CN111175394B - 一种液相色谱串联质谱检测血浆儿茶酚胺及其代谢物的方法 - Google Patents

一种液相色谱串联质谱检测血浆儿茶酚胺及其代谢物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于临床生物样本检测技术领域，具体涉及血浆中儿茶酚胺及其代谢物检测技术，特别涉及高通量液相色谱串联质谱法检测儿茶酚胺及其代谢物(肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素、3‑甲氧基酪胺)的方法。所述方法包括：标准溶液配制、样本处理、样本检测以及计算公式。该方法可以同时检测儿茶酚胺及其代谢物共6种物质，具有高准确度、高灵敏度、高特异性以及所需样本体积少、样本前处理简单及耐受性好等优点。

Description

一种液相色谱串联质谱检测血浆儿茶酚胺及其代谢物的方法
技术领域
本发明涉及高通量液相色谱串联质谱的检测方法以及高通量液相色谱串联质谱法检测儿茶酚胺及其代谢物的方法。
背景技术
儿茶酚胺是一种含有儿茶酚和胺基的神经类物质，包括肾上腺素(epinephrine，E)、去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)、多巴胺(dopamine，DA)，是由肾上腺髓质和一些交感神经元嗜铬细胞分泌的一类非常重要的神经递质，也是重要的激素物质。这三种儿茶酚胺都是由酪氨酸为前提转化得到的，在体内儿茶酚胺物质代谢后，被转变成相应的代谢产物如甲氧基肾上腺素(或变肾上腺素，Metanephrine，MN)、甲氧基去甲肾上腺素(或去甲变肾上腺素，Normetaneprine，NMN)、3-甲氧基酪胺(3-methoxytyramine)等。
儿茶酚胺及其代谢物在人体的心血管系统、神经系统、内分泌腺、肾脏、平滑肌等组织系统的生理活动中起着广泛的调节作用，同时还影响人体的代谢。甲氧肾上腺素及甲氧基去甲肾上腺素为肾上腺素及去甲肾上腺素的中间产物，特别地，被公认为是临床上诊断嗜铬细胞瘤的黄金标准，检测灵敏度和特异度均高于90％；神经母细胞瘤患者体内可同时分泌过量的肾上腺素、去甲肾上腺素以及多巴胺，因此同时检测儿茶酚胺代谢物，不仅可以间接反映体内儿茶酚胺的代谢情况，而且对嗜铬细胞瘤、神经母细胞瘤等中枢神经系统疾病的早期诊断及鉴别有重要意义。
目前杭州佰辰医学检验所有限公司于2016年申请了专利号：201610907368.5，发明名称“一种利用液相色谱串联质谱检测血浆中儿茶酚胺的方法”。该发明公开了一种利用液相色谱串联质谱检测血浆中儿茶酚胺的方法。本发明的方法用丹磺酰氯进行衍生化反应，提取后使用液相色谱串联三重四级杆质谱仪检测，同时定量血浆中包括多巴胺，肾上腺素，去甲肾上腺素的3种儿茶酚胺。但是仅能检测3种代谢产物，且样本处理步骤复杂，耗时长，不利于临床推广。广东中科康仪生物技术有限公司于2017年11月7日申请的中国专利“一种用液相色谱串联质谱技术检测儿茶酚胺及代谢产物的方法”，申请号CN201711081600.5，该发明公开一种用液相色谱串联质谱技术检测儿茶酚胺及代谢产物的方法，该方法可以高灵敏度地、特异性地一次性检测出儿茶酚胺及其代谢产物，包括MN和NMN、E和NE以及DA和3-MT，可以用于各种类型的PPGL进行诊断，但是有多个指标的最低定量限高于正常参考阈值，较多样本会出现检测不出的情况，并引起临床误判。
综上所述，现有技术中关于儿茶酚胺类物质检测的过程主要缺陷在于：一、儿茶酚胺类物质在血浆中含量低，对检测方法及仪器要求较高；二、儿茶酚胺类物质极性大，色谱柱保留困难，常用衍生化方法进行样本前处理，但其他操作复杂，不利于临床推广；三、一次检测6种儿茶酚胺类物质难度大，目前公开的多数方法只检测其中一部分物质。
发明内容
为了解决上述问题，本发明公开了一种灵敏度更高的液相色谱串联质谱仪检测儿茶酚胺及代谢物的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
(一)标准溶液的配制。
