CN108918722B

CN108918722B - 一种基于hplc-ms/ms技术检测nmda受体拮抗剂jcc-02血药浓度的方法

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Publication number: CN108918722B
Application number: CN201810870942.3A
Authority: CN
Inventors: 林建阳; 杨恬; 时月; 林城江; 阎成炟
Original assignee: First Hospital of China Medical University
Current assignee: First Hospital of China Medical University
Priority date: 2018-08-02
Filing date: 2018-08-02
Publication date: 2021-04-23
Anticipated expiration: 2038-08-02
Also published as: CN108918722A

Abstract

本发明提供了一种基于HPLC‑MS/MS技术检测NMDA受体拮抗剂JCC‑02血药浓度的方法，涉及药物分析领域，包括以下步骤：在JCC‑02灌胃给药后的SD大鼠血浆中，依次加入甲醇、乙腈和内标工作溶液，涡旋取上清用流动相溶解后进样，所述内标工作溶液为格列齐特的甲醇溶液；采用液质联用技术，乙腈‑甲酸水混合溶液为流动相进行梯度洗脱，Venusil ASB C8色谱柱进行色谱分离，二级质谱检测器检测，进行定量分析。该方法专属性强，灵敏度高，样品取样量少，预处理简单、快速，分析周期短，经方法学验证此方法准确、可靠，适用于SD大鼠血浆中JCC‑02的药物浓度测定和药代动力学研究。

Description

一种基于HPLC-MS/MS技术检测NMDA受体拮抗剂JCC-02血药浓度的方法

技术领域

本发明属于药物分析领域，尤其是涉及一种基于HPLC-MS/MS技术检测NMDA受体拮抗剂JCC-02血药浓度的方法。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种不可逆的神经进行性退变，临床表现为渐进性记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等，近年来其发病率呈逐年上升的趋势。目前，N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂类治疗药物上市的只有美金刚一种，用于中、重度AD的治疗，这对于复杂的临床需求是远远不够的，因此近年来NMDA受体拮抗剂类治疗药物的研究与开发已成为人们关注的热点。

根据美金刚的化学结构进行修饰，研制出了新型NMDA受体拮抗剂候选化合物JCC-02，化学结构式见图1，其初始药理活性已被证实，但尚未进行临床前药代动力学研究。目前，还未发现有关JCC-02生物样品中药物浓度定量分析方法和临床前药代动力学特征的国内外文献报道。

因此，建立一种灵敏、准确、快速的痕量定量分析方法，并应用于JCC-02在大鼠体内的药代动力学研究，将会为今后的药理、毒理、药剂学等的研究提供科学依据和数据支持，对新药的研发也具有积极促进作用。

发明内容

本发明的目的是建立一个操作简便、快速、准确、血浆用量少的能够测定SD大鼠灌胃给药后化合物JCC-02的血药浓度方法。

发明人经过多次不同条件的实验结果对比和优化，最终筛选出了本发明的实验条件。本发明是一种基于HPLC-MS/MS技术检测NMDA受体拮抗剂JCC-02血药浓度的方法，其特征在于，待测样品预处理后，在混合流动相梯度洗脱下，经高效液相色谱柱分离后，采用二级质谱检测器检测，内标法进行定量分析。该实验条件专属性强、准确度高、重现性好，可以得到满意的峰形及色谱保留时间，使分析时间相对较短。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

(1)大鼠血浆样品的预处理：

采用8周体成熟的SD大鼠，经时经眼眶静脉丛下取血0.4mL，经高速离心机离心取上清液制成；-70℃深低温冰箱冷冻保存待测；

在1.5mL离心管中依次加入溶解后待测血浆、内标工作溶液、甲醇(或JCC-02标准溶液)各10μL，涡旋10s，再加入乙腈沉淀剂40μL，涡旋30s后10000r·min^-1离心10min，取上清液20μL于新离心管，加入180μL流动相，涡旋10s，即得；

