CN114764090B - 清脑复神液高效液相色谱串联质谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及清脑复神液高效液相色谱串联质谱检测方法，采取清脑复神液中10种有效成分葛根素、芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷、小檗碱、细叶远志皂苷、黄芩素、大黄素、大黄酚浓度的高效液相色谱串联质谱检测方法。包括以下步骤：(1)储备液的制备：各有效成分分别溶解于100％甲醇溶液中，制得标准品储备溶液；(2)待测样品溶液的制备；(3)将步骤(2)所得待测样品溶液进行液相色谱分离及质谱分析。本发明的检测方法色谱峰形极佳，每个化合物的通道都只有唯一的目标峰，操作简单、分析快速、特异性高、分离度高。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，特别是涉及清脑复神液高效液相色谱串联质谱检测方法，更具体地，涉及清脑复神液药物中10种主要成分浓度的高效液相色谱串联质谱检测方法。
背景技术
清脑复神液载于卫生部颁布的药品标准中药成方制剂第九册,其主方由丹参、川芎、当归、红花、桃仁、赤芍、枣仁、茯苓、五味子、决明子、莲子心、柏子仁、钩藤、远志、半夏、桔梗、竹茹、陈皮、葛根、羌活、白芷等48味中药组成。具有清心安神、化痰醒脑、活血通络的作用,主治神经衰弱、失眠、顽固性头痛、脑震荡后遗症所致头痛，眩晕，健忘、失眠等症。作为安神类处方药,在临床上使用非常广泛和频繁。由于清脑复神液由多种中药组成，故相关药物的质量控制显得尤为重要。清脑复神液至今未收载于历版《中国药典》，只有广州市药检所确定的标准，即对大黄酚和丹参酮IIA进行定性的检测。质量标准的不明确，极大地限制了清脑复神液的使用，因此亟需针对清脑复神液中的有效成分成分建立灵敏度高、专属性强、快速高效的分析方法，为清脑复神液的质量控制和评价提供依据，为清脑复神液中的活性成分研究提供技术支持。
发明内容
基于此，本发明的目的之一是提供清脑复神液高效液相色谱串联质谱检测方法，更具体地，涉及清脑复神液中10种主要成分葛根素、芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷、小檗碱、细叶远志皂苷、黄芩素、大黄素、大黄酚的浓度的高效液相色谱串联质谱检测方法，该检测方法操作简单、分析快速、特异性高、分离度高。
根据清脑复神液的四十八味中药原料，我们选取其中含有明确有效成分的部分中药，将其有效成分单体作为检测对象，我们选取葛根素、芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷、小檗碱、细叶远志皂苷、黄芩素、大黄素、大黄酚作为检测对象，并采取高效液相色谱串联质谱检测方法。
具体技术方案如下：
清脑复神液高效液相色谱串联质谱检测方法，采取清脑复神液中10种有效成分葛根素、芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷、小檗碱、细叶远志皂苷、黄芩素、大黄素、大黄酚浓度的高效液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤：
(1)储备溶液的制备：
取标准品葛根素、芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷、小檗碱、细叶远志皂苷、黄芩素、大黄素、大黄酚，分别溶解于100％甲醇溶液中，制得标准品储备溶液；将标准品储备溶液混合，得到混合标准品储备溶液；
(2)工作溶液的制备：
分别用40±5％乙腈水溶液稀释所述混合标准品储备溶液，制得混合标准曲线样本工作溶液和混合质控样本工作溶液；
(3)待测样品溶液的制备：
待测样品溶液的制备：取清脑复神液，加入适量的40±5％乙腈水溶液稀释到合适的浓度，涡旋混匀，之后过0.22μm的微孔滤膜，滤液即为待测样品进样溶液；
(4)将步骤(3)所得待测样品溶液进行液相色谱分离；将液相色谱分离后的样品进行质谱分析。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明方法选择直接将清脑复神液产品进行稀释后过滤，之后只需要极少的进样量进行分析就可以满足定量要求，样本预处理过程被大大简化。本发明的检测方法采用的是液相色谱串联三重四极杆质谱法(LC-MS/MS)，采集模式采用多反应监测(multiplereaction monitoring,MRM)，基于每个化合物的离子对信息，对每个化合物的质谱信号单独采集，通道之间相互独立，同时采集。本发明建立的LC-MS/MS-MRM方法特异性强、灵敏度高、准确度高、重现性好；每个化合物的色谱峰形极佳，在定量范围内线性良好；前处理采用直接稀释法，操作简单；每一个样本的进样时间为3分钟，分析快速；在空白溶剂中未发现待检测的化合物峰，特异性高，能够满足药物检测的相关要求。
