CN112834680B - 一种测定肿瘤患者血浆中替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种测定肿瘤患者血浆中替加氟、吉美嘧啶和5‑氟尿嘧啶浓度的方法,通过LC‑MS/MS对血浆中替加氟、吉美嘧啶和5‑氟尿嘧啶进行分析,采用蛋白沉淀预处理方法,以对应的同位素标记物为内标,采用EclipseXDB‑C18柱,梯度洗脱,电喷雾电离源(ESI)串联质谱检测。本发明专一性选择性强、灵敏度高、检测快速、满足临床研究大批量样品分析需求。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,尤其涉及一种测定肿瘤患者血浆中替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶浓度的方法。
背景技术
替吉奥胶囊由日本Taiho研发,于1999年在日本首次上市,临床用于治疗胃癌、头颈部癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和胰腺癌。替吉奥胶囊是治疗晚期胃肠道恶性肿瘤的一线药物。替吉奥胶囊由替加氟、吉美嘧啶和奥替拉西钾三种主要药物成分。其中替加氟在体内转化为活性产物5-氟尿嘧啶进而发挥药效。为了推进替吉奥胶囊仿制药物的研发,需要监测各种药物成分在血液中的浓度水平,以获得药代动力学特征,进而评价原研药物和仿制药物的生物等效性。Ke Liu等于2010年开发了同时测定替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶的液相色谱-串联质谱方法,该法测定上述三种物质的定量下限分别为12.0、2.00和2.00ng/mL,该法测定5-氟尿嘧啶的灵敏度不足以完整描述其药动学特征。另外该法的色谱运行时间较长为7.5min,不利于大批量临床研究样品的测定。其次,该法各待测成分定量下限信噪比较低,替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶分别约为3、2和5,且有明显的干扰峰,测定低浓度样品时容易产生较大偏差。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明的目的是提供一种测定肿瘤患者血浆中替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶浓度的方法,提升方法的灵敏度和选择性的同时,尽量缩短分析时间以提升分析的准确性和通量。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种测定肿瘤患者血浆中替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶浓度的方法,包括以下步骤:
预处理,采集血浆,加入内标溶液,加入乙腈,涡流及离心后取上清液于氮气流吹干浓缩,残留物以复溶剂溶解,涡流混匀后为待测样品;
色谱,将待测样品液相色谱分离,采用Eclipse XDB-C18柱,梯度洗脱,在0min时,流动相A:流动相B体积比为95:5,在3.10-3.40min时,流动相A:流动相B体积比为60:40,在3.60-6.00min时,流动相A:流动相B体积比为95:5,流速0.8000mL/min,柱温40℃,自动进样器温4℃,进样量10.00μL,流动相A为0.005%甲酸水溶液,流动相B为甲醇;
质谱,采用电喷雾离子源,负离子检测,喷射电压-4500V,内源气体1(Gas1)60psi,气体2(Gas2)60psi,气帘气体(Curtain Gas)35psi,离子源温度400℃,碰撞诱导解离8psi,驻留时间80ms,替加氟定量分析离子对m/z 199.1→42.1,碰撞能量(CE)-37.0eV,去簇电压(DP)-21.0V,吉美嘧啶定量分析离子对m/z 143.9→64.0,碰撞能量(CE)-25.0eV,去簇电压(DP)-63.0V,5-氟尿嘧啶定量分析离子对m/z 128.8→42.1,碰撞能量(CE)-36.0eV,去簇电压(DP)-21.0V,13C15N2-替加氟定量分析离子对m/z 202.0→44.0,碰撞能量(CE)-37.0eV,去簇电压(DP)-21.0V,13C3-吉美嘧啶定量分析离子对m/z 147.0→67.0,碰撞能量(CE)-25.0eV,去簇电压(DP)-63.0V,13C15N2-氟尿嘧啶定量分析离子对m/z 132.0→44.0,碰撞能量(CE)-36.0eV,去簇电压(DP)-21.0V。