(2)待测样品和内标分离：

液相条件是采用Venusil ASB C₈色谱柱(2.1×50mm，3μm)，柱温：40℃，通用型二元泵(G4220A)和自动进样器(G4226A)进行色谱分离，流动相为含0.1％甲酸的乙腈-水混合溶液，进行梯度洗脱，洗脱程序见表1，流速为0.3mL·min^-1；

表1洗脱梯度程序

(3)二级质谱检测

采用Agilent 1290 Infinity高效液相色谱仪，串联AB API4000三重四级杆串联质谱仪为分析检测设备；质谱仪采用电喷雾(ESI)离子源，多反应监测分析模式(MRM)进行正离子检测；定量分析的离子分别为：JCC-02：m/z 333.20→162.9，IS：m/z 324.2→110.0，碰撞能量分别为：JCC-02：29eV，IS：31eV。

2、所述的一种基于HPLC-MS/MS技术检测NMDA受体拮抗剂JCC-02血药浓度的方法，其血浆样品是采用8周体成熟的SD大鼠，雌雄各半，体重为200g±50g；经眼眶静脉丛下取血0.4mL，经高速离心机离心，取上清液制成；取样量为100μL。

3、所述的一种基于HPLC-MS/MS技术检测NMDA受体拮抗剂JCC-02血药浓度的方法，其内标为格列齐特，结构式见图2；所述内标工作溶液为格列齐特的甲醇溶液；加样浓度为7μg·mL^-1。

4、所述的一种基于HPLC-MS/MS技术检测NMDA受体拮抗剂JCC-02血药浓度的方法，其流动相为两相混合溶液：流动相A为含0.1％甲酸的乙腈溶液；流动相B为含0.1％甲酸的水溶液；脱气、过膜后常温储存备用；溶解血浆样品和仪器平衡用流动相A、B配比为65％和35％。

5、所述的一种基于HPLC-MS/MS技术检测NMDA受体拮抗剂JCC-02血药浓度的方法，其质谱条件中，干燥气：N₂；离子源温度500℃；离子源电压3500V；Cur(气帘气)20psi；GS₁(雾化气)40psi；GS₂(干燥气)40psi。

6、所述的一种基于HPLC-MS/MS技术检测NMDA受体拮抗剂JCC-02血药浓度的方法，其流动相配制方法：将乙腈或100mL水加入100mL容量瓶中，加入100μL甲酸，定容，涡旋混匀后即得。

7、所述的一种基于HPLC-MS/MS技术检测NMDA受体拮抗剂JCC-02血药浓度的方法，其JCC-02系列标准溶液配制方法：精密称定JCC-02对照品10mg于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，超声2min至药物完全溶解，即得1mg·mL^-1的JCC-02储备液；取1mg·mL^-1JCC-02储备液，用甲醇将其逐级稀释溶解定容，配置成系列标准溶液，其浓度分别为1.25、2.5、5.00、10.0、40.0、80.0、200、400、666.7、800ng·mL^-1，其中2.5ng·mL^-1为低浓度质控溶液(LQC)，40ng·mL^-1为中浓度质控溶液(MQC)，666.7ng·mL^-1为高浓度质控溶液(HQC)。

8、所述的一种基于HPLC-MS/MS技术检测NMDA受体拮抗剂JCC-02血药浓度的方法，其内标工作溶液配制方法：精密称量格列齐特对照品10mg于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，超声2min至药物完全溶解，即得1mg·mL^-1的格列齐特内标储备液；取1mg·mL^-1的格列齐特内标储备液0.7mL至100mL容量瓶，用甲醇稀释定容，即得所需7μg·mL^-1内标工作溶液。

9、所述的一种基于HPLC-MS/MS技术检测NMDA受体拮抗剂JCC-02血药浓度的方法，其血浆样品上机检测的进样量为2μL。

上述的色谱条件为典型条件，实际应用中根据使用的仪器的不同特点，可对各参数进行适当的调整，以获得优选效果。

本方法具有以下优点：

1、采样量少：测定一份样品只需0.4mL血浆样本；样品预处理取样只需10μL；

2、预处理简便：样品只需乙腈沉蛋白，涡旋离心后加流动相稀释即可进行检测。非常简便易行，适用于临床前或临床常规定量分析检测；同在防止了基质效应，也提高了回收率，还避免了液液萃取法、氮气吹干后复溶等样品预处理方法的繁琐，节省时间、操作简便。

