CN114965735B - 附子的多元统计分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种附子的多元统计分析方法，属于药物检测技术领域，所述附子的多元统计分析方法是分别利用高效液相色谱和高效液相色谱串联质谱联用检测附子制品及煻灰炮附子，并分别获得附子制品及煻灰炮附子中6种乌头碱类生物碱含量和相应的化学色谱峰峰面积，从化学色谱峰中选取14个分析色谱峰，将14个分析色谱峰的峰面积和6种乌头碱类生物碱含量作为数据一并进行主成分分析、偏最小二乘‑判别分析和聚类分析，获得分析结果。本发明采用多元统计分析方法对不同附子制品的化学成分进行了研究和比较，为煻灰炮附子在经典名方中的应用提供理论依据和数据支持。

Description

附子的多元统计分析方法

技术领域

本发明涉及药物检测技术，尤其涉及一种附子的多元统计分析方法。

背景技术

附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根的加工品，主要功效为回阳救逆，补火助阳，散寒止痛。附子中的二萜生物碱还具有明显的降压、抑制心肌缩力和抗心律失常作用，而与其水溶性成分则具有升压、强心作用，附子中的双酯型二萜生物碱则能够改善心律失常。

附子作为重要的常用中药，在真武汤、附子汤、桂枝芍药知母汤、温脾汤和小续命汤等经典名方中均有使用，因其具有明显的毒性和疗效，常需炮制加工后使用。而炮制加工方法的改变也势必会影响不同附子加工品的药理活性和安全性。

煻灰炮附子在古代(尤其是唐朝之前)已经过长期临床使用，表明在炮制加工得当、规范煎煮的前提下，煻灰炮附子的安全性和药理活性得到了很大认可。鉴于煻灰炮附子在经典名方中的广泛使用及其古今炮制加工的差异，以煻灰炮附子中所含化学成分的研究并分析，对建立使用了煻灰炮附子的经典名方的质量标准至关重要。此外，由于附子的煻灰古法炮制过程中，存在不易掌握火候的困难、附子加工时易出现烤焦或者烤制时间不足的问题，也容易造成加工药材的浪费，对煻灰炮附子的化学成分进行研究并分析，为寻找能够代替古法煻灰炮附子的现代加工附子制品提供科学依据。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种附子的多元统计分析方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

一种附子的多元统计分析方法，所述多元统计分析方法包括以下步骤：

1)利用高效液相色谱检测附子制品及煻灰炮附子，并分别获得附子制品及煻灰炮附子中苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱和乌头碱共6种乌头碱类生物碱含量；

利用高效液相色谱串联质谱联用检测附子制品及煻灰炮附子，获得相应的化学色谱峰峰面积，并确认煻灰炮附子所得化学色谱峰对应的活性成分；

从煻灰炮附子所得的18个化学色谱峰中选取14个峰面积较大的分析色谱峰(主要色谱峰)作为分析对象；选取过程中，排除33号化学色谱峰，原因是33号色谱峰虽然具有最高的峰面积，但在HPLC-IT-TOF-MSn液质分析中未得到任何母离子和碎片离子信息；

2)将测得的附子制品和煻灰炮附子中6种乌头碱类生物碱含量、检测附子制品和煻灰炮附子获得的14个分析色谱峰的峰面积作为数据一并进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)和聚类分析(CA)，获得分析结果。

进一步的，主成分分析(PCA)、偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)和聚类分析(CA)采用软件Metaboanalyst4.0进行分析；聚类分析方法为系统聚类法(HierarchicalClustering)。

进一步的，所述高效液相色谱串联质谱联用检测中附子制品及煻灰炮附子需制备相应的附子供试品溶液；

所述附子供试品溶液是取附子制品/煻灰炮附子加入氨水溶液，再加入体积比为1∶1的异丙醇-乙酸乙酯混合溶液，经超声提取、定容、过滤，所得续滤液经浓缩后，再次加入体积比为1∶1的异丙醇-二氯甲烷混合溶液溶解，过滤制得。

进一步的，所述高效液相色谱串联质谱联用检测中附子制品及煻灰炮附子需制备相应的附子供试品溶液；

所述附子供试品溶液是取4重量份附子制品/煻灰炮附子加入3体积份浓度为10wt％的氨水溶液，再加入50体积份体积比为1∶1的异丙醇-乙酸乙酯混合溶液，经超声提取、定容、过滤，再取40体积份所得续滤液浓缩后，再次加入1体积份体积比为1∶1的异丙醇-二氯甲烷混合溶液溶解，过滤制得；