附图说明
图1为清脑复神液10种有效成分LC-MS/MS-MRM总色谱图。
图2为葛根素在样品中的液相色谱图(保留时间0.46min)：
图3为芍药苷在样品中的液相色谱图(保留时间0.49min)：
图4为柚皮苷在样品中的液相色谱图(保留时间0.50min)：
图5为橙皮苷在样品中的液相色谱图(保留时间0.51min)；
图6为黄芩苷在样品中的液相色谱图(保留时间0.60min)：
图7为小檗碱在样品中的液相色谱图(保留时间0.72min)：
图8为细叶远志皂苷在样品中的液相色谱图(保留时间1.05min)：
图9为黄芩素在样品中的液相色谱图(保留时间1.72min)；
图10为大黄素在样品中的液相色谱图(保留时间1.72min)。
图11为大黄酚在样品中的液相色谱图(保留时间1.90min)。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将结合实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本实施方式提供清脑复神液高效液相色谱串联质谱检测方法，采取清脑复神液中10种有效成分葛根素、芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷、小檗碱、细叶远志皂苷、黄芩素、大黄素、大黄酚，包括以下步骤：
(1)储备溶液的制备：
取标准品葛根素、芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷、小檗碱、细叶远志皂苷、黄芩素、大黄素、大黄酚，分别溶解于100％甲醇溶液中，制得标准品储备溶液；将标准品储备溶液混合，得到混合标准品储备溶液；
(2)标准曲线溶液的制备：
分别用40±5％乙腈水溶液稀释所述混合标准品储备溶液，制得混合标准曲线溶液和混合质控溶液；
(3)待测样品进样溶液的制备：
待测样品溶液的制备：取清脑复神液，加入适量的40±5％乙腈水溶液稀释到合适的浓度，涡旋混匀，之后过0.22μm的微孔滤膜，滤液即为待测样品进样溶液；
(4)将步骤(3)所得待测样品进样溶液进行液相色谱分离；将液相色谱分离后的样品进行质谱分析。
其中，各成分的性质如下：
葛根素游离态分子式与分子量为C21H20O9/416.38，具体结构如式(Ⅰ)所示。
芍药苷游离态分子式与分子量为C23H28O11/480.45，具体结构如式(Ⅱ)所示。
柚皮苷游离态分子式与分子量为C27H32O14/580.54，具体结构如式(Ⅲ)所示。
橙皮苷游离态分子式与分子量为C28H34O15/610.56，具体结构如式(Ⅳ)所示。
黄芩苷游离态分子式与分子量为C28H34O15/610.56，具体结构如式(Ⅴ)所示。
小檗碱游离态分子式与分子量为C28H34O15/610.56，具体结构如式(Ⅵ)所示。
细叶远志皂苷游离态分子式与分子量为C36H56O12/680.37，具体结构式如式(Ⅶ)所示。
黄芩素游离态分子式与分子量为C15H10O5/270.24，具体结构式如式(Ⅷ)所示。
大黄素游离态分子式与分子量为C15H10O5/270.24，具体结构式如式(Ⅸ)所示。
大黄酚游离态分子式与分子量为C15H10O4/254.23，具体结构式如式(Ⅹ)所示。
表1
在其中一些实施例中，所述液相色谱分离所采用的洗脱方式为：以(0.1±0.02)％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱。
在其中一些实施例中，所述梯度洗脱的过程包括：
0.0～0.5分钟，流动相B：40±5％→40±5％；
0.5～1.0分钟，流动相B：40±5％→95±5％；
1.0～2.0分钟，流动相B：95±5％→95±5％；
2.0～2.2分钟，流动相B：95±5％→40±5％；
2.2～3.0分钟，流动相B：40±5％→40±5％。
优选地，所述梯度洗脱的过程为：
0.0～0.5分钟，流动相B：40％→40％；
0.5～1.0分钟，流动相B：40％→95％；
1.0～2.0分钟，流动相B：95％→95％；