(a)标准曲线配制：分析天平精确称取3-甲氧酪胺、变肾上腺素、去甲变肾上腺素、多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素，各标准品分别用含维生素C甲醇水溶液溶解，配制标准品储备液；使用甲醇水溶液稀释标准品储备液，配制混合标准曲线；使其浓度范围分别为：3-甲氧酪胺3.9-1000pg/mL、变肾上腺素9.76-2500pg/mL、去甲变肾上腺素9.76-2500pg/mL、多巴胺19.5-5000pg/mL、肾上腺素19.5-5000pg/mL和去甲肾上腺素78-20000pg/mL。
(b)内标溶液配制：分析天平精确称取3-甲氧酪胺-d4、变肾上腺素-d3、去甲变肾上腺素-d3、多巴胺-d4、肾上腺素-d6、去甲肾上腺素-d3，各内标分别用含维生素C甲醇水溶液溶解，配制内标储备液；使用甲醇水溶液稀释内标储备液，配制混合内标工作液；使其浓度分别为：2～10ng/mL 3-甲氧酪胺-d4、10～50ng/mL变肾上腺素-d3、10～50ng/mL去甲变肾上腺素-d3、10～50ng/mL多巴胺-d4、2～10ng/mL肾上腺素-d6和10～50ng/mL去甲肾上腺素-d3。
(c)质控品配制：分析天平精确称取3-甲氧酪胺、变肾上腺素、去甲变肾上腺素、多巴胺(DA)、肾上腺素、去甲肾上腺素，各标准品分别用含维生素C 50％～90％甲醇水溶液配制质控品储备液；使用水溶液稀释质控品储备液，分别配制低浓度、中浓度、高浓度，三个浓度混合质控品工作液。将10～20人份的血浆配制混合血浆，加入不超过混合血浆总体积10％的混合质控品工作液，混合均匀，得到低浓度质控品(LQC)、中浓度质控品(MQC)、高浓度质控品(HQC)；每支500μL分装于EP管中，储存于-80℃冰箱中备用。
(二)血液的离心：取待检血液至少4mL，在离心速度为3000rpm下离心15min，分离得到上清液血浆，置于-80℃保存备用。
(三)待测血浆样本/标准曲线/质控品处理：用移液枪移取内标工作液10～50μL于1.5mL离心管中，然后加入200～400μL待测血浆样本/标准曲线/质控品于上述离心管中，加入5-100μL含有50mmol/L乙酸铵的缓冲液，混合均匀。分别用200μL甲醇和水对固相萃取(SPE)柱进行活化处理，再分别将上述处理好的血浆、标准品和质控品全部转移至活化后的SPE柱；依次用200μL 5～40mmol/L乙酸铵溶液和200μL 10～50％乙腈异丙醇溶液洗涤，抽至近干后，用100μL 50～98％乙腈2％甲酸溶液洗脱，收集洗脱液，供高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪检测。
(四)待测样本的检测：使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述待测血浆样本/标准曲线/质控品进行检测；通过标准曲线的浓度及峰面积，拟合得到标准曲线方程，通过待测血浆样本的峰面积计算出待测血浆样本中的3-甲氧酪胺，变肾上腺素，去甲变肾上腺素，多巴胺，肾上腺素和去甲肾上腺素的浓度。
优选的，所述方法可以同时检测6个化合物(肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素、3-甲氧基酪胺)。
优选的，所述步骤(a)、步骤(b)和步骤(c)中，所述配制标准品储备液中使用的抗氧化剂维生素C水溶液浓度是5～20mg/mL。所述配制标准品溶液使用的甲醇水溶液，其中甲醇含量为50～90％。
优选的，所述在步骤(c)质控品配制中血浆加标浓度如下表。
分析物 LQC MQC HQC
3-MT 10～30pg/mL 40～80pg/mL 100～400pg/mL
MN 20～80pg/mL 100～300pg/mL 400～800pg/mL
NMN 50～200pg/mL 200～600pg/mL 800～1500pg/mL
DA 20～100pg/mL 100～400pg/mL 500～1500pg/mL
E 20～100pg/mL 100～400pg/mL 500～1500pg/mL
NE 100～300pg/mL 400～800pg/mL 1000～3000pg/mL
