CN103272012B - 一种附子甘草提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种附子甘草提取物，它是由附子、甘草加水合煮，煎煮液离心、所得的沉积物干燥，即得；其中，提取物中含有苯甲酰新乌头原碱13.46～125.63μg·g^-1、苯甲酰次乌头原碱8.52～72.47μg·g^-1、苯甲酰乌头原碱13.43～116.74μg·g^-1、新乌头碱4.08～38.53μg·g^-1、次乌头碱7.23～73.65μg·g^-1、乌头碱5.25～49.86μg·g^-1。本发明还提供了该提取物的制备方法和用途。本发明将附子-甘草水煎液在实验研究和工业生产中所得到但常废弃的沉积物部分开发成为潜在的抗心衰提取物，制备工艺简便，产品易得，安全、有效、可控。

Description

一种附子甘草提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种附子甘草提取物，属药物领域。

背景技术

附子为毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliDebx.的子根加工品，首载于《神农本草经》，辛、甘，大热；补火助阳，散寒止痛，主用于亡阳虚脱及阳虚诸症，被誉为乱世之良将，回阳救逆之第一品。然附子毒性极大，《神农本草经》曰：“有毒宜制，可用相畏相杀也”。历代医家依据七情配伍之“相畏/相杀”理论，多以甘草味甘性缓之性缓和附子峻烈之性，减毒增效。《景岳全书》云：“附子之性急，得甘草而后缓；附子之性毒，得甘草而后解”。附子为毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliDebx.的子根加工品，首载于《神农本草经》，辛、甘，大热；补火助阳，散寒止痛，主用于亡阳虚脱及阳虚诸症，被誉为乱世之良将，回阳救逆之第一品。然附子毒性极大，《神农本草经》曰：“有毒宜制，可用相畏相杀也”。历代医家依据七情配伍之“相畏/相杀”理论，多以甘草味甘性缓之性缓和附子峻烈之性，减毒增效。《景岳全书》云：“附子之性急，得甘草而后缓；附子之性毒，得甘草而后解”。

发明内容

本发明的技术方案是提供了一种附子甘草提取物。本发明的另一技术方案是提供了该提取物的制备方法和用途。

本发明提供了一种附子甘草提取物，它是由附子、甘草加水煎煮，煎煮液离心、所得的沉积物干燥，即得；其中，提取物中含有苯甲酰新乌头原碱13.46～125.63μg·g^-1、苯甲酰次乌头原碱8.52～72.47μg·g^-1、苯甲酰乌头原碱13.43～116.74μg·g^-1、新乌头碱4.08～38.53μg·g^-1、次乌头碱7.23～73.65μg·g^-1、乌头碱5.25～49.86μg·g^-1。

其中，所述的附子、甘草的重量配比为：

附子1-10份、甘草1-10份。

进一步优选地，所述的附子、甘草的重量配比为：

附子1份、甘草1份。

其中，所述的提取物的指纹图谱具有28个特征峰，其保留时间为：1号峰：2.3min、2号峰：3.2min、3号峰：3.5min、4号峰：5.0min、5号峰：5.9min、6号峰：9.1min、7号峰：11.3min、8号峰：11.5min、9号峰：12.0min、10号峰：25.0min、11号峰：27.2min、12号峰：27.8min、13号峰：28.1、14号峰：28.6min、15号峰：28.9min、16号峰：29.2min、17号峰：29.4min、18号峰：29.9峰、19号峰：30.3min、20号峰：31.1min、21号峰：31.4min、22号峰：31.8min、23号峰：32.6min、24号峰：33.2min、25号峰：33.7min、26号峰：34.9min、27号峰：35.5min、28号峰：35.9min；

其色谱条件为：色谱柱：AgilentEclipsePlusC18柱（4.6mm×100mm，3.5μm）；流动相：5mmol·L-1醋酸铵（含0.1%醋酸）为A相，以乙腈（含0.1%甲酸）为B相，梯度洗脱条件按下表；流速0.4L·min-1；柱温：30°C；进样量10μL；

梯度洗脱条件

其中，所述的提取物的HPLC指纹图谱如图1所示。

本发明还提供了一种制备所述的附子甘草提取物的方法，包括如下步骤：

a、称取原料附子、甘草；

b、加水煮沸，汤液离心，得沉积物；

c、将沉积物干燥，即得。

本发明还提供了所述的附子甘草提取物在制备抗心衰的药物中的用途。

本发明提供了一种抗心衰的药物组合物，它包含所述的附子甘草提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药剂。