2.0～2.2分钟，流动相B：95％→40％；
2.2～3.0分钟，流动相B：40％→40％。
在其中一些实施例中，所述液相色谱的色谱条件包括：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
流速：0.3±0.05mL/min；
进样体积：3.00±0.5μL；
柱温：40±5℃；
自动进样器温度：4±4℃；
洗针液：50±5％甲醇水溶液；
洗冲速度：30-40μL/sec；
洗针液体积：400-600μL。
在其中一些实施例中，所述质谱分析的条件包括：
离子化模式：电喷雾离子源(ESI，Electrospray Ionization)；正负离子同时检测模式；多反应监测(MRM，Multiple Reaction Monitoring)；
离子源参数：气帘气：20psi；离子源气体1：30psi；离子源气体2：30psi
离子源喷雾电压：正离子模式5500±10V，负离子模式-4500±10V；
离子源温度：500±10℃；
分辨率Q1/Q3：Unit/Unit；
碰撞气：Medium；
暂停时间：20±1msec；
质谱采集时间为3.00±0.2min。
在其中一些实施例中，所述质谱分析中，各成分的四级杆质谱条件为：
葛根素：离子模式：ESI+；离子对：417.2→297.1；去簇电压：100.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：39.00eV；停留时间：50.0msec；
芍药苷：离子模式：ESI-；离子对：525.2→449.3；去簇电压：-100.0V；入口电压：-10.00V；出口电压：-16.00V；碰撞能量：-19.00eV；停留时间：50.0msec；
柚皮苷：离子模式：ESI-；离子对：579.2→270.9；去簇电压：-100.0V；入口电压：-10.00V；出口电压：-16.00V；碰撞能量：-47.00eV；停留时间：50.0msec；
橙皮苷：离子模式：ESI-；离子对：609.2→301.2；去簇电压：-100.0V；入口电压：-10.00V；出口电压：-16.00V；碰撞能量：-32.00eV；停留时间：50.0msec；
黄芩苷：离子模式：ESI+；离子对：447.1→271.1；去簇电压：100.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：35.00eV；停留时间：50.0msec；
小檗碱：离子模式：ESI+；离子对：336.1→320.0；去簇电压：100.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：35.00eV；停留时间：50.0msec；
细叶远志皂苷：离子模式：ESI-；离子对：679.4→455.3；去簇电压：-100.0V；入口电压：-10.00V；出口电压：-16.00V；碰撞能量：-44.00eV；停留时间：50.0msec；
黄芩素：离子模式：ESI-；离子对：269.1→240.8；去簇电压：-100.0V；入口电压：-10.00V；出口电压：-16.00V；碰撞能量：-31.00eV；停留时间：50.0msec；
大黄素：离子模式：ESI-；离子对：269.1→225.0；去簇电压：-100.0V；入口电压：-10.00V；出口电压：-16.00V；碰撞能量：-38.00eV；停留时间：50.0msec；
大黄酚：离子模式：ESI-；离子对：253.1→225.1；去簇电压：-100.0V；入口电压：-10.00V；出口电压：-16.00V；碰撞能量：-38.00eV；停留时间：100.0msec；
在其中一些实施例中，步骤(3)中，所述的待测样品进样溶液制备方法为直接用40±5％的乙腈溶液稀释后过0.22μm的微孔滤膜，这样待测样品进样溶液体系与初始流动相比例接近，且进样量十分低，完全可以忽略溶剂效应的影响，使得分离效果极佳。
在其中一些实施例中，所采用的液相色谱质谱联用仪的型号为Shimadzu LC30AD液相色谱仪联合Sciex Qtrap 5500质谱仪，所采用的操作系统为Analyst1.6.3；所采用的液相色谱柱为：ACQUITY UPLC BEH C18,Waters。其规格为1.7μm，2.1x50mm；本发明使用的Sciex Qtrap5500型质谱仪，其灵敏度较以前的仪器有了数量级的提升。