优选的，所述(四)所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪所使用的分析色谱柱为XBridge Amide柱，填料粒径为1.7～5μm，内径2.1～4.6mm，柱长50～150mm。柱温为30～40℃，进样量为5～20μL。
优选的，所述分析色谱柱的流动相A为含有0.5％甲酸水溶液和B为含有0.5％甲酸乙腈溶液，流速为0.4～0.6mL/min，分析色谱柱采用梯度洗脱方式，流动相A和流动相B的体积比为100～0％～0～100％。
优选的，所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪检测，采用电喷雾离子源(ESI)和多反映监测(MRM)扫描模式，具体的定量离子对与定性离子对如下。
分析物 定量离子对 定性离子对
3-MT 151.1→91.1 151.1→119.0
MN 180.1→148.2 198.2→180.1
NMN 166.2→134.2 184.0→166.2
DA 154.0→91.0 154.0→137.0
E 184.2→135.0 184.2→107.0
NE 170.2→152.1 152.2→107.1
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：1、本发明所述的检测血浆中儿茶酚胺及其代谢物含量的分析方法，血浆样本经off-line SPE前处理后直接进样，效率得到很大提高，检测过程更简便快速。2、本发明所述液相色谱串联质谱法检测时使用较少的缓冲盐，不仅能提高灵敏度，还能增强系统耐受性，减少系统污染。3、可以同时检测6个化合物且灵敏度足够低，可检测出大部分临床样本，为嗜铬细胞瘤的前期诊断提供实验基础。
附图说明
图1～图6依次为3-甲氧酪胺，变肾上腺素，去甲变肾上腺素，多巴胺，肾上腺素和去甲肾上腺素色谱图。
具体实施方式
一、为了更好地对本发明的技术特征和效果进行说明，下面采用具体实施方式对本发明进行详细说明，但本发明并不限于此。
(一)、标准溶液的标定。
(a)标准工作液的配制：精确称取3-甲氧酪胺标准品12.55mg置于10mL容量瓶中，用4mL浓度为10mg/mL的维生素C水溶液溶解，用甲醇定容至刻度，得到标准储备液A，其3-甲氧酪胺的浓度为1.03mg/mL，用50％的甲醇溶液从标准储备液A稀释得到标准中间液B，其3-甲氧酪胺的浓度为10.3μg/mL；精确称取变肾上腺素标准品8.46mg置于10mL容量瓶中，用4mL浓度为10mg/mL的维生素C水溶液溶解，用甲醇定容至刻度，得到标准储备液C，其变肾上腺素的浓度为0.7139mg/mL，用50％的甲醇溶液从标准储备液C稀释得到标准中间液D，其变肾上腺素的浓度为7.139μg/mL；精确称取去甲变肾上腺素标准品12.27mg置于10mL容量瓶中，用4mL浓度为10mg/mL的维生素C水溶液溶解，用甲醇定容至刻度，得到标准储备液E，其去甲变肾上腺素的浓度为1.023mg/mL，用50％的甲醇溶液从标准储备液E稀释得到标准中间液F，其去甲变肾上腺素的浓度为10.23μg/mL；精确称取多巴胺标准品12.83mg置于10mL容量瓶中，用4mL浓度为10mg/mL的维生素C水溶液溶解，用甲醇定容至刻度，得到标准储备液G，其多巴胺的浓度为1.036mg/mL，用50％的甲醇溶液从标准储备液G稀释得到标准中间液H，其多巴胺的浓度为10.36μg/mL；精确称取肾上腺素标准品12.63mg置于10mL容量瓶中，用4mL浓度为10mg/mL的维生素C水溶液溶解，用甲醇定容至刻度，得到标准储备液H，其肾上腺素的浓度为1.263mg/mL，用50％的甲醇溶液从标准储备液H稀释得到标准中间液I，其肾上腺素的浓度为12.63μg/mL；精确称取去甲肾上腺素标准品19.46mg置于10mL容量瓶中，用4mL浓度为10mg/mL的维生素C水溶液溶解，用甲醇定容至刻度，得到标准储备液J，其去甲肾上腺素的浓度为1.031mg/mL，用50％的甲醇溶液从标准储备液J稀释得到标准中间液K，其去甲肾上腺素的浓度为10.31μg/mL；将标准中间液B、D、F、H、I和K分别吸取7.76μL、28μL、20μL、39μL、64μL和155μL，再加入3686.24μL 50％甲醇溶液，混匀后，用水溶液进行稀释，在含有3.9-1000pg/mL3-甲氧酪胺、9.76-2500pg/mL变肾上腺素、9.76-2500pg/mL去甲变肾上腺素、19.5-5000pg/mL多巴胺、19.5-5000pg/mL肾上腺素和78-20000pg/mL去甲肾上腺素的浓度范围内配制出各浓度的标准工作液。优选浓度如下表。
