JP7400825B2 - 5-フルオロウラシルおよび5-フルオロジヒドロウラシルの分析方法 - Google Patents
5-フルオロウラシルおよび5-フルオロジヒドロウラシルの分析方法 Download PDFInfo
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Description
被験者から採取した血液を収納した検体容器および試薬が収納された試薬容器から、それぞれ一定量の流体を吸引して反応容器に分注する分注工程、
前記分注工程で分注された前記血液と前記試薬を前記反応容器内で混合する混合工程、
前記混合工程で得られた混合物を撹拌する撹拌工程、
前記撹拌工程で生成した沈殿物をろ過してろ液を採取するろ過工程、
前記工程により得られたろ液を液体クロマトグラフィーにより成分ごとに分離する分離工程、
前記分離工程により分離された各成分を質量分析装置により分析し、得られた質量分析データに基づき、前記血液中の5-フルオロウラシルおよび5-フルオロジヒドロウラシルの少なくとも一方について定性および定量する分析工程を含み、
前記各工程を自動的に行うとともに、前記分注工程、前記混合工程、前記撹拌工程、前記ろ過工程のうち、の少なくとも一つの工程で得られた液を希釈する希釈工程を含む、分析方法。
ウラシルを投与する患者や将来投与する可能性のある患者等、DPD活性を調べる必要のある対象者(以下、被験者という)からまず血液を採取し、検体容器に収納する。採取の方法は特に制限はなく、注射器等により後述するLCMS分析に必要な量を採取すればよい。
本発明において、希釈工程で希釈液をごく少量でも添加すればよく、希釈率としては1より大きければよい。希釈率は1.1倍以上が好ましく、2倍以上がより好ましい。希釈率の上限は上記マトリックス効果の低減と分離工程および分析工程での精度の観点から50倍以下が好ましい。
前記前処理装置が
被験者から採取した血液を収容した検体容器を1以上保持する検体ラックと、
1以上の試薬容器を保持するように構成された試薬ラックと、
前記検体容器と前記試薬容器とから一定量の流体を吸引して前記反応容器に分注するように動作可能な分注機構と、
前記反応容器に収容された混合物を撹拌するための撹拌機構と、
前記反応容器内の沈殿物をろ過してろ液を採取するろ過機構と、
前記分注機構を、検体容器から血液を吸引して反応容器に分注し、試薬容器から試薬を吸引して反応容器に分注するように制御する制御部と
を備える前処理装置であることが、分析の簡便性と迅速性の観点から、より好ましい。
少なくとも第1の位置と第2の位置との間で移動可能であり、前記回収容器を保持して搬送する保持機構をさらに備え、
前記制御部は、前記保持機構を、希釈工程後に前記回収容器を第1の位置から第2の位置に搬送するように制御する、
前処理装置であることが好ましい。
前記処理装置を用いて血液中のウラシル、ジヒドロウラシルを分析する分析方法の一実施形態について図1を用いて説明する。
攪拌部36の撹拌ポート36aは反応容器50を収容する容器である。撹拌ポート36aはその下方に設けられた撹拌機構によって駆動される。
ここで、ろ過ポート30は2つ、撹拌ポート36aは3つ設けられているが、これらの同じ処理を実行するために設けられたポート間には優先順位が設定されており、ランダムアクセス手段は優先順位の高いポートから順に使用するように構成されている。例えば、試料のろ過を実行する際に2つのろ過ポート30のいずれも空いている場合には、優先順位の高いろ過ポート30に回収容器54を設置し、その回収容器54上に反応容器50を設置する。
装置:NEXERA(登録商標) X2 またはXR (株式会社 島津製作所製)
カラム:Hypercarb、3μm、150*2、1mm
温度:25℃
移動相 A:水+0.5%酢酸
移動相 B:アセトニトリル+0.5%酢酸
流速:250μL/分
装置:LCMS-8060 ESIキャピラリー付き
温度:380℃(interface)、 500℃(heat block)、 300℃(DL)