其中，重量份与体积份之间的对应关系为g：mL。

进一步的，所述高效液相色谱串联质谱联用检测中的质谱分析采用ESI离子源，在正负离子模式下进行检测。

进一步的，所述高效液相色谱串联质谱联用检测中的质谱条件为：

第一个质量分析器(MS¹)的检测范围为100～1000质荷比(m/z)，离子积累时间设定为30ms；

第二个质量分析器(MS²)的检测范围为50～1000质荷比(m/z)，离子积累时间设定为20ms；

第三个质量分析器(MS³)的检测范围为50～1000质荷比(m/z)，离子积累时间设定为20ms。

进一步的，所述高效液相色谱串联质谱联用检测中的质谱条件为：

氮气流速为1.5L/min，CDL温度为200℃，加热块的温度为200℃，PDA的检测波长范围为200～700nm，正离子模式下接口电压为4.5kV，负离子模式下接口电压为3.5kV，正负离子模式的检测电压均为1.7kV，干燥气压设定为100kPa，最大压力设定为30MPa。

进一步的，所述高效液相色谱串联质谱联用检测中色谱条件为：

流动相A为采用浓度为0.04mol/L的乙酸铵溶液，流动相B为乙腈；

采用梯度洗脱，所述梯度洗脱的洗脱条件为：

0～10min，95％→90％流动相A，5％→10％流动相B；

10～25min，90％→60％流动相A，10％→40％流动相B；

25～50min，60％→48％流动相A，40％→52％流动相B；

50～80min，48％→30％流动相A，52％→70％流动相B；

80～95min，30％→15％流动相A，70％→85％流动相B。

进一步的，所述乙酸铵溶液为氨水调节pH值至10的乙酸铵溶液。

进一步的，所述高效液相色谱串联质谱联用检测中色谱柱为Phenomenex GeminiC18色谱柱、柱温为40℃、流速为1.0mL/min、检测波长为240nm。

本发明的附子的多元统计分析方法的有益效果为：

本发明通过对附子制品及煻灰炮附子，采用HPLC-IT-TOF-MSn结合生物碱含量测定及多元统计分析方法(主成分分析、偏最小二乘-判别分析、聚类分析)对不同附子制品的化学成分进行了研究和比较，为煻灰炮附子在经典名方中的应用提供理论依据和数据支持；

本发明通过多元统计分析方法对附子制品进行快速检测评判，准确将不同品质的附子制品区分处理，能够快速寻找出能够代替古法煻灰炮附子的附子制品；

本发明的多元统计分析方法具有快速、简单、灵敏、高效等优点，且不受附子制品种类的影响，可以对不同种类的附子制品进行检测分类；

本发明的多元统计分析的方法可用于附子制品的质量控制及质量标准的提高，为附子制品不同品质批次间的质量评价研究提供借鉴；

本发明通过调整色谱条件、质谱条件及附子的前处理过程，再采用高效液相色谱串联质谱联用检测方法对附子进行检测，能够有效将活性成分分离并检出；

本发明采用高效液相色谱串联质谱联用检测方法对煻灰炮附子及附子制品(生附片、炒附片、蒸附片和烘附子等)中化学成分进行鉴定，结合对照品及质谱特征共指认38种成分，其中煻灰炮附子18种，生附片24种(16种与煻灰炮附子相同)，炒附片22种(15种相同)、蒸附片17种(10种相同)，烘附子20种(15种相同)；

本发明采用高效液相色谱法对乌头碱类生物碱的含量进行测定，表明煻灰炮附子(0.0151％～0.0654％)和炒附片(0.0263％～0.0582％)中次乌头碱含量最高，生附片中新乌头碱含量最高(0.0638％～0.1207％)，而蒸附片中苯甲酰次乌头原碱含量最高(0.0106％～0.0213％)；

本发明通过对不同附子制品中6种乌头碱类生物碱含量及14个主要化学成分色谱峰面积进行了聚类分析，发现炒附片与煻灰炮附子归为一类的分类距离最小(d＝2.5，d＝6)；对不同附子制品中14个主要化学成分色谱峰面积进行了偏最小二乘法-判别分析，发现新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰新乌头原碱的含量对区分不同附子制品及煻灰炮附子的贡献最大(VIP≥1)；

本发明通过对不同附子制品及煻灰炮附子间的化学成分差异进行多元分析对比，发现炒附片与煻灰炮附子具有15种相同成分，且聚类分析中距离最小，同时两者中次乌头碱的含量均最高，说明炒附片具有与煻灰炮附子最为相似的化学成分物质基础，可以以炒附子作为煻灰炮附子的替代品；