其中，所述的药剂是口服制剂。

目前对于附子-甘草药对的研究，大多集中在两者配伍前后毒（效）成分、毒（效）作用变化方面，属于基础研究，未涉及产品利用与开发；在以附子-甘草药对为基础的四逆汤应用开发方面，常采用水提醇沉法，将提取液产生的沉积物除去。但通过研究发现，附子-甘草水煎液产生的沉积物含有较多量的酯型生物碱，同时具有一定的抗心衰作用。因此，本发明将附子-甘草水煎液在实验研究和工业生产中所得到但常废弃的沉积物部分开发成为潜在的抗心衰提取物，制备工艺简便，产品易得，安全、有效、可控。

本发明将附子-甘草水煎液在实验研究和工业生产中所得到但常废弃的沉积物部分开发成为潜在的抗心衰提取物，制备工艺简便，产品易得，安全、有效、可控。

附图说明

图1附子甘草合煎液沉积物HPLC-TOF/MS总离子流图

图2附子单煎液沉积物HPLC-TOF/MS总离子流图

图3空白K-R液（A）和空白K-R液含混合对照品（B）LC-MS分析图（1：新乌头碱对照品；2：次乌头碱对照品；3：乌头碱对照品）

图4双酯型生物碱在大鼠各肠段的累积吸收浓度曲线

图5双酯型生物碱在大鼠各肠段的吸收速率常数和表观渗透系数比较结果

图6空白人工肠液（A）和人工肠液含混合对照品（B）LC-MS分析图（1：新乌头碱对照品；2：次乌头碱对照品；3：乌头碱对照品）

具体实施方式

实施例1本发明提取物的制备

附子甘草配伍大火煮沸小火微沸30min后，汤液离心所得的大量沉积物，干燥，即得。

实施例2本发明提取物的制备

取生附片:炙甘草（1:1）100g，置于同一圆底烧瓶中，加适量水，浸泡后加热回流煎煮，大火煮沸后保持微沸30min，趁热滤除药渣，将药液静置至室温后，即可见汤液底部出现大量沉积物，将其离心10min（4000r·min^-1），去上清；加入少量水快速洗涤，离心去上清，重复洗涤两次，收集附子甘草合煎液沉积物，采用冷冻干燥法，将其沉积物干燥成浸膏粉末。

实施例3本发明提取物的制备

取生附片:炙甘草100g（1:1），置于同一圆底烧瓶中，加800mL水，浸泡30min，加热回流煎煮，大火煮沸后保持微沸30min，趁热滤除药渣，将药液静置至室温后，即可见汤液底部出现大量沉积物，将其离心10min（4000r·min^-1），去上清；加入少量水快速洗涤，离心去上清，重复洗涤两次，收集附子甘草合煎液沉积物，采用冷冻干燥法，将其沉积物干燥成浸膏粉末。

实施例4本发明提取物的质量控制方法

1、样品制备

附子单煎液沉积物：取生附片50g置于圆底烧瓶，加适量水，浸泡后加热回流煎煮（具体地：加800mL水，浸泡30min），大火煮沸后保持微沸30min，趁热滤除药渣，将药液静置至室温后，即可见汤液底部出现大量沉积物，将其离心10min（4000r·min^-1），去上清；加入少量水快速洗涤，离心而去上清，重复洗涤两次，收集得附子单煎液沉积物，采用冷冻干燥法，将其沉积物干燥成浸膏粉末。

附子-甘草合煎沉积物：取生附片:炙甘草100g（1:1），置于同一圆底烧瓶中，加适量水，浸泡后加热回流煎煮（具体地：加15倍水，浸泡30min），大火煮沸后保持微沸30min，趁热滤除药渣，将药液静置至室温后，即可见汤液底部出现大量沉积物，将其离心10min（4000r·min^-1），去上清；加入少量水快速洗涤，离心去上清，重复洗涤两次，收集附子甘草合煎液沉积物，采用冷冻干燥法，将其沉积物干燥成浸膏粉末。

供试品溶液制备：分别称取上述附子单煎及附子-甘草合煎沉积物0.1g，置于1mL容量瓶中，加入100μL盐酸将沉积物溶解，甲醇定容，0.22μm微孔滤膜滤过，进样。

2、色谱条件

其色谱条件为：色谱柱：AgilentEclipsePlusC18柱（4.6mm×100mm，3.5μm）；流动相：5mmol·L-1醋酸铵（含0.1%醋酸）为A相，以乙腈（含0.1%甲酸）为B相，梯度洗脱按照表1；流速0.4L·min-1；柱温：30°C；进样量10μL；