在其中一个实施例中，步骤(2)中，所述混合标准曲线溶液中，葛根素、芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷、小檗碱、细叶远志皂苷、黄芩素、大黄素、大黄酚的浓度如表2所示。
表2
在其中一个实施例中，步骤(2)中，所述混合质控样本工作溶液中，葛根素、芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷、小檗碱、细叶远志皂苷、黄芩素、大黄素、大黄酚的浓度如表3所示。
表3
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
(1)溶液的配制
储备溶液的制备：
称取适量清脑复神液各主要成分葛根素、芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷、小檗碱、细叶远志皂苷、黄芩素、大黄素、大黄酚的标准品，分别溶解于适量100％甲醇溶液中，制得浓度分别为1.00mg/mL的标准品储备溶液。
标准曲线工作溶液的制备：
按照下述表4的方法，用40％乙腈水溶液将10种成分的标准品储备溶液稀释成C8～C1的系列混合标准曲线溶液；
表4
*注：为表示方便，以葛根素的浓度代替混合标曲的浓度，其中10种待测物混合体系的比例不变。
其中，葛根素的标准曲线浓度从低到高为：0.200、0.400、1.00、2.00、4.00、8.00、16.0、20.0ng/mL；
芍药苷的标准曲线浓度从低到高为：0.500、1.00、2.50、5.00、10.0、20.0、40.0、50.0ng/mL；
柚皮苷的标准曲线浓度从低到高为：0.200、0.400、1.00、2.00、4.00、8.00、16.0、20.0ng/mL；
橙皮苷的标准曲线浓度从低到高为：0.100、0.200、0.500、1.00、2.00、4.00、8.00、10.0ng/mL；
黄芩苷的标准曲线浓度从低到高为：0.100、0.200、0.500、1.00、2.00、4.00、8.00、10.0ng/mL；
小檗碱的标准曲线浓度从低到高为：0.100、0.200、0.500、1.00、2.00、4.00、8.00、10.0ng/mL；
细叶远志皂苷的标准曲线浓度从低到高为：0.500、1.00、2.50、5.00、10.0、20.0、40.0、50.0ng/mL；
黄芩素的标准曲线浓度从低到高为：0.500、1.00、2.50、5.00、10.0、20.0、40.0、50.0ng/mL；
大黄素的标准曲线浓度从低到高为：0.500、1.00、2.50、5.00、10.0、20.0、40.0、50.0ng/mL；
大黄酚的标准曲线浓度从低到高为：1.00、2.00、5.00、10.0、20.0、40.0、80.0、100ng/mL；
质控工作溶液的制备：
按照下述表5的方法，用40％乙腈水溶液将10种成分的标准品储备溶液稀释成LLOQ、LQC、MQC、HQC的系列混合质控溶液；
表5
*注：为表示方便，以葛根素的浓度代替混合质控的浓度，其中10种待测物混合体系的比例不变。
其中，葛根素的质控溶液浓度从低到高为：0.200ng/mL(LLOQ，定量下限质控)、0.500ng/mL(LQC，低浓度质控)、10.0ng/mL(MQC，中浓度质控)、15.0ng/mL(HQC，高浓度质控)；
芍药苷的质控溶液浓度从低到高为：0.500ng/mL(LLOQ，定量下限质控)、1.25ng/mL(LQC，低浓度质控)、25.0ng/mL(MQC，中浓度质控)、37.5ng/mL(HQC，高浓度质控)；
柚皮苷的质控溶液浓度从低到高为：0.200ng/mL(LLOQ，定量下限质控)、0.500ng/mL(LQC，低浓度质控)、10.0ng/mL(MQC，中浓度质控)、15.0ng/mL(HQC，高浓度质控)；
橙皮苷的质控溶液浓度从低到高为：0.100ng/mL(LLOQ，定量下限质控)、0.25ng/mL(LQC，低浓度质控)、5.00ng/mL(MQC，中浓度质控)、7.50ng/mL(HQC，高浓度质控)；
黄芩苷的质控溶液浓度从低到高为：0.100ng/mL(LLOQ，定量下限质控)、0.25ng/mL(LQC，低浓度质控)、5.00ng/mL(MQC，中浓度质控)、7.50ng/mL(HQC，高浓度质控)；
小檗碱的质控溶液浓度从低到高为：0.100ng/mL(LLOQ，定量下限质控)、0.25ng/mL(LQC，低浓度质控)、5.00ng/mL(MQC，中浓度质控)、7.50ng/mL(HQC，高浓度质控)；