ガス流速:3L/分(噴霧ガス)、14L/分(ヒートガス)、3L/分(乾燥ガス)
移動相 B:アセトニトリル+0.5%酢酸
流速:250μL/分
実施形態2について図6を参照して説明する。なお以下の説明では前述した実施形態1との相違点を中心に説明する。その他の点については実施形態1と同様である。
本実施形態2では上述した前処理装置1が、さらに少なくとも第1の位置と第2の位置との間で移動可能であり、前記回収容器を保持して搬送する保持機構をさらに備え、
前記制御部は、前記保持機構を、希釈工程後に前記回収容器を第1の位置から第2の位置に搬送するように制御する機能を有する。
実施例1
上述した実施態様1で示した前処理装置1(図1)を用いて、ウラシルとジヒドロウラシルを含む検体に試薬を分注し、検体と試薬を混合、撹拌し、得られた沈殿物をろ過した。ろ液を含む回収容器を回収し、希釈液の添加により稀釈した後、分離工程に供した。ろ液の希釈率は5倍、10倍、40倍、50倍とした。各稀釈率の液を液体クロマトグラフィーにより成分ごとに分離し、分離された各成分を質量分析装置により分析した。
液体クロマトグラフィーの分析条件
装置:NEXERA(登録商標) X2 (株式会社 島津製作所製)
カラム:Hypercarb、3μm、150*2、1mm
温度:25℃
移動相 A:水+0.5%酢酸
移動相 B:アセトニトリル+0.5%酢酸
流速:250μL/分
装置:LCMS-8060 ESIキャピラリー付き
温度:380℃(interface)、 500℃(heat block)、 300℃(DL)
ガス流速:3L/分(噴霧ガス)、14L/分(ヒートガス)、3L/分(乾燥ガス)
移動相 B:アセトニトリル+0.5%酢酸
流速:250μL/分
(ウラシルの分析)
確認イオン
1段目のMSでm/z 112.95(プリカーサイオンとして選択)を通し、CIDセル(コリジョンセル)で壊して96,050m/z をつくり、2段目のMSでm/z :96,050(プロダクトイオン)を通過したもの
ターゲットイオン
1段目のMSでm/z 112.95(プリカーサイオンとして選択)を通し、CIDセルで壊してm/z 70.1をつくり、2段目のMSでm/z 70.1(プロダクトイオン)を通過したもの
確認イオン
1段目のMSでm/z 115.050(プリカーサイオンとして選択)を通し、CIDセルで壊してm/z 30.00をつくり、2段目のMSでm/z 30.00(プロダクトイオン)を通過したもの
ターゲットイオン
1段目のMSでm/z 115.050(プリカーサイオンとして選択)を通し、CIDセルで壊して55,1m/z をつくり、2段目のMSでm/z :55,1(プロダクトイオン)を通過したもの
また前処理装置1を用いることで、簡便かつ迅速にウラシルとジヒドロウラシルの存在比を測定することができた。
上述した実施態様2の前処理装置100(図6)を用いて、ウラシルとジヒドロウラシルを含む検体に試薬分注し、検体と試薬を混合、撹拌し、得られた沈殿物をろ過し、希釈ポートにて希釈液にて希釈する。希釈液を液体クロマトグラフィーにより成分ごとに分離し、分離された各成分を質量分析装置により分析することで上記実施例1と同様の結果が得られる。
上述の実施態様は以下の態様の好ましい具体例であることが当業者により理解される。
被験者から採取した血液を収納した検体容器および試薬が収納された試薬容器から、それぞれ一定量の流体を吸引して反応容器に分注する分注工程、
前記分注工程で分注された前記血液と前記試薬を前記反応容器内で混合する混合工程、
前記混合工程で得られた混合物を撹拌する撹拌工程、
前記撹拌工程で生成した沈殿物をろ過してろ液を採取するろ過工程、
前記工程により得られたろ液を液体クロマトグラフィーにより成分ごとに分離する分離工程、
前記分離工程により分離された各成分を質量分析装置により分析し、得られた質量分析データに基づき、前記血液中の5-フルオロウラシルおよび5-フルオロジヒドロウラシルの少なくとも一方をについて定性および定量する分析工程を含み、