表1梯度洗脱条件

3、色谱质谱条件的优化

由于沉积物化学成分复杂，因此采用梯度洗脱分离被测化合物。试验中考察了乙腈-水、甲醇-水系统，发现乙腈-水洗脱系统中各色谱峰峰形较好，故选择乙腈作为有机相。

试验中发现在流动相体系中加入甲酸可有效抑制甘草皂苷类和黄酮类等酸性化合物的拖尾，并增加生物碱类成分的质谱响应；同时分别考察了甲酸浓度在0.01%、0.1％、1%时样品出峰情况，试验发现加入0.01%甲酸时，色谱峰效应值较低，0.1％、1%甲酸均能有效抑制酸类物质的拖尾情况，且大多数成分有较好质谱响应。故最终采用0.1％甲酸水溶液作为水相。

分别比较了正、负离子两种扫描模式下质谱检测，结果发现正离子模式下生物碱类成分峰容量大、质谱响应强，而甘草类成分响应值较低，负离子模式下则相反。由于本试验重点在于关注沉积物中附子生物碱成分体内外变化，故本试验最终选择在正模式下进行。

附子单煎液沉积物HPLC-TOF/MS总离子流图见图2，附子甘草合煎液沉积物HPLC-TOF/MS总离子流图见图1。

4、附子-甘草配伍前后沉积物化学成分数据库建立

根据附子-甘草药对的化学成分研究报道，收集了乌头属生物碱类、三萜皂苷类、黄酮类化学成分及其质谱信息。

按照前述方法，对附子单煎液所得沉积物进行鉴定分析，共指认出响应值较高的26个峰，包括28种化合物，已鉴定出25种化合物及其结构，建立相应的化学成分数据库，结果见表2；

表2附子单煎沉积物LC-MS/MS成分分析鉴定结果

按照前述方法，对附子甘草合煎液所得沉积物进行鉴定分析，共指认出响应值较高的28个峰，共34种化合物，其中包括10种甘草成分及24种附子成分信息，已鉴定出32种化合物及其结构，建立相应的化学成分数据库，结果见表3；

表3附子甘草合煎沉积物LC-MS/MS成分分析鉴定结果

5、附子-甘草配伍前后沉积物中酯型生物碱含量对比

①对照品溶液制备

精密称取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱、乌头碱对照品适量于容量瓶中，加入二氯甲烷-异丙醇（1:1）混合溶液定容，配置成六种酯型生物碱的储备液，其中含苯甲酰新乌头原碱17.15μg·mL^-1，苯甲酰乌头原碱10.81μg·mL^-1，苯甲酰次乌头原碱8.55μg·mL^-1，新乌头碱6.37μg·mL^-1，次乌头碱46.51μg·mL^-1，乌头碱7.85μg·mL^-1。

分别吸取不同体积的该浓度混合对照品储备液，配置成不同浓度混合对照品溶液，均置于4°C下保存。

②线性关系考察

取上述不同浓度混合对照品溶液，进样10μL，按上述HPLC-TOF/MS分析条件测定，以进样浓度（μg·mL^-1）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表4。

表4线性关系试验结果

③精密度考察

取混合对照品储备液，连续进样6次，进样10μL，依法测定，记录峰面积，结果苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱、乌头碱RSD分别为0.43%、0.55%、0.46%、0.63%、0.75%、0.69%，表明仪器精密度良好。

④稳定性考察

取附子-甘草合煎液沉积物样品，分别于室温下0、2、4、8、12、16h，进样10μL，依法测定，记录峰面积，结果苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱、乌头碱RSD分别为0.79%、1.14%、0.74%、0.88%、1.16%、1.26%，表明样品在16h内稳定。

⑤重复性考察

按照上述供试品制备方法，平行制备附子-甘草合煎沉积物样品6份，进样10μL，依法测定，记录峰面积，结果苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱、乌头碱RSD分别为1.75%、1.69%、2.54%、2.79%、2.48%、2.74%，表明该方法重复性较好。

⑥加样回收率考察

取已知含量的附甘合煎沉积物样品6份，分别加入一定量的混合对照品，进样10μL，依法测定，结果苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱、乌头碱平均加样回收率分别为94.65%、95.26%、102.67%、103.21%、95.36%、96.97%，RSD分别为2.46%、3.23%、2.84%、2.18%、1.96%、2.48%。

⑦含量测定

按上述分析条件，分别测定附子单煎、附子-甘草合煎液沉积物中六种酯型生物碱的含量，结果如表5。

表5LC-MS对比分析附子配伍甘草前后沉积物中酯型生物碱含量结果（μg·g^-1）

结果显示，附子配伍甘草合煎沉积物中含有较大量的酯型生物碱，而附子单煎所得沉积物中所含酯型生物碱较少。

以下通过药效学试验证明本发明的有益效果。

试验例1本发明附子-甘草组合物毒性考察

取正常SD大鼠，雌雄各半，均分为两组，分别为空白对照组和附甘组合物组。常规饲养一周后开始给药，按照1mL药液/100g大鼠体重规格，将实施例2制备的附甘组合物研细后加入适量10%PEG-400水溶液配制成混悬液，供附甘组合物组动物灌服，空白对照组灌服10%PEG-400水溶液。各组实验动物连续灌服一周，每天一次，称重并观察各组大鼠机体状态，记录其异常体征，结果见表6，表7。