细叶远志皂苷的质控溶液浓度从低到高为：0.500ng/mL(LLOQ，定量下限质控)、1.25ng/mL(LQC，低浓度质控)、25.0ng/mL(MQC，中浓度质控)、37.5ng/mL(HQC，高浓度质控)；
黄芩素的质控溶液浓度从低到高为：0.500ng/mL(LLOQ，定量下限质控)、1.25ng/mL(LQC，低浓度质控)、25.0ng/mL(MQC，中浓度质控)、37.5ng/mL(HQC，高浓度质控)；
大黄素的质控溶液浓度从低到高为：0.500ng/mL(LLOQ，定量下限质控)、1.25ng/mL(LQC，低浓度质控)、25.0ng/mL(MQC，中浓度质控)、37.5ng/mL(HQC，高浓度质控)；
大黄酚的质控溶液浓度从低到高为：1.00ng/mL(LLOQ，定量下限质控)、2.50ng/mL(LQC，低浓度质控)、50.0ng/mL(MQC，中浓度质控)、75.0ng/mL(HQC，高浓度质控)；
(2)样本前处理
待测样品溶液的制备：取清脑复神液，加入适量的40±5％乙腈水溶液稀释到合适的浓度，涡旋混匀，之后过0.22μm的微孔滤膜，滤液即为待测样品进样溶液。
(3)液相色谱条件
仪器设备：Shimadzu LC-30AD液相色谱系统。
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50mm,1.7μm),Waters；柱温设置为40℃，自动进样器温度设置为4℃。
流动相A为0.1％甲酸水溶液；流动相B为100％乙腈。总流速为0.30mL/min。
流动相洗脱程序为：
0.0～0.5分钟，流动相B：40％→40％；
0.5～1.0分钟，流动相B：40％→95％；
1.0～2.0分钟，流动相B：95％→95％；
2.0～2.2分钟，流动相B：95％→40％；
2.2～3.0分钟，流动相B：40％→40％。
洗针液：50％乙腈。洗针模式为外部冲洗；冲洗速度：35μL/sec；冲洗端口液体：R1；冲洗液体积：500μL；冲洗模式：进针前后冲洗；冲洗浸润时间：0秒；冲洗方法：仅端口冲洗；冲洗时间：2秒；
进样体积为3.00μL，葛根素、芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷、小檗碱、细叶远志皂苷、黄芩素、大黄素、大黄酚的保留时间分别为0.46、0.49、0.50、0.51、0.60、0.72、1.05、1.72、1.72min。
(4)质谱条件
MRM技术是一种基于已知或假定的反应离子信息，有针对性地选择数据进行质谱信号采集，对符合规则的离子进行信号记录，去除不符合规则离子信号的干扰，通过对数据的统计分析从而获取质谱定量信息的质谱技术。对于MRM技术而言关键在于首先要能够检测到具有特异性的母离子，然后只将选定的特异性母离子进行碰撞诱导(collision-induced)，最后去除其他子离子的干扰，只对选定的特异子离子进行质谱信号的采集。本发明使用的Sciex Qtrap 5500质谱系统，扫描速度可达20,000Da/s，每个工作循环能处理多达300对母离子-子离子对，使得每个化合物的通道互不干扰，达到同时检测而不影响灵敏度的效果。
离子化模式：电喷雾离子源(ESI，Electrospray Ionization)；正负离子同时检测模式；多反应监测(MRM，Multiple Reaction Monitoring)；
离子源参数：气帘气：20psi；离子源气体1：30psi；离子源气体2：30psi；
离子源喷雾电压：正离子模式5500V，负离子模式-4500V；
离子源温度：500℃；
分辨率Q1/Q3：Unit/Unit；
碰撞气：Medium；
暂停时间：20msec；
质谱采集时间为3.00min。
监测离子对四极杆参数：
葛根素：离子模式：ESI+；离子对：417.2→297.1；去簇电压：100.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：39.00eV；停留时间：50.0msec；
芍药苷：离子模式：ESI-；离子对：525.2→449.3；去簇电压：-100.0V；入口电压：-10.00V；出口电压：-16.00V；碰撞能量：-19.00eV；停留时间：50.0msec；
柚皮苷：离子模式：ESI-；离子对：579.2→270.9；去簇电压：-100.0V；入口电压：-10.00V；出口电压：-16.00V；碰撞能量：-47.00eV；停留时间：50.0msec；