3、灵敏度高：通过二级质谱检测，明显提高测定的检测灵敏度，最低定量限为1.25ng·mL^-1；

4、选择性强：从空白血浆、加样血浆、实测血浆样品的色谱图(分别见附图3-8)比较可以看出，空白血浆中的内源性物质不干扰药物和内标的测定；

5、测定时间短：整个色谱分析测定过程为2.5min；

6、线性范围跨度大：本方法JCC-02的线性范围为1.25–800ng·mL^-1，能够很好地满足药物在体内动态分析变化的测定。

本发明方法快速准确、操作简便、样品需求量小、灵敏度高，适合临床前药代动力学研究。所述JCC-02测定的线性良好，方法回收率稳定，日内和日间的精密度(相对标准差，RSD)均小于15％，符合生物样品测定要求。

附图说明

图1是本发明方法中JCC-02的化学结构式；

图2是本发明方法中内标格列齐特的化学结构式；

图3是本发明方法实施例中空白血浆中JCC-02离子检测色谱图；

图4是本发明方法实施例中空白血浆中内标的离子检测色谱图；

图5是本发明方法实施例中加样血浆(2.5ng·mL^-1JCC-02和7μg·mL^-1内标)中JCC-02的离子检测色谱图；

图6是本发明方法实施例中加样血浆(2.5ng·mL^-1JCC-02和7μg·mL^-1内标)中内标的离子检测色谱图；

图7是本发明方法实施例中SD大鼠单次灌胃给药(0.7mg·kg^-1JCC-02)后1h采集实际血浆样品中JCC-02的离子检测色谱图；

图8是本发明方法实施例中SD大鼠单次灌胃给药(0.7mg·kg^-1JCC-02)后1h采集实际血浆样品中内标的离子检测色谱图；

图9是JCC-02血药浓度测定的标准曲线；

图10是SD大鼠单次灌胃给予0.7mg·kg^-1JCC-02后的平均血药浓度-时间曲线。

具体实施方式

为了更加清楚地说明本发明，以下通过具体的实施例来更为详细地说明本发明的具体实施方式。但应该理解，以下所述具体实施例仅用于对本发明进行示例性说明，而非对本发明进行任何性质的限定，其中所用试剂、材料、仪器及操作条件等仅为代表性的，并不限于所列举的情况。所属技术领域的技术人员通过阅读以下说明，可以对本发明做出不脱离本发明权利要求所限定的保护范围改动和改进，这些改动和改进也处于本发明所要求保护的范围内。

实施例1方法学研究

1、仪器与设备：

Agilent 1290 Infinity高效液相色谱仪，美国Agilent公司；

AB API4000三重四级杆串联质谱仪，美国AB Sciex公司；

D3024R离心机，北京大龙；

XW-80A涡旋混匀器，上海青浦沪西仪器厂；

CPA 124S电子分析天平，德国赛多利斯公司；

体重秤，慈溪市天东衡器厂；

2、试药与试剂：

JCC-02(≥纯度98.0％)，沈阳药科大学药物化学教研室提供；

格列齐特(纯度99.9％)，中国药品生物制品检定所；

甲醇(色谱纯)，迪马科技有限公司；

乙腈(色谱纯)，赛默飞世尔科技有限公司；

甲酸(色谱纯)，天津市科密欧化学试剂有限公司；

纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司；

3、色谱质谱条件：

液相条件是采用Venusil ASB C₈色谱柱(2.1×50mm，3μm)，柱温：40℃，通用型二元泵(G4220A)和自动进样器(G4226A)进行色谱分离，流动相为含0.1％甲酸的乙腈-水混合溶液，进行梯度洗脱，洗脱程序见表1，流速为0.3mL·min^-1；质谱条件是采用电喷雾(ESI)离子源，多反应监测分析模式(MRM)进行正离子检测；定量分析的离子分别为：JCC-02：m/z333.20→162.9，IS：m/z 324.2→110.0，碰撞能量分别为：JCC-02：29eV，IS：31eV；干燥气：N₂；离子源温度500℃；离子源电压3500V；Cur(气帘气)20psi；GS₁(雾化气)40psi；GS₂(干燥气)40psi。