表6附子-甘草组合物对大鼠体重的影响

注：VS空白组*P＜0.05

结果显示，连续灌胃附甘组合物一周后，未见显著影响大鼠体重正常增长率(P＜0.05）。

表7灌胃附子-甘草组合物后大鼠毒性症状观察结果

结果显示，空白对照组大鼠均未出现中毒症状，而灌胃附甘组合物后大鼠未见明显中毒反应。

试验例2本发明附子-甘草组合物抗心衰作用研究

取正常SD大鼠，雌雄各半，采用20%乌拉坦0.5ml·100g^-1腹腔注射麻醉大鼠，将其固定后分离右侧颈总动脉，经颈总动脉插入充满肝素的导管进入左心室，另一端通过压力换能器连接16道生理记录仪，当血压峰最低点在0mmHg时说明插管成功，同步测量左室内压、左室舒张末期压、左室最大上升速率、左室最大下降速率等各项血流动力学指标，在大鼠四肢皮下埋入针式电极，观察心电图，并记录心率。记录实验动物的正常指标后，尾静脉恒速注射1.0%戊巴比妥纳(6ml·h^-1)当左室最大上升速率降到正常值的20%～40%，以3ml·h^-1速度维持给药5min，即视为心衰模型成功。

将实验动物均分为三组，分别为空白对照组、模型对照组和附甘组合物组，按照1mL药液/100g大鼠体重规格，空白对照组和模型对照组十二肠注射给予10%PEG-400水溶液，附甘组合物组十二肠注射给予沉积物的10%PEG-400混悬液，分别记录和测定给药30min后各组实验动物血流动力学、心电图和心率指标，结果见表8，表9。

表8附子甘草组合物对急性心衰大鼠血流动力学的影响

注：VS模型组*P＜0.05；VS空白组^▲P＜0.05

结果显示，附子甘草沉积物可显著提高急性心衰大鼠的左心室内压、左室最大上升和下降速率（P<0.05），且显著降低其左室舒张末期压（P<0.05），表明附子甘草沉积物可明显改善大鼠心衰。

表9附子甘草组合物对急性心衰大鼠心电参数及心率的影响

注：VS模型组*P＜0.05；VS空白组^▲P＜0.05

结果显示，附子甘草沉积物可显著提高急性心衰大鼠的心率减慢现象（P<0.05），缩短心衰大鼠PR间期、QRS间期、QTC间期等心电图参数（P<0.05），表明附子甘草沉积物可明显改善大鼠心衰。

试验例3外翻肠囊法研究附甘合煎沉积物中三种双酯型生物碱小肠吸收动力学特性

1.1分析条件

色谱条件：色谱柱：AgilentEclipsePlusC₁₈柱（4.6mm×100mm，3.5μm）；流动相为5mmol·L^-1醋酸铵（含0.1%醋酸）：（含0.1%甲酸）（50:50），其余同前；流速0.4L·min^-1；柱温：30°C；进样量10μl。

质谱条件：电喷雾离子化源（ESI），离子源电压：4500V，干燥气流速：6L·min^-1；雾化气压力：2Bar；干燥气温度：180°C；质谱扫描范围150-1000m/z，正离子模式采集。

1.2样品制备

①对照品溶液制备

对照品溶液制备：取三种双酯型乌头碱对照品适量，精密称定，加入少量2%盐酸-甲醇溶液，超声使溶解，加入K-R液定容至刻度，摇匀，得其储备液，其中乌头碱浓度为15.374μg·ml^-1，次乌头碱浓度为21.1μg·ml^-1，新乌头碱浓度为12.674μg·ml^-1。

②供试品溶液制备

称取实施例2制备的适量干燥的附子甘草合煎沉积物，先用少量0.1%HCL溶解，再加入0.1%NaOH液调pH至中性后，加入K-R液配制为1g·ml^-1供试品溶液，其中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱浓度分别为46.6μg·ml^-1，56.53μg·ml^-1和39.64μg·ml^-1。

1.3样品处理

将样品置于冷冻干燥机中干燥6h至残渣，加入0.1%氨水0.2ml，乙醚3ml，涡旋2min，4000r·min^-1离心10min，吸取上层液，反复操作2次，合并上层液，氮气吹干，精密加入甲醇200μl，涡旋1min，12000r·min^-1离心10min。