(b)标准内标液的配制：精确称取3-甲氧酪胺同位素内标标准品13.32mg置于10mL容量瓶中，用4mL浓度为10mg/mL的维生素C水溶液溶解，用甲醇定容至刻度，得到标准储备液L，其3-甲氧酪胺同位素的浓度为1.0978mg/mL，用50％的甲醇溶液从标准储备液L稀释得到标准中间液M，其3-甲氧酪胺同位素的浓度为109.78μg/mL；精确称取变肾上腺素同位素内标标准品5mg置于10mL容量瓶中，用4mL浓度为10mg/mL的维生素C水溶液溶解，用甲醇定容至刻度，得到标准储备液N，其变肾上腺素同位素内标的浓度为0.4229mg/mL，用50％的甲醇溶液从标准储备液N稀释得到标准中间液O，其变肾上腺素同位素内标的浓度为42.29μg/mL；精确称取去甲变肾上腺素同位素内标标准品5mg置于10mL容量瓶中，用4mL浓度为10mg/mL的维生素C水溶液溶解，用甲醇定容至刻度，得到标准储备液P，其去甲变肾上腺素同位素内标的浓度为0.4180mg/mL，用50％的甲醇溶液从标准储备液P稀释得到标准中间液Q，其去甲变肾上腺素同位素内标的浓度为41.8μg/mL；精确称取多巴胺同位素内标标准品5mg置于10mL容量瓶中，用4mL浓度为10mg/mL的维生素C水溶液溶解，用甲醇定容至刻度，得到标准储备液R，其多巴胺同位素内标的浓度为0.8115mg/mL，用50％的甲醇溶液从标准储备液R稀释得到标准中间液S，其多巴胺同位素内标的浓度为81.15μg/mL；精确称取肾上腺素同位素内标标准品10mg置于10mL容量瓶中，用4mL浓度为10mg/mL的维生素C水溶液溶解，用甲醇定容至刻度，得到标准储备液T，其肾上腺素同位素内标的浓度为1mg/mL；用50％的甲醇溶液从标准储备液T稀释得到标准中间液U，其肾上腺素同位素内标的浓度为100μg/mL；精确称取去甲肾上腺素同位素内标标准品5mg置于10mL容量瓶中，用4mL浓度为10mg/mL的维生素C水溶液溶解，用甲醇定容至刻度，得到标准储备液V，其去甲肾上腺素同位素内标的浓度为0.4125mg/mL，用50％的甲醇溶液从标准储备液V稀释得到标准中间液W，其去甲肾上腺素同位素内标的浓度为41.25μg/mL；将标准中间液M、O、Q、S、U和W分别吸取2.5μL、100μL、100μL、50μL、5.0μL和50μL，再加入692.5μL 50％甲醇溶液，混匀后，用水溶液进行稀释，得到含有3ng/mL3-甲氧酪胺同位素、含有40ng/mL变肾上腺素同位素、含有40ng/mL去甲变肾上腺素同位素、含有40ng/mL多巴胺同位素、含有5ng/mL肾上腺素同位素和含有20ng/mL去甲肾上腺素同位素的标准内标液。
(c)质控品配制：如(a)所述方法，分析天平精确称取3-甲氧酪胺、变肾上腺素、去甲变肾上腺素、多巴胺(DA)、肾上腺素、去甲肾上腺素置于10mL容量瓶中，各标准品分别用4mL浓度为10mg/mL的维生素C水溶液溶解，用甲醇定容至刻度，得到质控品储备液；使用水溶液稀释质控品储备液，分别配制低浓度质控品、中浓度质控品、高浓度质控品三个浓度混合质控品工作液。
将50人份的血浆配制混合血浆120mL，分成3份，每份加入4mL的三个浓度混合质控品工作液，混合均匀，得到低浓度质控品(LQC)、中浓度质控品(MQC)、高浓度质控品(HQC)；每支500μL分装于EP管中，储存于-80℃冰箱中备用。具体标准品加入浓度如下表。
分析物 LQC pg/mL MQC pg/mL HQC pg/mL
3-MT 20 60 200
MN 50 150 500
NMN 100 300 1000
DA 50 200 600
E 50 200 600
NE 200 600 2000