优选地,所述的一种测定肿瘤患者血浆中替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶浓度的方法,所述预处理步骤,取50.0μL血浆样品,加入25.0μL内标溶液,加入200μL乙腈,涡流及离心后取100μL上清液于氮气流吹干浓缩,残留物以120μL复溶剂溶解,涡流混匀后为待测样品。
优选地,所述的一种测定肿瘤患者血浆中替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶浓度的方法,所述内标溶液为13C15N2-替加氟、13C3-吉美嘧啶、13C15N2-氟尿嘧啶混合溶液。
优选地,所述的一种测定肿瘤患者血浆中替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶浓度的方法,所述质谱采用负离子检测。
优选地,所述的一种测定肿瘤患者血浆中替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶浓度的方法,所述色谱步骤,Eclipse XDB-C18柱流动相A添加剂为甲酸。
借由上述方案,本发明至少具有以下优点:
1、本发明的选择性好,各化合物色谱干扰峰较少可得到基线分离。本发明灵敏较高,替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶浓度为10.0/2.00/1.00ng/mL,其中氟尿嘧啶是灵敏度为现有技术的2倍,信噪比分别为20、40和30远优于现有技术。
2、本发明检测速度快,检测时间为6.0min,比现有技术快20%,适合大批量临床研究样品分析。
上述说明仅是本发明技术方案的概述,为了能够更清楚了解本发明的技术手段,并可依照说明书的内容予以实施,以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是替加氟化学结构式。
图2是吉美嘧啶化学结构式。
图3是5-氟尿嘧啶化学结构式。
图4是13C15N2-替加氟化学结构式。
图5是13C3-吉美嘧啶化学结构式。
图6是13C15N2-氟尿嘧啶化学结构式。
图7是替加氟离子扫描质谱图。
图8是吉美嘧啶离子扫描质谱图。
图9是5-氟尿嘧啶离子扫描质谱图。
图10是13C15N2-替加氟离子扫描质谱图。
图11是13C3-吉美嘧啶离子扫描质谱图。
图12是13C15N2-氟尿嘧啶离子扫描质谱图。
图13是5-氟尿嘧啶在空白血浆(左上)、定量下限(左中)和患者口服替吉奥胶囊1h后(左下)的MRM色谱图,右侧均为与左侧一一对应的内标13C15N2-氟尿嘧啶的MRM色谱图。
图14是吉美嘧啶在空白血浆(左上)、定量下限(左中)和患者口服替吉奥胶囊1h后(左下)的MRM色谱图,右侧均为与左侧一一对应的内标13C3-吉美嘧啶的MRM色谱图。
图15是替加氟在空白血浆(左上)、定量下限(左中)和患者口服替吉奥胶囊1h后(左下)的MRM色谱图,右侧均为与左侧一一对应的内标13C15N2-替加氟的MRM色谱图。
图16是1例肿瘤患者餐后口服50mg替吉奥胶囊药物浓度-时间曲线。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图,对本发明作进一步的详细说明,本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下,本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中,并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等,除以下专门提及的内容之外,均为本领域的普遍知识和公知常识,本发明没有特别限制内容。
液相色谱-串联质谱检测血浆中药物浓度的方法开发通常可分为三个部分,即提取方法(即预处理方法)、液相色谱方法和质谱方法。本发明针对现有技术缺点,从以上这三个方面着手建立检测方法。
实施例
前处理
