CN109298098B - 附子指纹图谱、其建立方法及附子质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药品检测技术领域，具体而言，涉及一种附子指纹图谱、其建立方法及附子质量检测方法。附子指纹图谱方法的建立方法，主要包括以下步骤：制备对照品溶液，制备附子供试品溶液；用高效液相色谱法测定附子供试品溶液和对照品溶液。本发明实施例提供的方法稳定、可靠、操作简单、重复性好。本发明提供的指纹图谱分析方法参数在精密度、重复性、耐用性、专属性上均能达到较高要求，证明了该方法的稳定、可靠。

Description

附子指纹图谱、其建立方法及附子质量检测方法

技术领域

本发明涉及药品检测技术领域，具体而言，涉及一种附子指纹图谱、其建立方法及附子质量检测方法。

背景技术

附子，中药名。为毛茛科植物乌头的子根的加工品，又名附片、盐附子、附子。现阶段附子在《中国药典》中只是对附子的质量评价方式单一，不足以系统、完整地表明附子及其制剂的整体质量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种附子指纹图谱、其建立方法及附子质量检测方法，为了准确分析测定附子质量，可以有效可靠地预测产品质量，为质量评价提供依据。

本发明第一方面提供一种附子指纹图谱方法的建立方法，主要包括以下步骤：

制备对照品溶液：采用48vol％-52vol％甲醇水溶液溶解苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱制得对照品溶液，使每1ml对照品溶液中含甲酰新乌头原碱8μg-12μg、苯甲酰乌头原碱8μg-12μg以及苯甲酰次乌头原碱8μg-12μg；

制备附子供试品溶液；取附子粉末，加入35vol％-50vol％乙醇水溶液，密塞，超声处理30-40min，过滤，减压回收滤液中溶剂至干，再采用35vol％-50vol％甲醇水溶液溶解定容至4ml-6ml；附子粉末与乙醇水溶液的比例为0.03g/ml-0.05g/ml；

用高效液相色谱法测定附子供试品溶液和对照品溶液，色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以pH为9.5-10.4的0.14wt％-0.17wt％的乙酸铵溶液为流动相B，分别对对照品溶液和供试品溶液进行梯度洗脱，并且在梯度洗脱的过程中控制甲醇的体积，使得流动相A的体积占流动相总体积的百分比由5％-8％增加至60％-65％，流动相B的体积占流动相总体积的百分比由92％-95％降低至35％-40％。

通过本发明实施例提供的附子指纹图谱方法的建立方法建立附子指纹图谱，能够对系统、全面地反应附子中各个化学成分，共有峰相对保留时间稳定，该附子指纹图谱稳定性好。简化附子药材及其制剂的分析流程，对其相关性作出更精确的评价，实现了附子药材至制剂的质量可控。

在对照品溶液以及供试品溶液的制备过程中，采用上述工艺制备得到的对照品溶液以及供试品溶液可以使最终得到的图谱更稳定，结果更准确。

在本发明第一方面的一些实施例中，制备附子供试品溶液的步骤中，乙醇水溶液的体积分数为50％；甲醇水溶液的体积分数为50％；附子粉末与的乙醇水溶液比例为0.04g/ml。

乙醇水溶液的体积分数为50％对附子的提取效果相对较好，色谱峰信息量较大，峰型较好，系统适应性参数相对较优，甲醇水溶液的体积分数为50％的渗透性及溶解效果较好；附子粉末与的乙醇水溶液比例为0.04g/ml，供试品溶液中有效成分含量更合适。

在本发明第一方面的一些实施例中，在梯度洗脱步骤中：

t＝0min-7min时，流动相A的体积占流动相总体积的百分比为5％-8％，流动相B的体积占流动相总体积的百分比为92％-95％；

t＝7min-20min时，流动相A的体积占流动相总体积的百分比为5％-8％→24％-28％，流动相B的体积占流动相总体积的百分比为92％-95％→72％-76％；

t＝20min-50min时，流动相A的体积占流动相总体积的百分比为24％-28％→60％-65％，流动相B的体积占流动相总体积的百分比为72％-76％→35％-40％。