(d)用标准溶液标定，得到标准曲线方程：用移液枪分别移取九种不同浓度的标准工作液20μL，将上述九种不同浓度的标准工作液分别与50μL标准内标液和380μL水混合，并置于1.5mL离心管中制成至少九种标准溶液，在上述标准溶液中分别加入10μL含有50mmol/L乙酸铵的缓冲液，混匀，用200μL甲醇和水对off-line SPE固相萃取装置中的SPE柱进行活化处理，再将上述处理好的标准溶液分别全部转移至SPE柱，依次用200μL 20mmol/L乙酸铵溶液和200μL 50％乙腈异丙醇溶液洗涤，抽至近干后，用100μL98％乙腈2％甲酸溶液洗脱，收集洗脱液，供LC-MS/MS检测，分别得出上述九种标准溶液中的3-甲氧酪胺，变肾上腺素，去甲变肾上腺素，多巴胺，肾上腺素和去甲肾上腺素的色谱图及其对应的标准内标液中3-甲氧酪胺同位素，变肾上腺素同位素，去甲变肾上腺素同位素，多巴胺同位素，肾上腺素同位素和去甲肾上腺素同位素的色谱图，以上述九种标准溶液的3-甲氧酪胺，变肾上腺素，去甲变肾上腺素，多巴胺，肾上腺素和去甲肾上腺素的峰面积和对应的标准内标液中的3-甲氧酪胺同位素，变肾上腺素同位素，去甲变肾上腺素同位素，多巴胺同位素，肾上腺素同位素和去甲肾上腺素同位素的峰面积之比作为标准曲线图的纵坐标y1,y2,y3,y4,y5和y6，以上述标准工作液中含有3-甲氧酪胺，变肾上腺素，去甲变肾上腺素，多巴胺，肾上腺素和去甲肾上腺素的浓度与对应的标准内标液中的3-甲氧酪胺同位素，变肾上腺素同位素，去甲变肾上腺素同位素，多巴胺同位素，肾上腺素同位素和去甲肾上腺素同位素的浓度之比作为标准曲线图的横坐标x1,x2,x3,x4,x5和x6，将以上检测所得至少数据分别进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a*x1+b，y2＝c*x2+d，y3＝e*x3+f，y4＝g*x4+h，y5＝i*x5+j和y6＝k*x6+m，并且得到权重系数a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k和m。
(二)检测血液的离心：取待检血液至少4mL，在离心速度为3000rpm下离心15min，得到上清液血浆，置于-80℃备用。
(三)待测样本/质控品处理：(e)用移液枪移取标准内标液50μL于1.5mL离心管中，然后加入步骤(二)的400uL的血浆/质控品于上述离心管中，加入10uL含有50mmol/L乙酸铵的缓冲液，混匀，用200μL甲醇和水对off-line SPE固相萃取装置中的SPE柱进行活化处理，再讲上述处理好的标准溶液分别全部转移至SPE柱，依次用200μL 20mmol/L乙酸铵溶液和200μL 50％乙腈异丙醇溶液洗涤，抽至近干后，用100μL98％乙腈2％甲酸溶液洗脱，收集洗脱液，供LC-MS/MS检测。
(四)待测样本的检测：取步骤(e)待测样本，使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述待测样本进行检测，得出上述待测样本的3-甲氧酪胺，变肾上腺素，去甲变肾上腺素，多巴胺，肾上腺素和去甲肾上腺素的色谱图及其对应的标准内标液中3-甲氧酪胺同位素，变肾上腺素同位素，去甲变肾上腺素同位素，多巴胺同位素，肾上腺素同位素和去甲肾上腺素同位素的色谱图，将上述色谱图中的3-甲氧酪胺，变肾上腺素，去甲变肾上腺素，多巴胺，肾上腺素和去甲肾上腺素的峰面积和对应的标准内标液中的3-甲氧酪胺同位素，变肾上腺素同位素，去甲变肾上腺素同位素，多巴胺同位素，肾上腺素同位素和去甲肾上腺素同位素的峰面积之比y1,y2,y3,y4,y5和y6，代入上述步骤(c)的标准曲线方程y1＝a*x1+b，y2＝c*x2+d，y3＝e*x3+f，y4＝g*x4+h，y5＝i*x5+j和y6＝k*x6+m中，通过计算得到待检测样本中的3-甲氧酪胺，变肾上腺素，去甲变肾上腺素，多巴胺，肾上腺素和去甲肾上腺素的浓度与对应的标准内标液中的3-甲氧酪胺同位素，变肾上腺素同位素，去甲变肾上腺素同位素，多巴胺同位素，肾上腺素同位素和去甲肾上腺素同位素的浓度之比x1,x2,x3,x4,x5和x6，标准内标液中的3-甲氧酪胺同位素，变肾上腺素同位素，去甲变肾上腺素同位素，多巴胺同位素，肾上腺素同位素和去甲肾上腺素同位素的浓度是已知的，通过计算得到待检测血液中的3-甲氧酪胺，变肾上腺素，去甲变肾上腺素，多巴胺，肾上腺素和去甲肾上腺素的浓度。