本发明通过对5种附子制品(煻灰炮附子、生附子、炒附子、蒸附子、烘附子)进行高效液相色谱串联质谱联用检测，从特征碎片离子信息中鉴定出38种化学成分(均为生物碱)，并指认了33种化学成分；其中，煻灰炮附子中共鉴定出18种化学成分；生附片中共鉴定出24个化学成分，其鉴定出的14-乙酰尼奥灵或其异构体、乌头卡查敏碱B、翠雀碱或异翠雀碱未在其它加工品中检出；炒附片中共鉴定22个化学成分，其鉴定出的10-羟基苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰-3，13-双去氧新乌头原碱或其异构体、脱水苯甲酰新乌头原碱、脱水苯甲酰次乌头原碱、唐古替星A或其异构体未在其它炮制方法制备的饮片中检出；蒸附片中共鉴定17个化学成分，其鉴定出的1-乙酰光泽乌头碱或12-乙酰光泽乌头碱、苯甲酰去氧乌头原碱未在其它炮制方法制备的饮片中检出；烘附子中共鉴定20个化学成分，其鉴定出的尼奥灵或10-羟基塔拉乌头胺、森布星A或森布星B、14-乙酰尼奥灵或其异构体、卡米车灵A或其异构体未在其它炮制方法制备的饮片中检出；

本发明的高效液相色谱串联质谱联用检测方法具有超高的灵敏度和优异的定性能力；

本发明中38种化学成分存在细微结构差异，产生的质谱特征片段存在较大差异，可准确确证活性成分；

本发明的多元统计分析方法准确度高、方法简单、分析周期短、稳定性好、重复性良好、活性成分分离效果好，可作为附子制品药理活性和安全性检查的重要方法。

附图说明

图1是本发明实施例1中不同附子制品中6种乌头碱类生物碱含量对比图；

图2是本发明实施例1中不同附子制品的高效液相色谱对比图；

图3是本发明实施例1中蒸附子的高效液相色谱图；

图4是本发明实施例1中炒附子的高效液相色谱图；

图5是本发明实施例1中生附子的高效液相色谱图；

图6是本发明实施例1中煻灰炮附子的高效液相色谱图；

图7是本发明实施例1中煻灰炮附子的高效液相色谱图；

图8是本发明实施例1中不同附子制品及煻灰炮附子制品的分析色谱峰PCA二维空间图；

图9是本发明实施例1中不同附子制品及煻灰炮附子制品的分析色谱峰PLS-DA二维空间图；

图10是本发明实施例1中不同附子制品及煻灰炮附子制品的VIP值排序图；

图11是本发明实施例1中不同附子制品及煻灰炮附子制品的14种分析色谱峰峰面积聚类分析结果图；

图12是本发明实施例1中不同附子制品及煻灰炮附子制品的6种乌头碱类生物碱含量聚类分析结果图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

实施例1一种附子的多元统计分析方法

本实施例分别对煻灰炮附子、生附子、炒附子、蒸附子、烘附子这五种不同的饮片进行多元统计分析，具体方法如下：

一、6种乌头碱类生物碱含量检测

分别精密称定煻灰炮附子、生附子、炒附子、蒸附子的粉末(过3号筛)各2g，置具塞锥形瓶中，加入3mL氨试液(取25％浓氨水400mL，加超纯水使成1000mL，即得)，精密加入50mL体积比为1∶1的异丙醇-乙酸乙酯混合溶液，称定重量，经超声处理(功率300W，频率40kHz，水温在25℃以下)30分钟，放至室温，再次称定重量，并用体积比为1∶1的异丙醇-乙酸乙酯混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，所得续滤液再次精密量取25mL，于40℃以下减压回收溶剂至干，残余物精密加入3mL体积比为1∶1的异丙醇-二氯甲烷混合溶液溶解，滤过，取续滤液，相应的附子待测液，即煻灰炮附子待测液(制备8次，标记为PFZ1)、生附子待测液(制备3次，标记为SFZ1)、炒附子待测液(制备3次，标记为CFZ1)和蒸附子待测液(制备3次，标记为ZFZ1)。其中，不同附子待测液中附子浓度均为(2/3)g/mL。

取苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱对照品适量，分别精密称定后置于同一容量瓶中，加入体积比为1∶1的异丙醇-二氯甲烷混合溶液制成每1mL各含10μg苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱的混合溶液，即得对照品溶液A。其中，苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱的浓度均为10μg/mL。

取乌头碱、次乌头碱、新乌头碱对照品适量，分别精密称定后置于同一容量瓶中，加入体积比为1∶1的异丙醇-二氯甲烷混合溶液制成每1mL各含5μg乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的混合溶液，即得对照品溶液B。其中，乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的浓度均为5μg/mL。

分别煻灰炮附子待测液、生附子待测液、炒附子待测液、蒸附子待测液、对照品溶液A和对照品溶液B进行高效液相色谱检测，即得相应的附子和相应对照品的保留时间及峰面积，然后依据对应的保留时间和峰面积分别计算相应附子中苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱和乌头碱这6种乌头碱类生物碱的含量，具体结果见表1和图1。