进一步地，在梯度洗脱步骤中：

t＝0min-7min时，流动相A的体积占流动相总体积的百分比为5％，流动相B的体积占流动相总体积的百分比为95％；

t＝7min-20min时，流动相A的体积占流动相总体积的百分比为5％→25％，流动相B的体积占流动相总体积的百分比为95％→75％；

t＝20min-50min时，流动相A的体积占流动相总体积的百分比为25％→60％，流动相B的体积占流动相总体积的百分比为75％→40％。

在不同进样时间改变流动相A与流动相B的配比，使各个特征峰的保留时间稳定，不产生漂移，且在上述时间以及配比下，各个特征峰相互独立，相互分离，避免一些峰不能分离开的问题。

在本发明第一方面的一些实施例中，在梯度洗脱的过程中控制流速为0.8ml/min-1.2ml/min，柱温为30℃-35℃，检测波长为230nm-240nm。

各特征色谱峰保留时间受温度有微小的影响，流速在发生微小变化时对峰1、2的保留时间有一定的影响，对峰1、2、7、8相对峰面积有一定的影响；因此，选择上述柱温、流速等条件各特征色谱峰更加稳定。

在本发明第一方面的一些实施例中，色谱柱的型号是EXCEL 5μSUPERC18，参数是4.6mm×250mm，5μm。

发明人实验过程中发现，不同色谱柱得到的图谱各特征峰与参照物峰的相对保留时间的相对平均偏差值较大，结合色谱柱的分离效果，色谱柱的型号是EXCEL 5μSUPERC18，参数是4.6mm×250mm，5μm，的效果较佳。

本发明第二方面提供一种附子指纹图谱，附子指纹图谱由第一方面的附子指纹图谱方法的建立方法构建而成。

本发明提供的附子指纹图谱精密度、重复性、耐用性、专属性上均能达到较高要求，具有较佳的可参照性。

本发明第三方面提供一种附子质量检测方法，包括将待检测的附子的高效液相色谱图谱与本发明第二方面的附子指纹图谱进行比较。

在本发明第三方面的一些实施例中，待检测的附子的高效液相色谱图谱与附子指纹图谱相似度不低于0.80。

通过上述方法对附片主要产区附子的进行检测，结果表明不同产区附子存在8个以上的共有特征峰，说明该检测方法可靠，对于有效控制附子药材的质量具有十分重要的意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1提供的附子对照指纹图谱；

图2为11批次附子药材的特征图谱。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的附子指纹图谱、其建立方法及附子质量检测方法进行具体说明。

本发明第一方面提供一种附子指纹图谱方法的建立方法，主要包括以下步骤：

制备对照品溶液：采用48vol％-52vol％甲醇水溶液溶解苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱制得对照品溶液，使每1ml对照品溶液中含甲酰新乌头原碱8μg-12μg、苯甲酰乌头原碱8μg-12μg以及苯甲酰次乌头原碱8μg-12μg。

进一步地，在本发明的一些实施例中，采用50vol％甲醇水溶液溶解苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱制得对照品溶液，使每1ml对照品溶液中含甲酰新乌头原碱10μg、苯甲酰乌头原碱10μg以及苯甲酰次乌头原碱10μg。

制备附子供试品溶液过程中，就提取溶剂，溶剂用量，提取时间，以及干膏提取溶剂进行实验。

取附子粉末，加入35vol％-50vol％乙醇水溶液，密塞，超声处理30-40min，过滤，减压回收滤液中溶剂至干，再采用35vol％-50vol％甲醇水溶液溶解定容至4ml-6ml；附子粉末与乙醇水溶液的比例为0.03g/ml-0.05g/ml；

进一步地，在本发明的一些实施例中，采用50vol％乙醇水溶液提取附子粉末，再采用50vol％甲醇水溶液溶解定容至5ml；附子粉末与乙醇水溶液的比例为0.04g/ml。