4、方法学确证

(1)专属性

取6份不同来源的大鼠空白血浆样品，除不加内标溶液外，“样品预处理”项下步骤操作，在上述色谱质谱条件下分析，得空白血浆样品色谱图，如图3和图4；将一定质量浓度的JCC-02标准溶液(2.5ng·mL^-1)和内标溶液(7μg·mL^-1)加入空白血浆中，同法操作，得色谱图5和图6；取健康大鼠给药1h后收集的血浆样品，依法操作，得色谱图7和图8。

结果表明，大鼠血浆中内源性物质不干扰JCC-02和内标物的测定。

(2)标准曲线与线性范围

取空白血浆样品，用JCC-02标准系列溶液(1.25、5.00、10.0、80.0、200、400、800ng·mL^-1)代替“样品预处理”中的甲醇后，按“样品预处理”项下步骤操作，并在上述色谱质谱条件下分析，每个浓度进行双样本分析。以JCC-02浓度为横坐标(X)，JCC-02与内标峰面积比值为纵坐标(Y)，用加权最小二乘法进行线性回归运算，求得直线回归方程为y＝0.0056x+0.00126，r＝0.9964。同时得到JCC-02标准曲线，如图9。

结果表明，大鼠血浆中JCC-02的浓度测定线性范围为1.25～800ng·mL^-1，线性关系良好。定量下限为1.25ng·mL^-1。

(3)准确度与精密度

取空白血浆样品，分别用最低定量下限(LLOQ，1.25ng·mL^-1)、低、中、高三个浓度(2.5、40、666.7ng·mL^-1)的质控溶液(QC)代替“样品预处理”中的甲醇后，按此法操作制样，每个浓度6样本分析，并与标准曲线同时进行，连续分析3天，根据当日标准曲线计算LLOQ和QC血浆样品的测定浓度，与实际制备浓度比较，从而求得LLOQ和低、中、高三个浓度质控的准确度和精密度，见表2。

表2 SD大鼠血浆样品中JCC-02 HPLC/MS/MS测定方法的准确度与精密度(n＝6,3d)

加入量	实测值	精密度	(RSD，％)	准确度
					(ng·mL<sup>-1</sup>)	(ng·mL<sup>-1</sup>)	日内精密度	日间精密度	(RE，％)
1.25	1.296±0.1019	6.3	7.9	3.7
					2.5	2.712±0.2456	11.0	9.1	8.5
40	43.21±2.076	3.5	4.8	8.0
					666.7	648.5±41.73	2.9	6.4	-2.7

结果表明，LLOQ和三个浓度的日内精密度分别为6.3％、11.0％、3.5％、2.9％，日间精密度分别在7.9％、9.1％、4.8％、6.4％；准确度分别为3.7％、8.5％、8.0％、-2.7％；均＜±15％，符合生物样品测定要求，说明本方法具有良好的精密度与准确度。

(4)提取回收率

取空白SD大鼠血浆10μL，分别用低、中、高三个浓度(2.5、40、666.7ng·mL^-1)的质控溶液(QC)代替“样品预处理”中的甲醇后，按此法操作制样，每个浓度6样本分析，得各色谱峰面积A。同时，取空白SD大鼠血浆10μL，加入乙腈沉淀剂40μL，涡旋30s后10000r·min^-1离心10min。取上清50μL于新离心管中，分别加入低、中、高三个浓度质控溶液和内标溶液各10μL，涡旋10s后取上清20μL并用180μL流动相稀释，涡旋后进样，每个浓度进行6样本分析，得色谱峰面积B。以每一浓度正常提取操作步骤后所得峰面积A与未经提取样品所得色谱峰B的均值的比值分别计算JCC-02和内标的提取回收率，见表3。