前記各工程を自動的に行うとともに、前記分注工程、前記混合工程、前記撹拌工程、前記ろ過工程のうち、の少なくとも一つの工程で得られた液を希釈する希釈工程を含む、分析方法。
前記定性工程の後、前記質量分析データに基づいて、存在が確認された前記血液中の5-フルオロウラシルおよび5-フルオロジヒドロウラシルの少なくとも一方の濃度を定量する定量工程をさらに含む、前記[1]に記載の分析方法。
前記血液が、血漿または血清である前記[1]に記載の分析方法。
前記試薬は、アセトニトリルとギ酸の混合物である前記[1]から[3]に記載の分析方法。
前記希釈工程は、前記ろ過工程により採取したろ液を希釈し、
前記分離工程は、前記ろ過工程により希釈された希釈ろ液をクロマトグラフィ-により成分ごとに分離する前記[1]から[4]のいずれかに記載の分析方法。
前記希釈工程で、ろ液を希釈率50倍未満に希釈する前記[5]に記載の分析方法。
前希釈工程で、ろ液を希釈率5倍から40倍に希釈する前記[6]に記載の分析方法。
前記希釈工程で、水でろ液を希釈する前記[1]から[7]のいずれかに記載の分析方法。
前記ろ過工程で樹脂製の分離膜を用いる前記[1]から[7]のいずれかに記載の分析方法。
前記樹脂製の分離膜がポリテトラフルオロエチレンからなる分離膜である前記[9]に記載の分析方法。
前記分離工程の移動相は、水と酢酸の混合物とアセトニトリルと酢酸の混合物の少なくともいずれかである前記[1]から[10]のいずれかに記載の分析方法。
前記希釈工程の後、前記分離工程の前にさらに希釈されたろ液を回収容器に回収する回収工程をさらに含む前記[1]に記載の分析方法。
前記回収工程の後、前記分離工程の前に前記回収容器を前記液体クロマトグラフィーに搬送する搬送工程をさらに含む前記[12]に記載の分析方法。
少なくとも前記分注工程からろ過工程を一つの前処理装置で行う前記[1]、[11]および[13]に記載の分析方法。
前記分注工程から前記搬送工程までを一つの前処理装置で行う前記[13]に記載の分析方法。
前記前処理装置が
被験者から採取した血液を収容した検体容器を1以上保持する検体ラックと、
1以上の試薬容器を保持するように構成された試薬ラックと、
前記検体容器と前記試薬容器とから一定量の流体を吸引して前記反応容器に分注するように動作可能な分注機構と、
前記反応容器に収容された混合物を撹拌するための撹拌機構と、
前記反応容器内の沈殿物をろ過してろ液を採取するろ過機構と、
前記分注機構を、検体容器から血液を吸引して反応容器に分注し、試薬容器から試薬を吸引して反応容器に分注するように制御する制御部と
を備える前処理装置である前記[13]または[14]に記載の分析方法。
前記前処理装置が、さらに
少なくとも第1の位置と第2の位置との間で移動可能であり、前記回収容器を保持して搬送する保持機構をさらに備え、
前記制御部は、前記保持機構を、希釈工程後に前記回収容器を第1の位置から第2の位置に搬送するように制御する、前記[16]に記載の分析方法。
2 検体ラック
4 ラック
6 検体容器
8 試薬ラック
10 試薬容器
12 前処理キット設置部
20 サンプリングアーム
20a サンプリングノズル
22、29 軸
24 搬送アーム
25 保持部
26 試薬アーム
26a 試薬添加ノズル
30 濾過ポート
32 分注ポート
34 廃棄ポート
36 撹拌部
36a 撹拌ポート
42 回収容器排出部
43 排出ポート
44 移動部
45 洗浄ポート
50 反応容器
50a 反応容器の内部空間
50b 反応容器の開口
50c 反応容器の鍔部
50d 排出口
51 スカート部
52 分離膜
54 回収容器
54a 回収容器の内部空間
54b 回収容器の開口
54c 回収容器の鍔部
60 希釈ポート
Claims (15)
- 被験者から採取した血液を収納した検体容器および試薬が収納された試薬容器から、それぞれ一定量の流体を吸引して反応容器に分注する分注工程、
前記分注工程で分注された前記血液と前記試薬を前記反応容器内で混合する混合工程、