大部分附子饮片中大部分有效成分均具有较好水溶性，但在提取方法考察过程中发现用水提取的供试品过滤极为困难，故采用一定浓度的乙醇溶液作为提取溶剂。

在制备附子供试品溶液过程中：发明人选用水、25％、50％、95％乙醇作提取溶剂，取同一过50目的附子粉末，4份，每份约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入相同体积的水、25vol％、50vol％、95vol％乙醇提取，结果表明，水、25vol％、50vol％乙醇溶液作提取溶剂时与使用水作溶剂提取供试品具有基本相同的色谱峰信息量，峰型较好，系统适应性参数相对较优，但使用水、25vol％乙醇作提取溶剂，由于供试品过滤过程中较多胶质物造成过滤困难，因此选择50％乙醇作为附子药材的提取溶剂进行提取。

研究结果表明，超声提取与加热回流提取方式提取得到的色谱峰信息量几乎一致，峰型均较好，系统适应性参数相对较优，考虑到操作的便捷性，因此选择超声提取方式进行附子药材进行提取。

采用超声提取方式，分别加入25mL、50mL、100mL体积50vol％乙醇对附子的进行提取制备供试品进行分析，研究结果表明加入25ml、50ml提取溶剂对附子的提取效果相对较好，色谱峰信息量较大，峰型较好，系统适应性参数相对较优。

30min、45min、60min提取时间对附子药材进行分析，结果表明，提取时间30min、45min、60min对附子药材的提取效果相近，色谱分离效果无明显差异。因此，为了节省时间和简便操作，采用30min作为提取时间。

承上，减压回收滤液中溶剂至干(得到干膏)，再采用35vol％-50vol％甲醇水溶液溶解定容至4ml-6ml。

发明人采用30vol％甲醇、50vol％甲醇、70vol％甲醇作为干膏的提取溶剂，结果表明，30vol％甲醇、50vol％甲醇溶剂呈现出的色谱峰分离效果和系统适应性参数相对较好，考虑到50vol％甲醇的渗透性及溶解效果较好，故选择50vol％甲醇作为干膏的提取溶剂。

当然，可以理解的是，在本发明的其他实施例中，也可以采用48vol％甲醇、49vol％甲醇作为干膏的提取溶剂。

承上，对照品溶液以及附子供试品溶液制备好之后，用高效液相色谱法测定附子供试品溶液和对照品溶液。

色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以pH为9.5-10.4的0.14wt％-0.17wt％的乙酸铵溶液为流动相B，分别对对照品溶液和供试品溶液进行梯度洗脱，并且在梯度洗脱的过程中控制甲醇的体积，使得流动相A的体积占流动相总体积的百分比由5％-8％增加至60％-65％，流动相B的体积占流动相总体积的百分比由92％-95％降低至35％-40％。

在本发明的一些实施例中，流动相B为0.15wt％的乙酸铵溶液，流动相B的pH为10.0。

取同一批供试品溶液，考察流动相分别为Ⅰ乙腈－0.154wt％(氨水调pH9.5)乙酸铵溶液、Ⅱ乙腈－0.154wt％(氨水调pH10.0)乙酸铵溶液、Ⅲ乙腈－0.154wt％(氨水调pH10.5)乙酸铵溶液时，各特征峰与参照物S峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明当流动相pH发生微小变化时对保留时间影响在可接受范围，但峰面积受流动相pH影响较大，故采用pH为9.5-10.4的乙酸铵溶液为流动相B，进一步地，pH为10.0。

进一步地，在本发明的一些实施例中，在梯度洗脱步骤中：

t＝0min-7min时，流动相A的体积占流动相总体积的百分比为5％-8％，流动相B的体积占流动相总体积的百分比为92％-95％；

t＝7min-20min时，流动相A的体积占流动相总体积的百分比为5％-8％→24％-28％，流动相B的体积占流动相总体积的百分比为92％-95％→72％-76％；

t＝20min-50min时，流动相A的体积占流动相总体积的百分比为24％-28％→60％-65％，流动相B的体积占流动相总体积的百分比为72％-76％→35％-40％。

在本实施例中，在梯度洗脱步骤中：

t＝0min-7min时，流动相A的体积占流动相总体积的百分比为5％，流动相B的体积占流动相总体积的百分比为95％；

t＝7min-20min时，流动相A的体积占流动相总体积的百分比为5％→25％，流动相B的体积占流动相总体积的百分比为95％→75％；

t＝20min-50min时，流动相A的体积占流动相总体积的百分比为25％→60％，流动相B的体积占流动相总体积的百分比为75％→40％。

在洗脱过程中控制流动相A的体积占流动相总量的比例，最终得到的指纹图谱重现性好，各个特征峰清晰度高。

采用上述时间以及流动相A与流动相B的配比，使各个特征峰的保留时间稳定，不产生漂移，且在上述时间以及配比下，各个特征峰相互独立，相互分离，避免一些峰不能分离开的问题。