表3 JCC-02和内标的提取回收率(n＝6)

结果表明，JCC-02低、中、高三个浓度和内标提取回收率分别为97.73％、98.41％、100.4％和92.61％，RSD(相对标准偏差)均在±15％以内，符合生物样品测定要求。

(5)基质效应

取空白SD大鼠血浆10μL，加入乙腈沉淀剂40μL，涡旋30s后10000r·min^-1离心10min。取上清50μL于新离心管中，分别加入低、中、高三个浓度质控溶液(2.5、40、666.7ng·mL^-1)和内标溶液(7μg·mL^-1)各10μL，涡旋10s后取上清20μL并用180μL流动相稀释，涡旋后进样，每个浓度进行6样本分析，得色谱峰面积B。分别用低、中、高三个浓度的质控溶液(QC)代替“样品预处理”中的甲醇，并用水代替血浆，进行“样品预处理”操作，每一浓度进行6样本分析，得色谱峰面积C。以每一浓度未经提取含血浆基质样品所得峰面积B与不含血浆基质样品所得的峰面积C的均值的比值分别计算JCC-02和内标的基质效应，见表4。

表4 JCC-02和内标的基质效应(n＝6)

结果表明，JCC-02低、中、高三个浓度的基质效应分别为98.11％、105.7％、103.5％，内标的基质效应为99.91％，RSD均在±15％以内，表明基质效应对样品测定的影响比不大。

(6)稳定性

取空白SD大鼠血浆样品，以低、高两个浓度(2.5、666.7ng·mL^-1)的质控样品代替“样品预处理”中的甲醇，按此法操作制备样品，每个浓度进行3样本分析，分别考察血浆样品在室温下放置4小时后提取、冻融三次循环、样品处理后自动进样器内放置6小时，-70℃冰箱放置30天的稳定性，见表5。

表5 JCC-02在血浆样品中的稳定性考察结果(n＝3)

结果表明，JCC-02实测值与理论值的偏差(RSD)均在±15％以内，说明本方法具有良好的稳定性。

实例2药代动力学研究

1、给药方案与样品采集

精密称取JCC-02样品3.5mg，加入50μL DMSO溶解，再加入500μL吐温-80，超声混匀。继续加入2.5mL PEG-400，再次超声混匀。用纯净水稀释至50mL，超声混匀，即制成0.07mg·mL^-1的JCC-02澄清溶液。

实验前将SD大鼠禁食12小时，自由饮水。将体重为200±20g的8只SD大鼠(4雌4雄)称重并标号，按照0.7mg·kg^-1的给药剂量，采用灌胃给药的方式给药。在指定的采血时间点(0、0.17、0.33、0.5、0.75、1、1.5、2.5、4.5、6.5、9、12和24小时)进行眼眶静脉丛取血，取血量为0.4mL，置于1.5mL肝素化离心管中。以10000r·min^-1的速度离心10min，将上层血浆移至空离心管中，置于-70℃冰箱保存。

2、色谱质谱条件：

3、血浆样品测定和数据处理

将采集的大鼠血浆样品依照“样品预处理”方法进行处理后，按照上述色谱分析条件进行检测，将测得的JCC-02和内标的峰面积比值代入相应的标准曲线中，得到血浆中JCC-02的浓度，并绘制出药物浓度-时间曲线，如图10。采用DAS 2.0软件中的非房室模型计算相关药动学参数，见表6。

表6 SD大鼠单次灌胃给予JCC-02(0.7mg·kg^-1)的药代动力学参数(n＝8)