本发明中使用血浆用量仅为50.0μL,本发明中的提取方法选用蛋白沉淀法、该方法对极性物质有较高的回收率,并且具有操作简单、提取时间短、高适合临床研究中高通量样品预处理。
如图1至图6,具体前处理方法步骤如下:
1、96孔板中加入50.0μL血浆样品;
2、加入25.0μL内标溶液(FT-13C,15N2、CDHP-13C3、5-FU-13C,15N2浓度分别为1500/300/150ng/mL);
3、加入200μL乙腈;涡流震荡10min,离心(4℃)10min(4500rpm);
4、取100μL上清液于氮气流吹干浓缩;
5、残留物以120μL复溶剂溶解,涡流混匀,置于自动进样器内进行LC-MS/MS分析;
6、进样体积为10.0μL。
质谱
采用电喷雾离子源,负离子检测,喷射电压-4500V,内源气体1(Gas1)60psi,气体2(Gas2)60psi,气帘气体(Curtain Gas)35psi,离子源温度400℃,碰撞诱导解离8psi,驻留时间80ms,替加氟定量分析离子对m/z 199.1→42.1,碰撞能量(CE)-37.0eV,去簇电压(DP)-21.0V,吉美嘧啶定量分析离子对m/z143.9→64.0,碰撞能量(CE)-25.0eV,去簇电压(DP)-63.0V,5-氟尿嘧啶定量分析离子对m/z 128.8→42.1,碰撞能量(CE)-36.0eV,去簇电压(DP)-21.0V,13C15N2-替加氟定量分析离子对m/z 202.0→44.0,碰撞能量(CE)-37.0eV,去簇电压(DP)-21.0V,13C3-吉美嘧啶定量分析离子对m/z 147.0→67.0,碰撞能量(CE)-25.0eV,去簇电压(DP)-63.0V,13C15N2-氟尿嘧啶定量分析离子对m/z 132.0→44.0,碰撞能量(CE)-36.0eV,去簇电压(DP)-21.0V。
如图7、图8、图9、图10、图11和图12所示,图7是替加氟离子扫描质谱图,图8是吉美嘧啶离子扫描质谱图,图9是5-氟尿嘧啶离子扫描质谱图,图10是13C15N2-替加氟离子扫描质谱图,图11是13C3-吉美嘧啶离子扫描质谱图,图12是13C15N2-氟尿嘧啶离子扫描质谱图。
替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶结构中含有酸性基团,在质谱负离子检测模式下可产生较高的、显著的前体离子分别为m/z 199.1、m/z 143.9和m/z 128.8。对上述离子进行产物离子扫描(CID),主要碎片离子分别为m/z 42.1、m/z 64.0和m/z 42.1,将其作为定量分析替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶监测的产物离子件。替加氟和吉美嘧啶都含有碱性氮原子,容易产生正离子前提离子,但由于同时分析三个化合物,使用正负离子切换分析时间会延长,且替加氟和吉美嘧啶负离子模式下响应也能满足生物分析的要求,因此均使用负离子模式进行分析。
色谱
将待测样品液相色谱分离,采用Eclipse XDB-C18柱,梯度洗脱,在0min时,流动相A:流动相B体积比为95:5,在3.10-3.40min时,流动相A:流动相B体积比为60:40,在3.60-6.00min时,流动相A:流动相B体积比为95:5,流速0.8000mL/min,柱温40℃,自动进样器温4℃,进样量10.00μL,流动相A为0.005%甲酸水溶液,流动相B为甲醇,Eclipse XDB-C18柱柱长度150mm、直径4.6mm。
替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶极性较强,不易保留,因此本法采用梯度洗脱模式,初始流动相比例较低利于色谱保留。三个待测组分及内标之间极性均有差异,采用梯度洗脱可保证各组分均能在较短时间内洗脱。本法质谱检测时采用负离子的离子化模式,在流动相中添加微量的甲酸可以增强吉美嘧啶在色谱柱上的保留,但不影响其他化合物的质谱响应。流动相中因加入微量的甲酸而呈酸性,本发明采用Eclipse XDB-C18柱,其pH适用范围宽,可耐受酸性流动相。本发明色谱运行时间仅为6.0min,检测快速适用于临床研究大批量样品检测。
实施例一:
缩写说明
1材料
1.1仪器
色谱仪:LC-30AD快速液相色谱系统,日本岛津公司。
