CN114965736B - 附子的高效液相色谱检测方法及高效液相色谱串联质谱联用检测方法 - Google Patents

附子的高效液相色谱检测方法及高效液相色谱串联质谱联用检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种附子的高效液相色谱检测方法及高效液相色谱串联质谱联用检测方法，属于药物检测技术领域，所述高效液相色谱检测方法是取附子供试品溶液利用0.04mol/L的乙酸铵‑乙腈作为流动相进行高效液相色谱检测，即得检测结果；所述高效液相色谱质谱联用检测方法利用上述附子的高效液相色谱检测条件进行检测。本发明通过调整色谱条件及附子的前处理过程，再分别采用高效液相色谱检测方法及高效液相色谱串联质谱联用检测方法对附子进行检测，能够有效将活性成分分离并检出。

Description

附子的高效液相色谱检测方法及高效液相色谱串联质谱联用检测方法
技术领域
本发明涉及药物检测技术领域，尤其涉及一种附子的高效液相色谱检测方法及高效液相色谱串联质谱联用检测方法。
背景技术
附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根的加工品，主要功效为回阳救逆，补火助阳，散寒止痛。附子中的二萜生物碱还具有明显的降压、抑制心肌缩力和抗心律失常作用，而与其水溶性成分则具有升压、强心作用，附子中的双酯型二萜生物碱则能够改善心律失常。
附子作为重要的常用中药，在真武汤、附子汤、桂枝芍药知母汤、温脾汤和小续命汤等经典名方中均有使用，因其具有明显的毒性和疗效，常需炮制加工后使用。而炮制加工方法的改变也势必会影响不同附子加工品的药理活性和安全性。
附子加工品中的活性成分(包括有效成分和毒性成分)复杂多样，各成分之间干扰严重，加上炮制工艺的影响，使其活性成分的检测方法要求更具专属性。当前用于检测附子制品的方法主要是高效液相色谱、高效液相色谱串联质谱等方法，但由于活性成分间相互影响，且含量相差较多，导致部分活性成分很难分离检出，进而影响对于附子加工品药理活性和安全性的判断。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种附子的高效液相色谱检测方法及高效液相色谱串联质谱联用检测方法。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种附子的高效液相色谱检测方法，所述检测方法是取附子供试品溶液进行高效液相色谱检测，即得检测结果；
所述高效液相色谱检测过程中采用浓度为0.04mol/L的乙酸铵溶液作为流动相A，乙腈作为流动相B；
所述高效液相色谱检测的洗脱方式为梯度洗脱；
所述梯度洗脱的洗脱条件为：
0～10min，95％→90％流动相A，5％→10％流动相B；
10～25min，90％→60％流动相A，10％→40％流动相B；
25～50min，60％→48％流动相A，40％→52％流动相B；
50～80min，48％→30％流动相A，52％→70％流动相B；
80～95min，30％→15％流动相A，70％→85％流动相B。
进一步的，所述高效液相色谱检测过程中色谱柱为Phenomenex Gemini C18色谱柱。
进一步的，所述乙酸铵溶液为用氨水调节pH值至10的乙酸铵溶液。
进一步的，所述高效液相色谱检测过程中柱温为40℃、流速为1.0mL/min、检测波长为240nm。
进一步的，所述附子供试品溶液是取附子制品加入氨水溶液，再加入体积比为1∶1的异丙醇-乙酸乙酯混合溶液，经超声提取、定容、过滤，所得续滤液经浓缩后，再次加入体积比为1∶1的异丙醇-二氯甲烷混合溶液溶解，过滤制得。
进一步的，所述附子供试品溶液制备的具体步骤如下：
取4重量份附子制品加入3体积份浓度为10wt％的氨水溶液，再加入50体积份体积比为1∶1的异丙醇-乙酸乙酯混合溶液，经超声提取、定容、过滤，再取40体积份所得续滤液浓缩，加入1体积份体积比为1∶1的异丙醇-二氯甲烷混合溶液溶解，过滤，即得所述附子供试品溶液；
其中，重量份与体积份之间的对应关系为g：mL。
一种附子的高效液相色谱串联质谱联用检测方法，所述高效液相色谱质谱联用检测方法中高效液相色谱检测条件是利用上述附子的高效液相色谱检测条件进行检测。
进一步的，所述附子的高效液相色谱质谱联用检测方法中的质谱分析采用ESI离子源，在正负离子模式下进行检测。