其中，高效液相色谱检测的检测条件为：

色谱柱为

BDSHYPERSIL C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；

检测波长为235nm；

柱温为25℃；

流速为1.0mL/min；

进样量为10μL；

流动相A是0.1mol/L乙酸铵(每1000mL加冰醋酸0.5mL)，流动相B为体积比为25：15的乙腈-四氢呋喃混合溶液；

洗脱方式为梯度洗脱，具体洗脱程序为：

0～48min，85％→74％流动相A，15％→26％流动相B；

48～49min，74％→65％流动相A，26％→35％流动相B；

49～58min，65％流动相A，35％流动相B；

58～65min，65％→85％流动相A，35％→15％流动相B。

含量计算方法具体如下：

乌头碱类生物碱含量计算公式(％)＝(附子待测液对应的乌头碱类生物碱峰面积×对照品溶液中乌头碱类生物碱的浓度)/(乌头碱类生物碱对照品对应的峰面积×附子待测液中附子浓度)×100％；

比如：煻灰炮附子中苯甲酰新乌头原碱含量(％)＝(煻灰炮附子待测液对应的苯甲酰新乌头原碱峰面积×对照品溶液A中苯甲酰新乌头原碱的浓度)/(对照品溶液A中苯甲酰新乌头原碱对应的峰面积×煻灰炮附子待测液中附子浓度)×100％＝(煻灰炮附子待测液对应的苯甲酰新乌头原碱峰面积×1.5×10^-5/对照品溶液A中苯甲酰新乌头原碱对应的峰面积)×100％。

表1附子不同加工品的含量测定结果(％)

BMA＝苯甲酰新乌头原碱；BAC＝苯甲酰乌头原碱；BHA＝苯甲酰次乌头原碱；MA＝新乌头碱；HA＝次乌头碱；AC＝乌头碱

¹表示形式为平均值±标准差；²N.D.表示实验条件下未检出

由于，研究中烘附子样品不足，作为定量研究(含量测定)和统计分析研究(PCA、PLS-DA、CA)的代表性不足，本实施例未对烘附子进行多元分析，但在定性研究中(HPLC-IT-TOF-MSⁿ)可以作为不同附子加工品中化学成分差异的参考。

二、高效液相色谱串联质谱联用检测(HPLC-IT-TOF-MSⁿ)

精密称取8批煻灰炮附子粉末(过3号筛)各0.5g，混合均匀，混合粉末共4g，置于具塞锥形瓶中，加3mL氨试液(取25％浓氨水400mL，加超纯水使之成1000mL)，精密加入50mL体积比为1∶1的异丙醇-乙酸乙酯混合溶液，称定重量，再经超声处理(功率300W，频率40kHz，水温在25℃以下)30分钟，放至室温(20～25℃)，再次称定重量，用体积比为1∶1的异丙醇-乙酸乙酯混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，所得续滤液再次精密量取40mL，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入体积比为1∶1的异丙醇-二氯甲烷混合溶液1mL溶解，滤过，所得滤液即为煻灰炮附子供试品溶液，标记为PFZ。

取3批生附片粉末(过3号筛)各1.4g，混合均匀，再次取所得混合粉末4g，依照煻灰炮附子供试品溶液的方法制备生附片供试品溶液，标记为SFZ。

依照生附子供试品溶液的制备方法，分别制备炒附片供试品溶液(标记为CFZ)和蒸附片供试品溶液(标记为ZFZ)。

取4g烘附子粉末(过3号筛)，依照煻灰炮附子供试品溶液的方法制备烘附子供试品溶液，标记为HFZ。

煻灰炮附子供试品溶液PFZ、生附片供试品溶液SFZ、炒附片供试品溶液CFZ、蒸附片供试品溶液ZFZ、烘附子供试品溶液HFZ统称为不同的附子供试品溶液。

分别取烘附子供试品溶液HFZ、煻灰炮附子供试品溶液PFZ、生附片供试品溶液SFZ、炒附片供试品溶液CFZ、蒸附片供试品溶液ZFZ、烘附子供试品溶液HFZ及上述对照品溶液A和对照品溶液B进行高效液相色谱串联质谱联用检测，即得相应的色谱图和质谱鉴定结果。所得相应的附子色谱图见图2～6，图2为不同附子制品的色谱对比图，其中A测定的是蒸附子供试品溶液，B测定的是炒附子供试品溶液，C测定的是生附子供试品溶液，D测定的是煻灰炮附子供试品溶液；图3为蒸附子的色谱图，图4为炒附子的色谱图，图5为生附子的色谱图，图6为煻灰炮附子的色谱图；图7为烘附子的色谱图。