前記混合工程で得られた混合物を撹拌する撹拌工程、
前記撹拌工程で生成した沈殿物をろ過してろ液を採取するろ過工程、
前記工程により得られたろ液を液体クロマトグラフィーにより成分ごとに分離する分離工程、
前記分離工程により分離された各成分を質量分析装置により分析し、得られた質量分析データに基づき、前記血液中の5-フルオロウラシルおよび5-フルオロジヒドロウラシルの少なくとも一方について定性および定量する分析工程を含み、
前記各工程を自動的に行うとともに、前記分注工程、前記混合工程、前記撹拌工程、前記ろ過工程のうち、の少なくとも一つの工程で得られた液を希釈する希釈工程を含み、
前記ろ過工程により採取したろ液を50倍未満に希釈し、
前記分離工程は、前記ろ過工程により希釈された希釈ろ液をクロマトグラフィーにより成分ごとに分離する、
分析方法。 - 前記分析工程は、前記質量分析データに基づいて、前記定性をした後に存在が確認された前記血液中の5-フルオロウラシルおよび/または5-フルオロジヒドロウラシルの濃度を定量することを特徴とする請求項1に記載の分析方法。
- 前記血液が、血漿または血清である請求項1に記載の分析方法。
- 前記試薬は、アセトニトリルとギ酸の混合物である請求項1~3に記載の分析方法。
- 前記ろ過工程により採取したろ液を5倍から40倍に希釈する請求項1に記載の分析方法。
- 前記ろ過工程により採取したろ液を水で希釈する請求項1から5のいずれか1項に記載の分析方法。
- 前記ろ過工程で樹脂製の分離膜を用いる請求項1から6のいずれか1項に記載の分析方法。
- 前記樹脂製の分離膜がポリテトラフルオロエチレンからなる分離膜である請求項7に記載の分析方法。
- 前記分離工程の移動相は、水と酢酸の混合物とアセトニトリルと酢酸の混合物の少なくともいずれかである請求項1から8のいずれか1項に記載の分析方法。
- 前記ろ過工程の後、前記分離工程の前にさらに希釈されたろ液を回収容器に回収する回収工程をさらに含む請求項1に記載の分析方法。
- 前記回収工程の後、前記分離工程の前に前記回収容器を前記液体クロマトグラフィーに搬送する搬送工程をさらに含む請求項10に記載の分析方法。
- 少なくとも前記分注工程からろ過工程を一つの前処理装置で行う請求項1または9記載の分析方法。
- 前記分注工程から前記搬送工程までを一つの前処理装置で行う請求項11に記載の分析方法。
- 前記前処理装置が
被験者から採取した血液を収容した検体容器を1以上保持する検体ラックと、1以上の試薬容器を保持するように構成された試薬ラックと、
前記検体容器と前記試薬容器とから一定量の流体を吸引して前記反応容器に分注するように動作可能な分注機構と、
前記反応容器に収容された混合物を撹拌するための撹拌機構と、
前記反応容器内の沈殿物をろ過してろ液を採取するろ過機構と、
前記分注機構を、前記検体容器から血液を吸引して前記反応容器に分注し、前記試薬容器から試薬を吸引して前記反応容器に分注するように制御する制御部と備える前処理装置である請求項12に記載の分析方法。 - 前記前処理装置が
被験者から採取した血液を収容した検体容器を1以上保持する検体ラックと、1以上の試薬容器を保持するように構成された試薬ラックと、
前記検体容器と前記試薬容器とから一定量の流体を吸引して前記反応容器に分注するように動作可能な分注機構と、
前記反応容器に収容された混合物を撹拌するための撹拌機構と、
前記反応容器内の沈殿物をろ過してろ液を採取するろ過機構と、
前記分注機構を、前記検体容器から血液を吸引して前記反応容器に分注し、前記試薬容器から試薬を吸引して前記反応容器に分注するように制御する制御部と、
少なくとも第1の位置と第2の位置との間で移動可能であり、前記回収容器を保持して搬送する保持機構を備え、
前記制御部は、前記保持機構を、前記希釈工程後に前記回収容器を第1の位置から第2の位置に搬送するように制御する、請求項13に記載の分析方法。
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