进一步的，所述质谱检测过程中，第一个质量分析器(MS1)的检测范围为100～1000质荷比(m/z)，离子积累时间设定为30ms；第二个质量分析器(MS2)的检测范围为50～1000质荷比(m/z)，离子积累时间设定为20ms；第三个质量分析器(MS3)的检测范围为50～1000质荷比(m/z)，离子积累时间设定为20ms。
进一步的，所述质谱检测过程中，氮气流速为1.5L/min，CDL温度为200℃，加热块的温度为200℃，PDA的检测波长范围为200～700nm，正离子模式下接口电压为4.5kV，负离子模式下接口电压为3.5kV，正负离子模式的检测电压均为1.7kV，干燥气压设定为100kPa，最大压力设定为30MPa。
本发明的附子的高效液相色谱检测方法及高效液相色谱串联质谱联用检测方法的有益效果为：
本发明通过调整色谱条件及附子的前处理过程，再分别采用高效液相色谱检测方法及高效液相色谱串联质谱联用检测方法对附子进行检测，能够有效将活性成分分离并检出；
本发明针对不同炮制方法获得的附子制品进行检测，通过对4种附子制品(煻灰炮附子、生附子、炒附子、蒸附子)进行高效液相色谱检测，检测出36个化学特征色谱峰；通过对5种附子制品(煻灰炮附子、生附子、炒附子、蒸附子、烘附子)进行高效液相色谱串联质谱联用检测，从特征碎片离子信息中鉴定出38种化学成分(均为生物碱)，并指认了33种化学成分；其中，煻灰炮附子中共鉴定出18种化学成分；生附片中共鉴定出24个化学成分，其鉴定出的14-乙酰尼奥灵或其异构体、乌头卡查敏碱B、翠雀碱或异翠雀碱未在其它加工品中检出；炒附片中共鉴定22个化学成分，其鉴定出的10-羟基苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰-3，13-双去氧新乌头原碱或其异构体、脱水苯甲酰新乌头原碱、脱水苯甲酰次乌头原碱、唐古替星A或其异构体未在其它炮制方法制备的饮片中检出；蒸附片中共鉴定17个化学成分，其鉴定出的1-乙酰光泽乌头碱或12-乙酰光泽乌头碱、苯甲酰去氧乌头原碱未在其它炮制方法制备的饮片中检出；烘附子中共鉴定20个化学成分，其鉴定出的尼奥灵或10-羟基塔拉乌头胺、森布星A或森布星B、14-乙酰尼奥灵或其异构体、卡米车灵A或其异构体未在其它炮制方法制备的饮片中检出；
本发明的高效液相色谱检测方法及高效液相色谱串联质谱联用检测方法均显著提高了检测效率，一次高效液相色谱检测即可分析36种化学成分，一次高效液相色谱串联质谱联用检测即可分析38种化学成分，检测指标的设置更有利于附子的药理活性和安全性的判断；
本发明的高效液相色谱检测方法及高效液相色谱串联质谱联用检测方法均具有超高的灵敏度和优异的定性能力；
本发明中38种化学成分存在细微结构差异，产生的质谱特征片段存在较大差异，可准确确证活性成分；
本发明的高效液相色谱检测方法及高效液相色谱串联质谱联用检测方法，只需在仪器上完成标准液相图谱或标准质谱图库的构建，后续分析可不需对照品，只需检测样品，将检品测试结果与标准液相图谱或标准质谱图库比较，即可确证样品中是否含有目标活性成分；
本发明的附子的高效液相色谱检测方法及高效液相色谱串联质谱联用检测方法适用于各类附子制品的活性成分检测，进而判断附子的药理活性和安全性；
本发明的检测方法简单、准确度高、稳定性好、重复性良好、活性成分分离效果好，可作为附子药理活性和安全性检查的重要方法。
附图说明
图1是本发明实施例1中不同附子制品的高效液相色谱对比图；
图2是本发明实施例1中蒸附子的高效液相色谱图；
图3是本发明实施例1中炒附子的高效液相色谱图；
图4是本发明实施例1中生附子的高效液相色谱图；
图5是本发明实施例1中煻灰炮附子的高效液相色谱图；
图6是本发明实施例1中烘附子的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
实施例1一种附子的高效液相色谱检测方法
本实施例分别对煻灰炮附子、生附子、炒附子、蒸附子这四种不同的饮片进行高效液相色谱检测，具体检测方法如下：