在本发明的一些实施例中，梯度洗脱的过程中控制流速为0.8ml/min-1.2ml/min，柱温为30℃-35℃，检测波长为230nm-240nm。

取同一批供试品溶液(批号JY-170901)，分别用0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min的流速进行测定，考察本品在流速发生微小变化时各特征峰与参照物S峰(6号峰)的相对保留时间和相对峰面积的变化，结果表明，各特征峰与参照物S峰(6号峰)的相对保留时间的相对平均偏差分别为10.061％、4.111％、2.023％、0.112％、0.348％、0.00％、0.123％、0.228％，与参照物S峰(6号峰)的相对峰面积的相对平均偏差分别为4.601％、11.363％、0.996％、1.694％、2.933％、0.000％、7.635％、6.168％，结果表明流速在发生微小变化时对峰1、2的保留时间有一定的影响，对峰1、2、7、8相对峰面积有一定的影响，结合不同流速的考察结果以及柱压，流速为1.0mL/min较佳。

取同一批供试品溶液，设置柱温分别为30℃、35℃、40℃，考察在柱温发生变化时各特征峰与参照物S峰(7号峰)的相对保留时间和相对峰面积，结果相对保留时间的相对平均偏差分别为2.840％、2.543％、1.671％、1.049％、0.052％、0.00％、0.287％、0.398％，相对峰面积的相对平均偏差分别为1.560％、4.391％、0.324％、2.859％、4.095％、0.00％、8.196％、5.486％，表明柱温在发生变化时，各特征色谱峰保留时间发生微小变化，说明各特征色谱峰保留时间受温度有微小的影响，温度对峰7、8相对峰面积有一定的影响，故柱温30℃-35℃为宜。

在本发明的一些实施例中，色谱柱的型号是EXCEL 5μSUPERC18，参数是4.6mm×250mm，5μm。在本实施例中，厂家是ACE。

取同一批供试品溶液，考察不同色谱柱对图谱的影响。

色谱柱1：Phenomenex-Gemini C18 5μm(4.6mm×250mm，5μm)；色谱柱2：ACE EXCEL5SUPERC18(4.6mm×250mm，5μm)；色谱柱3：广州菲罗门TitanK C18(4.6mm×250mm，5μm)；发生变化时各特征峰与参照物S峰(6号峰)的相对保留时间的相对平均偏差分别为16.517％、12.754％、1.085％、3.286％、0.731％、0.000％、2.102％、3.228％，8个特征峰与参照物S峰(2号峰)的相对峰面积的相对平均偏差分别为12.789％、16.474％、1.871％、18.416％、7.389％、0.000％、9.397％、2.874％，结果表明不同品牌色谱柱对测定结果有影响，结合各色谱柱的分离效果，色谱柱为ACE EXCEL 5SUPERC18(4.6mm×250mm，5μm)较佳。

本发明第二方面提供一种附子指纹图谱，附子指纹图谱由第一方面的附子指纹图谱方法的建立方法构建而成。

本发明提供的附子指纹图谱精密度、重复性、耐用性、专属性上均能达到较高要求，具有较佳的可参照性。

本发明第三方面提供一种附子质量检测方法，包括将待检测的附子的高效液相色谱图谱与本发明第二方面的附子指纹图谱进行比较。

在本发明第三方面的一些实施例中，待检测的附子的高效液相色谱图谱与附子指纹图谱相似度不低于0.80。

通过上述方法对附片主要产区附子的进行检测，结果表明不同产区附子存在8个以上的共有特征峰，说明该检测方法可靠，对于有效控制附子药材的质量具有十分重要的意义。

上述附子质量检测方法将附子作为一个整体对待，通过与指纹图谱中各个特征峰进行比较，可以得出附子药材之间的差异，有利于对附子的真假和品质进行控制。简化附子药材及其制剂的分析流程，对其相关性作出更精确的评价，实现了附子药材至制剂的质量可控。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种附子指纹图谱方法的建立方法，主要包括以下步骤：