质谱仪:6500+型三重四极杆串联质谱仪,配有电喷雾电离源(Turbo Ion Spray)加拿大Sciex公司。
数据处理采用软件:Analyst(version 1.6.3),加拿大Sciex公司。
离心机:HerμLe Z2326K型台式离心机,德国贺默公司。
分析天平:CPA225D型分析天平,北京赛多利斯仪器有限公司。
1.2对照品和试剂
替加氟(含量99.71%)、吉美嘧啶(纯度99.55%)、5-氟尿嘧啶(纯度99.85%)购自大连美仑生物技术有限公司。13C15N2-替加氟、13C3-吉美嘧啶、13C15N2-氟尿嘧啶购自TRC。甲醇(HPLC级)、乙腈(HPLC级)购自美国Sigma公司。去离子水(18.2mΩ,TOC≤50ppb)由法国Milli-Q超纯水系统制备。
2方法
2.1溶液及样品的配制
标准系列样品:精密称取各对照品适量,以甲醇分别溶解并定容,配制成替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶浓度约为1.00mg/mL的贮备液。精密吸取各自贮备液适量,以人空白血浆逐级稀释得到混合标准系列样品,替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶浓度范围分别为10.0-3000、2.00-600和1.00-300ng/mL。
质控样品:采用与标准系列样品相似方法配制替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶四个浓度水平混合质控样品。定量下限浓度为0.200/0.0400/0.0200ng/mL,低质控(lowquality control,LQC)浓度为0.500/0.100/0.0500,中质控(medium quality control,MQC)浓度为12.0/2.40/1.20ng/mL,高质控(high quality control,HQC)浓度为45.0/9.00/4.50ng/mL。
内标溶液:精密称取13C15N2-替加氟、13C3-吉美嘧啶、13C15N2-氟尿嘧啶对照品,以甲醇溶解并定容,配制成浓度约为1.00mg/mL的内标贮备液。精密吸取上述各内标贮备液适量,加甲醇:水(50:50,v/v)稀释,获得浓度均为1500/300/150ng/mL的内标溶液。
2.2血浆样品处理
96孔板中加入50.0μL血浆样品,加入25.0μL内标溶液(FT-13C,15N2、CDHP-13C3、5-FU-13C,15N2浓度分别为1500/300/150ng/mL),加入200μL乙腈;涡流2min,离心5min(14000rpm),取100μL上清液于氮气流吹干浓缩。残留物以120μL复溶剂溶解,涡流混匀,置于自动进样器内进行LC-MS/MS分析,进样体积为10.0μL。
2.3色谱及质谱条件
色谱条件
色谱柱:Eclipse XDB-C18,110A,5μm,4.6×150mm,安捷伦公司。
流动相A:0.005%甲酸水溶液。
流动相B:甲醇。
梯度洗脱,
柱温:40℃
流速:0.8000mL/min
进样量:10.0μL
自动进样器温度:4℃。
质谱条件
采用电喷雾离子源,负离子检测,喷射电压-4500V,内源气体1(Gas1)60psi,气体2(Gas2)60psi,气帘气体(Curtain Gas)35psi,离子源温度400℃,碰撞诱导解离8psi,驻留时间80ms,替加氟定量分析离子对m/z 199.1→42.1,碰撞能量(CE)-37.0eV,去簇电压(DP)-21.0V,吉美嘧啶定量分析离子对m/z 143.9→64.0,碰撞能量(CE)-25.0eV,去簇电压(DP)-63.0V,5-氟尿嘧啶定量分析离子对m/z 128.8→42.1,碰撞能量(CE)-36.0eV,去簇电压(DP)-21.0V,13C15N2-替加氟定量分析离子对m/z 202.0→44.0,碰撞能量(CE)-37.0eV,去簇电压(DP)-21.0V,13C3-吉美嘧啶定量分析离子对m/z 147.0→67.0,碰撞能量(CE)-25.0eV,去簇电压(DP)-63.0V,13C15N2-氟尿嘧啶定量分析离子对m/z 132.0→44.0,碰撞能量(CE)-36.0eV,去簇电压(DP)-21.0V。