精密称取8批煻灰炮附子粉末(过3号筛)各0.5g，混合均匀，混合粉末共4g，置于具塞锥形瓶中，加3mL氨试液(取25％浓氨水400mL，加超纯水使之成1000mL)，精密加入50mL体积比为1∶1的异丙醇-乙酸乙酯混合溶液，称定重量，再经超声处理(功率300W，频率40kHz，水温在25℃以下)30分钟，放至室温(20～25℃)，再次称定重量，用体积比为1∶1的异丙醇-乙酸乙酯混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，所得续滤液再次精密量取40mL，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入体积比为1∶1的异丙醇-二氯甲烷混合溶液1mL溶解，滤过，所得滤液即为煻灰炮附子供试品溶液，标记为PFZ。
取3批生附片粉末(过3号筛)各1.4g，混合均匀，再次取所得混合粉末4g，依照煻灰炮附子供试品溶液的方法制备生附片供试品溶液，标记为SFZ。
依照生附子供试品溶液的制备方法，分别制备炒附片供试品溶液(标记为CFZ)和蒸附片供试品溶液(标记为ZFZ)。
取4g烘附子粉末(过3号筛)，依照制备煻灰炮附子供试品溶液的方法制备烘附子供试品溶液，标记为HFZ。
煻灰炮附子供试品溶液PFZ、生附片供试品溶液SFZ、炒附片供试品溶液CFZ、蒸附片供试品溶液ZFZ和烘附子供试品溶液HFZ统称为不同的附子供试品溶液。
取苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱对照品适量，分别精密称定后置于同一容量瓶中，加入体积比为1∶1的异丙醇-二氯甲烷混合溶液制成每1mL各含10μg苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱的混合溶液，即得对照品溶液A；
取乌头碱、次乌头碱、新乌头碱对照品适量，分别精密称定后置于同一容量瓶中，加入体积比为1∶1的异丙醇-二氯甲烷混合溶液制成每1mL各含5μg乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的混合溶液，即得对照品溶液B。
分别取煻灰炮附子供试品溶液PFZ、生附片供试品溶液SFZ、炒附片供试品溶液CFZ、蒸附片供试品溶液ZFZ、烘附子供试品溶液HFZ、对照品溶液A和对照品溶液B进行高效液相色谱检测，即得相应的附子高效液相色谱图和相应对照品的高效液相色谱图。所得相应的附子高效液相色谱图见图1～5，图1为不同附子制品的高效液相色谱对比图，其中A测定的是蒸附子供试品溶液，B测定的是炒附子供试品溶液，C测定的是生附子供试品溶液，D测定的是煻灰炮附子供试品溶液；图2为蒸附子的高效液相色谱图，图3为炒附子的高效液相色谱图，图4为生附子的高效液相色谱图，图5为煻灰炮附子的高效液相色谱图；图6为烘附子的高效液相色谱。
其中，高效液相色谱检测的检测条件为：
色谱柱为Phenomenex Gemini C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；
检测波长为240nm；
柱温为40℃；
流速为1.0mL/min；
进样量为5μL；
流动相A是以氨水调节pH值至10、浓度为0.04mol/L的乙酸铵溶液，流动相B为乙腈；
洗脱方式为梯度洗脱，具体洗脱程序为：
0～10min，95％→90％流动相A，5％→10％流动相B；
10～25min，90％→60％流动相A，10％→40％流动相B；
25～50min，60％→48％流动相A，40％→52％流动相B；
50～80min，48％→30％流动相A，52％→70％流动相B；
80～95min，30％→15％流动相A，70％→85％流动相B。
针对不同附子制品所测的高效液相色谱图中不同化学特征色谱峰进行对比、统计，并与对照品的化学特征色谱峰进行对比，获得不同附子制品的36个HPLC化学特征色谱峰，具体见表1。
表1不同附子制品的36个HPLC化学特征色谱峰
Figure BDA0003594843110000081
Figure BDA0003594843110000091