橙皮苷：离子模式：ESI-；离子对：609.2→301.2；去簇电压：-100.0V；入口电压：-10.00V；出口电压：-16.00V；碰撞能量：-32.00eV；停留时间：50.0msec；
黄芩苷：离子模式：ESI+；离子对：447.1→271.1；去簇电压：100.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：35.00eV；停留时间：50.0msec；
小檗碱：离子模式：ESI+；离子对：336.1→320.0；去簇电压：100.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：35.00eV；停留时间：50.0msec；
细叶远志皂苷：离子模式：ESI-；离子对：679.4→455.3；去簇电压：-100.0V；入口电压：-10.00V；出口电压：-16.00V；碰撞能量：-44.00eV；停留时间：50.0msec；
黄芩素：离子模式：ESI-；离子对：269.1→240.8；去簇电压：-100.0V；入口电压：-10.00V；出口电压：-16.00V；碰撞能量：-31.00eV；停留时间：50.0msec；
大黄素：离子模式：ESI-；离子对：269.1→225.0；去簇电压：-100.0V；入口电压：-10.00V；出口电压：-16.00V；碰撞能量：-38.00eV；停留时间：50.0msec；
大黄酚：离子模式：ESI-；离子对：253.1→225.1；去簇电压：-100.0V；入口电压：-10.00V；出口电压：-16.00V；碰撞能量：-38.00eV；停留时间：100.0msec；
(5)结果
1.方法学验证
①专属性
结果显示空白溶液中10种成分的出峰互不干扰，峰形良好。
②最低定量限和线性范围
葛根素、芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷、小檗碱、细叶远志皂苷、黄芩素、大黄素、大黄酚10种待测物的最低定量限分别为0.200、0.500、0.200、0.100、0.100、0.100、0.500、0.500、0.500、1.00ng/mL，线性范围分别为0.200～20.0、0.500～50.0、0.200～20.0、0.100～10.0、0.100～10.0、0.100～10.0、0.500～50.0、0.500～50.0、0.500～50.0、1.00～100ng/mL，三种化合物的R2在0.9911～0.9973之间。
③准确度和精密度
配置10个待测物的定量下限质控、低浓度质控、中浓度质控、高浓度质控的质控血浆样本，每一浓度6样本分析，至少两天内连续测定3个批次，根据当日标准曲线计算QC(质控)样品浓度，求得每一浓度的RE值及RSD值，具体如表6所示。
表6
/>
/>
④回收率
低浓度、中浓度、高浓度质控样本分别配制6个样品，进行加样回收率实验。具体如表7所示。
表7
/>
/>
2.样品检测结果
采用上述方法，对清脑复神液进行检测，测得样本中葛根素、芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷、小檗碱、细叶远志皂苷、黄芩素、大黄素、大黄酚的含量如表8所示，10种化合物标准品的标准色谱图如图1-11所示。
表8
/>
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (2)
1.清脑复神液高效液相色谱串联质谱检测方法，采取清脑复神液中10种有效成分葛根素、芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷、小檗碱、细叶远志皂苷、黄芩素、大黄素、大黄酚浓度的高效液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤：
(1)储备溶液的制备：
取标准品葛根素、芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷、小檗碱、细叶远志皂苷、黄芩素、大黄素、大黄酚，分别溶解于100％甲醇溶液中，制得标准品储备溶液；将标准品储备溶液混合，得到混合标准品储备溶液；
(2)工作溶液的制备：
分别用40±5％乙腈水溶液稀释所述混合标准品储备溶液，制得混合标准曲线样本工作溶液和混合质控样本工作溶液；
(3)待测样品进样溶液的制备：
待测样品溶液的制备：取清脑复神液，加入适量的40±5％乙腈水溶液稀释到合适的浓度，涡旋混匀，之后过0.22μm的微孔滤膜，滤液即为待测样品进样溶液；