所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱检测的质谱仪参数如下。
所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱检测的多反应监测参数如下。
所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱检测的流动相梯度洗脱程序参数如下。
二、本实施例中技术方案论证如下。
(一)该方法的线性关系和定量限：将上述配置的混合标准工作液，经SPE前处理后进样。按本实施例测定条件，按浓度由低到高进行测定，以定量色谱峰面积-浓度作图，得到标准曲线；结果表明：6种分析物的线性相关系数r均在0.995以上，线性范围、检测限(LOD)和定量限(LOQ)如下。
(二)该方法的回收率和精密度
取3-甲氧基酪胺，变肾上腺素，去甲变肾上腺素，多巴胺，肾上腺素和去甲肾上腺素标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行精密度实验，按本实施例方法进行测定，重复分析测定3批次，精密度如下。
取3-甲氧基酪胺，变肾上腺素，去甲变肾上腺素，多巴胺，肾上腺素和去甲肾上腺素标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率实验，按本实施例方法进行测定，重复分析测定3批次，回收率如下。
综合上述验证实验，本实施例的检测限，回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，方法检测血浆中儿茶酚胺及其代谢物含量，重现性良好，加标回收率高，提高了检测结果的准确度。
血浆样本中儿茶酚胺及其代谢物质谱图如下，3-甲氧基酪胺的保留时间为0.87min，变肾上腺素的保留时间为0.88min，去甲变肾上腺素的保留时间为0.93min，多巴胺的保留时间为0.94min，肾上腺素的保留时间为0.99min，去甲肾上腺素的保留时间为1.2min，从图中可知本实施例方法目标化合物的识别准确，且分析时间短，干扰小，特异性强。

Claims (4)

1.一种使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪检测血浆中儿茶酚胺及其代谢物含量的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
(一)标准溶液的配制
(a)标准曲线溶液配制：
分析天平精确称取3-甲氧酪胺(3-MT)、变肾上腺素(MN)、去甲变肾上腺素(NMN)、多巴胺(DA)、肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)，各标准品分别用含维生素C甲醇水溶液溶解，配制标准品储备液；使用甲醇水溶液稀释标准品储备液，配制混合标准曲线工作液；使其浓度范围分别为：3-甲氧酪胺3.9-1000pg/mL、变肾上腺素9.76-2500pg/mL、去甲变肾上腺素9.76-2500pg/mL、多巴胺19.5-5000pg/mL、肾上腺素19.5-5000pg/mL和去甲肾上腺素78-20000pg/mL；
(b)内标溶液配制：
分析天平精确称取3-甲氧酪胺-d4(3-MT-d4)、变肾上腺素-d3(MN-d3)、去甲变肾上腺素-d3(NMN-d3)、多巴胺-d4(DA-d4)、肾上腺素-d6(E-d6)、去甲肾上腺素-d3(NE-d3)，各内标分别用含维生素C甲醇水溶液溶解，配制内标储备液；使用甲醇水溶液稀释内标储备液，配制混合内标工作液；使其浓度分别为：2～10ng/mL 3-甲氧酪胺-d4、10～50ng/mL变肾上腺素-d3、10～50ng/mL去甲变肾上腺素-d3、10～50ng/mL多巴胺-d4、2～10ng/mL肾上腺素-d6和10～50ng/mL去甲肾上腺素-d3；
(c)质控品配制：