表1中，3号色谱峰对应的化学成分为1-乙酰光泽乌头碱或12-乙酰光泽乌头碱，5号色谱峰对应的化学成分为附子灵、10-羟基苯甲酰新乌头原碱，6号色谱峰对应的化学成分为苯甲酰新乌头原碱、尼奥灵(或其异构体10-羟基塔拉乌头胺)，8号色谱峰对应的化学成分为苯甲酰乌头原碱，9号色谱峰对应的化学成分为14-乙酰尼奥灵或其异构体，10号色谱峰对应的化学成分为苯甲酰次乌头原碱，11号色谱峰对应的化学成分为14-乙酰尼奥灵或其异构体，16号色谱峰对应的化学成分为卡米车灵A或其异构体，17号色谱峰对应的化学成分为苯甲酰-3，13-双去氧新乌头原碱、8-乙酰-14-苯甲酰尼奥灵(或其异构体)、trifoliolasine E，18号色谱峰对应的化学成分为脱水苯甲酰新乌头原碱，20号色谱峰对应的化学成分为新乌头碱，21号色谱峰对应的化学成分为乌头芬碱，22号色谱峰对应的化学成分为翠雀碱或异翠雀碱，23号色谱峰对应的化学成分为乌头碱，24号色谱峰对应的化学成分为乌头卡查敏碱B，25号色谱峰对应的化学成分为脱水苯甲酰次乌头原碱，27号色谱峰对应的化学成分为次乌头碱，29号色谱峰对应的化学成分为3-去氧乌头碱或印乌头碱，30号色谱峰对应的化学成分为唐古替星A或其异构体，31号色谱峰对应的化学成分为展花乌头碱或3，13-双脱氧乌头碱，34号色谱峰对应的化学成分为8-乙酰-14-苯甲酰尼奥灵或其异构体，36号色谱峰对应的化学成分为1-羰基翠雀素或6，14-二乙酰翠雀拉亭。
在后续检测过程中，再对附子样品采用上述方法检测时，获得的附子样品的HPLC色谱峰与表1中的保留时间进行比对，用于判断该附子样品的品质，其中，新乌头碱(20号峰)、乌头碱(23号峰)、次乌头碱(27号峰)为附子炮制加工后应尽量减少的物质。当附子样品的HPLC色谱峰与表1中化学特征色谱峰基本保持一致时，且新乌头碱、乌头碱及次乌头碱含量较少时，则证明附子样品产品质量较好。
实施例2一种附子的高效液相色谱串联质谱联用检测方法
本实施例分别对煻灰炮附子、生附子、炒附子、蒸附子、烘附子这五种不同的饮片进行高效液相色谱串联质谱联用检测(HPLC-IT-TOF-MSn)，具体检测方法如下：
分别取实施例1中制备的煻灰炮附子供试品溶液PFZ、生附片供试品溶液SFZ、炒附片供试品溶液CFZ、蒸附片供试品溶液ZFZ、烘附子供试品溶液HFZ、上述对照品溶液A和对照品溶液B进行高效液相色谱串联质谱联用检测，即得相应的色谱图和质谱鉴定结果。其中，所得色谱图及分析结果与实施例1一致，在此不再赘述。
其中，高效液相色谱检测的检测条件为：
色谱柱为Phenomenex Gemini C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；
检测波长为240nm；
柱温为40℃；
流速为1.0mL/min；
进样量为5μL；
流动相A是以氨水调节pH值至10、浓度为0.04mol/L的乙酸铵溶液，流动相B为乙腈；
洗脱方式为梯度洗脱，具体洗脱程序为：
0～10min，95％→90％流动相A，5％→10％流动相B；
10～25min，90％→60％流动相A，10％→40％流动相B；
25～50min，60％→48％流动相A，40％→52％流动相B；
50～80min，48％→30％流动相A，52％→70％流动相B；
80～95min，30％→15％流动相A，70％→85％流动相B。
质谱检测条件为：
采用ESI离子源进行质谱分析，并在正负离子模式下进行检测；
第一个质量分析器(MS1)的检测范围为100～1000质荷比(m/z)，离子积累时间设定为30ms；
第二个质量分析器(MS2)的检测范围为50～1000质荷比(m/z)，离子积累时间设定为20ms；
第三个质量分析器(MS3)的检测范围为50～1000质荷比(m/z)，离子积累时间设定为20ms；
氮气流速设定为1.5L/min；
CDL温度为200℃；
加热块温度为200℃；
PDA检测波长范围为200～700nm；
正离子模式下接口电压为4.5kV，负离子模式下接口电压为3.5kV，正负离子模式的检测电压均为1.7kV；
干燥气压力设定为100kPa，最大压力为30MPa。
针对不同附子制品所测的质谱鉴定结果进行对比、统计，并与对照品的质谱鉴定结果进行对比，获得不同附子制品鉴定的38种化学成分，且这些化学成分均为生物碱，具体见表2。
Figure BDA0003594843110000131
Figure BDA0003594843110000141
从表2中可以看出，煻灰炮附子中共鉴定18个化学成分；生附片中共鉴定24个化学成分，其中14-乙酰尼奥灵或其异构体、乌头卡查敏碱B、翠雀碱或异翠雀碱未在其他加工品中检出；炒附片中共鉴定22个化学成分，其中10-羟基苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰-3，13-双去氧新乌头原碱或其异构体、脱水苯甲酰新乌头原碱、脱水苯甲酰次乌头原碱、唐古替星A或其异构体未在其他加工品中检出；蒸附片中共鉴定17个化学成分，其中1-乙酰光泽乌头碱或12-乙酰光泽乌头碱、苯甲酰去氧乌头原碱未在其他加工品中检出；烘附子中共鉴定20个化学成分，其中尼奥灵或10-羟基塔拉乌头胺、森布星A或森布星B、14-乙酰尼奥灵或其异构体、卡米车灵A或其异构体未在其他加工品中检出。