2.4方法学验证
按照美国FDA指导原则对本方法进行了方法学验证,内容包括稳定性、选择性、线性、准确度、精密度、回收率基质效应等。
选择性
取六个来源不同的空白血浆及各自配制的定量下限样品处理后进样分析。色谱共流出干扰物的峰面积须小于定量下限待测物峰面积的1/5,小于内标峰面积的1/20。
标准曲线
以待测物理论浓度为横坐标(x),待测物与内标物的峰面积比为纵坐标(y),进行回归分析计算的直线回归方程(权重因子W=1/x2)。方法验证每一分析批对标准曲线样品双样本分析。
精密度和准确度
方法验证每一分析批测定五个浓度质控样本各六样本。定量下限批内、批间精密度以相对标准差(RSD)计算小于20%方可接受,准确度以相对偏差计算(RE)在-20%~20%之间方可接受。其余各浓度水平的QC样品各成分批内、批间精密度需小于15%方可接受,准确度在-15%~15%之间方可接受。
稳定性
考察各待测物在血浆样品中的稳定性时,将LQC和HQC置于不同温度及环境中,放置结束后进行三样本分析。共考察四种放置条件,分别为:室温放置24h,提取后进样器内放置128h,经历6次冷冻-解冻循环(从-75±10℃到冰室温),-75±5℃放置233天。
回收率
取空白血浆50.0μL,提取后(不加内标溶液)加入待测物溶液和内标溶液,使最终浓度与LQC、MQC和HQC相同,进样测定。另提取LQC、MQC和HQC各6份,进样测定。以2种处理方法的峰面积比值计算提取回收率。
基质效应
取6个不同来源空白血浆,提取后(不加内标溶液),取全部乙腈层液体加入和LQC和HQC相同浓度的待测物溶液和内标溶液,涡流混合后测定。另取去离子水代替血浆,按上述方法处理。以两种方法获得的峰面积比值计算基质因子,通过基质因子的RSD评估基质效应,基质因子小于15%方可接受。
2.5临床研究
应用建立的方法测定血浆中替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶的浓度,用于替吉奥胶囊人体生物等效性研究。临床研究经过医院伦理委员会批准,患者在试验前均被告知试验风险,自愿签署知情同意书。空腹和餐后各入组60例肿瘤患者给予50mg替吉奥胶囊。于给药前(0h)、给药后0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、4h、6h、8h、10h、12h、24h和48h,静脉取血4mL,置肝素抗凝离心管中,离心(1700g,4℃)10min后分离血浆,-75±10℃保存。
3结果与讨论
3.1方法学验证
方法的选择性
如图13至图15所示,替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶保留时间分别约为5.1、4.4、2.9min,5-氟尿嘧啶保留时间处干扰峰可基线分离。替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶定量下限样品的信噪比分别约为20、40和30。
标准曲线
测定肿瘤患者血浆中替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶线性范围分别为10.0~3000ng/mL 2.00~600ng/mL和1.00~300ng/mL。待测物标准曲线直线平均回归方程(方法学验证第一批)分别为:
替加氟:y=0.00146x+0.000289;
吉美嘧啶:y=0.00669x+0.000601;
5-氟尿嘧啶:y=0.0185x+0.000278。
方法的精密度与准确度
精密度准确度结果均符合接受标准,结果见表1,其中,表1是测定肿瘤患者血浆中替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶精密度和准确度。
表1
处理回收率
LQC、MQC和HQC浓度水平:替加氟提取回收率分别为40.1%、38.6%和35.3%;吉美嘧啶的提取回收率分别为37.1%、36.8%和35.6%;5-氟尿嘧啶的提取回收率分别为38.5%、39.3%和38.0%;内标13C15N2-替加氟的回收率为;内标13C15N2-替加氟的回收率为33.5%;内标13C15N2-氟尿嘧啶的回收率为35.5%。
基质效应