1.4三种双酯型生物碱在空白Krebs液中测定方法的建立

①线性范围考察

分别精密吸取“1.2”项下双酯型生物碱混合对照品储备液溶液适量，用K-R液分别稀释成不同浓度的新乌头碱、次乌头碱、乌头碱对照品溶液。参照“1.3”项下方法处理样品，进样5μl，记录乌头碱、次乌头碱、新乌头碱色谱峰面积，以样品浓度（X）对各待测物质峰面积（Y）进行线性回归，结果见表10。

表10K-R液中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱标准曲线及线性范围

②专属性考察

配制空白K-R试液、对照品的K-R试液，分别在上述色谱条件下考察空白试剂、对照品是否有干扰，图谱见图3，由图可知，空白K-R试剂和对照品之间无干扰。

③精密度考察

精密吸取高、中、低三个不同浓度混合对照品溶液适量，稀释成不同浓度的新乌头碱、次乌头碱、乌头碱对照品溶液，进样测定。测定同一样品，以1d内测定6次的峰面积结果和连续3d内测定的峰面积结果计算日内和日间精密度，其RSD值均小于3%，表明该试验方法精密度良好。

④稳定性考察

配制一定浓度混合对照品溶液，密封置于37°C恒温水浴中，分别于0、1、2、4、6、8、12h取样分析，按“1.3”项下方法处理样品，进样测定，其RSD值均小于5%，表明各成分在K-R溶液12h内较稳定。

⑤回收率试验

配制双酯型生物碱混合对照品6份，测定含量，精密移入“1.2”新鲜配制的混合对照品储备液1.0ml，按“1.3”方法处理样品，其新乌头碱、次乌头碱、乌头碱平均回收率分别为101.96%、101.19%、102.27%，RSD值分别为3.15%、1.37%、2.23%，表明该方法回收率较好。

1.5外翻肠囊法肠细胞活性评价

采用乳酸脱氢酶(LDH)法检测肠细胞的活性，分别于15、30、45、60、90、120分钟在黏膜侧取样200μL，以双波长分光光度法在440nm处进行测定吸光度A值，按照试剂盒使用说明书上的方法计算LDH的活力，考察肠细胞的活性，最终确定离体肠外翻试验的试验周期，结果见表11。

表11LDH样品测定结果

注：VS15min活力值**P<0.01

结果显示，小肠细胞在90分钟内LDH活力波动不大，而在90分钟后LDH活力值显著增大，表明此时细胞受损较严重，因此确定本试验中试验周期为90分钟。

1.6外翻肠囊制备

取健康SD大鼠，试验前禁食不禁水12h，脱颈处死，打开腹腔，剪取胃幽门以下约10cm十二指肠段。用0°CKrebs液冲洗内容物，去除肠系膜和脂肪，一端用细线扎紧，用玻璃棒轻柔的将肠管翻转使黏膜面朝外，另一端绑扎于取样口，使之形成囊状肠管，用注射器从取样口向肠内注入2ml空白Krebs液，作为受药体系。

将整个装置放入通入95%O₂/5%CO₂麦氏浴槽(37°C)中平衡10min。10min后，将肠段迅速置于盛有10ml供试品溶液的麦氏浴槽(37°C)中（继续通入95%O₂/5%CO₂），开始计时。分别于10，20，30，45，60，90min从肠囊内取样0.2ml，同时补足相同体积的空白Krebs液。样品置于-20°C冷冻保存，待测。

1.7数据处理

药物累积吸收量按下列公式计算：

$Q_n=C_{n}V+\underset{i=1}{\overset{n-1}{\mathrm{\&Sigma;}}}{C}_i{V}_i---\left(1\right)$

式中，Q_n为药物各时间点的累积吸收量，n为取样次数，V为肠囊内溶液体积，V_i为取样体积，C_n为n时间点的实际检测浓度。

吸收速率常数K_a（μg·min^-1·cm^-2)）按下列公式计算：

$K_a=\frac{K}{A}---\left(2\right)$

式中，K为以药物累计吸收量对时间进行线性回归所得斜率，A为药物透过的表面积（肠段腔膜表面积）。

表观渗透系数P_app（nm/s）按下列公式计算：

$P_{\mathrm{app}}=\frac{\mathrm{\&Delta;Q}}{\mathrm{\&Delta;t}\&CenterDot;A\&CenterDot;C_0}---\left(3\right)$