其中，高效液相色谱检测的检测条件为：

色谱柱为Phenomenex Gemini C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；

检测波长为240nm；

柱温为40℃；

流速为1.0mL/min；

进样量为5μL；

流动相A是以氨水调节pH值至10、浓度为0.04mol/L的乙酸铵溶液，流动相B乙腈；

洗脱方式为梯度洗脱，具体洗脱程序为：

0～10min，95％→90％流动相A，5％→10％流动相B；

10～25min，90％→60％流动相A，10％→40％流动相B；

25～50min，60％→48％流动相A，40％→52％流动相B；

50～80min，48％→30％流动相A，52％→70％流动相B；

80～95min，30％→15％流动相A，70％→85％流动相B。

质谱检测条件为：

采用ESI离子源进行质谱分析，并在正负离子模式下进行检测；

第一个质量分析器(MS¹)的检测范围为100～1000质荷比(m/z)，离子积累时间设定为30ms；

第二个质量分析器(MS²)的检测范围为50～1000质荷比(m/z)，离子积累时间设定为20ms；

第三个质量分析器(MS³)的检测范围为50～1000质荷比(m/z)，离子积累时间设定为20ms；

氮气流速设定为1.5L/min；

CDL温度为200℃；

加热块温度为200℃；

PDA检测波长范围为200～700nm；

正离子模式下接口电压为4.5kV，负离子模式下接口电压为3.5kV，正负离子模式的检测电压均为1.7kV；

干燥气压力设定为100kPa，最大压力为30MPa。

针对不同附子制品所测的色谱图中不同化学特征色谱峰进行对比、统计，并与对照品的化学特征色谱峰进行对比，获得不同附子制品的36个HPLC化学特征色谱峰，具体见表2。

表2不同附子制品的36个HPLC化学特征色谱峰

表2中，3号色谱峰对应的化学成分为1-乙酰光泽乌头碱或12-乙酰光泽乌头碱，5号色谱峰对应的化学成分为附子灵、10-羟基苯甲酰新乌头原碱，6号色谱峰对应的化学成分为苯甲酰新乌头原碱、尼奥灵(或其异构体10-羟基塔拉乌头胺)，8号色谱峰对应的化学成分为苯甲酰乌头原碱，9号色谱峰对应的化学成分为14-乙酰尼奥灵或其异构体，10号色谱峰对应的化学成分为苯甲酰次乌头原碱，11号色谱峰对应的化学成分为14-乙酰尼奥灵或其异构体，16号色谱峰对应的化学成分为卡米车灵A或其异构体，17号色谱峰对应的化学成分为苯甲酰-3，13-双去氧新乌头原碱、8-乙酰-14-苯甲酰尼奥灵(或其异构体)、trifoliolasine E，18号色谱峰对应的化学成分为脱水苯甲酰新乌头原碱，20号色谱峰对应的化学成分为新乌头碱，21号色谱峰对应的化学成分为乌头芬碱，22号色谱峰对应的化学成分为翠雀碱或异翠雀碱，23号色谱峰对应的化学成分为乌头碱，24号色谱峰对应的化学成分为乌头卡查敏碱B，25号色谱峰对应的化学成分为脱水苯甲酰次乌头原碱，27号色谱峰对应的化学成分为次乌头碱，29号色谱峰对应的化学成分为3-去氧乌头碱或印乌头碱，30号色谱峰对应的化学成分为唐古替星A或其异构体，31号色谱峰对应的化学成分为展花乌头碱或3，13-双脱氧乌头碱，34号色谱峰对应的化学成分为8-乙酰-14-苯甲酰尼奥灵或其异构体，36号色谱峰对应的化学成分为1-羰基翠雀素或6，14-二乙酰翠雀拉亭。

再次针对不同附子制品所测的质谱鉴定结果进行对比、统计，并与对照品的质谱鉴定结果进行对比，获得不同附子制品鉴定的38种化学成分，且这些化学成分均为生物碱，具体见表3。

从表3中可以看出，煻灰炮附子中共鉴定18个化学成分；生附片中共鉴定24个化学成分，其中14-乙酰尼奥灵或其异构体、乌头卡查敏碱B、翠雀碱或异翠雀碱未在其他加工品中检出；炒附片中共鉴定22个化学成分，其中10-羟基苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰-3，13-双去氧新乌头原碱或其异构体、脱水苯甲酰新乌头原碱、脱水苯甲酰次乌头原碱、唐古替星A或其异构体未在其他加工品中检出；蒸附片中共鉴定17个化学成分，其中1-乙酰光泽乌头碱或12-乙酰光泽乌头碱、苯甲酰去氧乌头原碱未在其他加工品中检出；烘附子中共鉴定20个化学成分，其中尼奥灵或10-羟基塔拉乌头胺、森布星A或森布星B、14-乙酰尼奥灵或其异构体、卡米车灵A或其异构体未在其他加工品中检出。