制备对照品溶液：采用50vol％甲醇水溶液溶解苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱制得对照品溶液，使每1ml对照品溶液中含甲酰新乌头原碱10μg、苯甲酰乌头原碱10μg以及苯甲酰次乌头原碱10μg；

制备附子供试品溶液；取附子粉末，加入50vol％乙醇水溶液，密塞，超声处理30min，过滤，减压回收滤液中溶剂至干，再采用50vol％甲醇水溶液溶解定容至5ml；附子粉末与乙醇水溶液的比例为0.04g/ml。

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，得到图1所示的指纹图谱。

色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以pH为10的0.15wt％的乙酸铵溶液为流动相B，流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为235nm。分别对对照品溶液和供试品溶液进行梯度洗脱。

色谱柱的型号是EXCEL 5μSUPERC18，参数是4.6mm×250mm，5μm。洗脱参数参见表1。

表1实施例1的洗脱参数

从图1可以看出，附子饮片指纹图谱有8个特征峰，其中3个峰S峰(6号峰)为苯甲酰新乌头原碱峰、峰7为苯甲酰乌头原碱峰、峰8为苯甲酰次乌头原碱峰。

实施例2

本实施例提供了一种附子指纹图谱方法的建立方法，主要包括以下步骤：

制备对照品溶液：采用48vol％甲醇水溶液溶解苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱制得对照品溶液，使每1ml对照品溶液中含甲酰新乌头原碱8μg、苯甲酰乌头原碱8μg以及苯甲酰次乌头原碱8μg；

制备附子供试品溶液；取附子粉末，加入35vol％乙醇水溶液，密塞，超声处理40min，过滤，减压回收滤液中溶剂至干，再采用35vol％甲醇水溶液溶解定容至4ml；附子粉末与乙醇水溶液的比例为0.03g/ml；

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测定，得到指纹图谱。

色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以pH为9.5的0.14wt％的乙酸铵溶液为流动相B，流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为235nm。分别对对照品溶液和供试品溶液进行梯度洗脱。

色谱柱的型号是EXCEL 5μSUPERC18，参数是4.6mm×250mm，5μm。洗脱参数参见表2。

表2实施例2的洗脱参数

最终得到的指纹图谱有8个特征峰，其中3个峰S峰(6号峰)为苯甲酰新乌头原碱峰、峰7为苯甲酰乌头原碱峰、峰8为苯甲酰次乌头原碱峰。

实施例3

本实施例提供了一种附子指纹图谱方法的建立方法，主要包括以下步骤：

制备对照品溶液：采用52vol％甲醇水溶液溶解苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱制得对照品溶液，使每1ml对照品溶液中含甲酰新乌头原碱9μg、苯甲酰乌头原碱9μg以及苯甲酰次乌头原碱9μg；

制备附子供试品溶液；取附子粉末，加入45vol％乙醇水溶液，密塞，超声处理40min，过滤，减压回收滤液中溶剂至干，再采用45vol％甲醇水溶液溶解定容至4ml；附子粉末与乙醇水溶液的比例为0.05g/ml；

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测定，得到指纹图谱。

色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以pH为10.1的0.17wt％的乙酸铵溶液为流动相B，流速为1.1ml/min，柱温为30℃，检测波长为235nm。分别对对照品溶液和供试品溶液进行梯度洗脱。

色谱柱的型号是EXCEL 5μSUPERC18，参数是4.6mm×250mm，5μm。洗脱参数参见表3。

表3实施例3的洗脱参数

最终得到的指纹图谱有8个特征峰，其中3个峰S峰(6号峰)为苯甲酰新乌头原碱峰、峰7为苯甲酰乌头原碱峰、峰8为苯甲酰次乌头原碱峰。

实施例4

本实施例提供了一种附子指纹图谱方法的建立方法，主要包括以下步骤：

制备对照品溶液：采用52vol％甲醇水溶液溶解苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱制得对照品溶液，使每1ml对照品溶液中含甲酰新乌头原碱11μg、苯甲酰乌头原碱11μg以及苯甲酰次乌头原碱11μg；