式中，ΔQ为药物在Δt时间内透过的量，A为药物透过的表面积（肠段腔膜表面积），C₀为供体侧的初始浓度。

1.8不同肠段对沉积物中双酯型生物碱吸收的影响

配制0.5g·ml^-1供试品溶液（乌头碱、次乌头碱、新乌头碱分别为46.6μg·ml^-1，56.53μg·ml^-1和39.64μg·ml^-1），对大鼠小肠的十二指肠、空肠、回肠3个肠段，按照外翻肠囊法进行离体试验研究，试验周期中各肠段累积吸收浓度结果见图，不同肠段吸收速度常数K_a和表观渗透系数P_app见图4、图5。

试验结果显示，随着时间的增加，大鼠小肠壁的三种双酯型生物碱的透过量均同步增加，并且在90分钟内未出现饱和现象。根据试验考察周期内药物浓度变化情况可知，乌头碱、新乌头碱、次乌头碱在大鼠离体小肠各肠段的通过量由多到少依次为空肠>回肠>十二指肠。

吸收速率常数和表观渗透系数比较结果如图5所示，三种双酯型生物碱在三个不同肠段中转运情况均出现：次乌头碱＞新乌头碱＞乌头碱，同时回肠段吸收与其他肠段相比存在显著性增加（P<0.05）。

试验例4在体肠灌流模型研究本发明附甘合煎沉积物中三种双酯型生物碱小肠吸收动力学特性。

2.1分析条件

同“试验例31.1”项下。

2.2样品制备

①对照品溶液制备

取三种双酯型乌头碱对照品适量，精密称定，加入2%盐酸-甲醇溶液，超声使溶解，加入空白人工肠液定容至刻度，摇匀，得其储备液，其中乌头碱浓度为16.783μg·ml^-1，次乌头碱浓度为22.674μg·ml^-1，新乌头碱浓度为13.475μg·ml^-1。

②供试品溶液制备

空白人工肠液制备：取空白K-R液，按大鼠在体肠灌流方法灌流，收集流出液即得。

称取适量干燥的附子甘草合煎沉积物，先用少量0.1%HCL溶解，再加入0.1%NaOH液调pH至中性后，加入空白肠循环液配制为0.5g·ml^-1供试品溶液。2.3样品处理

同“1.3”项下。

2.4三种双酯型生物碱在空白人工肠液中测定方法的建立

①线性范围考察

分别精密吸取“2.2”项下双酯型生物碱混合对照品储备液溶液适量，用空白人工肠循环液分别稀释成6个不同浓度。参照“2.3”项下方法处理样品，进样5μl，记录乌头碱、次乌头碱、新乌头碱色谱峰面积，以样品浓度（X）对各待测物质峰面积（Y）进行线性回归计算，结果见表12。

表12人工肠循环液中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱标准曲线及线性范围

②专属性考察

配制空白人工肠液、人工肠液配制混合对照品溶液，分别在上述色谱条件下考察空白试剂是否干扰对照品测定。由图6可知，空白人工肠液和对照品之间无干扰。

③精密度考察

精密吸取高、中、低三个不同浓度混合对照品溶液适量，按“2.3”项下方法处理样品，进样测定。测定同一样品，以1d内测定6次的峰面积结果和连续3d内测定的峰面积结果计算日内和日间精密度，其RSD均小于3%，表明该试验方法精密度良好。

④稳定性考察

小肠内环境pH可能在一定范围内波动，不同pH下药物的稳定性可能不同，故首先考察双酯型生物碱在不同pH下的K-R液中的稳定性情况。

加入适当醋酸调节K-R液pH值，分别得到pH7.4、6.8及6.0的K-R液，均配制成含三种双酯型生物碱的对照品溶液，置于37°C恒温水浴中，分别在0、4h取样，测定各成分浓度，与水浴前比较。结果显示三者成分剩余百分比均大于95%，表明双酯型生物碱在pH6.0~7.4的人工肠液中稳定性均较好。

以pH7.4的K-R液配制混合对照品溶液，密封置于37°C恒温水浴中，分别于0、1、2、4、6、8、12h取样分析，按“2.3”项下方法处理样品，进样测定，结果表明各成分RSD值均小于5%，显示其在pH7.4的K-R溶液12h内较稳定。

⑤回收率试验

配制以pH7.4的K-R液配制双酯型生物碱混合对照品溶液6份，测定含量，精密移入新鲜配制的混合对照品储备液1.0ml，按“2.3”项下方法处理样品，测定含量。结果表明三种成分回收率RSD值均小于5%，显示该方法具有较好的回收率。