(4)将步骤(3)所得待测样品进样溶液进行液相色谱分离；将液相色谱分离后的样品进行质谱分析；
(5)液相色谱条件包括：
色谱柱：ACQUITY BEH C18，2.1×50mm,1.7μm,Waters；
流速：0.3±0.05mL/min；
进样体积：3.00±0.5μL；
柱温：40±5℃；
自动进样器温度：4±4℃；
洗针液：50±5％乙腈水溶液；
洗冲速度：30-40μL/sec；
洗针液体积：400-600μL；
液相色谱分离所采用的洗脱方式为：以0.1±0.02％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱的过程包括：
0.0～0.5分钟，流动相B：40±5％→40±5％；
0.5～1.0分钟，流动相B：40±5％→95±5％；
1.0～2.0分钟，流动相B：95±5％→95±5％；
2.0～2.2分钟，流动相B：95±5％→40±5％；
2.2～3.0分钟，流动相B：40±5％→40±5％；
(6)质谱分析条件包括：
离子化模式：电喷雾离子源；正负离子同时检测模式；多反应监测；
离子源参数：气帘气：20psi；离子源气体1：30psi；离子源气体2：30psi；
离子源喷雾电压：正离子模式5500±10V，负离子模式-4500±10V；
离子源温度：500±10℃；
分辨率Q1/Q3：Unit/Unit；
碰撞气：Medium；
暂停时间：20±1msec；
质谱采集时间为3.00±0.2min；
各成分的四级杆质谱条件为：
葛根素：离子模式：ESI+；离子对：417.2→297.1；去簇电压：100.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：39.00eV；停留时间：50.0msec；
芍药苷：离子模式：ESI-；离子对：525.2→449.3；去簇电压：-100.0V；入口电压：-10.00V；出口电压：-16.00V；碰撞能量：-19.00eV；停留时间：50.0msec；
柚皮苷：离子模式：ESI-；离子对：579.2→270.9；去簇电压：-100.0V；入口电压：-10.00V；出口电压：-16.00V；碰撞能量：-47.00eV；停留时间：50.0msec；
橙皮苷：离子模式：ESI-；离子对：609.2→301.2；去簇电压：-100.0V；入口电压：-10.00V；出口电压：-16.00V；碰撞能量：-32.00eV；停留时间：50.0msec；
黄芩苷：离子模式：ESI+；离子对：447.1→271.1；去簇电压：100.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：35.00eV；停留时间：50.0msec；
小檗碱：离子模式：ESI+；离子对：336.1→320.0；去簇电压：100.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：35.00eV；停留时间：50.0msec；
细叶远志皂苷：离子模式：ESI-；离子对：679.4→455.3；去簇电压：-100.0V；入口电压：-10.00V；出口电压：-16.00V；碰撞能量：-44.00eV；停留时间：50.0msec；
黄芩素：离子模式：ESI-；离子对：269.1→240.8；去簇电压：-100.0V；入口电压：-10.00V；出口电压：-16.00V；碰撞能量：-31.00eV；停留时间：50.0msec；
大黄素：离子模式：ESI-；离子对：269.1→225.0；去簇电压：-100.0V；入口电压：-10.00V；出口电压：-16.00V；碰撞能量：-38.00eV；停留时间：50.0msec；
大黄酚：离子模式：ESI-；离子对：253.1→225.1；去簇电压：-100.0V；入口电压：-10.00V；出口电压：-16.00V；碰撞能量：-38.00eV；停留时间：100.0msec。
2.根据权利要求1所述的清脑复神液高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所采用的液相色谱质谱联用仪的型号为Shimadzu LC 30AD液相色谱仪联合Sciex Qtrap5500质谱仪，所采用的操作系统为Analyst 1.6.3。
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