三、多元统计分析

在多元分析过程中，舍弃样本量不足的烘附子。

在HPLC-IT-TOF-MSⁿ研究的基础上，从煻灰炮附子所具有的18个化学特征色谱峰(图6)中选择14个峰面积较大的主要色谱峰(具体见表4)作为分析色谱峰。其中，33号色谱峰虽然具有最高的峰面积，但在HPLC-IT-TOF-MSⁿ液质分析中未得到任何母离子和碎片离子信息，故不作为多元统计分析的分析色谱峰。具体分析色谱峰如下：

表4 14种煻灰炮附子的分析色谱峰一览

表4中色谱峰序号列中数字与表2中色谱峰序号对应

分别将不同附子制品(生附片、炒附片、蒸附片)及煻灰炮附子的对应14种分析色谱峰峰面积及6种乌头碱类生物碱含量导入Excel表格，添加“Label”行并为相同加工品种的不同批次标上同一标签，保存为csv格式的csv文件。将csv文件导入在线分析软件Metaboanalyst 4.0(https：//www.metaboanalyst.ca/)的单因素统计分析工具集中，导入时数据类型选择“峰面积”或“浓度”，数据格式选择“未配对列向排布(sample incolumn)”。数据过滤项选择“None”，标准化处理时，Sample normalization、DataTransformation及Data Scaling三项均选择“None”，最后选择相应的分析模块分别对上述数据进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)和聚类分析(CA)，聚类分析方法为层次聚类(Hierarchical Clustering)，距离标准为Pearson，聚类算法为Ward，分析结束后将分析结果导出为树状图(Dendrogram)。

1)主成分分析

主成分分析(PCA)是一种对数据进行旋转变换的统计学方法，其本质是在线性空间中进行一个基变换，使得变换后的数据投影在一组新的“坐标轴”上的方差最大化，随后，裁剪掉变换后方差很小的“坐标轴”，剩下的新“坐标轴”即被称为主成分(PrincipalComponent)，它们可以在一个较低维度的子空间中尽可能地表示原有数据的性质。

通过PCA，我们可以将表征附子制品及煻灰炮附子选取的化学物质基础的N个成分的含量(N个维度)，通过适当的函数变换，降维成2个“主成分”(2个维度)，同时尽可能地保留了原有数据的性质。在新的2维空间坐标中，2个样品点的空间距离越近，表明该样品原有数据(N个成分的含量)的相近成度越高，反之相近程度越低。

主成分分析(PCA)结果见图8。图8中，绿色数据点表示煻灰炮附子中14种分析色谱峰峰面积数据经处理后在二维坐标空间中的投影，绿色空间区域表示煻灰炮附子中14个化学特征色谱峰峰面积数据经处理后在二维坐标空间中投影的分布范围情况；蓝色数据点表示生附片样品中14种分析色谱峰峰面积数据经处理后在二维坐标空间中的投影，蓝色空间区域表示生附片样品中14种分析色谱峰峰面积数据经处理后在二维坐标空间中投影的分布范围情况；红色数据点表示炒附片样品中14种分析色谱峰峰面积数据经处理后在二维坐标空间中的投影，红色空间区域表示炒附片样品中14种分析色谱峰峰面积数据经处理后在二维坐标空间中投影的分布范围情况；青色数据点表示蒸附片样品中14种分析色谱峰峰面积数据经处理后在二维坐标空间中的投影，青色空间区域表示蒸附片样品中14种分析色谱峰峰面积数据经处理后在二维坐标空间中投影的分布范围情况。

在图8中，若两个样品的数据投影点的空间分布越相近，则表示这两个样品在化学成分上的相似性越高(体现在14种分析色谱峰峰面积的相似性上)、差异性越小；反之，若两个样品的数据投影点的空间分布越相离，则表示这两个样品在化学成分上的相似性越低、差异性越大。同理，在图8中，若附子制品与煻灰炮附子的数据投影空间区域越相近、重合度越大，则表示这种附子制品与煻灰炮附子在化学成分上的相似性越高、差异性越小；反之，若这种附子制品与煻灰炮附子的数据投影空间区域越相离、重合度越小，则表示这种附子制品与煻灰炮附子在化学成分上的相似性越低、差异性越大。