LQC、HQC浓度水平下替加氟的基质因子分别为100.1%和99.9%,RSD分别为0.8%和0.2%;吉美嘧啶基质因子分别为87.2%和87.2%,RSD分别为0.6%和0.1%;5-氟尿嘧啶基质因子分别为119.7%和119.0%,RSD为0.5%和0.4%。以上结果表明,基质不干扰待测物定量分析。
血浆稳定性考察
血浆稳定性试验结果见表2,结果表明在考察条件下替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶均稳定。其中,表2是替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶在人血浆中的稳定性(n=6)。
表2
4生物等效性研究
将验证后的方法用于同时定量检测血浆中替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶,以评价替吉奥胶囊生物等效性。1例患者口服50mg替吉奥胶囊后,血浆药物浓度-时间曲线见图16。本发明选择性好,5-氟尿嘧啶干扰峰可得到基线分离。本发明灵敏度高、信噪比为现有技术提升7、20和12倍,并可完整描绘替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶的药动学特性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,并不用于限制本发明,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和变型,这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种测定肿瘤患者血浆中替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶浓度的方法,其特征在于,包括以下步骤:
预处理,采集血浆,加入内标溶液,其中,所述内标溶液为13C15N2-替加氟、13C3-吉美嘧啶、13C15N2-氟尿嘧啶混合溶液,加入乙腈,涡流及离心后取上清液于氮气流吹干浓缩,残留物以复溶剂溶解,涡流混匀后为待测样品;
色谱,将待测样品液相色谱分离,采用Eclipse XDB-C18柱,梯度洗脱,在0min时,流动相A:流动相B体积比为95:5,在3.10min时,流动相A:流动相B体积比为40:60,在3.40min时,流动相A:流动相B体积比为40:60,在3.60时,流动相A:流动相B体积比为95:5,在6.00min时,停止;流速0.8000mL/min,柱温40℃,自动进样器温4℃,进样量10.00μL,流动相A为0.005%甲酸水溶液,流动相B为甲醇;
质谱,采用电喷雾离子源,负离子检测,喷射电压-4500V,内源气体1(Gas1)60psi,气体2(Gas2)60psi,气帘气体(Curtain Gas)35psi,离子源温度400℃,碰撞诱导解离8psi,驻留时间80ms,替加氟定量分析离子对m/z 199.1→42.1,碰撞能量(CE)-37.0eV,去簇电压(DP)-21.0V,吉美嘧啶定量分析离子对m/z143.9→64.0,碰撞能量(CE)-25.0eV,去簇电压(DP)-63.0V,5-氟尿嘧啶定量分析离子对m/z 128.8→42.1,碰撞能量(CE)-36.0eV,去簇电压(DP)-21.0V,13C15N2-替加氟定量分析离子对m/z 202.0→44.0,碰撞能量(CE)-37.0eV,去簇电压(DP)-21.0V,13C3-吉美嘧啶定量分析离子对m/z 147.0→67.0,碰撞能量(CE)-25.0eV,去簇电压(DP)-63.0V,13C15N2-氟尿嘧啶定量分析离子对m/z 132.0→44.0,碰撞能量(CE)-36.0eV,去簇电压(DP)-21.0V。
2.根据权利要求1所述的一种测定肿瘤患者血浆中替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶浓度的方法,其特征在于:所述预处理的步骤,取50.0μL血浆样品,加入25.0μL内标溶液,加入200μL乙腈,涡流及离心后取100μL上清液于氮气流吹干浓缩,残留物以120μL复溶剂溶解,涡流混匀后为待测样品。
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