由上方法学考察可知，本试验所建立的三种双酯型生物碱在人工空白肠液中测定方法专属性、稳定性、重复性等均较好。

2.5肠壁与灌流装置对双酯型生物碱物理吸附的考察

试验前将大鼠禁食不禁水12h，腹腔注射5ml·kg^-1的20%乌拉坦麻醉并固定，沿腹中线打开腹腔，生理盐水冲洗肠段以排空内容物，取出小肠，置于冰浴的K-R营养液中，通入95%O₂/5%CO₂，用镊子去除肠系膜，将硅胶管连接于肠段两端，置于37±0.5°C含供试品的K-R试液中(乌头碱、次乌头碱、新乌头碱浓度分别为45.74μg·ml^-1，55.86μg·ml^-1和40.23μg·ml^-1)，以灌流流速控制在0.25ml·min^-1，平衡10分钟后开始取样计时，循环2小时后取样，测定双酯型生物碱的浓度，计算得到循环2h后三种双酯型生物碱的剩余百分比见表，结果表13，表明大鼠肠壁和灌流装置对三种双酯型生物碱无显著物理吸附。

表13双酯型生物碱循环2h后剩余百分比

2.6大鼠在体单向灌流模型制备

取清洁级SD大鼠，雌雄各半，禁食不禁水12h后，腹腔注射5ml·kg^-1的20%乌拉坦麻醉并固定，沿腹中线打开腹腔，对需要考察的肠段于两端剪切后插管，结扎，入口处的插管与蠕动泵相连，手术完成后红外灯保持37°C体温。用37°C恒温的生理盐水以5ml·min^-1的速度将肠内容物冲洗干净，再用空气将生理盐水排空，装好装置。

改用已知重量并装有供试液的试管进行灌流，出口处用已知重量的试管接流出的灌流液，灌流流速控制在0.25ml·min^-1，平衡10min，并将其灌流液舍去，开始计时，后每隔30min迅速更换一次装有供试液的试管和用来收集灌流液的试管，并称重，计算泵入供试液的重量(ω_in),并测定每10min内收集到流出液(ω_out)的重量。直至120min结束试验。将考察的肠段剪下，测量其长度(L)和内径(r)。

2.7数据处理

采用重量法对灌流液流入和流出的体积进行校正,消除其体积变化的影响。

药物吸收速率常数(K_a′)的计算:

$K_a\&prime;=(1-\frac{C_{\mathrm{out}}{Q}_{\mathrm{oout}}}{C_{\mathrm{in}}{Q}_{\mathrm{in}}})\frac{Q}{V}$

药物表观吸收系数(P_app′)的计算:

$P_{\mathrm{app}}\&prime;=\frac{-Q\ln \left(\frac{C_{\mathrm{out}}{Q}_{\mathrm{out}}}{C_{\mathrm{in}}{Q}_{\mathrm{in}}}\right)}{2\mathrm{\&pi;rl}}$

式中，C_in和C_out分别为肠道进出口灌流液药物浓度(μg·m1^-1)；Q_in和Q_out分别为肠道进出口灌流液的体积(ml)(进出口灌流液密度为1.0g·m1^-1)；l和r分别为被灌流肠段的长度(cm)和横截面半径(cm)；Q为灌流速度(ml·h^-1)；V为灌流肠段的体积(ml)。

2.8大鼠在体不同肠段对沉积物中双酯型生物碱吸收的影响

对大鼠肠段进行结扎：十二指肠段(自幽门1cm处开始往下10cm处)；空肠段(自幽门15cm处往下10cm处)；回肠段(离盲肠上行20cm处开始往下10cm处)，其他步骤同“3.3.2.6”项；考察大鼠不同肠段对药物吸收的影响，其试验结果见表14。

表14双酯型生物碱在不同肠段的在体肠吸收特性

注：VS十二指肠**P＜0.01；VS乌头碱^▲P＜0.01

对各肠段吸收速率常数K_a'和表观吸收系数P_app'进行方差分析结果表明，新乌头碱、次乌头碱、乌头碱在十二指肠段和其他肠段比较，吸收速率常数和表观吸收系数差异显著（P＜0.01），以回肠段吸收最大，十二肠和空肠吸收无显著性差异；新乌头碱、次乌头碱、乌头碱三者在回肠段吸收比较，次乌头碱＞新乌头碱＞乌头碱，同时次乌头碱与乌头碱具有显著性差异（P＜0.01）。

2.9不同药物浓度对大鼠肠吸收的影响

分别选用高浓度（新乌头碱：40μg·ml^-1、次乌头碱：55μg·ml^-1、乌头碱：45μg·ml^-1），中浓度（新乌头碱：8μg·ml^-1、次乌头碱：11μg·ml^-1、乌头碱：9μg·ml^-1），低浓度（新乌头碱：4μg·ml^-1、次乌头碱：5.5μg·ml^-1、乌头碱：4.5μg·ml^-1）的附子甘草合煎沉积物供试液，进行回肠部位肠段灌流，其他步骤同“2.6”项，考察药物浓度对吸收的影响。