药动学参数	单位	Mean±SD
			Cmax	(ng·mL<sup>-1</sup>)	19.15±13.51
Tmax	(h)	0.3540±0.1068
			t<sub>1/2</sub>	(h)	10.92±15.41
AUC<sub>0-t</sub>	(ng·h·mL<sup>-1</sup>)	54.11±46.84
			AUC<sub>0-∞</sub>	(ng·h·mL<sup>-1</sup>)	66.06±59.07

3、本发明的检测方法能够简便、准确、快速、高效、可靠的检测NMDA受体拮抗剂新型候选化合物JCC-02。此方法具有很高的灵敏度，且操作简便，通过药代动力学研究进而为研究此类化合物提供了客观数据和研究基础。

以上所述仅为本发明的具体实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明作的等效变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之中。

Claims

1.一种基于HPLC-MS/MS技术检测NMDA受体拮抗剂JCC-02血药浓度的方法，其特征在于，待测样品预处理后，在混合流动相梯度洗脱下，经高效液相色谱柱分离后，采用二级质谱检测器检测，内标法进行定量分析，包括以下步骤：

(1)大鼠血浆样品的预处理：

在含有JCC-02的SD大鼠血浆中，依次加入内标工作溶液、甲醇和乙腈，涡旋后离心，并取上清，加流动相即得；

(2)待测样品和内标分离：

采用Venusil ASB C8色谱柱，柱温：40℃，通用型二元泵和自动进样器进行色谱分离；采用含0.1％甲酸的乙腈-水混合溶液为流动相，进行梯度洗脱；

(3)二级质谱检测

采用Agilent 1290 Infinity高效液相色谱仪，串联AB API4000三重四级杆串联质谱仪为分析检测设备；质谱仪采用电喷雾ESI离子源，多反应监测分析模式MRM进行正离子检测；定量分析的离子分别为：JCC-02：m/z 333.20→162.9，IS：m/z 324.2→110.0，碰撞能量分别为：JCC-02：29eV，IS：31eV；

所述内标工作溶液为格列齐特的醇溶液，加样浓度为7μg·mL^-1；

所述流动相A为含0.1％甲酸的乙腈溶液；流动相B为含0.1％甲酸的水溶液；洗脱方式为梯度洗脱；流速：0.3mL·min^-1；

其中，洗脱梯度程序：

所述质谱条件中，干燥气：N₂；离子源温度500℃；离子源电压3500V；气帘气：Cur；20psi；雾化气：GS1；40psi；干燥气：GS2；40psi。

2.根据权利要求1所述的一种基于HPLC-MS/MS技术检测NMDA受体拮抗剂JCC-02血药浓度的方法，其特征在于，血浆样品是采用8周体成熟的SD大鼠，血浆样品量为0.4mL，经高速离心机离心，取上清液制成；取样量为100μL。

3.根据权利要求1所述的一种基于HPLC-MS/MS技术检测NMDA受体拮抗剂JCC-02血药浓度的方法，其特征在于，流动相配制方法：将乙腈或100mL水加入100mL容量瓶中，加入100μL甲酸，定容，涡旋混匀后即得。

4.根据权利要求1所述的一种基于HPLC-MS/MS技术检测NMDA受体拮抗剂JCC-02血药浓度的方法，其特征在于，JCC-02系列标准溶液配制方法：精密称定JCC-02对照品10mg于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，超声2min至药物完全溶解，即得1mg·mL^-1的JCC-02储备液；再用甲醇将其逐级稀释至各所需浓度，即得到各浓度的JCC-02系列标准溶液。

5.根据权利要求1所述的一种基于HPLC-MS/MS技术检测NMDA受体拮抗剂JCC-02血药浓度的方法，其特征在于，内标工作溶液配制方法：精密称定格列齐特对照品10mg于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，超声2min至药物完全溶解，即得1mg·mL^-1的格列齐特内标储备液；再用甲醇将其稀释至所需浓度7μg·mL^-1，即得内标工作溶液。

6.根据权利要求1所述的一种基于HPLC-MS/MS技术检测NMDA受体拮抗剂JCC-02血药浓度的方法，其特征在于，血浆样品上机检测的进样量为2μL。