根据PCA结果可以看出，在图8中，炒附片样品的数据投影空间区域与煻灰炮附子的数据投影空间区域最为相近，它们的数据投影空间区域几乎完全重合，表明在3种现代附子制品中，炒附片的化学成分与煻灰炮附子的相似程度最高；生附片样品的数据投影空间区域与煻灰炮附子的数据投影空间区域分布较为相离，它们的数据投影空间区域仅有小部分重合，表明生附片的化学成分与煻灰炮附子有较大差异，相似程度不如炒附片；蒸附片样品的数据投影空间区域与煻灰炮附子的数据投影空间区域最为相离，它们的数据投影空间区域完全没有发生重合，表明在3种现代附子制品中，蒸附片的化学成分与煻灰炮附子的相似程度最低。

2)偏最小二乘-判别分析

PLS-DA(Partial Least Squares Discriminant Analysis)，即偏最小二乘法判别分析，是多变量数据分析技术中的判别分析法，经常用来处理分类和判别问题。通过对主成分适当的旋转，PLS-DA可以有效的对组间观察值进行区分，并且能够找到导致组间区别的影响变量。该方法与PCA类似。

同理，根据PLS-DA结果，参见图9，可以看出，在图9中，炒附片样品的数据投影空间区域与煻灰炮附子的数据投影空间区域最为相近，它们的数据投影空间区域有很大的重合度，表明在3种现代附子制品中，炒附片的化学成分与煻灰炮附子的相似程度最高；在图9中，生附片样品的数据投影空间区域与煻灰炮附子的数据投影空间区域分布较为相离，它们的数据投影空间区域仅有小部分重合，表明生附片的化学成分与煻灰炮附子有较大差异，相似程度不如炒附片；在图9中，蒸附片样品的数据投影空间区域与“煻灰炮”附子的数据投影空间区域最为相离，它们的数据投影空间区域完全没有发生重合，表明在3种现代附子制品中，蒸附片的化学成分与煻灰炮附子的相似程度最低。

根据PLS-DA的结果，我们发现在3种附子现代加工品中，炒附片在化学成分上与煻灰炮附子具有最高的相似程度，此结果与主成分分析(PCA)结果一致。

图8和图9综合来看，可以看出炒附片的空间分布区域(红)与煻灰炮附子(绿)具有最高的重合度，而蒸附片的空间分布(青)与煻灰炮附子(绿)无重合。

VIP值是PLS-DA模型变量的变量权重值，可用于衡量各化学成分含量差异对各组样本分类判别的影响强度和解释能力，VIP≥1为常见的差异化学成分筛选标准。对偏最小二乘-判别分析PLS-DA获得的结果进行VIP值排序，排序结果见图10，发现VIP值≥1的化学特征色谱峰有3个，降序排列依次为峰20(t_R＝41.224min)、峰27(t_R＝59.179min)、峰6(t_R＝28.279min)。根据HPLC-IT-TOF液质指认结果，峰20为新乌头碱，峰27为次乌头碱，峰6主要为苯甲酰新乌头原碱。上述结果表明，4种附子不同加工品(“煻灰炮”附子、生附片、炒附片、蒸附片)中新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰新乌头原碱的含量差异是导致它们具有不同化学成分特征的重要因素，也是区分“煻灰炮”附子、生附片、炒附片、蒸附片的关键成分。其中，炒附子的VIP值与煻灰炮附子最为接近。

3)聚类分析

聚类分析(ClusterAnalysis)又称群分析，是根据“物以类聚”的道理，对样品或指标进行分类的一种多元统计分析方法，它们讨论的对象是大量的样品，要求能合理地按各自的特性来进行合理的分类，没有任何模式可供参考或依循，即是在没有先验知识的情况下进行的。聚类是将数据分类到不同的类或者簇这样的一个过程，所以同一个簇中的对象有很大的相似性，而不同簇间的对象有很大的相异性。

在聚类分析中，衡量样本间相似性和差异性的方法就是计算两个样本之间的分类距离(d)，分类距离越小，样本间的相似性越大，反之相似性越小。

聚类分析的分析结果见图11和图12，其中，PFZ表示煻灰炮附子，SFZ表示生附片，CFZ表示炒附片，ZFZ表示蒸附片，序号表示不同的批次，即PFZ-7表示第7批次的煻灰炮附子。

图11为14种分析色谱峰峰面积的聚类分析结果，图12为6种乌头碱类生物碱含量的聚类分析结果，可以看出，以14个主要色谱峰HPLC峰面积为变量，发现分类距离d＝5时生附片、炒附片与煻灰炮附子可聚为一类，而d＝20时蒸附片可与煻灰炮附子聚为一类；以6种生物碱含量为变量，发现d＝2.5时炒附片可与煻灰炮附子聚为一类，d＝5时生附片可与煻灰炮附子聚为一类，而d＝7.5时蒸附片可与煻灰炮附子聚为一类。因此，炒附片与煻灰炮附子归为一类的分类距离最小。