表15不同浓度双酯型生物碱在回肠段吸收比较结果

注：VS低剂量组*P＜0.05，**P＜0.01

附甘合煎沉积物中乌头碱（4.5～45μg·ml^-1）、次乌头碱（5.5～55μg·ml^-1）、新乌头碱（4～40μg·ml^-1）随着药物浓度增加，各自的K_a'和P_app'未出现明显差异，而其吸收量随质量浓度升高而增加，表明其肠转运机制可能为被动扩散。

Claims (8)

1.一种具有抗心衰功效的附子甘草提取物，其特征在于：所述的提取物是由附子、甘草加水合煮，煎煮液离心、所得的沉积物干燥，即得；其中，提取物中含有苯甲酰新乌头原碱13.46～125.63μg·g^-1、苯甲酰次乌头原碱8.52～72.47μg·g^-1、苯甲酰乌头原碱13.43～116.74μg·g^-1、新乌头碱4.08～38.53μg·g^-1、次乌头碱7.23～73.65μg·g^-1、乌头碱5.25～49.86μg·g^-1；所述的附子、甘草的重量配比为：

附子1份、甘草1份。

2.根据权利要求1所述的附子甘草提取物，其特征在于：所述的提取物的指纹图谱具有28个特征峰，其保留时间为：1号峰：2.3min、2号峰：3.2min、3号峰：3.5min、4号峰：5.0min、5号峰：5.9min、6号峰：9.1min、7号峰：11.3min、8号峰：11.5min、9号峰：12.0min、10号峰：25.0min、11号峰：27.2min、12号峰：27.8min、13号峰：28.1min、14号峰：28.6min、15号峰：28.9min、16号峰：29.2min、17号峰：29.4min、18号峰：29.9峰、19号峰：30.3min、20号峰：31.1min、21号峰：31.4min、22号峰：31.8min、23号峰：32.6min、24号峰：33.2min、25号峰：33.7min、26号峰：34.9min、27号峰：35.5min、28号峰：35.9min；

其色谱条件为：色谱柱：4.6mm×100mm，3.5μm的AgilentEclipsePlusC18柱；流动相：以含0.1％醋酸的5mmol·L-1醋酸铵为A相，以含0.1％甲酸的乙腈为B相；流速0.4L·min-1；柱温：30℃；进样量10μL；梯度洗脱条件为：0min，A相占75％，B相占25％；10min，A相占60％，B相占40％；25min，A相占50％，B相占50％。

3.根据权利要求2所述的附子甘草提取物，其特征在于：所述的提取物的HPLC指纹图谱如图1所示。

4.一种制备权利要求1-3任意一项所述的附子甘草提取物的方法，包括如下步骤：

a、称取原料附子、甘草；

b、加水煮沸，汤液离心，得沉积物；

c、将沉积物干燥，即得。

5.权利要求1-3任意一项所述的附子甘草提取物在制备抗心衰的药物中的用途。

6.一种权利要求1-3任意一项所述的附子甘草提取物的检测方法，它是采用高效液相色谱法进行检测，其色谱条件为：色谱柱：4.6mm×100mm，3.5μm的AgilentEclipsePlusC₁₈柱；流动相：以含0.1％醋酸的5mmol·L^-1醋酸铵为A相，以含0.1％甲酸的乙腈为B相；流速0.4L·min^-1；柱温：30℃；进样量10μL；梯度洗脱条件为：0min，A相占75％，B相占25％；10min，A相占60％，B相占40％；25min，A相占50％，B相占50％；所述的提取物的指纹图谱具有28个特征峰，其保留时间为：1号峰：2.3min、2号峰：3.2min、3号峰：3.5min、4号峰：5.0min、5号峰：5.9min、6号峰：9.1min、7号峰：11.3min、8号峰：11.5min、9号峰：12.0min、10号峰：25.0min、11号峰：27.2min、12号峰：27.8min、13号峰：28.1min、14号峰：28.6min、15号峰：28.9min、16号峰：29.2min、17号峰：29.4min、18号峰：29.9峰、19号峰：30.3min、20号峰：31.1min、21号峰：31.4min、22号峰：31.8min、23号峰：32.6min、24号峰：33.2min、25号峰：33.7min、26号峰：34.9min、27号峰：35.5min、28号峰：35.9min。

7.一种抗心衰的药物组合物，它是由权利要求1-3任意一项所述的附子甘草提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅助性成分制备而成的药剂。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于：所述的药剂是口服制剂。