制备附子供试品溶液；取附子粉末，加入48vol％乙醇水溶液，密塞，超声处理35min，过滤，减压回收滤液中溶剂至干，再采用35vol％-50vol％甲醇水溶液溶解定容至5.2ml；附子粉末与乙醇水溶液的比例为0.045g/ml；

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测定，得到指纹图谱。

色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以pH为10.0的0.16wt％的乙酸铵溶液为流动相B，流速为0.9ml/min，柱温为32℃，检测波长为235nm。分别对对照品溶液和供试品溶液进行梯度洗脱。

色谱柱的型号是EXCEL 5μSUPERC18，参数是4.6mm×250mm，5μm。洗脱参数参见表4。

表4实施例4的洗脱参数

最终得到的指纹图谱有8个特征峰，其中3个峰S峰(6号峰)为苯甲酰新乌头原碱峰、峰7为苯甲酰乌头原碱峰、峰8为苯甲酰次乌头原碱峰。

试验例1

本试验例对本发明实施例提供的附子指纹图谱方法的建立方法进行验证。

取同一份供试品溶液，实施例1提供的方法重复进样6次，测定8个共有峰的相对保留时间，结果其中3个峰(峰S、峰7、8)分别与相应的参照物峰保留时间相相同；各特征峰与参照物S峰(6号峰)的相对保留时间的RSD(relative standard deviation，相对标准偏差)分别为0.229％、0.126％、0.042％、0.056％、0.014％、0、0.040％、0.068％。各特征峰与参照物S峰(6号峰)的相对峰面积的RSD分别为1.064％、1.510％、0.982％、0.938％、1.045％、0、1.060％、0.867％，表明仪器精密度良好。

取同一批号供试品，按实施例1提供的方法，分别测定8个共有峰的相对保留时间，结果其中3个峰(峰S、峰7、8)分别与相应的参照物峰保留时间相相同；各特征峰与参照物S峰(6号峰)的相对保留时间的RSD分别为0.230％、0.091％、0.080％、0.070％、0.047％、0.000％、1.076％、1.106％。各特征峰与参照物S峰(6号峰)的相对峰面积的RSD分别为4.846％、7.723％、0.474％、1.218％、2.886％、0.000％、3.129％、1.638％，表明本方法重复性良好。

分别由三名检验员在不同的时间，用同一台设备，按实施例1提供的方法测定同一批号的附子药材(JY-170901)，结果其中3个峰(峰S、峰7、8)分别与相应的参照物峰保留时间相相同；各特征峰与参照物S峰(6号峰)的相对平均偏差分别为1.388％、0.499％、0.237％、0.436％、0.078％、0.00％、0.472％、0.768％，对不同人员检测结果色谱图进行特征峰匹配，相似度结果均大于0.995，表明本方法中间精密度(不同人员)较好。

由同一名检验员在不同的时间，分别用三台设备，同一色谱柱按附子药材按实施例1提供的方法测定同一批号的附子药材，结果其中3个峰(峰6、7、8、)分别与相应的参照物峰保留时间相相同；各特征峰与参照物S峰(6号峰)的相对保留时间的相对平均偏差分别为2.994％、0.747％、0.043％、0.150％、0.000％、0.062％、0.081％，对不同仪器检测结果色谱图进行特征峰匹配，相似度结果均大于0.995，表明本方法中间精密度(不同仪器)较好。

精密吸取供试品溶液、阴性对照溶液(50％甲醇)各10μl，分别注入高效液相色谱仪，按实施例1提供的方法试验，结果阴性无干扰。

取同一批号供试品，制备后按实施例1提供的方法试验，分别在0、12、24小时进样，测定8个共有峰的相对保留时间，结果其中3个峰(峰S、峰7、8)分别与相应的参照物峰保留时间相相同；各特征峰与参照物S峰(6号峰)的相对保留时间平均偏差分别为0.556％、0.285％、0.225％、0.203％、0.159％、0.000％、0.192％、0.252％，各特征峰与参照物S峰(6号峰)的相对峰面积的相对平均偏差分别为2.137％、3.329％、0.922％、3.689％、2.270％、0.000％、0.488％、1.228％，表明供试品溶液在24小时内稳定。

