美易科技有限公司；肌张力换能器，JZ100型张力换能器(5g)，北京新航兴业科贸有限公司；数控超级恒温槽，SC-15型，宁波天恒仪器厂。
2方法
2.1Beagle犬腹主动脉血管环的制备
Beagle犬麻醉后，放血处死，打开腹腔，迅速游离腹主动脉，截取约1.5cm动脉，置于冰冷的盛有Krebs-Henseleit(K-H)液的平皿中，剔除周围结缔组织，制成约3mm长的血管环。将血管环悬挂于37℃预热容量为8ml K-H液的浴槽中，一端固定，一端通过张力换能器连接Medlab生物信号采集系统。在持续通O2的状态下，基础张力(前负荷)约1.0g，稳定60min左右，期间每15min换液1次。
用60mmol/L的KCl刺激达峰值，然后用K-H液冲洗，重复3次，以诱发血管环的最大收缩幅度。待血管环重新稳定后，用重酒石酸钠去甲肾上腺素注射液(NA)10-6mol/L收缩血管环达峰值，加入氯化乙酰胆碱(Ach)10-5mol/L检验血管内皮完整性。加入Ach后使NA与收缩的血管环舒张80％以上，可以认为血管环内皮完整，可用于实验。
2.2Krebs-Henseleit(K-H)营养液组成(mmol/L)：
NaCl 118，KCl 4.7，KH2PO41.2，MgSO41.2，NaHCO3，25，Glucose 5.5，CaCl22.5。
2.3对腹主动脉环基础张力的影响：
将延胡索酰胺类化合物提取物对内皮完整腹主动脉环基础张力的影响：采用累积加药方法，使灌流液药物浓度分别达到1、10、100、1000mg/L，并与空白对照比较。
2.4结果观察与数据处理：
药物对血管环收缩活动的影响测定，记录血管环张力变化数值，张力变化以血管环收缩幅度变化相对值的百分比(％)，进行t检验，作组间比较。与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
3结果
3.1对Beagle犬腹主动脉血管环收缩活动的影响
延胡索酰胺类化合物提取物的4种浓度对Beagle犬腹主动脉血管环收缩活动作用:在浓度1、10、100和1000mg/L有舒血管作用，舒张百分率分别为:16.5％**、32.1％**、56.7％**和76.4％**，结果见表4。
表4延胡索酰胺类化合物提取物对Beagle犬腹离体主动脉血管环收缩活性的影响(n＝10)
由此可见，延胡索酰胺类化合物提取物各浓度都有明显的舒血管作用，具备开发成心脑血管新药的可能。
实施例6
片剂制备：
将上述配方的粉末混合，通过压片机压片，制成每片为202mg的片剂。该片剂可根据需要包糖衣。
本品也可根据上述方法制备成其它口服制剂。
实施例7
注射剂制备：
延胡索酰胺类化合物提取物100mg
将上述配方的粉末溶于5ml的注射用水中，灌入安培瓶中，灭菌，封口，制备成延胡索酰胺类化合物提取物注射液。
本品也可根据上述方法制备成注射剂冻干制剂。
Claims (7)
1.一种延胡索酰胺类化合物，其特征在于，具有式(I)结构，
其中R为或者
2.一种含有权利要求1所述的延胡索酰胺类化合物的提取物，其特征在于，含有50％～55％具有式(I)结构的化合物，
其中R为或者
3.如权利要求2所述延胡索酰胺类化合物提取物，其特征在于，其中2-氨基戊酰胺-5-乙酸酯含量为22％，丁酰胺-4-乙酸酯含量为32％；或2-氨基戊酰胺-5-乙酸酯含量为25％，丁酰胺-4-乙酸酯含量为28％；或2-氨基戊酰胺-5-乙酸酯含量为33％，丁酰胺-4-乙酸酯含量为21％；或2-氨基戊酰胺-5-乙酸酯含量为38％，丁酰胺-4-乙酸酯含量为16％。
4.一种如权利要求2所述延胡索酰胺类化合物提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将干燥的10～100目延胡索药材粗粉用5～8倍重量的体积浓度60％～80％乙醇溶液提取2～4次，浓缩至相对密度1.1～1.2，0～10℃下静置10～48小时，取上清液；将上清液过大孔树脂柱，收集纯水洗脱部位；所述大孔树脂为中等极性和非极性大孔树脂柱；
(2)收集步骤(1)洗脱液，浓缩至相对密度为1.1～1.2，用1/4～1/2倍体积乙酸乙酯萃取2～5次；
(3)收集步骤(2)的萃取后水层，用1/4～1/2倍体积正丁醇萃取2～5次，收集正丁醇层，浓缩干燥即得酰胺类化合物的组分。
5.如权利要求1所述延胡索酰胺类化合物的制备方法，其特征在于，将权利要求2所述延胡索酰胺类化合物提取物用硅胶正相柱色谱和反相柱色谱层析分离。
6.权利要求1所述延胡索酰胺类化合物在制备治疗冠心病、心绞痛或心肌梗塞的药物中的应用。
7.权利要求2所述延胡索酰胺类化合物的提取物在制备治疗冠心病、心绞痛或心肌梗塞的药物中的应用。
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Denomination of invention: A fumaramide compound extract and its preparation method and application Effective date of registration: 20221024 Granted publication date: 20160921 Pledgee: Bank of China Limited Lanxi Sub-branch Pledgor: ZHEJIANG CONBA PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Registration number: Y2022980019363 |
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Granted publication date: 20160921 Pledgee: Bank of China Limited Lanxi Sub-branch Pledgor: ZHEJIANG CONBA PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Registration number: Y2022980019363 |