分析天平精确称取3-甲氧酪胺、变肾上腺素、去甲变肾上腺素、多巴胺(DA)、肾上腺素、去甲肾上腺素，各标准品分别用含维生素C甲醇水溶液配制质控品储备液；使用水溶液稀释质控品储备液，分别配制低浓度、中浓度、高浓度，三个浓度混合质控品工作液；将10～20人份的血浆配制混合血浆，加入不超过混合血浆总体积10％的混合质控品工作液，混合均匀，得到低浓度质控品(LQC)、中浓度质控品(MQC)、高浓度质控品(HQC)；每支500μL分装于EP管中，储存于-80℃冰箱中备用；
(二)血液的离心
取待检血液至少4mL，在离心速度为3000rpm下离心15min，分离得到上清液血浆，置于-80℃保存备用；
(三)待测血浆样本/标准曲线溶液/质控品处理
用移液枪移取内标工作液50μL于1.5mL离心管中，然后加入400μL待测血浆样本/标准曲线溶液/质控品于上述离心管中，加入10μL含有50mmol/L乙酸铵的缓冲液，混合均匀；分别用200μL甲醇和水对固相萃取(SPE)柱进行活化处理，再分别将上述处理好的血浆、标准曲线溶液和质控品全部转移至活化后的SPE柱；依次用200μL 20mmol/L乙酸铵溶液和200μL50％乙腈异丙醇溶液洗涤，抽至近干后，用100μL 98％乙腈2％甲酸溶液洗脱，收集洗脱液，供高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪检测；
(四)待测样本的检测
使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述待测血浆样本/标准曲线溶液/质控品进行检测；
所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪所使用的分析色谱柱为Xbridge Amide柱，填料粒径为1.7～5μm，内径2.1～4.6mm，柱长50～150mm；柱温为30～40℃，进样量为5～20μL；
所述分析色谱柱的流动相A为含有0.5％甲酸水溶液和B为含有0.5％甲酸乙腈溶液，流速为0.4mL/min，分析色谱柱采用梯度洗脱方式，所述梯度洗脱的程序参数如下：
所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪检测采用电喷雾离子源(ESI)和多反应监测(MRM)扫描模式，具体的定量离子对与定性离子对如下：
分析物 定量离子对 定性离子对 3-MT 151.1→91.1 151.1→119.0 MN 180.1→148.2 198.2→180.1 NMN 166.2→134.2 184.0→166.2 DA 154.0→91.0 154.0→137.0 E 184.2→135.0 184.2→107.0 NE 170.2→152.1 152.2→107.1
；
通过标准曲线溶液的浓度及峰面积，拟合得到标准曲线方程，通过待测血浆样本的峰面积计算出待测血浆样本中的3-甲氧酪胺，变肾上腺素，去甲变肾上腺素，多巴胺，肾上腺素和去甲肾上腺素的浓度。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：在步骤(a)、步骤(b)和步骤(c)中，配制标准品储备液中使用的抗氧化剂维生素C水溶液浓度是5～20mg/mL；配制标准品溶液使用的甲醇水溶液，其中甲醇含量为50～90％。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：在步骤(c)质控品配制中血浆加标浓度如下表：
分析物 LQC pg/mL MQC pg/mL HQC pg/mL 3-MT 10～30 40～80 100～400 MN 20～80 100～300 400～800 NMN 50～200 200～600 800～1500 DA 20～100 100～400 500～1500 E 20～100 100～400 500～1500 NE 100～300 400～800 1000～3000
。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：可以同时检测6个化合物：肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素、3-甲氧基酪胺。
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