说明本发明实施例提供的方法稳定、可靠、操作简单、重复性好。本发明提供的指纹图谱分析方法参数在精密度、重复性、耐用性、专属性上均能达到较高要求，证明了该方法的稳定、可靠。

试验例2

取全国主要产区15批附子饮片(批号：AX-171101、AX-171102、AX-171103、DL-170901、DL-170902、DL-170903、HZ-171001、HZ-171002、HZ-171101、JY-170901、JY-171001、江油160901、布拖170405、布拖170406、布拖170506)按拟定附子药材指纹图谱测定方法操作。各个特征峰与附子饮片特征峰进行匹配相似度均符合规定要求。测定结果见表5、图2。图2中：S1-S15分别为：AX-171101、AX-171102、AX-171103、DL-170901、DL-170902、DL-170903、HZ-171001、HZ-171002、HZ-171101、JY-170901、JY-171001、江油160901、布拖170405、布拖170406、布拖170506。

表5 15批附子饮片特征图谱相似度测定结果

从图2可以看出：不同产区附子存在8个以上的共有特征峰，从表5可以看出，附子饮片的指纹图谱与附子饮片对照图谱的相似度均大于0.84。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种附子指纹图谱方法的建立方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

制备对照品溶液：采用48vol%-52vol%甲醇水溶液溶解苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱制得对照品溶液，使每1ml所述对照品溶液中含甲酰新乌头原碱8µg-12µg、苯甲酰乌头原碱8µg -12µg以及苯甲酰次乌头原碱8µg-12µg；

制备附子供试品溶液；取附子粉末，加入35vol%-50vol%乙醇水溶液，密塞，超声处理30-40min，过滤，减压回收滤液中溶剂至干，再采用35vol%-50vol%甲醇水溶液溶解定容至4ml-6ml；所述附子粉末与所述乙醇水溶液的比例为0.03g/ml-0.05g/ml；

用高效液相色谱法测定所述附子供试品溶液和所述对照品溶液，色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以pH为9.5-10.4的0.14wt%-0.17wt%的乙酸铵溶液为流动相B，分别对所述对照品溶液和所述供试品溶液进行梯度洗脱，并且在所述梯度洗脱的过程中控制所述甲醇的体积，使得所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比由5%-8%增加至60%-65%，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比由92%-95%降低至35%-40%；

所述流动相B为0.15wt%的乙酸铵溶液，所述流动相B的pH为10.0；

在所述梯度洗脱步骤中：

t=0min-7min时，所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比为5%-8%，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比为92%-95%；

t=7min-20min时，所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比为5%-8%→24%-28%，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比为92%-95%→72%-76%；

t=20min-50min时，所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比为24%-28%→60%-65%，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比为72%-76%→35%-40%。

2.根据权利要求1所述的附子指纹图谱方法的建立方法，其特征在于，制备所述附子供试品溶液的步骤中，所述乙醇水溶液的体积分数为50%；甲醇水溶液的体积分数为50%；所述附子粉末与所述的乙醇水溶液比例为0.04g/ml。

3.根据权利要求1所述的附子指纹图谱方法的建立方法，其特征在于，在所述梯度洗脱步骤中：

t=0min-7min时，所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比为5%，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比为95%；

t=7min-20min时，所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比为5%→25%，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比为95%→75%；

t=20min-50min时，所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比为25%→60%，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比为75%→40%。

4.根据权利要求1所述的附子指纹图谱方法的建立方法，其特征在于，在所述梯度洗脱的过程中控制流速为0.8ml/min-1.2ml/min，柱温为30℃-35℃，检测波长为230nm-240nm。

5.根据权利要求1所述的附子指纹图谱方法的建立方法，其特征在于，色谱柱的型号是EXCEL SUPERC18，参数是4.6mm×250mm，5μm。

6.一种附子质量检测方法，其特征在于，包括将待检测的附子的高效液相色谱图谱与权利要求1-5任一项所述的附子指纹图谱方法的建立方法构建而成的附子指纹图谱进行比较。

7.根据权利要求6所述的附子质量检测方法，其特征在于，所述待检测的附子的高效液相色谱图谱与所述附子指纹图谱相似度不低于0.80。

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