在后续检测过程中，再对附子样品采用上述方法检测时，获得的附子样品的质谱鉴定结果与表2中的保留时间、实测[M+H]+、MS2碎片离子信息进行比对，用于判断该附子样品的品质。其中，新乌头碱(20号峰)、乌头碱(23号峰)、次乌头碱(27号峰)为附子炮制加工后应尽量减少的物质。当附子样品的HPLC色谱峰与表2中化学成分基本保持一致时，且新乌头碱、乌头碱及次乌头碱含量较少时，则附子样品产品质量较好。
显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (7)

1.一种附子的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测方法是取附子供试品溶液进行高效液相色谱检测，即得检测结果；
所述附子供试品溶液是取附子制品加入氨水溶液，再加入体积比为1:1的异丙醇-乙酸乙酯混合溶液，经超声提取、定容、过滤，所得续滤液经浓缩后，再次加入体积比为1:1的异丙醇-二氯甲烷混合溶液溶解，过滤制得；
所述高效液相色谱检测过程中采用浓度为0.04mol/L的乙酸铵溶液作为流动相A，乙腈作为流动相B；
所述乙酸铵溶液为用氨水调节pH值至10的乙酸铵溶液；
所述高效液相色谱检测的洗脱方式为梯度洗脱；
所述梯度洗脱的洗脱条件为：
0~10min，95%→90%流动相A，5%→10%流动相B；
10~25min，90%→60%流动相A，10%→40%流动相B；
25~50min，60%→48%流动相A，40%→52%流动相B；
50~80min，48%→30%流动相A，52%→70%流动相B；
80~95min，30%→15%流动相A，70%→85%流动相B；所述高效液相色谱检测过程中色谱柱为Phenomenex Gemini C18色谱柱。
2.根据权利要求1所述的附子的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测过程中柱温为40℃、流速为1.0mL/min、检测波长为240nm。
3.根据权利要求1所述的附子的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述附子供试品溶液制备的具体步骤如下：
取4重量份附子制品加入3体积份浓度为10wt%的氨水溶液，再加入50体积份体积比为1:1的异丙醇-乙酸乙酯混合溶液，经超声提取、定容、过滤，再取40体积份所得续滤液浓缩，加入1体积份体积比为1:1的异丙醇-二氯甲烷混合溶液溶解，过滤，即得所述附子供试品溶液；
其中，重量份与体积份之间的对应关系为g：mL。
4.一种附子的高效液相色谱串联质谱联用检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱质谱联用检测方法中高效液相色谱检测条件是利用权利要求1-3中任一项所述的附子的高效液相色谱检测条件进行检测。
5.根据权利要求4所述的附子的高效液相色谱串联质谱联用检测方法，其特征在于，所述附子的高效液相色谱质谱联用检测方法中的质谱分析采用ESI离子源，在正负离子模式下进行检测。
6.根据权利要求5所述的附子的高效液相色谱串联质谱联用检测方法，其特征在于，所述质谱检测过程中，第一个质量分析器的检测范围为100~1000质荷比，离子积累时间设定为30ms；第二个质量分析器的检测范围为50~1000质荷比，离子积累时间设定为20ms；第三个质量分析器的检测范围为50~1000质荷比，离子积累时间设定为20ms。
7.根据权利要求5或6所述的附子的高效液相色谱串联质谱联用检测方法，其特征在于，所述质谱检测过程中，氮气流速为1.5L/min，CDL温度为200℃，加热块的温度为200℃，PDA的检测波长范围为200~700nm，正离子模式下接口电压为4.5kV，负离子模式下接口电压为3.5kV，正负离子模式的检测电压均为1.7kV，干燥气压设定为100kPa，最大压力设定为30MPa。
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