当主成分分析(PCA)、偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)和聚类分析(CA)的分析结果一致，且判定结果均为附子制品与煻灰炮附子相似度较高时，即可判定该附子制品(如：炒附子)可代替煻灰炮附子使用；当分析结果不一致，出现附子制品与煻灰炮附子相似度不高时，则判定该附子制品(如：蒸附子、生附子)无法代替煻灰炮附子使用。

显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (6)

1.一种附子的多元统计分析方法，其特征在于，所述多元统计分析方法包括以下步骤：

1)利用高效液相色谱检测附子制品及煻灰炮附子，并分别获得附子制品及煻灰炮附子中苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱和乌头碱共6种乌头碱类生物碱含量；

利用高效液相色谱串联质谱联用检测附子制品及煻灰炮附子，获得相应的化学色谱峰峰面积，并确认煻灰炮附子所得化学色谱峰对应的活性成分；

所述高效液相色谱串联质谱联用检测中附子制品及煻灰炮附子需制备相应的附子供试品溶液；

所述附子供试品溶液是取附子制品/煻灰炮附子加入氨水溶液，再加入体积比为1:1的异丙醇-乙酸乙酯混合溶液，经超声提取、定容、过滤，所得续滤液经浓缩后，再次加入体积比为1:1的异丙醇-二氯甲烷混合溶液溶解，过滤制得；

所述高效液相色谱串联质谱联用检测中色谱条件为：

流动相A为采用浓度为0.04mol/L的乙酸铵溶液，流动相B为乙腈；

所述乙酸铵溶液为氨水调节pH值至10的乙酸铵溶液；

采用梯度洗脱，所述梯度洗脱的洗脱条件为：

0～10min，95％→90％流动相A，5％→10％流动相B；

10～25min，90％→60％流动相A，10％→40％流动相B；

25～50min，60％→48％流动相A，40％→52％流动相B；

50～80min，48％→30％流动相A，52％→70％流动相B；

80～95min，30％→15％流动相A，70％→85％流动相B；

所述高效液相色谱串联质谱联用检测中色谱柱为Phenomenex Gemini C18色谱柱、柱温为40℃、流速为1.0mL/min、检测波长为240nm；

从煻灰炮附子所得的18个化学色谱峰中选取14个峰面积较大的分析色谱峰作为分析对象；选取过程中，排除33号化学色谱峰，原因是33号色谱峰虽然具有最高的峰面积，但在HPLC-IT-TOF-MSⁿ液质分析中未得到任何母离子和碎片离子信息；

2)将测得的附子制品和煻灰炮附子中6种乌头碱类生物碱含量、检测附子制品和煻灰炮附子获得的14个分析色谱峰的峰面积作为数据一并进行主成分分析、偏最小二乘-判别分析和聚类分析，获得分析结果。

2.根据权利要求1所述的附子的多元统计分析方法，其特征在于，主成分分析、偏最小二乘-判别分析和聚类分析采用软件Metaboanalyst 4.0进行分析；

聚类分析方法为系统聚类法。

3.根据权利要求1或2所述的附子的多元统计分析方法，其特征在于，所述高效液相色谱串联质谱联用检测中附子制品及煻灰炮附子需制备相应的附子供试品溶液；

所述附子供试品溶液是取4重量份附子制品/煻灰炮附子加入3体积份浓度为10wt％的氨水溶液，再加入50体积份体积比为1:1的异丙醇-乙酸乙酯混合溶液，经超声提取、定容、过滤，再取40体积份所得续滤液浓缩后，再次加入1体积份体积比为1:1的异丙醇-二氯甲烷混合溶液溶解，过滤制得；

其中，重量份与体积份之间的对应关系为g：mL。

4.根据权利要求1或2所述的附子的多元统计分析方法，其特征在于，所述高效液相色谱串联质谱联用检测中的质谱分析采用ESI离子源，在正负离子模式下进行检测。

5.根据权利要求4所述的附子的多元统计分析方法，其特征在于，所述高效液相色谱串联质谱联用检测中的质谱条件为：

第一个质量分析器的检测范围为100～1000质荷比，离子积累时间设定为30ms；

第二个质量分析器的检测范围为50～1000质荷比，离子积累时间设定为20ms；

第三个质量分析器的检测范围为50～1000质荷比，离子积累时间设定为20ms。

6.根据权利要求4所述的附子的多元统计分析方法，其特征在于，所述高效液相色谱串联质谱联用检测中的质谱条件为：

氮气流速为1.5L/min，CDL温度为200℃，加热块的温度为200℃，PDA的检测波长范围为200～700nm，正离子模式下接口电压为4.5kV，负离子模式下接口电压为3.5kV，正负离子模式的检测电压均为1.7kV，干燥气压设定为100kPa，最大压力设定为30MPa。

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